Załącznik nr 2 do wniosku o wszczęcie postępowania habilitacyjnego

AUTOREFERAT

dr n. wet. Magdalena Chłopecka

Zakład Farmakologii i Toksykologii

Katedra Nauk Przedklinicznych

Wydział Medycyny Weterynaryjnej

Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie

Warszawa, 2018

- 2 -

1. Imię i nazwisko

Magdalena Chłopecka

2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe/artystyczne z podaniem nazwy, miejsca i

roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej:

1993-1999 tytuł zawodowy lekarza weterynarii (1999),

Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie,

ocena na dyplomie: bardzo dobry,

dyplom z wyróżnieniem

2006 tytuł specjalisty w dziedzinie weterynaryjnej diagnostyki

laboratoryjnej,

Komisja do Spraw Lekarzy Weterynarii, Puławy

2007 stopień naukowy doktora nauk weterynaryjnych (grudzień 2007),

Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie,

rozprawa doktorska nagrodzona wyróżnieniem.

Tytuł rozprawy doktorskiej: „Ocena przydatności izolowanych

wycinków jelita czczego jako alternatywnego modelu

doświadczalnego do badania działania ksenobiotyków po

narażeniu per os”.

Promotor: prof. dr hab. Maria Wiechetek

Recenzenci:

prof. dr hab. Romuald Zabielski;

prof. dr hab. Arkadiusz Zasadowski

- 3 -

3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych/

artystycznych:

1997-1999 Asystent stażysta w Katedrze Farmakologii i Toksykologii

Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Szkoły Głównej

Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie.

1999-2008 Asystent w Katedrze, a następnie Zakładzie Farmakologii i

Toksykologii Katedry Nauk Przedklinicznych Wydziału

Medycyny Weterynaryjnej Szkoły Głównej Gospodarstwa

Wiejskiego w Warszawie.

od 2008 Adiunkt w Zakładzie Farmakologii i Toksykologii Katedry Nauk

Przedklinicznych Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Szkoły

Głównej Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie.

4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003

r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie

sztuki (Dz.U. nr 65 poz. 595 ze zm.)

a) osiągnięciem naukowym jest jednotematyczny cykl publikacji pod wspólnym

tytułem:

„Ocena wpływu pestycydów na aktywność motoryczną przewodu pokarmowego

w warunkach in vitro na przykładzie glifosatu i piryproksyfenu”

b) publikacje stanowiące osiągnięcie naukowe:

A. Chłopecka M., Mendel M., Dziekan N., Karlik W. (2014) Glyphosate affects the

spontaneous motoric activity of intestine at very low doses – In vitro study. Pesticide

Biochemistry and Physiology, 113, 25-30 (MNiSW = 25, IF2014: 2,014).

Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na zaplanowaniu i przygotowaniu

wszystkich doświadczeń, przeprowadzeniu eksperymentów oraz nadzorze nad

zespołem badawczym, analizie i interpretacji uzyskanych wyników, przygotowaniu

- 4 -

manuskryptu do publikacji oraz opracowaniu odpowiedzi na uwagi recenzentów. Mój

udział procentowy szacuję na 80%.

B. Chłopecka M., Mendel M., Dziekan N., Karlik W. (2017) The effect of glyphosate-

based herbicide Roundup and its co-formulant, POEA, on the motoric activity of rat

intestine – In vitro study, Environmental Toxicology and Pharmacology, 49, 156-162

(MNiSW = 25, IF2017: 2,776)

Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na zaplanowaniu i przygotowaniu

wszystkich doświadczeń, przeprowadzeniu eksperymentów oraz nadzorze nad

zespołem badawczym, analizie i interpretacji uzyskanych wyników, przygotowaniu

manuskryptu do publikacji oraz opracowaniu odpowiedzi na uwagi recenzentów. Mój

udział procentowy szacuję na 80%.

C. Chłopecka M., Mendel M., Dziekan N., Karlik W. (2018). The effect of pyriproxyfen

on the motoric activity of rat intestine - In vitro study. Environmental Pollution, 241,

1146-1152 (MNiSW = 40, IF2017: 4,358).

Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na zaplanowaniu i przygotowaniu

wszystkich doświadczeń, przeprowadzeniu eksperymentów oraz nadzorze nad

zespołem badawczym, analizie i interpretacji uzyskanych wyników, przygotowaniu

manuskryptu do publikacji oraz opracowaniu odpowiedzi na uwagi recenzentów,

pełniłam funkcję autora korespondencyjnego. Mój udział procentowy szacuję na 85%.

Łączna punktacja osiągnięcia (dla pracy z 2018 roku przyjęto wskaźnik z roku 2017):

IF: 9,148

MNiSW: 90

Kopie publikacji oraz oświadczenia współautorów znajdują się odpowiednio w załącznikach

4 i 5 do Wniosku o przeprowadzenie postępowania habilitacyjnego.

- 5 -

c) Omówienie celu naukowego prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich

ewentualnego wykorzystania.

Wprowadzenie

W latach 2003-2007 prowadziłam szerokie badania związane ze standaryzacją

warunków doświadczalnych w eksperymentach wykorzystujących izolowane wycinki

przewodu pokarmowego szczura. Ich zakończenie zaowocowało powstaniem podstawowego

protokołu doświadczalnego, który uwzględniał wszystkie punkty krytyczne związane z

prowadzeniem badań z wykorzystaniem ocenianego modelu. Znaczna część uzyskanych

wyników została zawarta w mojej rozprawie doktorskiej oraz publikacjach i doniesieniach

konferencyjnych. Zakończenie prac standaryzacyjnych pozwoliło członkom zespołu

badawczego Zakładu Farmakologii i Toksykologii Wydziału Medycyny Weterynaryjnej w

Warszawie na rozwinięcie projektów związanych z wykorzystaniem modelu izolowanych

wycinków przewodu pokarmowego w eksperymentach oceniających toksyczność różnych

ksenobiotyków.

Jednym z realizowanych kierunków badawczych, którego byłam inicjatorką, jest ocena

wpływu pestycydów na aktywność mięśniówki przewodu pokarmowego w warunkach in vitro.

Wszystkie pestycydy trafiające na rynki europejskie wymagają szeregu badań w procesie

zatwierdzania substancji czynnych, autoryzacji gotowych produktów handlowych oraz stałego

monitorowania toksykologicznych i ekotoksykologicznych skutków dopuszczonych do

stosowania preparatów pestycydowych 1,2. Oprócz wymaganych prawnie wyników badań

toksykometrycznych, stanowiących obowiązek w procesie oceny pestycydów, istotnym

elementem bezpieczeństwa chemicznego są badania podejmowane stale w wielu ośrodkach

naukowych z wykorzystaniem różnorodnych modeli badawczych. Wyniki takich badań są

często źródłem nowych informacji na temat bezpieczeństwa stosowania pestycydów, które

mogą mieć wpływ na wyniki przeglądu i odnowienia zatwierdzenia substancji czynnych przez

państwa członkowskie oraz ustalanie warunków dopuszczenia gotowych produktów

pestycydowych 3,4.

Glifosat (N-fosfonometyloglicyna) jest substancją czynną najpowszechniej obecnie

stosowanych preparatów herbicydowych na całym świecie. Główny mechanizm działania

glifosatu na rośliny polega na hamowaniu syntetazy szlaku szikimowego, co skutkuje

zahamowaniem wytwarzania przez nie aminokwasów aromatycznych. Szlak ten obecny jest

- 6 -

jedynie w organizmach roślin, grzybów i bakterii 5. Działanie glifosatu na proces metaboliczny,

który nie jest obecny w organizmach zwierzęcych stanęło u podstaw opracowania skutecznego,

ale jednocześnie bezpiecznego herbicydu. Wyniki wymaganych prawnie badań zdają się

potwierdzać stosunkowo wysokie bezpieczeństwo glifosatu dla organizmów zwierzęcych 5-7.

Należy jednak zaznaczyć, że bardzo liczne badania in vivo oraz in vitro jak również dane

epidemiologiczne zbierane przez dekady stosowania glifostowych preparatów herbicydowych,

ujawniły wiele działań szkodliwych dla organizmów niedocelowych skutkujących

uszkodzeniami tkanek oraz zaburzeniami procesów fizjologicznych i biochemicznych 5,8,9-16.

Jednocześnie dostępne dane literaturowe wskazują na dużo wyższą toksyczność gotowych

preparatów glifosatowych w porównaniu z substancją czynną 4,14,17-19. Mając na uwadze

powyższe dane i po wykonaniu eksperymentów pilotażowych, podjęłam decyzję o rozpoczęciu

badań nad wpływem glifosatu oraz jego handlowego produktu na aktywność motoryczną

mięśniówki przewodu pokarmowego. Kierowałam również grantem badawczym

finansowanym z Narodowego Centrum Nauki pt. „Ocena działania toksycznego glifosatu i jego

handlowego preparatu na modelu izolowanych wycinków przewodu pokarmowego” (Załącznik

3, II.I.1).

W kolejnych eksperymentach postanowiłam zbadać substancję z grupy insektycydów.

Piryproksyfen (PPF) jest analogiem hormonu juwenilnego, który bardzo skutecznie blokuje

płodność, rozwój i dojrzewanie larw owadów, co skutkuje silnymi właściwościami

owadobójczymi. Ten charakterystyczny, unikatowy mechanizm działania czyni insektycyd

bardziej selektywnym, a co za tym idzie, bezpieczniejszym dla organizmów niebędących

przedmiotem zwalczania w porównaniu z konwencjonalnymi środkami owadobójczymi.

Preparaty zawierające piryproksyfen zyskały dużą popularność i są obecnie powszechnie

stosowane w gospodarstwie domowym, w rolnictwie i ogrodnictwie, na obszarach miejskich

oraz do zwalczania ektopasożytów zwierząt 20-22. W ostatnich latach zwrócono jednak uwagę

na konieczność zintensyfikowania badań na różnych modelach doświadczalnych, które

pozwoliłyby ocenić potencjalne skutki narażenia na PPF 22,23-27. Wzrost zainteresowania tą

substancją wynika z faktu, iż w 2014 roku podjęto w Brazylii pierwszą w skali światowej akcję

dodawania insektycydu do zbiorników z wodą pitną w celu zahamowania rozwoju wektorów

przenoszących wirus Zika, którymi są komary Aedes aegypti 28. Substancją czynną

stosowanych do tego celu preparatów jest właśnie piryproksyfen. Ta bezprecedensowa w skali

światowej akcja rozpoczęła dyskusję na temat ewentualnych skutków zdrowotnych stałego,

- 7 -

długotrwałego narażenia całej populacji ogólnej (dzieci, dorośli, osoby starsze, kobiety w ciąży

oraz w czasie laktacji) na ten insektycyd.

Biorąc pod uwagę ogromne znaczenie prawidłowej perystaltyki przewodu

pokarmowego dla zdrowia organizmu, ocena wpływu ksenobiotyków, które są stale obecne w

diecie człowieka, na aktywność mięśniówki przewodu pokarmowego wydaje się w pełni

uzasadniona. Wiadomo, że nawet niewielkie zaburzenia aktywności mięśni gładkich mogą

zaburzać takie jak wchłanianie, wydzielanie czy pasaż treści29. Warto zauważyć, że wyniki

badań eksperymentalnych oraz dane epidemiologiczne sugerują, że ekspozycja na różne

zanieczyszczenia obecne w wodzie i żywności jak również leki, może przyczyniać się do

zaburzeń motoryki przewodu pokarmowego 30-33. Sugeruje to możliwość sumowania się

efektów takich działań będących skutkiem aktywności biologicznej różnych substancji, a w

konsekwencji trudności w prawidłowej i pełnej ocenie ryzyka, jakie niesie takie narażenie na

te związki, dla motoryki przewodu pokarmowego.

Rozwijanie badań toksykologicznych i farmakologicznych w kierunku eksperymentów

wykorzystujących alternatywne do badań na zwierzętach modele badawcze jest dzisiaj

koniecznością i obowiązkiem każdego badacza. Akty prawne regulujące wszystkie aspekty

bezpieczeństwa chemicznego w Unii Europejskiej narzucają również konieczność

podejmowania działań ograniczających wykorzystanie zwierząt jako modeli badawczych 34,35.

Zawarte w rozporządzeniu 1272/2008 zapisy jasno wskazują, że „Priorytetową rolę ma

ochrona zwierząt (…) wykorzystywanych do celów doświadczalnych i innych celów

naukowych”. Dyrektywa Parlamentu Europejskiego i Rady 2010/63/UE w sprawie ochrony

zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych 36 również jasno określa konieczność

stosowania metod alternatywnych jako wiodących metod badawczych.

Podsumowując, cele moich badań prezentowały się następująco:

I. ocena wpływu glifosatu oraz jego handlowego produktu na aktywność motoryczną

izolowanych wycinków jelita czczego szczura:

a) ocena charakteru i nasilenia zaburzeń mięśniówki,

b) porównanie toksyczności substancji czynnej i gotowego preparatu

herbicydowego;

- 8 -

II. zbadanie wpływu surfaktantu stosowanego w preparatach glifosatowych -

polioksyetylenoaminy (POEA), na toksyczność preparatu herbicydowego:

a) ocena wpływu POEA na aktywność mięśniówki wycinków jelita czczego

szczura;

b) zbadanie interakcji pomiędzy glifosatem i surfaktantem;

III. zbadanie wpływu piryproksyfenu na aktywność motoryczną mięśniówki

izolowanych wycinków przewodu pokarmowego szczura:

a) ocena zaburzeń aktywności spontanicznej mięśniówki,

b) wpływ insektycydu na reakcję mięśniówki na acetylocholinę (ACh),

c) porównanie wrażliwości wycinków pochodzących z różnych części przewodu

pokarmowego (dwunastnica, jelito czcze).

Syntetyczne omówienie publikacji stanowiących osiągnięcie badawcze

Wyniki badań kinetycznych wskazują, że po narażeniu doustnym największa ilość

glifosatu pojawia się w komórkach ściany jelita cienkiego (pow. 30% przyjętej dawki).

Maksymalne stężenie substancji w ścianie jelita pojawia się również dużo szybciej (po 2

godzinach od narażenia) niż w innych tkankach (powyżej 6 godzin) i utrzymuje się w znaczącej

ilości do 7 dni 37. Jednocześnie w przebiegu zatruć preparatami glifosatowymi odnotowuje się

nasilone objawy ze strony przewodu pokarmowego 38,39. Dane te sugerują, że mechanizm

powstawania zaburzeń perystaltyki nie jest związany jedynie z oddziaływaniem składników

preparatów herbicydowych na śluzówkę przewodu pokarmowego, ale również może wynikać

z oddziaływania glifosatu po wchłonięciu do organizmu, bezpośrednio poprzez obecność w

ścianie jelita. Pierwszym etapem badań, który zainicjowałam, była zatem ocena wpływu

czystego glifosatu na aktywność wycinków przewodu pokarmowego. Najważniejsze wyniki

tych doświadczeń zostały zaprezentowane w pracy:

Chłopecka M., Mendel M., Dziekan N., Karlik W. (2014) Glyphosate affects the

spontaneous motoric activity of intestine at very low doses – In vitro study. Pesticide

Biochemistry and Physiology, 113, 25-30.

- 9 -

Do doświadczeń wykorzystałam roztwory glifosatu w stężeniach od 1,7 do 0,003 g/l,

które podawałam do komór inkubacyjnych dwukrotnie w sposób niekumulacyjny. Ze względu

na fakt, iż wraz ze wzrostem stężenia glifosatu odczyn roztworu istotnie się obniża (do pH 5,2

w przypadku roztworu glifosatu o stężeniu 1,7 g/l) wszystkie roztwory były buforowane do pH

7,35. Do doświadczeń wykorzystałam również niezbuforowany roztwor glifosatu oraz

zakwaszony bufor inkubacyjny o pH 5,2.

Inkubacja wycinków w roztworach glifosatu (pH 7,35) wyraźnie zaburzała aktywność

mięśniówki w przypadku wszystkich zastosowanych stężeń substancji badanej. W przypadku

inkubacji wycinków w roztworach o stężeniach 0,014; 0,34 i 1,7 g glifosatu/l reakcja miała

charakter dwufazowy (obserwowano relaksację i skurcz w przebiegu jednej odpowiedzi

mięśniówki). W pozostałych przypadkach zaobserwowano tendencję wycinków do reakcji

dwufazowej, przy czym istotnie większą siłę względem kontroli miała tylko skurczowa

komponenta odpowiedzi. Siła reakcji relaksacyjnej mięśniówki była znacząca i wynosiła od

około 60% (0,014 g/l) do 100% (1,7 g/l) względem reakcji po podaniu izoproterenolu.

Najsilniejszą komponentę skurczową reakcji odnotowano po podaniu glifosatu w najniższym

zastosowanym stężeniu (0,003 g/l). Najważniejszym elementem prezentowanych wyników jest

fakt, że pierwsze istotne zaburzenia aktywności mięśniówki pojawiają się w obecności glifosatu

w stężeniach, które korespondują ze stężeniami tej substancji stwierdzanymi w warunkach in

vivo u ludzi nie wykazujących żadnych klinicznych objawów narażenia (badania

epidemiologiczne populacji ogólnej) oraz u osób zatrutych preparatami glifosatowymi

manifestujących bardzo słabo wyrażone objawy zatrucia 38,40. Dane te mogą wskazywać, że

glifosat może doprowadzać do subklinicznych zaburzeń aktywności motorycznej przewodu

pokarmowego, które nie są diagnozowane jako konsekwencje narażenia na ten herbicyd. Biorąc

pod uwagę fakt, że ekstrapolacja otrzymanych danych na organizm powinna uwzględniać

mniejszą wrażliwość modeli in vitro, otrzymane wyniki wydają się jeszcze bardziej

niepokojące. Obserwacja ta ma bardzo duże znaczenie, ponieważ nawet niewielkie zakłócenia

aktywności motorycznej przewodu pokarmowego prowadzą do poważnych problemów

zdrowotnych29. Istnieje duża liczba zaburzeń motoryki, które występują bez wyraźnych

objawów patomorfologicznych, a których przyczyny nie są określone. Stałe, powtarzające się

narażenie nawet na małe dawki glifosatu powoduje ciągłe oddziaływanie na komórki

mięśniowe ściany jelita, co może odgrywać kluczową rolę w nawracających zaburzeniach

perystaltyki. Dodatkowym aspektem, który należy wziąć pod uwagę, jest ryzyko interakcji

pomiędzy glifosatem i substancjami lub ich metabolitami obecnymi w diecie i środowisku w

- 10 -

wyniku jednoczesnego narażenia na te związki chemiczne. W przypadku glifosatu podejrzenia

te zostały potwierdzone w badaniach in vivo na szczurach przeprowadzonych przez Mariana

wraz z zespołem 41, których wyniki ujawniły, że efekt toksyczny, obejmujący mechanizmy

stresu oksydacyjnego, był wielokrotnie wyższy w przypadku narażenia na mieszaninę

substancji czynnych pestycydów (dimetoatu, zinebu i glifosatu) niż na sumę efektów po

ekspozycji na pojedyncze substancje.

Ważnym aspektem uzyskanych wyników było wykazanie zachowania aktywności

biologicznej glifosatu w pH 7,35. Wiadomo, że aktywność biologiczna glifosatu wzrasta wraz

z obniżeniem pH środowiska, co jest wykorzystywane do zwiększeniu siły chwastobójczej

roztworów preparatów glifosatowych 42,43. Uzyskane wyniki wskazują jasno, że glifosat po

wchłonięciu z przewodu pokarmowego, w dobrze zbuforowanych warunkach in vivo, może

pozostawać aktywny biologicznie i może oddziaływać na tkanki. Natomiast inkubacja

wycinków w nie zbuforowanym (kwaśnym) roztworze glifosatu (pH 5,2 w stężeniu 1,7 g/l)

powodowała zmianę charakteru i siły reakcji: odnotowana odpowiedź miała charakter trwałej

relaksacji, o ponad dwukrotnie większej sile w porównaniu z reakcją na glifosat zastosowany

w tej samej dawce, ale w zbuforowanym fizjologicznym pH. Wzrost toksycznego działania

glifosatu w kwaśnym środowisku tłumaczy zmiana jonizacji cząsteczek związku, który wiążąc

dodatkowy proton zmniejszają ładunek zwiększając lipofilność glifosatu i w konsekwencji jego

penetrację przez błony 44. Proponowany mechanizm może wyjaśnić zmniejszoną i przemijającą

odpowiedź mięśniówki jelita czczego w odpowiedzi na glifosat stosowany w roztworze

buforowanym. Charakter obserwowanych zaburzeń mięśniówki (m.in. reakcja dwufazowa)

może sugerować złożony mechanizm działania glifosatu. Na zmienny charakter efektu

toksycznego zwraca uwagę również Mariana wraz z zespołem 41 w badaniach z użyciem

erytrocytów ludzkich: w niskim stężeniu glifosat doprowadzał do podwyższenia aktywności

ATPazy błony komórkowej, podczas gdy w wysokich dawkach doprowadzał do hamowania

aktywności enzymów.

W przebiegu doświadczeń odnotowano dodatkowe zjawiska, które mogą zwiększać

ryzyko zaburzeń motoryki w sytuacji stałego narażenia na glifosat. Wycinki jelita powtórnie

narażone na roztwory glifosatu o tym samym stężeniu (w sposób niekumulacyjny) wykazały

tendencję do zwiększania odpowiedzi skurczowej. W przypadku powtórnego narażeniu na

glifosat w dawce 0,014 g/l siła komponenty skurczowej reakcji była istotnie wyższa w

porównaniu z pierwszym podaniem substancji. Powszechność stosowania pestycydów

zawierających glifosat i stała obecność w związku z tym tej substancji w żywności i wodzie

- 11 -

powoduje duże prawdopodobieństwo wielokrotnego narażenia ludzi, co potwierdzają

wcześniej przytoczone dane dotyczące obecności tej substancji we krwi populacji ogólnej 38,40.

Zagrożenie jest jeszcze większe w przypadku rolników i profesjonalnych operatorów środków

ochrony roślin oraz ich rodzin. Obserwowane nasilenie odpowiedzi mięśniówki może

sugerować, że powtarzająca się (w krótkim czasie) ekspozycja na glifosat może powodować

narastające zaburzenia motoryki, pomimo iż glifosat prawdopodobnie nie kumuluje się w

organizmach zwierzęcych 7,37. Podobne zjawisko narastania toksyczności w wyniku

wielokrotnego narażenia stwierdzono również w przypadku innych herbicydów (np. 2,4 D,

pochodne mocznika), które nie wykazują tendencji do kumulacji w organizmie 45,46. Drugim

ciekawym zjawiskiem, które może nasilać konsekwencje stałego narażenia na glifosat jest

bardzo wyraźny, przemijający skurcz mięśniówki obserwowany bezpośrednio po usunięciu

substancji z komór inkubacyjnych (od 20 do nawet 50% skurczu w odniesieniu do reakcji na

ACh). Powstaje zatem przypuszczenie, że obniżenie stężenia glifosatu w organizmie może

skutkować ujawnianiem się dodatkowego mechanizmu hamowanego wcześniej przez obecność

tej substancji we krwi i tkankach i w rezultacie pojawieniem się przemijającego nasilenia

skurczu mięśniówki jelita.

Prezentowane wyniki były również przedstawiane na konferencji Europejskich

Towarzystw Toksykologicznych i opublikowane w postaci recenzowanych materiałów

indeksowanych w bazie Web od Science (Załącznik 3, II.DD.5; III.B.28).

Po uzyskaniu interesujących wyników dotyczących wpływu czystego glifosatu na

aktywność mięśniówki przewodu pokarmowego, zwróciłam uwagę na wyniki badań in vivo i

in vitro prowadzonych w czasie ostatnich kilkunastu lat, które potwierdziły przypuszczenia

dotyczące wyższej toksyczności handlowych preparatów glifosatowych w porównaniu z

czystym glifosatem 14,17-19,47. Należy również zaznaczyć, że preparaty glifosatowe typu

Roundup są przyczyną poważnych zatruć u ludzi 38,39, pomimo wyników badań rejestracyjnych

wskazujących na niską toksyczność ostrą substancji czynnej względem ssaków. Przypuszcza

się, że zwiększenie toksyczności produktów handlowych może wynikać z obecności tak

zwanych składników obojętnych preparatów herbicydowych czyli składników mieszaniny

innych niż substancja czynna 47-50. Stosowane dotychczas preparaty glifosatowe zawierały

surfaktant zwiększający chwastobójczą aktywność substancji czynnej czyli polietoksylowaną

aminę łojową (polioksyetylenoaminę, POEA). Dane uzyskane w licznych badaniach wskazują

na bardzo wysoką toksyczność POEA dla zwierząt 4,19,50-52 . Pojawiły się również dane

wskazujące na możliwość interakcji pomiędzy glifosatem i POEA 4,53-56. Dlatego też w

- 12 -

kolejnych badaniach postanowiłam ocenić wpływu handlowego preparatu glifosatowego

Roundup i czystej POEA na aktywność motoryczną wycinków jelita czczego. Ważnym

elementem tego etapu badań była również ocena ewentualnych interakcji pomiędzy substancją

czynną i surfaktantem w kontekście oddziaływania na motorykę przewodu pokarmowego.

Najważniejsze wyniki uzyskane w tej części badań przedstawiłam w publikacji:

Chłopecka M., Mendel M., Dziekan N., Karlik W. (2017) The effect of glyphosate-based

herbicide Roundup and its co-formulant, POEA, on the motoric activity of rat intestine –

In vitro study, Environmental Toxicology and Pharmacology, 49, 156-162.

W pierwszej części badań wykorzystałam zbuforowane roztwory preparatu Roundup o

stężeniach substancji czynnej odpowiadającym stężeniom glifosatu stosowanych we

wcześniejszych badaniach. Do doświadczeń użyłam również roztwór Roundupu (1,7 g

glifosatu/l) w postaci niezbuforowanej (pH 6,3). Wykorzystane do doświadczeń roztwory

POEA (800 – 1,28 mg/l) odpowiadały z kolei zawartości surfaktantu w roztworach preparatu

Roundup, a następnie rozszerzyłam zakres dawek surfaktantu w celu uzyskania pierwszego

„nie działającego” stężenia aminy.

Uzyskane wyniki wyraźnie wskazują, że zarówno Roundup, jak również POEA

znacząco zaburzają aktywność motoryczną mięśni gładkich przewodu pokarmowego,

stosowane w szerokim zakresie stężeń. Badania z wykorzystaniem gotowego preparatu

herbicydowego potwierdziły wyniki naszych wcześniejszych doświadczeń z wykorzystaniem

czystego glifosatu wskazujące na możliwość zaburzenia motoryki w dawkach odnoszących się

do stężenia substancji czynnej u osób wykazujących niewielkie objawy zatrucia. Efektywne

stężenia są również są zbliżone do stężeń odnotowywanych w populacji ogólnej narażonej na

pozostałości herbicydu w diecie 38,40. Reakcja wycinków na Roundup wyraźnie różniła się od

reakcji obserwowanej w przypadku czystego glifosatu, przy czym otrzymane wyniki nie

pozwalają na postawienie jednoznacznego wniosku dotyczącego porównania toksyczności

handlowego preparatu i czystej substancji czynnej. Porównując reakcję mięśniówki (siła i

charakter reakcji) uzyskane dane wskazują na nasilenie reakcji relaksacyjnej w przypadku

zastosowania wyższych dawek Roundupu. Z drugiej strony, zastosowanie glifosatu w

preparacie Roundup w niższych stężeniach spowodowało utratę komponenty skurczowej

reakcji i zanik dwufazowości reakcji w porównaniu do reakcji na czysty glifosat.

Na szczególną uwagę zasługują wyniki oceniające toksyczność POEA, z których jasno

wynika, że surfaktant wykazuje bardzo wysoką toksyczność względem mięśniówki przewodu

- 13 -

pokarmowego, która wyraźnie przewyższą toksyczność czystego glifosatu jak i gotowej

formulacji handlowej. Pierwsze istotne zakłócenia spontanicznej czynności motorycznej

wycinków jelita czczego (odpowiedź dwufazowa) obserwowano po zastosowaniu POEA w

bardzo niskim stężeniu wynoszącym zaledwie 0,256 mg/l. Niestety, odniesienie tych wyników

do warunków in vivo jest bardzo trudne ze względu na brak danych toksykokinetycznych dla

tej substancji u ssaków. Biorąc jednak pod uwagę sporadyczne dane uzyskane z analizy

pośmiertnej przypadków zatrucia herbicydami, stężenie POEA we krwi było w tych

przypadkach 1900 razy większe 56 niż najniższe efektywne stężenie prezentowane w

niniejszych badaniach. Co ciekawe, najsilniejszą reakcję mięśniówki wycinków, zarówno w

zakresie komponenty skurczowej jak i relaksacyjnej, stwierdzono po zastosowaniu POEA w

stężeniu 6,4 mg/l, natomiast w obecności wyższych dawek (począwszy od 32 mg/l)

obserwowano wyłącznie silną miorelaksację i postępujące, nieodwracalne zaburzenia

aktywności spontanicznej i reaktywności na ACh, co potwierdza wysoką toksyczność POEA

względem mięśniówki jelita i wskazuje na toksyczne uszkodzenie tkanek.

W kolejnym etapie zbadałam toksyczność niezbuforowanych roztworów preparatu

herbicydowego. Biorąc pod uwagę różnice w charakterze chemicznym najważniejszych

składników preparatu Roundup: glifosatu (kwas) i POEA (słaba zasada) uzyskane wyniki

stanowią mocny argument wskazujący na to, że wraz ze wzrostem pH może dochodzić do

wzrostu udziału POEA w obrazie zaburzeń motoryki przewodu pokarmowego. Nasilona

miorelaksacja wycinków jelita inkubowanych w niebuforowanym roztworze preparatu

Roundup (1,7 g glifosatu/l, pH 6,0) w porównaniu z reakcją wywołaną przez inkubację w

zbuforowanym roztworze herbicydu może potwierdzać zwiększenie aktywności biologicznej

glifosatu w kwaśnym środowisku (analogicznie do wyników badań z czystym glifsatem). Co

ciekawe, wzrost wartości pH roztworu zawierającego 0,34 g glifosatu/L do 6,7 spowodował

odwrócenie tej zależności i silniejsze działanie Roundupu w roztworze zbuforowanym (pH

7,35). Etoksylowane aminy w środowisku kwaśnym występują w postaci kationowej 57,

natomiast wraz ze wzrost pH roztworu i wzrostem liczby niezjonizowanych cząsteczek związki

te zwiększają prawdopodobnie toksyczność poprzez nieswoiste uszkodzenia błon

biologicznych i nasilenie przenikania do komórek 58.

W ostatnim etapie badań skierowałam swoją uwagę na ocenę ewentualnych interakcji

pomiędzy głównymi składnikami preparatu Roundup w oddziaływaniu na aktywność

mięśniówki przewodu pokarmowego. Aby dopełnić tę część badań wykonałam dodatkowe

testy z wykorzystaniem „laboratoryjnego preparatu herbicydowego”: zbuforowanego roztworu

- 14 -

glifosatu (1,7 g/l) i POEA (800 m/l) czyli w proporcjach jak w najniższym rozcieńczeniu

preparatu Roundup wykorzystanym we wcześniejszych badaniach oraz zbuforowanego

roztworu glifosatu (1,7g/l) i POEA w stężeniu „nieefektywnym” (0,051 mg/l).

Otrzymane wyniki wskazują na interakcję pomiędzy glifosatem i POEA w badanym

modelu. Wyraźnie widać, że POEA stosowana w najwyższej dawce (800 mg/l) maskuje

działanie innych składników preparatu Roundup, podczas gdy zastosowanie Roundupu w

niższych stężeniach pozwala zaobserwować antagonistyczne oddziaływanie między

poszczególnymi składnikami mieszaniny. Podsumowując wszystkie wyniki przeprowadzonych

badań, dane potwierdzające antagonistyczną interakcję pomiędzy glifosatem i POEA w

badanym modelu przedstawiają się następująco:

a. efekt toksyczny działania Roundupu jak również „laboratoryjnego preparatu

herbicydowego” na mięśniówkę gładką nie jest sumą efektu toksycznego glifosatu i

POEA, brak również dwufazowego charakteru reakcji w porównaniu z reakcją na czysty

glifosat,

b. całkowita odwracalność reakcji wywołanych przez roztwory preparatu Roundup (o

zawartości 32 i 160 mg POEA/l) w porównaniu z trwałą reakcją mięśniówki po

zastosowaniu czystej POEA w analogicznych dawkach,

c. mniejsza siła reakcji mięśniówki w obecności preparatu Roundup w porównaniu z

reakcją na roztwór POEA w analogicznej dawce; zjawisko antagonizmu pomiędzy

składnikami preparatu herbicydowego jest najwyraźniej widoczne, gdy porównamy

reakcję wycinków inkubowanych w roztworze Roundupu zawierającym odpowiednio

0,014 g glifosatu/l i 6,4 mg POEA/l z reakcją w odpowiedzi na czystą POEA w

analogicznej dawce. Inkubacja w roztworze preparatu handlowego wywoływała jedynie

relaksację, której siła była dwa razy mniejsza niż reakcja mięśniówki w obecności

czystej POEA w analogicznej dawce,

d. obecność POEA w bardzo małym, "nieefektywnym" stężeniu (0,051 mg/g) w roztworze

zmieniła odpowiedź na glifosat (1,7g/l): mięśniówka wycinków reagowała relaksacją

(brak dwufazowości reakcji) i była o 50% mniejsza w porównaniu z reakcją na czysty

glifosat w tej samej dawce.

Dostępne dane literaturowe z ostatnich lat opisujące wyniki badań z wykorzystaniem

różnych modeli wskazują na możliwość interakcji (synergistycznej i antagonistycznej)

pomiędzy glifosatem i POEA, ale również na możliwość braku wzajemnego oddziaływania na

- 15 -

siebie tych substancji 54-56. Prezentowane przeze mnie wyniki, jak również pojawiające się

ostatnio sugestie literaturowe, wskazują, że na ostateczny efekt toksyczny w dużym stopniu

może wpływać stosunek ilościowy pomiędzy glifosatem i surfaktanem, a nie jedynie obecność

tych substancji w roztworze. Jest to niezwykle ważna informacja biorąc pod uwagę różnice w

biologicznym okresie półtrwania tych substancji w środowisku: 2 -70 dni w przypadku glifosatu

i 13-18 godzin do nawet 21-42 dni dla POEA w zależności od warunków

środowiskowych49,59,60. Prezentowane rozbieżności w długości czasu degradacji tych substancji

sugerują, że pozostałości badanych związków obecne w wodzie, żywności lub paszy mogą

pozostawać w zmiennym stosunku stężeń. Konsekwencją może być nie dający się w pełni

przewidzieć efekt toksyczny wynikający z interakcji pomiędzy składnikami preparatu lub

odziaływania pojedynczych substancji preparatu herbicydowego. Wyniki tej części projektu

zostały również zaprezentowane na konferencjach tematycznych (Załącznik 3, III.B.31,46).

Po zakończeniu eksperymentów oceniających kompleksowo toksyczność pestycydu z

grupy herbicydów dla funkcjonowania mięśniówki przewodu pokarmowego podjęłam decyzję

o włączeniu do badań substancji z innej grupy użytkowej pestycydów. Piryproksyfen (PPF) jest

substancją czynną preparatów należących do insektycydów i akarycydów, a zatem docelowym

obiektem ich działania są organizmy zwierzęce. Decyzja o podjęciu badań toksykologicznych

spowodowana była trwającą od 2014 roku w Brazylii akcją wprowadzania preparatów

zawierających tę substancję czynną do zbiorników na wodę pitną i w związku z tym stałym

narażeniem populacji ogólnej. Polecane do stosowania stężenie PPF określają wytyczne

WHO61 na podstawie wyników badań wymaganych przepisami (koniecznych w procesie

zatwierdzania substancji czynnej ) i wynosi ono 0,01 mg/l. Stałe stosowanie PPF w wodzie

pitnej spowodowało zwrócenie uwagi na konieczność poszerzenia danych toksykologicznych

dla tego insektycydu w celu jak najdokładniejszej oceny bezpieczeństwa. Wyniki tej części

badań przedstawiłam w pracy:

Chłopecka M., Mendel M., Dziekan N., Karlik W. (2018). The effect of pyriproxyfen on

the motoric activity of rat intestine - In vitro study. Environmental Pollution, 241, 1146-

1152.

Do badań wykorzystałam roztwory PPF w zakresie stężeń 0,032 mM (0,01 mg/l) - 100

mM. Zbadałam wpływ PPF na aktywność spontaniczną wycinków przewodu pokarmowego

oraz reakcję mięśniówki na ACh w dwóch schematach, które sprawdzały: a) wpływ PPF na

skurcz mięśniówki wywołany uprzednio podaniem ACh oraz b) wpływ preinkubacji w

- 16 -

roztworach PPF na reaktywność mięśniówki wycinków na ACh. Badania wykonałam z

użyciem izolowanych wycinków dwunastnicy i jelita czczego.

Inkubacja w roztworach PPF znacząco zaburzała aktywność motoryczną wycinków, a

obserwowana reakcja miała charakter relaksacji i była zależna od dawki. Warto podkreślić, że

przeprowadzone badania ujawniły bardzo dużą różnicę we wrażliwości wycinków

pochodzących z różnych części przewodu pokarmowego: pierwsze istotne zaburzenia

aktywności spontanicznej i reaktywności mięśniówki dwunastnicy pojawiły się w obecności

PPF w stężeniu 125 razy niższym niż w przypadku jelita czczego. Zaburzenia aktywności

wycinków dwunastnicy miały charakter odwracalny (z wyjątkiem najwyższej zastosowanej

dawki) co świadczy o tym, iż relaksacja wywołana przez PPF nie wynikała z trwałego

hamowania mechanizmów fizjologicznych ani trwałego wiązania insektycydu do struktur

zewnątrz- lub wewnątrzkomórkowych.

Uzyskane wyniki mogą wskazywać na możliwość interakcji PPF z jelitowych szlakiem

cholinergicznym związanym z postsynaptycznym mechanizmem charakterystycznym dla

egzogennych agonistów receptorów muskarynowych 62,63. Wskazuje na to przede wszystkim

możliwość bardzo szybkiego hamowania poacetylocholinowego skurczu mięśniówki

wycinków: podanie PPF natychmiast po pojawieniu się skurczu wywołanego przez substancję

referencyjną istotnie hamuje tę reakcję (w zakresie stężeń od 0,8 do 100 µM). Warto podkreślić,

że zmiana schematu doświadczenia polegająca na wcześniejszej preinkubacji wycinków w PPF

przed podaniem ACh skutkowała istotnym zmniejszeniem siły skurczu już w obecności PPF w

stężeniu pięć razy mniejszym (0,16 mM) niż we wcześniejszym doświadczeniu. Wyniki te

mogą wskazywać, że preinkubacja w obecności PPF pozwala na ujawnienie innych,

dodatkowych mechanizmów hamujących skurcz mięśniówki związanych ze szlakami

cholinergicznymi. W dalszych planach badawczych należy rozważyć ocenę m.in. udziału

komórek Cajala (ICC) obecnych w splotach śródmięśniowych i zależnych od stymulacji

cholinergicznej jak również zaangażowanie mechanizmów wewnątrzkomórkowych

indukowanych przez receptory muskarynowe 64.

Bardzo interesujące i jednocześnie trudne do wytłumaczenia są wspomniane wcześniej

wyniki wskazujące na wyjątkową oporność wycinków jelita czczego na działanie PPF. Wyniki

te potwierdzają konieczność przeprowadzania eksperymentów z użyciem wycinków

pochodzących z różnych części przewodu pokarmowego. Wiadomo, iż pomiędzy

poszczególnymi odcinkami przewodu pokarmowego występują znaczące różnice dotyczące

- 17 -

szlaków neuronalnych (w tym ich neurochemicznych właściwości)65, niemniej jednak nie

stanowi to wystarczającego wyjaśnienia dla zaobserwowanych tak dużych różnic we

wrażliwości dwunastnicy i jelita czczego na działanie PPF.

Bardzo ważnym aspektem prezentowanych badań jest to, iż stężenia PPF, które istotnie

zaburzały aktywność mięśniówki wycinków dwunastnicy są znacznie niższe niż dawki

insektycydu wywołujące efekt toksyczny w przypadku innych modeli badawczych

wykorzystujących komórki 22,23 oraz zarodki danio pręgowanego 24,27. W niektórych

przypadkach efektywne stężenia PPF prezentowane w naszych doświadczeniach były nawet

1100 razy niższe niż w przypadku badań wykorzystujących modele komórkowe 22. Różnice te

mogą sugerować większą wrażliwość i wiarygodność modeli narządowych w badaniach in

vitro, ale mogą również wynikać z różnic we wrażliwości ocenianych mechanizmów

biologicznych zakłócanych przez PPF.

Szczególną uwagę należy zwrócić na trudności w interpretacji otrzymanych wyników.

W przeprowadzanych ostatnio badaniach neurorozwojowych 24 autorzy dokonali wyboru

testowanych stężeń PPF, jak również przeprowadzili analizę wyników, w oparciu o stężenia

insektycydu zalecane do stosowania w wodzie pitnej 62. Nasze badania wykazały, iż pierwsze

znaczące zaburzenia reaktywności mięśniówki dwunastnicy pojawiały się w obecności PPF w

stężeniu tylko około pięć razy większym niż normy zalecane przez WHO. PPF jest substancją

bardzo lipofilną, łatwo przenikającą przez błony, co może sprzyjać kumulacji w organizmie.

Jednakże nieliczne dostępne dane kinetyczne z badań na ssakach wskazują na stosunkowo

szybkie wydalanie PPF z organizmu 21. W tym kontekście uzyskane przez nas efektywne dawki

PPF wydają się być stosunkowo wysokie. Należy jednak podkreślić, że biorąc pod uwagę

ekstrapolacyjne możliwości modelu izolowanych wycinków przewodu pokarmowego, pełna

interpretacja wyników będzie możliwa dopiero po zebraniu danych epidemiologicznych w

populacji ludzi stale narażonych na PPF. Dane te powinny uwzględniać wyniki stałego

monitoringu rzeczywistego stężenia insektycydu w wodzie pitnej oraz szeroką analizę stężeń

PPF we krwi osób w populacjach długotrwale narażonych. Omówione wyniki zostały również

zaprezentowane na konferencji Polskiego Towarzystwa Toksykologicznego w 2017 roku

(Załącznik 3, III.B.51).

Podsumowanie

- 18 -

Prowadzone przeze mnie prace doświadczalne obejmujące osiągnięcie naukowe

pozwoliły w pełni zrealizować postawione cele badawcze, a uzyskane wyniki wskazują, że:

a. Glifosat, jego handlowy preparat Roundup oraz POEA wyraźnie zaburzają aktywność

motoryczną mięśniówki przewodu pokarmowego szczura w warunkach in vitro.

b. Pierwsze zaburzenia aktywności mięśniówki wycinków jelita czczego pojawiają się po

zastosowaniu glifosatu (również w postaci preparatu Roundup) w stężeniach, które

korespondują ze stężeniami tej substancji we krwi osób w populacji ogólnej (nie

wykazujących objawów klinicznych zatrucia), co wskazuje na to, iż stałe narażenie na

pozostałości tych herbicydów w diecie może być jednym z czynników powszechnych

obecnie zburzeń perystaltyki przewodu pokarmowego.

c. Reakcja mięśniówki na glifosat ma charakter dwufazowy (skurcz i relaksacja

mięśniówki w przebiegu jednej reakcji), co sugeruje złożony mechanizm działania tej

substancji. Wskazuje na to również nasilenie reakcji mięśniówki po ponownym

(niekumulacyjnym) narażeniu na glifosat w tej samej dawce oraz pojawienie się silnego

skurczu po usunięciu substancji z układu badanego.

d. Reakcja mięśniówki przewodu pokarmowego w odpowiedzi na Roundup wyraźnie różni

się od reakcji obserwowanej po podaniu czystego glifosatu, przy czym interpretacja

danych porównujących toksyczność substancji czynnej i preparatu nie daje

jednoznacznych wniosków i jest zależna od zastosowanej dawki.

e. POEA wpływa bardzo silnie na aktywność motoryczną jelita czczego, a jej toksyczność

przewyższa znacząco toksyczność glifosatu i preparatu Roundup.

f. Istnieje wyraźna interakcja antagonistyczna pomiędzy między glifosatem i surfaktantem

w odniesieniu do działania na aktywność mięśniówki przewodu pokarmowego.

g. PPF wyraźnie zaburza aktywność motoryczną izolowanych wycinków przewodu

pokarmowego szczura, zarówno w przypadku wpływu na aktywność spontaniczną

mięśniówki jak i reakcji na ACh, co sugeruje wpływ insektycydu na jelitowy szlak

cholinergiczny.

h. Istnieją bardzo znaczące różnice we wrażliwości wycinków pochodzących z różnych

części przewodu pokarmowego na toksyczne działanie PPF. Wycinki dwunastnicy

cechuje dużo wyższa wrażliwość w odpowiedzi na insektycyd w porównaniu z jelitem

czczym.

i. Biorąc pod uwagę nieliczne dane kinetyczne PPF uzyskane u zwierząt, obserwowane

zaburzenia pojawiają się podczas inkubacji w relatywnie wysokich stężeniach

- 19 -

insektycydu, przy czym do prawidłowej interpretacji wyników i pełnej oceny niezbędne

są dane kinetyczne ludzi narażonych długoterminowo na tę substancję.

j. Wykorzystany do badań model cechuje niezwykła czułość, co może wskazywać na

lepszą przydatność i wiarygodność modeli tkankowych i narządowych do badania

skutków działania pestycydów na organizmy ssaków w porównaniu z modelami

komórkowymi.

k. Uzyskane wyniki wskazują jednoznacznie na przydatność izolowanych wycinków

przewodu pokarmowego szczura do badań oceniających wpływ pestycydów na

aktywność motoryczną przewodu pokarmowego.

Przedstawione wyniki stanowią bardzo istotny wkład w rozwój dyscyplin związanych

z obszarem badań toksykologicznych wykorzystujących metody alternatywne do klasycznych

badań na zwierzętach. Omawiane badania mają charakter pionierski w obszarze badań

toksyczności pestycydów. Uzyskane wyniki potwierdzają bowiem możliwość wykorzystania

metod in vitro do oceny efektu toksycznego działania różnych substancji na kurczliwość

przewodu pokarmowego, co może znacząco przyspieszyć badania toksykologiczne dzięki

właściwemu ukierunkowaniu przebiegu analiz już na etapie badań wstępnych. Kompleksowość

uzyskanych wyników, ich wiarygodność toksykologiczna i możliwości ekstrapolacyjne

wskazują jasno, że podjęte przeze mnie badania pozwoliły na stworzenie unikatowego w skali

światowej ośrodka oceniającego toksyczność pestycydów w odniesieniu do aktywności

mięśniówki gładkiej przewodu pokarmowego, w którym zarówno narażenie na badany

pestycyd jak i ocena efektów jej działania odbywają się w warunkach in vitro.

Biorąc pod uwagę zastosowany gatunek zwierzęcia (szczur) oraz zasady ekstrapolacji

wyników na warunki in vivo w zastosowanym modelu, uzyskane wyniki stanowią istotny wkład

w ocenę ryzyka narażenia człowieka na objęte badaniami pestycydy. Zastosowany model

badawczy pozwolił na ujawnienie nowych, często subtelnych i przemijających efektów, które

pozostają nieuchwytne w klasycznych badaniach na zwierzętach, a które mogą stanowić ważną

przyczynę stałych zaburzeń motoryki przewodu pokarmowego. Ma to szczególne znaczenie,

jeśli weźmiemy pod uwagę jak duże jest ryzyko jednoczesnego narażenia populacji ogólnej na

różne substancje mające zdolność zaburzania aktywności mięśniówki gładkiej (pozostałości

ksenobiotyków w wodzie i żywności, stosowane leki i suplementy) oraz innych czynników

takich jak np. stres. Przedstawione wyniki dają ponadto silne argumenty do rozwoju dalszych

ważnych kierunków badawczych obejmujących m.in. zjawisko interakcji pomiędzy różnymi

- 20 -

pestycydami oraz innymi ksenobiotykami w kontekście oddziaływania na aktywność

mięśniówki gładkiej. Ważnym, podjętym już przeze mnie i stale rozwijanym, kierunkiem

badawczym są doświadczenia oceniające mechanizm działania pestycydów na komórki mięśni

gładkich przewodu pokarmowego, których wyniki mogą być kluczowe dla opracowywania

najbardziej skutecznych metod terapii zatruć tymi związkami jak również pozwolą na

zrozumienie mechanizmów powstawania interakcji z innymi substancjami.

Dodatkowym, niezwykle ważnym aspektem przedstawionego osiągnięcia jest fakt, iż

uzyskane wyniki wypełniają wyraźnie wytyczne Komisji Europejskiej dotyczące

bezpieczeństwa chemicznego w obszarze oceny toksykologicznej substancji czynnych oraz

preparatów pestycydowych. Wytyczne te nakładają obowiązek oceny wszystkich dostępnych

danych toksykologicznych pochodzących z różnych źródeł. Oznacza to, że oprócz

obowiązkowego standardowego zestawu badań bezpieczeństwa wykonywanych na wniosek

aplikantów wprowadzających dany produkt na rynek, istnieje konieczność oceny danych

znajdujących się w otwartej literaturze naukowej. Tylko takie podejście zapewnia spójną i

obiektywną ocenę toksykologiczną wprowadzanych na rynki preparatów pestycydowych 3.

W tym kontekście duże znaczenie mają pojawiające się w ostatnim czasie, chociaż

jeszcze bardzo nieliczne, nowe badania dotyczące potencjalnych oddziaływań PPF na

organizmy zwierzęce. Stosowanie środka owadobójczego w wodzie pitnej to absolutnie

bezprecedensowa akcja w skali światowej stanowiąca nowe i poważne wyzwanie dla

toksykologii. Prezentowane przeze mnie dane wskazują na konieczność zbierania danych

toksykologicznych w warunkach in vivo, które poprzez stały i długotrwały monitoring

narażenia populacji pozwoli uzyskać profil kinetyczny tego insektycydu u człowieka i

następnie w pełni ocenić dane pozyskiwane z użyciem innych modeli badawczych. Dane te

wydają się kluczowe w analizie ryzyka, szczególnie jeśli uwzględnimy pojawiające się ostatnio

bardzo niepokojące doniesienia wskazujące na znacznie wyższe realne narażenie na PPF

stosowany w wodzie pitnej 27 oraz możliwość silnej interakcji synergistycznej PPF z innymi

pestycydami 22.

Odzwierciedleniem prezentowanego przez Komisję Europejską podejścia są również

wyniki ostatniego przeglądu glifosatu, który zakończył się zatwierdzeniem tej substancji

czynnej 12 grudnia 2017 r. na okres tylko 5 lat 66. Biorąc pod uwagę bardzo intensywne badania

prowadzone w różnych zespołach badawczych na różnych modelach doświadczalnych,

pozwoli to na ponowny przegląd danych toksykologicznych dla tej substancji i podjęcie

- 21 -

decyzji, czy spełnia ona kryteria dopuszczające ją do stosowania w preparatach

herbicydowych1. Wymiernym efektem wszystkich danych toksykologicznych z ostatnich lat są

aktualnie ustanowione warunki dopuszczenia glifosatu nakładające obowiązek wprowadzenia

środków zmniejszających ryzyko narażenia i ograniczających obszar stosowania tych

preparatów herbicydowych. Niezwykle ważnym zapisem tego rozporządzenia, w które wpisują

się również wyniki prezentowanych przeze mnie badań, jest zakaz stosowania POEA jako

składnika herbicydów glifosatowych, jako najbardziej toksycznego składnika tych

preparatów66.

Dodatkowe badania powiązane z tematyką osiągnięcia naukowego:

Biorąc pod uwagę możliwość różnic we wrażliwości wycinków pochodzących z

różnych części przewodu pokarmowego w odpowiedzi na działanie ksenobiotyków,

wykonałam również badania oceniające wpływ glifosatu i Roundupu na aktywność motoryczną

wycinków dwunastnicy. Otrzymane wyniki ujawniły pewne różnice dotyczące charakteru i siły

reakcji mięśniówki dwunastnicy w porównaniu z wycinkami jelita czczego, przy czym nie były

one tak silnie wyrażone ja w przypadku ocenianego w późniejszych badaniach PPF. Wyniki

zostały przedstawione na konferencji tematycznej (III.B.38).

Oczywistą kontynuacją badań było rozpoczęcie doświadczeń oceniających mechanizm

działania glifosatu z wykorzystaniem antagonistów receptorów i kanałów błonowych oraz

wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych. Wstępne wyniki zostały już zaprezentowane na

konferencjach oraz opublikowane w recenzowanych materiałach konferencyjnych

uwzględnionych w bazie Web of Science (II.DD.6; III.B.32). Zakończone prace nad oceną

mechanizmu działania glifosatu są na etapie przygotowania manuskryptu do publikacji.

Piśmiennictwo

1. DYREKTYWA PARLAMENTU EUROPEJSKIEGO I RADY 2009/128/WE z dnia 21

października 2009 r. ustanawiająca ramy wspólnotowego działania na rzecz

zrównoważonego stosowania pestycydów, Dz.U. UE L309/71 z dnia 24.11.2009.

2. KOMUNIKAT KOMISJI 372 Strategia tematyczna w sprawie zrównoważonego

stosowania pestycydów, wersja ostateczna, 2006, Bruksela.

3. KOMUNIKAT KOMISJI C 8414 dotyczący europejskiej inicjatywy obywatelskiej „Zakaz

stosowania glifosatu i ochrona ludzi i środowiska przed toksycznymi pestycydami” , wersja

ostateczna, 2017, Strasburg.

4. Mesnage, R., Defarge, N., Spiroux de Vendômois, J., Séralini, G.E., 2015. Potential toxic

effects of glyphosate and its commercial formulations below regulatory limits. Food Chem.

Toxicol. 84, 133–153

- 22 -

5. Dill M.G., Sammons R.D., Feng P.C.C., Kohn F., Kretzmer K., Mehrsheikh A., Bleeke M.,

Honedder J.L., Farmer D., Wright D., Haupfear E.A., 2010. Glyphosate: discovery,

development, applications, and properties, in: V.K. Nandula (Ed.), Glyphosate Resistance

in Crops and Leeds: History, Development, and Management, John Wiley and Sons Inc,

Hoboken, 1–33.

6. Burgat V., Keck G., Guerre P., Bigorre V., Pineau X., 1998. Glyphosate toxicosis in

domestic animals: a survey from the data of the Centre National d’Informations

Toxicologique Veterinaires (CNITV), Vet. Hum. Toxicol. 40, 363–367.

7. Williams G.M., Kroes R., Munro I.C., 2000. Safety evaluation and risk assessment of the

herbicide Roundup and its active ingredient, glyphosate, for humans, Regul. Toxicol.

Pharmacol. 31, 117–165.

8. Bernya P., Calonib F., Croubelsc S., Sachanad M., Vandenbrouckec V., Davanzo F., Guitart

R., 2010. Animal poisoning in Europe. Part 2: Companion animals, Vet. J .183, 255–259.

9. Bradberry S.M., Proudfoot A.T., Vale J.A., 2004. Glyphosate poisoning, Toxicol. Rev. 23,

159–167.

10. Jasper R., Locatelli G.O., Pilati C., Locatelli C. 2012. Evaluation of biochemical,

hematological and oxidative parameters in mice exposed to the herbicide glyphosate-

Roundup, Interdiscip. Toxicol. 5, 133–140.

11. Lajmanovich R.C., Attademo A.M., Peltzer P.M., Junges C.M., Cabagna M.C., 2011.

Toxicity of four herbicide formulations with glyphosate on Rhinella arenarum (Anura:

Bufonidae) tadpoles: B-esterases and glutathione S-transferase inhibitors, Arch. Environ.

Contam. Toxicol. 60, 681–689.

12. Marc J., Mulner-Lorillon O., Bellé R., 2004. Glyphosate-based pesticides affect cell cycle

regulation, Biol. Cell . 96, 245–249.

13. Modesto K.A., Martinez C.B.R., 2010. Effects of Roundup Transorb on fish: Hematology,

antioxidant defenses and acetylcholinesterase activity, Chemosphere 81, 781–787.

14. Richard S., Moslemi S., Sipahutar H., Benachour N., Seralini G.E., 2005. Differential

effects of glyphosate and Roundup on human placental cells and aromatase, Environ. Health

Perspect. 113, 716–720.

15. Talbot A.R., Shiaw M.H., Huang J.S., Yang S.F., Goo T.S., Wasng S.H., Chien C.L.,

Sanford T.R., 1991. Acute poisoning with a glyphosate-surfactant herbicide (Roundup): a

review of 93 cases, Hum. Exp. Toxicol. 10, 1–8.

16. Thongprakaisang S., Thiantanawat A., Rangkadilok N., Suriyo T., Satayavivad J., 2013.

Glyphosate induces human breast cancer cells growth via estrogen receptors, Food Chem.

Toxicol. 59, 129–136.

17. Contardo-Jara, V., Klingelmann, E., Wiegand, C., 2009. Bioaccumulation of glyphosate

and its formulation Roundup Ultra in Lumbriculus variegatus and its effects on

biotransformation and antioxidant enzymes. Environ. Pollut. 157, 57–63.

18. El-Shenawy, N.S., 2009. Oxidative stress responses of rats exposed to Roundup and its

active ingredient glyphosate. Environ. Toxicol. Pharmacol. 28, 379–385.

19. Howe, C.M., Berrill, M., Pauli, B.D., Helbing, C.C., Werry, K., Veldhoen, N., 2004.

Toxicity of glyphosate-based pesticides to four North American frog species. Environ.

Toxicol. Chem. 23, 1928–1938.

20. (EFSA) European Food Safety Authority, 2009. Conclusion on pesticide peer review

regarding the risk assessment of the active substance pyriproxyfen. Sci. Rep. 336, 1-99.

21. Assessment Report, 2012. Pyriproxyfen, Product-type 18.

http://dissemination.echa.europa.eu/Biocides/ActiveSubstances/0061-

18/006118_Assessment_Report.pdf.

- 23 -

22. Manabe, M., Kanda, S., Fukunaga, K., Tsubura, A., Nishiyama, T., 2006. Evaluation of the

estrogenic activities of some pesticides and their combinations using MtT/Se cell

proliferation assay. Int. J. Hyg Environ. Health. 209, 413-421.

23. Bayoumi, A.E., Pérez-Pertejo, Y., Zidan, H.Z., Balaña-Fouce, R., Ordóñez, C.,Oróñez, D.,

2003. Cytotoxic effects of two antimolting insecticides in mammalian CHO-K1 cells.

Ecotoxicol. Environ. Saf. 55, 19-23.

24. Dzieciolowska, S., Larroque, A.L., Kranjec, E.A., Drapeau, P., Samarut, E., 2017. The

larvicide pyriproxyfen blamed during the Zika virus outbreak does not cause microcephaly

in zebrafish embryos. Sci. Rep. 7, 40067.

25. Sharmin, T., Satho, T., Irie, K., Watanabe, M., Hosokawa, M., Hiramatsu, Y., Talukder, P.,

Okuno, T., Tsuruda, S., Uyeda, S., Fukmits, Y., Tamura, Y., Nakashima, Y., Imoto, M.,

Toda, A., Kashige, N., Miake, F., 2013. Pyriproxyfen enhances the immunoglobulin G

immune response in mice. Microbiol. Immunol. 57, 316-322.

26. SWETOX - Swedish Toxicology Science Research Center, 2016. Pyriproxyfen and

Microcephaly: an Investigation of Potential Ties to the Ongoing “Zika Epidemic” (Report

from a working group).

27. Truong, L., Gonnerman, G., Simonich, M.T., Tanguay, R.L., 2016. Assessment of the

developmental and neurotoxicity of the mosquito control larvicide, pyriproxyfen, using

embryonic zebrafish. Environ. Pollut. 218, 1089-1093.

28. Ministerstwo Zdrowia Brazylii, 2014. Orientações técnica para utilização do larvicida

pyriproxyfen (0,5 G) no controle de Aedes aegypti

http://portalsaude.saude.gov.br/images/pdf/2014/julho/15/Instrue–es-para-uso-de-

pyriproxifen-maio-2014.pdf. dostęp: 22.02.2018.

29. Drossman, D.A., 2016. Functional Gastrointestinal Disorders: History, Pathophysiology,

Clinical Features and Rome IV. Gastroenterology 150, 1262-1279.

30. Ceregrzyn, M., Ozaki, T., Kuwahara, A.,Wiechetek, M., 1998. Sodium nitrite, a potent

relaxant of rat stomach fundus: in vitro evidence. Can. J. Physiol. Pharmacol. 76, 989-999.

31. Escalante, J., McQuade, R.M., Stojanovska, V., Nurgali, K., 2017. Impact of chemotherapy

on gastrointestinal functions and the enteric nervous system. Maturitas 105, 23-29.

32. Izzo, A.A., Mascolo, N., Maiolino, P., Capasso, F., 1996. Nitric oxide-donating compounds

and cyclic GMP depress the spontaneous contractile activity of the isolated rabbit jejunum.

Pharmacology 53, 109-113.

33. Rocha, B.S., Gago, B., Barbosa, R.M., Cavaleiro, C., Laranjinha, J., 2015. Ethyl nitrite is

produced in the human stomach from dietary nitrate and ethanol, releasing nitric oxide at

physiological pH: potential impact on gastric motility. Free Radic. Biol. Med. 82, 160-166.

34. ROZPORZĄDZENIE (WE) NR 1907/2006 PARLAMENTU EUROPEJSKIEGO I RADY

z dnia 18 grudnia 2006 r. w sprawie rejestracji, oceny, udzielania zezwoleń i stosowanych

ograniczeń w zakresie chemikaliów (REACH), Dz.U. UE L 396 z dnia 30.12.2006.

35. ROZPORZĄDZENIA ROZPORZĄDZENIE PARLAMENTU EUROPEJSKIEGO I

RADY (WE) NR 1272/2008 z dnia 16 grudnia 2008 r. w sprawie klasyfikacji, oznakowania

i pakowania substancji i mieszanin, zmieniające i uchylające dyrektywy 67/548/EWG i

1999/45/WE oraz zmieniające rozporządzenie (WE) nr 1907/2006, Dz.U. UE L 353/1 z

dnia 31.12.2008.

36. DYREKTYWA PARLAMENTU EUROPEJSKIEGO I RADY 2010/63/UE z dnia 22

września 2010 r. w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych.

Dz.U. UE L 276/33 z dnia 20.10.2010.

37. Brewster D.W., Warren J., Hopkins W.E. 2nd, 1991. Metabolism of glyphosate in Sprague-

Dawley rats: tissue distribution, identification, and quantitation of glyphosate-derived

materials following a single oral dose, Fundam. Appl. Toxicol. 17, 43–51.

- 24 -

38. Roberts D.M., Buckley N.A., Mohamed F., Eddleston M., Goldstein D.A., Mehrsheikh A.,

Bleeke M.S., Dawson A.H., 2010. A prospective observational study of the clinical

toxicology of glyphosate-containing herbicides in adults with acute self-poisoning, Clin.

Toxicol. (Phila.) 48, 129–136.

39. Stella, J., Ryan, M., 2004. Glyphosate herbicide formulation: a potentially lethal ingestion.

Emerg. Med. Aust. 16, 235–239.

40. Aris A., Leblanc S., 2011. Maternal and fetal exposure to pesticides associated to

genetically modified foods in Eastern Townships of Quebec, Can. Reprod. Toxicol. 31,

528–533.

41. Mariana A., de Alaniz M.J.T., Marra C.A., 2009. The impact of simultaneous intoxication

with agrochemicals on the antioxidant defense system in rat, Pestic. Biochem. Physiol. 94,

93–99.

42. Hedberg D., Wallin M., 2010. Effects of Roundup and glyphosate formulations on

intracellular transport, microtubules and actin filaments in Xenopus laevis melanophores,

Toxicol. In Vitro 24, 795–802.

43. Mollin W., Hirase K., 2004. Comparison of commercial glyphosate formulations for control

of prickly sida, purple nutsedge, morningglory and sicklepod, Weed Biol. Manag. 4, 136–

141.

44. Chamberlain K., Evans A.A., Bromilow R.H., 1996. 1-Octanol/water partition coefficient

(Kow) and pKa for ionisable pesticides measured by a pH-metric method, Pestic. Sci. 47,

256–271.

45. Gupta P.K., 2007. Toxicity of herbicides, in: P.K. Gupta (Ed.), Veterinary Toxicology,

Elsevier, New York, 567–586.

46. Hapke H.J., 1975. Toxikologie für Veterinärmediziner, Ferdinand Enke Verlag, Stuttgart.

47. Mesnage, R., Defarge, N., Spiroux de Vendômois, J., Séralini, G.E., 2014. Major pesticides

are more toxic to human cells than their declared active principles. Biomed. Res. Int. 2014,

179691.

48. Brausch, J.M., Beall, B., Smith, P.N., 2007. Acute and sub-lethal toxicity of three POEA

surfactant formulations to daphnia magna. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 78, 510–514.

49. Mann, R.M., Hyne, R.V., Choung, C.B., Wilson, S.P., 2009. Amphibians andagricultural

chemicals: review of the risks in a complex environment. Environ.Pollut. 157, 2903–2927.

50. Moore, L.J., Fuentes, L., Rodgers Jr., J.H., Bowerman, W.W., Yarrow, G.K., Chao, W.Y.,

Bridges Jr., W.C., 2012. Relative toxicity of the components of the original formulation of

Roundup to five North American anurans. Ecotoxicol. Environ.Saf. 78, 128–133.

51. Seok, S.J., Park, J.S., Hong, J.R., Gil, H.W., Yang, J.O., Lee, E.Y., Song, H.Y., Hong, S.Y.,

2011. Surfactant volume is an essential element in human toxicity in acute glyphosate

herbicide intoxication. Clin. Toxicol. (Phila) 49, 892–899.

52. Tsui, M.T., Chu, L.M., 2003. Aquatic toxicity of glyphosate-based formulations:

comparison between different organisms and the effects of environmental factors.

Chemosphere 52 (7), 1189–1197.

53. Benachour, N., Séralini, G.E., 2009. Glyphosate formulations induce apoptosis andnecrosis

in human umbilical, embryonic, and placental cells. Chem. Res.Toxicol. 22, 97–105.

54. Guilherme, S., Santos, M.A., Barroso, C., Gaivão, I., Pacheco, M., 2012. Differentia l

genotoxicity of Roundup(®) formulation and its constituents in blood cells offish (Anguilla

anguilla): considerations on chemical interactions and DNA damaging mechanisms.

Ecotoxicology 21, 1381–1390.

55. Kim, Y.H., Hong, J.R., Gil, H.W., Song, H.Y., Hong, S.Y., 2013. Mixtures of glyphosate

and surfactant TN20 accelerate cell death via mitochondrial damage-induced apoptosis and

necrosis. Toxicol. In Vitro 27, 191–197.

- 25 -

56. Song, H.Y., Kim, Y.H., Seok, S.J., Gil, H.W., Hong, S.Y., 2012a. In vitro cytotoxic effect

of glyphosate mixture containing surfactants. J. Korean Med. Sci. 27,711–715.

57. Cullum, D.C., 1994. Surfactant types; classification, identification. W: Cullum, D.C.(Ed.),

Separation, in Introduction to Surfactant Analysis. Springer Science+Business Media

Dordrecht, 17–41.

58. Schüürmann, G., 1990. Quantitative structure-property relationships for the polarizability,

solvatochromic parameters and lipophilicity. Quant. Struct.-Act.Relat. 9, 326–333.

59. Giesy, J.P., Dobson, S., Solomon, K.R., 2000. Ecotoxicological risk assessment for

Roundup herbicide. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 167, 35–120.

60. Wang, N., Besser, J.M., Buckler, D.R., Honegger, J.L., Ingersoll, C.G., Johnson,

B.T.,Kurtzweil, M.L., Macgregor, J., McKee, M.J., 2005. Influence of sediment on the fate

and toxicity of a polyethoxylated tallow amine surfactant system (MON0818) in aquatic

microcosms. Chemosphere 59, 545–551.

61. (WHO), World Health Organization, 2008. Pyriproxyfen in Drinking-water: Use for Vector

Control in Drinking-water Sources and Containers.

62. Unno, T., Matsuyama, H., Izumi, Y., Yamada, M., Wess, J., Komori, S., 2006. Roles of M2

and M3 muscarinic receptors in cholinergic nerve-induced contractions in mouse ileum

studied with receptor knockout mice. Br. J. Pharmacol. 149, 1022-1030.

63. Zhu, M.H., Sung, I.K., Zheng, H., Sung, T.S., Britton, F.C., O'Driscoll, K., Koh, S.D.,

Sanders, K.M., 2011. Muscarinic activation of Ca2+activated Cl- current in interstitial cells

of Cajal. J. Physiol. 589, 4565-4582.

64. Tobin, G., Giglio, D., Lundgren, O., 2009. Muscarinic receptor subtypes in the alimentary

tract. J. Physiol. Pharmacol. 60, 3-21.

65. Costa, M., Brookes, S.J., Hennig, G.W., 2000. Anatomy and physiology of the enteric

nervous system. Gut 47, 15-19.

66. ROZPORZĄDZENIE WYKONAWCZE KOMISJI (UE) 2017/2324 z dnia 12 grudnia

2017 r. w sprawie odnowienia zatwierdzenia substancji czynnej glifosat, zgodnie z

rozporządzeniem Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 1107/2009 dotyczącym

wprowadzania do obrotu środków ochrony roślin, oraz w sprawie zmiany załącznika do

rozporządzenia wykonawczego Komisji (UE) nr 540/2011, Dz.U. UE L333/10 z dnia

15.12.2017.

- 26 -

5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo-badawczych

a) Osiągnięcia naukowo-badawcze przed osiągnięciem stopnia doktora

Udział w zajęciach z przedmiotu „Toksykologia i Ochrona Środowiska” w roku

akademickim 1996/1997 był tym momentem w czasie studiów na Wydziale Medycyny

Weterynaryjnej, który zdeterminował całą moją dalszą ścieżkę zawodową. Bezpośrednio po

zdaniu egzaminu przedmiotowego, rozpoczęłam staż przedasystencki w Katedrze Farmakologii

i Toksykologii Wydziału Medycyny Weterynaryjnego w Warszawie po opieką prof. dr hab.

Marii Wiechetek. W tym czasie, będąc jednocześnie członkiem sekcji Toksykologicznej Koła

Medyków Weterynaryjnych, brałam udział w badaniach prowadzonych w Katedrze przez

członków zespołu. Jednym z kierunków badawczych prowadzonym w tamtym okresie była

ocena wpływu przeazotowania środowiska na zdrowie zwierząt i ludzi. W ramach tych badań

brałam czynny udział w pierwszych doświadczeniach z użyciem izolowanych wycinków

przewodu pokarmowego szczura, w których oceniano wpływ azotynu sodu na aktywność

motoryczną. Badania te wykazały, że azotyn sodu wyraźnie zaburza aktywność motoryczną

mięśniówki wycinków, a w mechanizmie tych zaburzeń może brać udział cyklaza guanylowa.

Wyniki prac zostały zaprezentowane w ramach Przeglądu Dorobku Kół Naukowych Szkoły

Głównej Gospodarstwa Wiejskiego (praca została nagrodzona I Nagrodą J.M. Rektora SGGW)

oraz na konferencji międzynarodowej (Załącznik 3, III.B.1,3).

Brałam również udział w pracach nad stworzeniem ankiety toksykologicznej

skierowanej do lekarzy weterynarii dotyczącej przypadków zatruć, z którymi spotykają się w

swojej praktyce. Wyniki ankiety miały stanowić podstawę rozpoczęcia prac nad stworzeniem

weterynaryjnej bazy toksykologicznej z centrum informacji toksykologicznej dla lekarzy

weterynarii. Wyniki prac nad ankietą były również zaprezentowane w czasie Przeglądu

Dorobku Kół Naukowych SGGW (Załącznik 3, III.B.2).

W tym czasie odbyłam również staż toksykologiczny (2 tygodnie) w Stołecznym

Ośrodku Ostrych Zatruć przy Szpitalu Praskim w Warszawie, w czasie którego zapoznałam się

z zasadami funkcjonowania Centrum Informacji Toksykologicznej.

W czasie stażu przedasystenckiego uczestniczyłam w kursie dotyczącym możliwości

stosowania alternatywnych metod badawczych w toksykologii "Nowoczesne metody oceny

toksyczności substancji chemicznych" (4 dni ), 1997 organizowanym przez Instytut Medycyny

Pracy w Łodzi.

- 27 -

Po zakończeniu studiów w 1999 roku rozpoczęłam pracę w Katedrze, a następnie

Zakładzie Farmakologii i Toksykologii Wydziału Medycyny Weterynaryjnej w Warszawie na

stanowisku asystenta. W pierwszym okresie mojej pracy zainteresowałam się toksynami

roślinnymi oraz problemem zatruć roślinami toksycznymi u zwierząt. Z tego okresu pochodzą

pierwsze prace przeglądowe skierowane do lekarzy praktyków:

1. Chłopecka M., Dziekan N., Wiechetek M (2001). Rośliny dziko rosnące i uprawiane a

zdrowie psów i kotów. Biologiczna Medycyna Weterynaryjna, 2, 30-37.

2. Chłopecka M., Dziekan N. (2001). Domowe i ogrodowe rośliny ozdobne a zdrowie

psów i kotów. Biologiczna Medycyna Weterynaryjna, , 3, 75-82.

3. Chłopecka M. (2002). Zatrucia roślinami u psów i kotów, Magazyn Weterynaryjny, 65,

16-20.

Byłam również współautorem publikacji przeglądowych dotyczących:

- substancji i preparatów używanych powszechnie w domach, które są częstym źródłem zatruć

zwierząt domowych:

1. Dziekan N., Chłopecka M. (2002): Zatrucia artkułami gospodarstwa domowego u psów

i kotów, Magazyn Weterynaryjny, 72, 44-47.

- zagadnień związanych z chronicznym zatruciem miedzią u owiec obejmujących krytyczny

przegląd piśmiennictwa na temat źródeł i okoliczności narażenia, losów w organizmie,

mechanizmu działania oraz objawów i konsekwencji narażenia na ten metal:

1. Mendel M., Chłopecka M., Dziekan N. (2007): Haemolytic crisis in sheep as a result of

chronic exposure to copper. Polish Journal of Veterinary Sciences, 10, 51-56 (MNiSW

= 10 pkt., IF = 0,291)

W latach (2002-2005) uczestniczyłam w doświadczeniach realizowanych w ramach

grantu badawczego KBN zatytułowanego: „Wpływ błony śluzowej w mechanizmie

relaksacyjnego działania jonu azotynowego na mięśniówkę gładką przewodu pokarmowego”

(załącznik 3, II.I.2) jako główny wykonawca projektu. Pierwszy etap prac obejmujący

doświadczenia wstępne ujawnił bardzo wiele problemów metodycznych i interpretacyjnych

związanych z wykorzystaniem modelu badawczego izolowanych wycinków przewodu

pokarmowego, a uzyskiwane w toku prac wyniki pozostawały często w sprzeczności z

powszechnie publikowanymi danymi literaturowymi. Stało się to powodem rozpoczęcia przeze

mnie bardzo intensywnych prac nad standaryzacją modelu izolowanych wycinków przewodu

pokarmowego szczura, również w zakresie jego rożnych podtypów (klasyczny model otwarty,

- 28 -

zamknięte woreczki jelitowe, wycinki pozbawione błony śluzowej) oraz określeniem jego

możliwości ekstrapolacyjnych na warunki in vivo. Dodatkowym wsparciem dla tych działań

była możliwość realizacji grantu wewnętrznego SGGW „Standaryzacja metody badawczej

wykorzystującej wycinki przewodu pokarmowego jako alternatywnej metody badań wpływu

substancji na motorykę mięśniówki przewodu pokarmowego” (załącznik 3, II.I.3). Prowadzone

przez kilka lat badania pozwoliły uzyskać wszystkie dane w tym zakresie. W konsekwencji

Zakład Farmakologii i Toksykologii zyskał wystandaryzowany, wiarygodny model

doświadczalny, również w zakresie prawidłowej interpretacji otrzymanych wyników,

szczególnie podczas ich ekstrapolacji do warunków in vivo. Wyniki prac wskazują, że wycinki

z różnych części przewodu pokarmowego cechuje różna stabilność w czasie wielogodzinnych

doświadczeń zarówno pod względem aktywności spontanicznej mięśniówki, reakcji na

substancje referencyjne oraz zachowania integralności tkanek. Wyniki ujawniły również, że

papaweryna, powszechnie stosowana w badaniach in vitro w doświadczeniach z użyciem

wycinków mięśniówki gładkiej, nie spełnia kryteriów substancji referencyjnej w zakresie

rozpuszczalności w buforze inkubacyjnym jak również charakteru odpowiedzi mięśniówki.

Wyniki badań standaryzacyjnych pozwoliły stworzyć podstawowy protokół doświadczalny

wykorzystywany we wszystkich eksperymentach wykonywanych w Zakładzie Farmakologii i

Toksykologii na modelu izolowanych wycinków przewodu pokarmowego szczura. Znaczna

część uzyskanych wyników została zawarta w mojej pracy doktorskiej oraz w następujących

publikacjach:

1. Chłopecka M., Dziekan N., Mendel M., Bąkała A., Małdyk J., Wiechetek M. (2007)

Evaluation of time-stability of an alternative research model based on isolated rat

gastrointestinal strips. Journal of Physiology and Pharmacology 58, 73-86 (MNiSW =

20 pkt., IF = 2,974)

2. Chłopecka M., Dziekan N., Bąkała A., Wiechetek M., Mendel M. (2007) Papaverine

should not be used as an indicator for controlling the ability of gastrointestinal tract

muscle to relax in vitro. Medycyna Weterynaryjna, 63 (11) (MNiSW = 10 pkt., IF =

0.259)

Standaryzacja prezentowanego modelu pozwoliła rozważyć i zainicjować nowe

kierunki badawcze. Byłam pomysłodawcą rozpoczęcia w Zakładzie Farmakologii i

Toksykologii badań oceniających wpływu substancji czynnych zawartych w roślinach na

aktywność motoryczną przewodu pokarmowego szczura. Badania te zainicjowała w swojej

pracy doktorskiej, a następnie rozwinęła w kolejnych latach kariery zawodowej dr hab. Marta

- 29 -

Mendel. Przed uzyskaniem stopnia doktora byłam współautorem jednej publikacji w tym

zakresie przedstawiającej nasze wstępne wyniki dotyczące oceny wpływu metabolitów

wtórnych bluszczu pospolitego na aktywność mięśniówki przewodu pokarmowego:

1. Mendel M., Chłopecka M., Dziekan N., Wiechetek M. (2006) Wpływ saponin

triterpenowych (α-hederyny) z bluszczu pospolitego (Hedera helix) na mięśniówkę

gładką izolowanych wycinków przewodu pokarmowego. Herba Polonica, 52, 75-76.

Wyniki badań, w których uczestniczyłam przed uzyskaniem stopnia doktora były

również prezentowane w postaci doniesień na krajowych i międzynarodowych konferencjach

tematycznych (Załącznik 3, III.B.4-16).

Prezentowane przeze mnie wyniki badań naukowych zostały uhonorowane I nagrodą

Dziekana Wydziału Medycyny Weterynaryjnej za najlepszą prezentację wyników badań

naukowych na dorocznych przeglądzie dorobku Katedr w 2004 roku.

W celu doskonalenia warsztatu badawczego związanego z doświadczeniami na

izolowanych wycinkach mięśniówki gładkiej brałam udział w warsztatach organizowanych

przez Katedrę Farmakologii i Toksykologii Uniwersytetu Semmelweisa w Budapeszcie

(PowerLab Research Workshop, 7-11.11.2005). W 2007 roku byłam współorganizatorem i

prelegentem podobnego spotkania, które odbyło się w Warszawie, w Zakładzie Farmakologii i

Toksykologii SGGW (3rd ADInstruments Workshop in Poland – 13-14.06.2007).

Brałam również udział w szkoleniu z zakresu monitorowania działań niepożądanych

weterynaryjnych produktów leczniczych organizowanym przez Urząd Rejestracji Produktów

Leczniczych, Wyrobów Medycznych i Produktów Biobójczych.

W 2006 roku zakończyłam czterosemestralne Specjalizacyjne Studia Podyplomowe z

dziedziny Weterynaryjna Diagnostyka Weterynaryjna otrzymując tytuł specjalisty.

b) Osiągnięcia naukowo-badawcze po uzyskaniu stopnia doktora

Po uzyskaniu stopnia doktora nauk weterynaryjnych objęłam stanowisko adiunkta w

Zakładzie Farmakologii i Toksykologii Wydziału Medycyny Weterynaryjnej w Warszawie,

gdzie kontynuowałam doświadczenia z wykorzystaniem modelu izolowanych wycinków

przewodu pokarmowego szczura oceniające wpływ różnych ksenobiotyków na aktywność

motoryczną mięśniówki gładkiej. W tamtym czasie ukazały się ostatnie metodyczne prace z

zakresu optymalizacji warunków doświadczalnych:

- 30 -

1. Chłopecka M., Dziekan N. Mendel M., Wiechetek M. (2008). Izolowane wycinki jelita

czczego szczura – alternatywny model badawczy do badania działania ksenobiotyków.

Prace i Materiały Zootechniczne, 66, 174-176 (MNiSW: 2 pkt.)

2. Mendel M., Dziekan N., Chłopecka M., Wiechetek M. (2008). Stosowane w

doświadczeniach rozpuszczalniki organiczne, a wiarygodność otrzymanych wyników:

badania in vitro na izolowanych wycinkach żołądka szczura. Prace i Materiały

Zootechniczne 66, 193-195 (MNiSW: 2 pkt.)

3. Dziekan N., Chłopecka M., Mendel M., Wiechetek. (2008). Schemat postępowania

doświadczalnego w badaniach prowadzonych na izolowanych wycinkach przewodu

pokarmowego szczura. Prace i Materiały Zootechniczne, 66, 190-192 (MNiSW: 2 pkt.)

Główne kierunki badań naukowych oraz działalności popularyzatorskiej, w których

brałam udział po uzyskaniu stopnia doktora, dotyczyły następujących zagadnień:

- Wykorzystanie modelu izolowanych wycinków przewodu pokarmowego szczura do

badania wpływu pestycydów na aktywność motoryczną przewodu pokarmowego.

- Ocena wpływu metabolitów wtórnych roślin na aktywność wycinków przewodu

pokarmowego szczura.

- Optymalizacja warunków doświadczalnych eksperymentów wykorzystujących inne

modele izolowanej mięśniówki gładkiej.

- Ocena wpływu metabolitów wtórnych roślin na aktywność wycinków przewodu

pokarmowego krowy oraz interakcji pomiędzy fitozwiązkami i chemioterapeutykami.

- Problemy toksykologiczne zwierząt gospodarskich i towarzyszących:

Zatrucia roślinami u koni.

Zagrożenia toksykologiczne bydła wynikające z obecności substancji

niebezpiecznych w paszy i wodzie.

Wpływ metali na zdrowie zwierząt towarzyszących.

Zatrucia zwierząt towarzyszących substancjami obecnymi w gospodarstwie

domowym.

- 31 -

Wykorzystanie modelu izolowanych wycinków przewodu pokarmowego szczura do badania

wpływu pestycydów na aktywność motoryczną przewodu pokarmowego

Wyniki badań uzyskane w ramach realizacji tego kierunku badawczego stanowią

osiągnięcie naukowe (Załącznik 3, I.B.1-3) oraz były prezentowane na krajowych i

międzynarodowych konferencjach tematycznych (Załącznik 3, II.DD.5, III.B.28, 31, 46, 51).

Ocena wpływu metabolitów wtórnych roślin na aktywność wycinków przewodu

pokarmowego szczura

I. Pełniąc rolę opiekuna naukowego prac prowadzonych w ramach realizacji rozprawy

doktorskiej lek. wet. Marty Mendel brałam udział w eksperymentach, których wyniki ujawniły,

że zarówno ekstrakt z bluszczu pospolitego jak i pojedyncze saponiny triterpenowe nasilają

aktywność skurczową mięśniówki dna i trzonu żołądka. Mechanizm indukowania skurczu

przez α-hederynę wynika prawdopodobnie ze zmiany potencjału błonowego miocytów (na

skutek zmian przepuszczalności) w wyniku czego dochodzi do napływu wapnia przez zależne

od napięcia kanały typu L do wnętrza komórek. Uzyskane wyniki znajdują się w następujących

pracach:

1. Mendel M., Chłopecka M., Dziekan N., Wiechetek M. (2011). The effect of the whole

extract of common ivy (Hedera helix) leaves and its selected active substances on the

motoric activity of rat isolated stomach strips. Journal of Ethnopharmacology 134, 796-

802. (MNiSW: 35, IF: 3.014).

2. Mendel M., Chłopecka M., Dziekan N., Karlik W., Wiechetek M. (2012). The

participation of cholinergic pathways in α-hederin-induced contraction of rat isolated

stomach strips. Phytomedicine 19, 591-595. (MNiSW: 35, IF: 2.972).

3. Mendel M., Chłopecka M., Dziekan N., Karlik W., Wiechetek M. (2013). The

participation of extracellular calcium in α-hederin-induced contraction of rat isolated

stomach strips. Journal of Ethnopharmacology 146, 423-426 (MNiSW: 40, IF: 2.939).

II. Kontynuacją zainteresowań badawczych obejmujących wpływ fitozwiązków na aktywność

motoryczną przewodu pokarmowego był mój aktywny udział w kolejnych badaniach, które

pozwoliły na ustalenie wpływu różnych wtórnych metabolitów roślin na aktywność mięśniówki

gładkiej wycinków przewodu pokarmowego szczura. Badania w tej części prowadziliśmy we

- 32 -

współpracy z Katedrą i Zakładem Farmakognozji z Pracownią Roślin Leczniczych

Uniwersytetu Medycznego w Lublinie z której pochodził materiał roślinny izolowany przez

pracowników tego ośrodka badawczego. Doświadczenia wykonane na wycinkach

pochodzących od szczurów dają dużą możliwość ekstrapolacji uzyskanych wyników na

organizm człowieka. Uzyskane wyniki wskazują, że furanokumaryny (bergapten i

imperatoryna) wyraźnie zaburzały aktywność wycinków jelita czczego w szerokim zakresie

stężeń. W przypadku bergaptenu pierwszą istotną reakcję o charakterze miorelaksacji

odnotowano już po zastosowaniu substancji w dawce 0,0001 µM. Może to oznaczać, że nawet

przy niewielkiej biodostępności badanej furanokumaryny istnieje możliwość jej oddziaływania

w warunkach przyżyciowych, co daje perspektywy wykorzystania tej substancji u pacjentów z

nasiloną motoryką przewodu pokarmowego. W przypadku zastosowania bergaptenu w

wysokich dawkach, około połowa wycinków zareagowała wyraźnym skurczem mięśniówki.

Kolejną badaną przez nas furanokumaryną była imperatoryna, która wykazała wyraźne,

odwracalne i zależne od dawki działanie miorelaksacyjne na wycinki jelita czczego, co również

daje pespektywę jej wykorzystania w warunkach in vivo. Dodatkowym atutem tej części badań

była ocena prawdopodobnego mechanizmu działania imperatoryny na komórki mięśni gładkich

przewodu pokarmowego, która wykazała m.in, że działanie miorelalsacyjne badanej substancji

może wynikać z zaburzenia funkcji napięciozależnych kanałów wapniowych, co skutkuje

hamowaniem napływu jonów wapnia do komórek. W kolejnych doświadczeniach oceniliśmy

efekt flawonoidów pozyskiwanych z roślin cytrusowych. Otrzymane wyniki wskazują, że

zarówno aglikony (hesperytyna i diosmetyna), jak również ich pochodne glikozydowe

(hesperydyna i diosmina) nie wpływają istotnie na aktywność spontaniczną mięśniówki jelita

czczego w warunkach in vitro. Aglikony flawonoidów zastosowane w stężeniach 10 - 100 μM

istotnie zmniejszały odpowiedź wycinków na podanie ACh, co ma ogromne znaczenie ze

względu na fakt, iż jest główny neuroprzekaźnik szlaków cholinergicznych jelitowego układu

nerwowego. Ocena mechanizmu działania hespertyny wykazała prawdopodobny udział

zależnych od potencjału kanałów potasowych o szybkiej przewodności oraz zależnych od ATP,

przewodnictwa nieadrenergicznego, niecholinergicznego (NANC) oraz zdolności hamowania

cyklooksygenazy w spazmolitycznym działaniu badanego flawonoidu. Wyniki prac z

wykorzystaniem modelu izolowanych wycinków przewodu pokarmowego szczura autorzy

przedstawili w poniższych pracach:

1. Mendel M., Skalicka-Woźniak K., Chłopecka M., Dziekan N. (2015). Effect of

imperatorin on the spontaneous motoric activity of rat isolated jejunum strips. Evidence-

- 33 -

Based Complementary and Alternative Medicine (eCAM), Volume 2015, Article ID

614849. (MNiSW: 30 pkt., IF: 1,880).

2. Skalicka-Woźniak K., Mendel M., Chłopecka M., Dziekan N. (2016). Isolation and

evaluation of the myorelaxant effect of bergapten on isolated rat jejunum.

Pharmaceutical Biology, 54, 48-54. (MNiSW: 20 pkt., IF: 1,241).

3. Mendel M., Chłopecka M, Dziekan N., Karlik W. (2016). Antispasmodic effect of

selected Citrus flavonoids on rat isolated jejunum specimens. European Journal of

Pharmacology, 791, 640-646. (MNiSW: 30 pkt., IF: 2,532).

Optymalizacja warunków doświadczalnych eksperymentów wykorzystujących inne modele

izolowanej mięśniówki gładkiej

I. Przed rozpoczęciem kolejnego etapu doświadczeń, które obejmowały wpływ fitozwiązków na

aktywność motoryczną wycinków przewodu pokarmowego krowy, wzięłam udział w serii

doświadczeń metodycznych, których celem była optymalizacja warunków doświadczalnych w

eksperymentach wykorzystujących tkanki pozyskiwane poubojowo od krów mlecznych. Plan

prac oparty był na wykorzystywanym od dawna w naszym zakładzie schemacie postępowania

z wycinkami pochodzącymi od szczura, na podstawie którego wykonywaliśmy eksperymenty

sprawdzające punkty krytyczne w ocenie przydatności i wiarygodności nowego modelu.

Wynikiem tych prac jest protokół doświadczalny wykorzystywany do dalszych doświadczeń.

Praca opisuje dokładną metodykę w zakresie pobierania i następnie preparacji laboratoryjnej

wycinków mięśniówki okrężnej i podłużnej trawieńca krów, rodzaju i dawek substancji

referencyjnych, wpływu rozpuszczalników organicznych oraz stabilności modelu w czasie

długotrwałych doświadczeń. Uzyskane wyniki wskazują na wysoką stabilność modelu

wycinków mięśniówki gładkiej trawieńca krów zarówno pod względem morfologii jak i reakcji

na ACh podczas wielogodzinnej inkubacji, zarówno w dniu preparacji jak i po przechowywaniu

przez 24h w temp. do 4ºC. Prace w ramach tego kierunku badawczego prowadziliśmy we

współpracy z Zakładem Patologii Zwierząt Egzotycznych, Laboratoryjnych,

Nieudomowionych i Ryb Wydziału Medycyny Weterynaryjnej, SGGW. Współpraca dotyczyła

części doświadczeń w zakresie oceny zmian wstecznych wycinków w czasie przechowywania

oraz długotrwałej inkubacji. Efektem współpracy jest wspólna publikacja pracowników obu

zakładów:

- 34 -

1. Mendel M., Chłopecka M., Dziekan N., Sobczak-Filipiak M., Bielecki W., Karlik W.

(2016). Bovine isolated abomasum specimens – a useful tool in preclinical in vitro

studies. Research & Reviews: Journal of Veterinary Sciences 2, 76-83.

II. Wiedza i doświadczenie w zakresie alternatywnych modeli in vitro wykorzystujących

mięśniówkę gładką stały się podstawą nawiązania współpracy z Katedra Farmakologii i

Toksykologii Wydziału Lekarskiego Uniwersytetu Warmińsko-Mazurskiego w Olsztynie,

która rozpoczyna właśnie aktywność badawczą w tym zakresie. W oparciu o moje

doświadczenie w zakresie prac standaryzacyjnych prowadzonych w naszym zakładzie na

wycinkach przewodu pokarmowego, moja rola polegała na przygotowaniu merytorycznym

członków zespołu olsztyńskiego do optymalizacji modelu badawczego wykorzystującego

wycinki aorty szczura. Efektem tej współpracy jest wspólna publikacja wieloautorska

dotycząca stabilności modelu izolowanych pierścieni aorty w przebiegu długotrwałych

doświadczeń (manuskrypt w trakcie recenzji).

Ocena wpływu metabolitów wtórnych roślin na aktywność wycinków przewodu

pokarmowego krowy oraz interakcji pomiędzy fitozwiązkami i chemioterapeutykami

I. Kolejny etap prac dotyczył oceny wpływu flawonoidów oraz saponin triterpenowych na

aktywność motoryczną wycinków przewodu pokarmowego krowy. Prace wykonywane były w

ramach grantu badawczego Narodowego Centrum Nauki „Interakcje pomiędzy roślinnymi

substancjami aktywnymi biologicznie zawartymi w paszy, a wybranymi lekami stosowanymi

w leczeniu chorób bydła – badania in vitro”, w którym byłam wykonawcą projektu (Załącznik

3, II.I.4).

Uzyskane w przebiegu doświadczeń wyniki wskazują, że:

- apigenina doprowadzała do zmniejszenia reakcji mięśniówki trawieńca indukowanej

przez ACh, a obserwowana reakcja była zależna od dawki,

- luteolina nasilała reaktywność mięśniówki trawieńca na ACh stosowana w niskich

dawkach,

- kwercetyna nasilała reaktywność wycinków trawieńca na ACh stosowana w niskich

stężeniach, natomiast inkubacja wycinków w wysokich stężeniach wywoływała efekt

spazmolityczny.

- 35 -

- hederagenina nasilała aktywność mięśniówki wycinków trawieńca i dwunastnicy krowy

po zastosowaniu substancji w bardzo niskich stężeniach.

- kwas medikagenowy wykazywał aktywność proskurczową w przypadku mięśniówki

wycinków trawieńca (począwszy od najniższego badanego stężenia) natomiast nie

wpływał istotnie na aktywność wycinków dwunastnicy.

Należy podkreślić, że uzyskane wyniki wskazują również na zmianę odpowiedzi mięśniówki

w sytuacji wielokrotnego narażenia na flawonoidy w porównaniu do bezpośredniego (bez

narażania uprzednio na mniejsze dawki) narażenia wycinków na wysoką dawkę tych substancji.

W przypadku zastosowania flawonoidu w najwyższych dawkach, bez ich wcześniejszego

narażenia na tę samą substancję w niższych dawkach, reakcja mięśniówki była znacząco

wyższa. Obserwacja ta ma duże znaczenie ze względu na to, iż narażenie krów na działanie

wtórnych metabolitów roślin ma charakter stały. Prokinetyczne działanie luteoliny i

kwercetyny (stosowanych w niskich dawkach) może przyczyniać się zwiększenia aktywności

motorycznej trawieńca i zmniejszenia ryzyka przemieszczeń tego narządu w przypadku

stosowania pasz wzbogaconych tymi związkami. Pomimo niskiej biodostępności saponin

triterpenowych u bydła, otrzymane wyniki wskazują również na możliwość działania tych

substancji in vivo, ze względu na ich proskurczowe działanie już w obecności bardzo niskich

stężeń. Sugeruje to zatem możliwość zastosowania w diecie krów roślin bogatych w te związki

w celu zapobiegania skutkom chorób wynikających z osłabienia motoryki trawieńca.

Najważniejsze wyniki tego etapu prac przedstawiono w następujących publikacjach:

1. Mendel M., Chłopecka M., Dziekan N., Karlik W. (2016). Modification of abomasum

contractility by flavonoids present in ruminants diet: in vitro study. Animal: The

International Journal of Animal Biosciences, 10, 1431-1438. (MNiSW: 35 pkt., IF:

1,841)

2. Mendel M., Chłopecka M., Dziekan N., Karlik W. (2016). The effect of alfalfa saponins

on the contractility of bovine isolated abomasum and duodenum preparations. Livestock

Science, 188, 153-158. (MNiSW: 30 pkt., IF: 1,171)

Oprócz prac doświadczalnych, brałam również udział w przygotowaniu publikacji

przeglądowej, która podsumowuje aktualną wiedzę na temat wpływu olejków eterycznych,

saponin i tanin na aktywność motoryczną przewodu pokarmowego zwierząt, głównie

przeżuwaczy.

- 36 -

1. Mendel M., Chłopecka M., Dziekan N., Karlik W. (2017). Phytogenic feed additives as

potential gut contractility modifiers – a review. Animal Feed Science and Technology,

230, 30-46. (MNiSW: 45 pkt., IF: 1,755).

II. Optymalizacja warunków doświadczalnych modelu izolowanych wycinków przewodu

pokarmowego krowy, a następnie seria doświadczeń wykorzystujących wtórne metabolity

roślin pozwoliły na podjęcie przez nasz zespół kolejnego etapu badawczego. Dotyczył on

interakcji pomiędzy substancjami czynnymi roślin (saponiny i flawonoidy) a lekami

stosowanymi w leczeniu bydła, które poza głównym działaniem terapeutycznych wpływają

również na aktywność motoryczną przewodu pokarmowego (erytromycyna, fluniksyna,

lewamizol). Otrzymane wyniki ujawniły synergistyczny charakter interakcji pomiędzy

saponinami triterpenowymi i badanymi lekami. Zjawisko to może być korzystne w przypadku

leczenia zaburzeń przewodu pokarmowego krów przebiegających z osłabieniem aktywności

motorycznej mięśniówki. W przypadku badanych flawonoidów, charakter interakcji zależał od

zastosowanej dawki tej grupy substancji: stosowane w niskich dawkach nasilały efekt

prokinetyczny lewamizolu, podczas kiedy w wysokich stężeniach wykazywały wyraźny efekt

antagonistyczny w odniesieniu do wszystkich badanych leków. Wyniki te mogą wskazywać,

że stosowanie diety bogatej w flawonoidy może doprowadzić do hamowania prokinetycznego

działania badanych chemioterapeutyków. Uzyskane wyniki przedstawia praca:

1. Mendel M., Chłopecka M., Dziekan N., Karlik W. (2017). Interactions between

erythromycin, flunixin meglumine, levamisole and plant secondary metabolites towards

bovine gastrointestinal motility – in vitro study. Journal of Veterinary Pharmacology

and Therapeutics, 41, 281-291 (MNiSW: 30, IF2016: 1,441).

III. W czasie ostatnich lat byłam zaangażowana również w inne projekty naukowe podejmowane

w Zakładzie Farmakologii i Toksykologii, których wyniki były prezentowane na konferencjach

krajowych i zagranicznych. Ich wspólnym tematem są badania toksyczności ksenobiotyków z

wykorzystaniem różnych alternatywnych metod i modeli badawczych:

- Badanie ekotoksyczności leków weterynaryjnych i nanocząstek (standaryzacja

warunków testu, ocena interakcji chemioterapeutyków).

- Optymalizacja metody izolacji oraz ocena przydatności modelu izolowanych

hepatocytów bydlęcych.

- 37 -

- Wpływ chlorofiliny na wchłanianie deoksyniwalenolu na modelu izolowanej

śluzówki jelita świni.

- Wykorzystanie modelu izolowanych mikrosomów oraz frakcji postmitochondrialnej

S9 do badania wpływu wtórnych metabolitów roślin na aktywność cytochromu P450

oraz ocena interakcji roślinnych substancji czynnych z lekami

przeciwpasożytniczymi. Część wyników tego projektu została zaprezentowana w

publikacji (praca po recenzji, manuskrypt jest aktualnie poprawiany zgodnie z

uwagami recenzenta).

Liczne doniesienia konferencyjne obejmujące wyniki prac doświadczalnych, w których

brałam udział po uzyskaniu stopnia doktora zaprezentowałam w Załączniku 3 (III.B.17-54).

Warto zaznaczyć, że część prezentowanych abstraktów stanowi recenzowane materiały

konferencyjne z konferencji międzynarodowej indeksowane w Web of Science Core Collection

(II.DD.1-9).

Problemy toksykologiczne zwierząt gospodarskich i towarzyszących

I. Wyrazem zaangażowania merytorycznego w tematykę związaną z aktywnością biologiczną

wtórnych metabolitów roślin oraz ich wpływem na organizm jest mój udział w przygotowaniu

obszernej monografii:

1. “Zatrucia roślinami u koni”, praca zbiorowa pod red. Magdaleny Chłopeckiej, wydanie

I, Warszawa, Świadome Jeździectwo (monografia w druku, poświadczenie wydawnictwa

– załącznik 6) (MNiSW: 20: 15 + 5/redakcja/).

Książka zawiera profil toksykologiczny ponad 100 roślin trujących dla koni. Każdy opis

posiada krótką charakterystykę botaniczną oraz informacje na temat substancji czynnych

rośliny, toksyczności i okoliczności narażenia, mechanizmu działania toksycznego, objawów

zatrucia oraz sposobów zapobiegania i leczenia. Dodatkowo w opracowaniu znajdują się dwa

rozdziały poświęcone: (i) racjonalnej fitoterapii zwierząt, w którym zawarto m.in. istotne

informacje na temat interakcji pomiędzy lekami ziołowymi i suplementami diety a także lekami

konwencjonalnymi, (ii) szczegółowym schematom postępowania terapeutycznego w

- 38 -

przypadku zatruć roślinami. Oprócz pełnienia funkcji redaktora całości opracowania jestem

również głównym autorem monografii.

II. Wykorzystując swoją wiedzę z zakresu toksykologii weterynaryjnej zainicjowałam, a następnie

współtworzyłam publikacje skierowane do lekarzy praktyków.

Byłam głównym autorem rozdziałów w monografiach dotyczących problemów

toksykologicznych bydła:

1. Chłopecka M., Dziekan N., Mendel M., Karlik W., Wiechetek M. (2011) Zagrożenia

toksykologiczne związane z obecnością związków trujących w paszach. Aktualne

Problemy Bujatryki XXI Wieku. ISBN 978-83-861775-63-5 Wyd. Łomżyńskie

Towarzystwo Naukowe im. Wagów, 127-140 (MNiSW = 6.0).

2. Chłopecka M., Dziekan N., Mendel M., Karlik W. (2012) Jakość chemiczna wody a

dobrostan krów mlecznych, Dobrostan i bioasekuracja - ważne elementy współczesnej

bujatrii. ISBN 9788393465514 PTNW Oddział Łomżyńsko-Ostrołęcki, Polskie

Towarzystwo Bujatryczne, 9-16 (MNiSW = 6.0).

Ważnym obszarem moich zainteresowań naukowych jest także toksyczność metali dla zwierząt

domowych. Byłam współautorem publikacji stanowiącej szeroki przegląd aktualnej wiedzy na

temat przebiegu, konsekwencji oraz diagnostyki zatruć ołowiem u psów i kotów:

1. Chłopecka M., Mendel M. (2008) Zatrucie ołowiem u małych zwierząt. Część I.

Magazyn Weterynaryjny 140, 1232-1236 (MNiSW: 2 pkt.).

2. Chłopecka M., Mendel M. (2009) Zatrucie ołowiem u małych zwierząt. Cz. II –

rozpoznawanie i leczenie. Magazyn Weterynaryjny 142, 84-88 (MNiSW: 2 pkt.).

oraz na temat wpływu różnych czynników m.in. dawki i drogi podania, statusu

antyoksydacyjnego i wieku zwierząt oraz wieku odsadzenia na toksyczność i ryzyko

wystąpienia działań niepożądanych preparatów żelaza u prosiąt:

1. Chłopecka M., Mendel M., Dziekan N. (2012) Przyczyny działań niepożądanych

preparatów żelaza u nowo narodzonych prosiąt. Cz. I. Magazyn Weterynaryjny 21, 1133-

1135 (MNiSW: 3 pkt.).

- 39 -

2. Chłopecka M., Mendel M., Dziekan N. (2013) Przyczyny działań niepożądanych

preparatów żelaza u nowo narodzonych prosiąt. Cz. II. Magazyn Weterynaryjny 22, 133-

139 (MNiSW = 3 pkt.).

Współtworzyłam również publikacje dotyczące okoliczności, konsekwencji, diagnostyki oraz

możliwości terapeutycznych zatruć paracetamolem u zwierząt towarzyszących oraz zagrożeń

toksykologicznych związanych ze zjadaniem resztek z przydomowych śmietników i

kompostowników:

1. Dziekan N., Chłopecka M., Mendel M. (2012) Zatrucie paracetamolem u psów i kotów.

Magazyn Weterynaryjny 21, 1136-1138 (MNiSW = 3 pkt.).

2. Mendel M., Chłopecka M., Tarasiewicz J., Wojciechowska K. (2018). Śmietnik –

potencjalne źródło narażenia psów na trucizny. Cz. II. Magazyn Weterynaryjny, 27, 65-

67 (MNiSW = 3 pkt.).

3. Mendel M., Chłopecka M., Tarasiewicz J., Wojciechowska K. (2018). Śmietnik –

potencjalne źródło narażenia psów na trucizny. Cz. II. Magazyn Weterynaryjny, 27, 65-

67 (MNiSW = 3 pkt.).

Wykorzystując swoją wiedzę na temat aktywności biologicznej oraz konsekwencji narażenia

na pestycydy zainicjowałam powstanie artykułów dotyczących sposobów rozpoznawania i

schematów leczenia zatruć tą grupą substancji:

1. Chłopecka M., Dziekan N. (2010). Zatrucia psów i kotów wybranymi pestycydami,

przebiegające z objawami neurologicznymi – algorytmy postępowania diagnostycznego

i terapeutycznego. Cz. I, Magazyn Weterynaryjny, 152, 44-53. (MNiSW: 2 pkt.).

2. Chłopecka M., Dziekan N. (2010) Zatrucia psów i kotów wybranymi pestycydami,

przebiegające z objawami neurologicznymi – algorytmy postępowania diagnostycznego

i terapeutycznego. Cz. II, Magazyn Weterynaryjny, 153, 156-160. (MNiSW: 2 pkt.).

III. Brałam udział jako wykładowca w konferencjach skierowanych do lekarzy praktyków:

1. II Kongres „Akademia po Dyplomie”, 2009. Warszawa.

2. VII Kongres „Akademia po Dyplomie”, 2015, Warszawa.

3. IX Kongres Akademia po Dyplomie”, 2017, Warszawa.

- 40 -

4. II Międzynarodowa Konferencja Naukowa: Aktualne problemy bujatryki XXI wieku,

2011, Łomża.

5. III Międzynarodowa Konferencja Bujatryczna: Dobrostan i bioasekuracja – ważne

elementy współczesnej bujatryki, 2012, Łomża.

6. Pozostała działalność naukowa

a) działalność ekspercka

Ważnym aspektem mojej aktywności naukowej w zakresie toksykologii jest działalność

ekspercka. W 2013 roku, w dowód uznania mojej wiedzy w zakresie toksykologii, w tym

toksykologii pestycydów, zostałam ekspertem Ministerstwa Rolnictwa i Rozwoju Wsi

(MRiRW) oceniającym bezpieczeństwa środków ochrony roślin w zakresie toksykologii

ssaków. W ramach mojej działalności eksperckiej dokonuję oceny dokumentacji dotyczącej

toksyczności oraz ewentualnych skutków zdrowotnych wynikających z kontaktu z preparatami

pestycydowymi. Ponadto do moich obowiązków należy opiniowanie i zgłaszanie uwag do

dokumentów przygotowywanych przez Komisję Europejską i Europejski Urząd ds.

Bezpieczeństwa Żywności (EFSA) w zakresie zatwierdzania substancji czynnych środków

ochrony roślin jak również w zakresie wytycznych dotyczących kryteriów ocen bezpieczeństwa

pestycydów. W czasie 5 lat działalności w opisanym zakresie wykonałam około 150 takich

ekspertyz.

Biorę również udział w cyklicznych spotkaniach eksperckich organizowanych przez

MRiRW dotyczących harmonizacji ocen środków ochrony roślin w zakresie toksykologii.

b) członkostwo w towarzystwach naukowych

Jestem członkiem Polskiego Towarzystwa Toksykologicznego od 2004, a od 2008 pełnię

funkcję Członka Zarządu Oddziału Warszawskiego PTToks.

- 41 -

Tabela. Zbiorcze zestawienie osiągnięć naukowych

Przed uzyskaniem stopnia doktora Po uzyskaniu stopnia doktora

(w tym osiągnięcie)

Liczba publikacji w

czasopismach z listy A

MNiSW

3 13

(3)

Liczba publikacji w

czasopismach z listy B

MNiSW

2 13

Inne publikacje 2 4

Monografie -

1

Rozdział w monografii -

2

Wyniki prezentowane na

konferencjach

naukowych

krajowych międzynarodowych krajowych międzynarodowych

9 7 23 15

W całym okresie pracy naukowej

Współczynnik IF

sumarycznie

osiągnięcie

33,458

9,128

Liczba punktów wg

MNiSW

sumarycznie

osiągnięcie

521 90

Liczba cytowań

(bez autocytowań) 32

Indeks Hirscha 4

- 42 -

7. Działalność organizacyjna i popularyzująca naukę

a) Festiwal Nauki:

Działalność organizacyjna na rzecz Wydziału Medycyny Weterynaryjnego SGGW w

Warszawie jest bardzo ważnym elementem mojej ścieżki zawodowej. Festiwal Nauki (FN) w

Warszawie jest największą imprezą popularyzująca naukę wśród społeczeństwa. Od 2004 roku

pełniłam funkcję współorganizatora, a następnie głównego koordynatora (od 2011 roku do

chwili obecnej) FN na Wydziale Medycyny Weterynaryjnej SGGW. Moje obowiązki polegają

na:

- przygotowaniu, w porozumieniu z pracownikami naukowo-dydaktycznymi, studentami

oraz innymi pracownikami wydziału, oferty proponowanych w danym roku lekcji

festiwalowych, spotkań i wykładów.

- koordynowaniu przebiegu imprez,

- rozliczeniu finansowym.

Zajmuję się również promocją imprez festiwalowych, poprzez materiały informacyjne

oraz kontakt ze szkołami średnimi. Oprócz działalności organizacyjnej związanej z

przygotowaniem FN jestem również czynnym uczestnikiem wydarzeń festiwalowych.

Byłam pomysłodawcą największej imprezy organizowanej regularnie przez Wydział

Medycyny Weterynaryjnej skierowanej do dzieci. Jestem autorem formatu tej imprezy, w

ramach której dzieci i młodzież uczestniczą w wielu warsztatach przybliżających im

zagadnienia związane z funkcjonowaniem organizmu, chorobami zwierząt, pracą lekarza

weterynarii czy zjawiskami chemicznymi. Prowadzę również wykłady i lekcje przybliżające

wiedzę z zakresu toksykologii. Prowadzona przeze ze mnie od wielu lat działalność w ramach

FN przyczynia się znacząco do promocji Wydziału Medycyny Weterynaryjnej i SGGW wśród

mieszkańców Warszawy oraz województwa mazowieckiego.

b) Inne aktywności organizacyjne i popularyzatorskie:

1. W latach 2001-2006 sprawowałam funkcję opiekuna roku.

2. Brałam udział w przygotowaniu Konferencji Szkoleniowo-Naukowej Polskiego

Towarzystwa Toksykologicznego „Toksykologia w Służbie publicznej” połączonej z X

Zjazdem Polskiego Towarzystwa Toksykologicznego w 2011 roku, jako członek komitetu

organizacyjnego.

- 43 -

3. Uczestniczę w Przeglądach Dorobku Studenckich Kół Naukowych SGGW jako członek

jury oceniający wystąpienia ustne i prezentacje plakatowe.

4. W 2017 i 2018 r. byłam członkiem komisji oceniającej wiedzę uczestników Olimpiady

Wiedzy i Umiejętności Rolniczych w zakresie weterynarii.

5. Biorę udział, jako organizator i uczestnik, w spotkaniach z uczniami szkół średnich i ich

rodzicami w ramach Dni Otwartych oraz w Dniach SGGW organizowanych w kampusie

uczelni dla mieszkańców Warszawy oraz kandydatów na studia.

6. W związku z dotychczasowym profilem działalności organizacyjnej, w 2017 roku Dziekan

Wydziału Medycyny Weterynaryjnej powierzył mi funkcję pełnomocnika ds. kontaktu ze

szkołami średnimi.

7. Od 2018 roku jestem również opiekunem Samorządu Studenckiego.

8. W dowód uznania mojej działalności organizacyjnej na rzecz Wydziału Medycyny

Weterynaryjnej SGGW w 2017 roku otrzymałam nagrodę II stopnia JM Rektora SGGW za

działalność organizacyjną.

9. Jestem autorem prac popularyzujących wiedzę z zakresu roślin trujących:

a. Chłopecka M., Dziekan N. (2012). Zatrucia roślinami zawierającymi alkaloidy

pirolizydynowe, Bydło, 1, 22 – 25.

b. Chłopecka M., Dziekan N., Mendel M. (2012). Zatrucia orlicą pospolitą,

nostrzykiem oraz roślinami wywołującymi nadwrażliwość na światło słoneczne,

Bydło, 5, 14 – 18.

10. Udzieliłam wywiadów popularyzujących wiedzę z zakresu toksykologii weterynaryjnej:

a. Chłopecka M., Dziekan N. (2011). Trawa dla kota, Kocie sprawy.

b. Chłopecka M. (2012), O tajemniczych objawach zatruć, Tygodnik Rolniczy, numer

z 28.09.2012.

c. Chłopecka M. (2012), Toksyczna gwiazdka, Kocie sprawy.

8. Działalność dydaktyczna

Działalność dydaktyczną rozpoczęłam już w ramach stażu przedasystenckiego

prowadząc wybrane zajęcia pod opieką prof. Marii Wiechetek. Od początku zatrudnienia

uczestniczę w działalności dydaktycznej zespołu zakładu Farmakologii i Toksykologii

prowadząc liczne przedmioty na kilku wydziałach SGGW oraz w ramach studiów

podyplomowych i specjalizacyjnych. Obecnie jestem koordynatorem większości przedmiotów

prowadzonych przez pracowników zakładu oraz autorem i współautorem sylabusów dla tych

przedmiotów.

- 44 -

a) Zajęcia dydaktyczne prowadzone na wydziałach/kierunkach SGGW:

Wydział Medycyny Weterynaryjnej:

1. Toksykologia - koordynator przedmiotu.*

2. Toksykologia kliniczna małych zwierząt (wybrane wykłady).

3. Toksykologia kliniczna dużych zwierząt (wybrane wykłady).

Wydział Ogrodnictwa, Biotechnologii i Architektury Krajobrazu,

Kierunek Biotechnologia:

4. Bezpieczeństwo chemiczne i szacowanie ryzyka – koordynator przedmiotu.*

5. Biotechnologia w produkcji roślinnej i zwierzęcej – koordynator przedmiotu* (do

2017 r.).

6. Biotechnologia w produkcji i ochronie zwierząt, seminarium – koordynator

przedmiotu.*

7. Kultury komórkowe i tkankowe – koordynator przedmiotu.*

8. Wybrane zagadnienia z toksykologii, fakultet – koordynator przedmiotu.*

9. Alternatywne metody badania ksenobiotyków – koordynator przedmiotu.*

Wydział Budownictwa i Inżynierii Środowiska,

Kierunek Ochrona Środowiska:

10. Podstawy Toksykologii – koordynator przedmiotu.*

11. Ekotoksykologia – koordynator przedmiotu.*

Wydział Rolnictwa i Biologii,

Kierunek Biologia Eksperymentalna:

12. Kultury in vitro (wybrane ćwiczenia).

13. Podstawy toksykologii, fakultet – koordynator przedmiotu.*

14. Wybrane zagadnienia z toksykologii, fakultet – koordynator przedmiotu.*

Kierunek Biologia Mikrobiologiczna:

15. Kultury in vitro (wybrane ćwiczenia).

Wydział Nauk o Zwierzętach,

Kierunek Bioinżynieria Zwierząt:

16. Alternatywne metody oceny ksenobiotyków – koordynator przedmiotu.*

*autor lub współautor programów dydaktycznych