8/13/2019 Automated Micobiology Method 4 Vit b12

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J . c l i n . P a t h . , 1 9 7 3 , 2 6 , 4 9 4 - 4 9 8

An a u t o m a t e d m i c r o b i o l o g i c a l m e t h o d f o r t h em e a s u r e m e n t o f v i t a m i n B 1 2R . E . DAVIS, J . MOULTON, AND A . KELLYFrom t h e D e p a r t m e n t o f H a e m a t o l o g y , R o y a l P e r t h H o s p i t a l , W e s t e r n A u s t r a l i a

SYNOPSIS A n a u t o m a t e d method f o r t h e m i c r o b i o l o g i c a l assay o f v i t a m i n B 1 2 i s d e s c r i b e d . Ac h l o r a m p h e n i c o l - r e s i s t a n t s t r a i n o f L a c t o b a c i l l u s l e i c h m a n n i i i s u s e d as t h e t e s t o r g a n i s m a n d t h i se l i m i n a t e s t h e n e e d f o r s t e r i l i z a t i o n o r a s e p t i c a d d i t i o n . P r e c i p i t a t i o n o f t h e s e r u m p r o t e i n i sa v o i d e d b y d i l u t i o n o f t h e s e r u m w i t h a g l u t a m i c / m a l i c a c i d s o l u t i o n b e f o r e h e a t i n g t h e p r e p a r a t i o nt o f r e e t h e v i t a m i n B 1 2 . T e s t s ca n b e s e t up a t a r a t e o f 8 0 a n h o u r a n d a f t e r i n c u b a t i o n t h e y ca n b er e a d a t 1 6 0 a n h o u r . B y i n t e r f a c i n g a p r o g r a m m e d e l e c t r o n i c c a l c u l a t o r d i r e c t l y w i t h t h e M e c o l a bM w h i c h i s u s e d f o r t h e a s s a y s , r e s u l t s are p r i n t e d d i r e c t l y i n n g / l .

T h e m i c r o b i o l o g i c a l a s s a y o f v i t a m i n B 1 2 i n s e r u mw a s f i r s t d e s c r i b e d b y R o s s 1 9 5 0 ) more t h a n2 0 y e a r s a g o u s i n g E u g l e n a g r a c i l i s v a r . b a c i l l a r i sa s t h e t e s t o r g a n i s m . T h e t e c h n i q u e was t e d i o u sa n d t i m e c o n s u m i n g a n d r e q u i r e d e l a b o r a t e p r o -c e d u r e s f o r t h e c l e a n i n g o f g l a s s w a r e . L a t e r t h eZ s t r a i n o f E u g l e n a g r a c i l i s w a s i n t r o d u c e d a n d t h i ss h o r t e n e d t h e g r o w t h p e r i o d r e q u i r e d f o r t h e a s s a yt o f i v e d a y s H u t n e r , B a c h , a n d R o s s , 1 9 5 6 ) . T h i st e c h n i q u e g a v e h i g h l y r e p r o d u c i b l e r e s u l t s a n da p p e a r e d s p e c i f i c f o r v i t a m i n B 1 2 i n s e r u m . S p r a y 1 9 5 5 ) d e s c r i b e d a r a p i d a s s a y t e c h n i q u e u s i n gL a c t o b a c i l l u s l e i c h m a n n i i a s t h e t e s t o r g a n i s m , t h em e t h o d g a v e r a t h e r h i g h e r r e s u l t s t h a n w e r e o b t a i n e du s i n g E u g l e n a a n d was n o t a s s p e c i f i c b u t h a d t h ea d v a n t a g e o f b e i n g a b l e t o p r o v i d e a r e s u l t i n 2 4h o u r s . V a r i a t i o n s o f t h i s b a s i c m e t h o d a r e u s e d b ymany l a b o r a t o r i e s . I n 1 9 6 5 L a u , G o t t l i e b ,W a s s e r m a n , a n d H e r b e r t d e s c r i b e d an a s s a y t e c h -n i q u e b a s e d on i s o t o p e d i l u t i o n . T h i s t e c h n i q u e i su s e f u l f o r l a b o r a t o r i e s m a k i n g a l i m i t e d n u m b e r o fm e a s u r e m e n t s , b u t i t h a s n o t b e e n u s e d w h e r e v e r yl a r g e n u m b e r s o f s a m p l e s r e q u i r e m e a s u r e m e n t , a n dmore r e c e n t l y d o u b t s h a v e b e e n c a s t on t h e v a l i d i t yo f some o f t h e r e s u l t s ( R a v e n , R o b s o n , M o r g a n , a n dH o f f b r a n d , 1 9 7 2 ) .We d e s c r i b e h e r e a f u l l y a u t o m a t e d m e t h o d f o r t h em i c r o b i o l o g i c a l m e a s u r e m e n t o f v i t a m i n B 1 2 u s i n gL a c t o b a c i l l u s l e i c h m a n n i a s t h e t e s t o r g a n i s m .R e s u l t s a r e a v a i l a b l e i n 2 4 h o u r s a n d t h e e q u i p m e n tc a n s e t u p t e s t s a t a s p e e d o f 8 0 an h o u r a n d c a n r e a dr e s u l t s f o l l o w i n g i n c u b a t i o n a t 1 6 0 a n h o u r .R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 2 2 May 1 9 7 3 .

M a t e r i a l s a n d M e t h o d sA c h l o r a m p h e n i c o l - r e s i s t a n t s t r a i n o f L . l e i c h m a n n i iw a s d e v e l o p e d f r o m t h e s t a n d a r d s t r a i n (ATCC 7 8 3 0NCIB 8 1 1 7 ) b y a m e t h o d s i m i l a r t o t h a t d e s c r i b e db y D a v i s , N i c o l , a n d K e l l y 1 9 7 0 ) f o r L a c t o b a c i l l u sc a s e i . T h e s t a n d a r d s t r a i n o f t h e o r g a n i s m w a sp a s s a g e d t h r o u g h l i q u i d m e d i a c o n t a i n i n g i n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o n s o f c h l o r a m p h e n i c o l . A s t o c k s o l u t i o no f 0 - 1 c h l o r a m p h e n i c o l b a s e i n 1 e t h a n o l w a sp r e p a r e d . I n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n s o f t h e a n t i b i o t i cw e r e a d d e d t o o n e o u n c e s c r e w - c a p p e d b o t t l e sc o n t a i n i n g 1 0 m l o f s i n g l e s t r e n g t h a s s a y m e d i a w i t ha d d e d v i t a m i n B 1 2 5 0 n g / l ) . E a c h c o n c e n t r a t i o nw a s p r e p a r e d i n d u p l i c a t e a n d c h l o r a m p h e n i c o l w a sa d d e d i n t h e f o l l o w i n g i n c r e m e n t s : b y 0 5 m g s t e p sf r o m 1 t o 1 0 m g / I ; t h e n i n 1 I 0 m g s t e p s t o 2 0 m g / I ;5 m g s t e p s t o 1 0 0 m g / I ; a n d t h e r e a f t e r 1 0 m g s t e p st o 3 0 0 m g / I . I n t h e e v e n t o f p o o r g r o w t h a t a n y s t a g et h e o r g a n i s m w a s s u b c u l t u r e d b a c k i n t o t h e p r e v i o u sc o n c e n t r a t i o n a n d i n c u b a t e d u n t i l s a t i s f a c t o r y g r o w t hw a s a c h i e v e d . T h e o r g a n i s m w a s s u i t a b l e f o r u s e i nt h e a s s a y w h e n t o l e r a n t t o a c h l o r a m p h e n i c o lc o n c e n t r a t i o n o f 2 0 0 m g / I . I n t h e a s s a y p r o p e rc h l o r a m p h e n i c o l w a s u s e d a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 0m g / l . T h e d i f f e r e n t i a l b e t w e e n t h e t w o c o n c e n t r a t i o n so f a n t i b i o t i c w a s n e c e s s a r y t o e n s u r e v i g o r o u sg r o w t h o f t h e t e s t o r g a n i s m .PRESERVATION OF THE TEST ORGANISMT h e c h l o r a m p h e n i c o l - r e s i s t a n t o r g a n i s m w a s g r o w ni n m a i n t e n a n c e m e d i a w i t h o u t c h l o r a m p h e n i c o l u n t i la h e a v y g r o w t h w a s o b t a i n e d ; t h i s u s u a l l y t o o k 2 4 - 3 64 9 4

8/13/2019 Automated Micobiology Method 4 Vit b12

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An a u t o m a t e d m i c r o b i o l o g i c a l m e t h o d f o r t h e measurement o f v i t a m i n B 1 2h o u r s . The c u l t u r e w a s t h e n c e n t r i f u g e d a n d t h es u p e r n a t a n t d i s c a r d e d . F i v e pe r c e n t s o d i u m g l u t a -mate w a s a d d e d t o g i v e a h e a v y s u s p e n s i o n o f t h eo r g a n i s m . A f e w d r o p s o f t h i s s u s p e n s i o n w e r e t h e na d d e d t o a n a m p o u l e c o n t a i n i n g a b o u t 1 0 0 s m a l ls t e r i l e c e r a m i c b e a d s . The a m p o u l e w a s g e n t l ys h a k e n t o c o a t t h e b e a d s w i t h t h e o r g a n i s m , i t wast h e n c o n n e c t e d t o a vacuum s y s t e m a n d t h e o r g a n i s m sd r i e d f r o m t h e l i q u i d p h a s e . The d r i e d o r g a n i s m sw e r e s t o r e d i n a s c r e w - c a p p e d b o t t l e t o w h i c h twoc r y s t a l s o f i n d i c a t o r s i l i c a g e l h a d b e e n a d d e d . Th em e t h o d was e s s e n t i a l l y t h a t d e s c r i b e d b y A n n e a r 1 9 6 2 ) .PREPARATION OF INOCULUMO n t h e d a y b e f o r e t h e t e s t a t u b e c o n t a i n i n g 1 0 ml o fm a i n t e n a n c e m e d i a w a s i n o c u l a t e d w i t h o ne c e r a m i cb e a d c o n t a i n i n g t h e d r i e d o r g a n i s m . The us e o f a s s a ym e d i a w i t h a d d e d v i t a m i n B 1 2 f o r t h e p r e p a r a t i o no f t h e i n o c u l u m r a t h e r t h a n l e s s w e l l d e f i n e d m e d i as u c h as b r o t h had t h e a d v a n t a g e o f p r o m o t i n g t h eg r o w t h o f t h e t e s t o r g a n i s m s u n d e r c o n d i t i o n ss i m i l a r t o t h o s e f o u n d i n t h e t e s t p r o p e r . Th e c u l t u r ewas i n c u b a t e d o v e r n i g h t a t 3 7 C a f t e r w h i c h i t w a sc e n t r i f u g e d a n d t h e s u p e r n a t a n t d i s c a r d e d . Theo r g a n i s m s w e r e s u s p e n d e d i n s a l i n e t o g i v e a n o p t i c a ld e n s i t y o f 1 - 0 . To e a c h l i t r e o f d o u b l e - s t r e n g t h a s s a ymedium 2 - 0 ml o f t h i s s u s p e n s i o n w a s a d d e d i m m e d i -a t e l y b e f o r e t h e t e s t .SUBSTRATED o u b l e - s t r e n g t h a s s a y medium was p r e p a r e d a c c o r d -i n g t o t h e p r o t o c o l i n t a b l e I. A f t e r m i x i n g t h e pHwas a d j u s t e d t o 6 9 , t h e medium was t h e n s t o r e d a t-2 0 0 C i n 2 - l i t r e p l a s t i c c o n t a i n e r s . I t w i l l k e e pu n d e r t h e s e c o n d i t i o n s f o r m a n y months. A l t e r -n a t i v e l y D i f c o B 1 2 a s s a y medium USP m a y b e u s e dp r o v i d e d t h e pH i s f i r s t a d j u s t e d t o 6 - 9 . I m m e d i a t e l yb e f o r e us e c h l o r a m p h e n i c o l w a s a dded t o a co nce n-t r a t i o n o f 2 0 m g / I .

MAINTENANCE MEDIUMT h i s was s i n g l e - s t r e n g t h a s s a y medium c o n t a i n i n g5 0 n g / l o f v i t a m i n B 1 2 a n d 1 0 0 m g / l c h l o r -a m p h e n i c o l .DISASSOCIATING VITAMIN B1 2 FROM ITSCARRIERM o s t o f t h e v i t a m i n B 1 2 p r e s e n t i n serum i s boundt o a p r o t e i n t r a n s c o b a l a m i n a n d i s no t a v a i l a b l e tot h e t e s t o r g a n i s m i n t h i s f o r m . The v i t a m i n i s u s u a l l yf r e e d f r o m t h e p r o t e i n c a r r i e r w i t h t h e a i d o f h e a t ;t h i s a l s o r e s u l t s i n p r e c i p i t a t i o n o f t h e serum p r o t e i n su n l e s s t h e p r e p a r a t i o n h a s a l o w pH. When u s i n gE . g r a c i l i s as t h e t e s t o r g a n i s m p r e c i p i t a t i o n o f t h es e r u m p r o t e i n s d o e s n o t occur b e c a u s e t h e pH o f t h ep r e p a r a t i o n i s 3 - 6 , w h e r e a s a s s a y s u s i n g L . l e i c h -m a n n i i ar e r un a t a pH o f 59 a n d h e a t i n g w i l lp r e c i p i t a t e t h e p r o t e i n s . To overcome t h i s p r o b l e ms e ru m s a m p l e s w e r e d i l u t e d i n t o 2 - 4 5 m l o f s o l u t i o nc o n t a i n i n g 0 2 g o f m a l i c a c i d a n d 3 - 0 g o f g l u t a m i ca c i d pe r l i t r e ; t h e pH o f t h i s s o l u t i o n s h o u l d b e 3 - 6 .T h e t u b e s w e r e t h e n p l a c e d i n a water b a t h a t 1 0 0 Cf o r f i v e m i n u t e s a f t e r w h i c h t h e y were c o o l e d a n dp r o c e s s i n g c o n t i n u e d . The optimum h e a t i n g t i m e wasd e t e r m i n e d b y p l a c i n g a n a c i d i f i e d s a m p l e i n a b o i l i n gw a t e r b a t h a n d r e m o v i n g a l i q u o t s a t o n e - m i n u t ei n t e r v a l s . N o i n c r e a s e i n f r e e v i t a m i n B 1 2 o c c u r r e da f t e r t h r e e m i n u t e s h e a t i n g .STANDARDSA s t o c k s o l u t i o n was p r e p a r e d b y d i s s o l v i n g 1 0 mgo f c r y s t a l l i n e c y a n o c o b a l a m i n ( S i g m a ) i n 5 0 0 m l o fd i s t i l l e d w a t e r t o g i v e a c o n c e n t r a t i o n o f 2 0 m g / l . Onem i l l i l i t r e o f t h i s s o l u t i o n was t h e n d i l u t e d t o 1 0 0 m lw i t h d i s t i l l e d w a t e r t o g i v e a c o n c e n t r a t i o n o f 2 0 0, u g / l . Aw o r k i n g s o l u t i o n was p r e p a r e d b y t a k i n g 1 m lo f t h e l a s t d i l u t i o n a n d a g a i n d i l u t i n g t o 2 0 0 m l w i t hd i s t i l l e d w a t e r . Th e w o r k i n g s o l u t i o n may b e k e p tf o r f o u r w e e k s when s t o r e d a t 4 C ; t h e s t o c k s o l u t i o nw i l l k e e p f o r m o n t h s i f r e f r i g e r a t e d . T h e w o r k i n g

E n z y m a t i c c a s e i n h y d r o l y s a t e ( N B C ) 2 0 0 ml Ca p a n t o t h e n a t e 2 m gG l u c o s e 4 0 g P y r i d o x i n e HCI 4 mgS o d i u m a c e t a t e a n h v d r o u s ) 1 2 g T h i a m i n e HCI 4 m gL - C y s t i n e 2 0 0 mg N i c t o n i n i c a c i d 2 m gD L - T r y p t o p h a n 4 0 0 mg B i o t i n 1 0 l s gA d e n i n e s u l p h a t e 1 0 mg F o l i c a c i d 1 mgG u a n i n e H C I I 1 0 mg P y r i d o x a l I m gU r a c i l l 1 0 mg p - A m i n o b e n z o i c a c i d 1 m gX a n t h i n e l 1 0 mg D L - a - a l a n i n e gKH,PO4 1 g T h i o m a l i c a c i d I gK.HPO, g C a C I , 2 0 0 m gMgSO4 4 0 0 mg G u a n o s i n e 2 0 0 m gN a C I 2 0 mg G u a n y l i c a c i d 2 0 0 m gF e S O 4 . 7 H , O 2 0 mg C y s t e i n e gM n S O 4 . 7 H 2 0 2 0 mg G l u t a m i n e 4 0 0 m gTween 8 0 / p o l y s o r b a t e 8 0 2 g D i s t i l l e d water t o 1 l i t r eR i b o f l a v i n 2 mgT a b l e I D o u b l e - s t r e n g t h a s s a y m e d i u mD i s s o l v e d b y s u s p e n d i n g i n a s m a l l v o l u m e o f H,O a n d t h e n a d d i n g c o n c e n t r a t e d KOH d r o p b y d r o p u n t i l s o l u t i o n i s c o m p l e t e .

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8/13/2019 Automated Micobiology Method 4 Vit b12

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An a u t o m a t e d m i c r o b i o l o g i c a l m e t h o d f o r t h e m e a s u r e m e nt o f v i t a m i n i B 1 2o f 0 3 3 . T h e r a c k s w e r e t h e n r e t u r n e d t o t h e M e c o l a bw h e r e t h e c o n t e n t s o f e a c h t u b e w e r e m i x e d a n d t h eg r o w t h m e a s u r e d i n t h e c o l o r i m e t e r . R e s u l t s w e r er e c o r d e d i n d i g i t a l f o r m o n t o p a p e r t a p e .CALCULATION OF RESULTSR e a d i n g s o b t a i n e d f r o m t h e s t a n d a r d s c a n b e u s e dt o p l o t a c u r v e o n l i n e a r g r a p h p a p e r , a n d t h ec o n c e n tr a ti o n o f t h e u n k n o w n c a n b e d e t e r m i n e d b yi n t e r p o l a t i o n . H o w e v e r , t h i s i s i n c o n v e n i e n t whenl a r g e n u m b e r s o f s a m p l e s a r e b e i n g p r o c e s s e d . Am o r e s a t i s f a c t o r y a p p r o a c h i s t o u s e a p r o g r a m m a b l ee l e c t r o n i c c a l c u l a t o r s u c h a s t h e D i e h l C o m b i t r o n Sw i t h p u n c h t a p e r e a d e r . T h e p r o g r a m c a n b e p u n c h e do n t o p a p e r t a p e a n d b y p a s s i n g t h i s t h r o u g h t h e t a p er e a d e r t h e m a c h i n e c a n b e r a p i d l y s e t u p .T h e C o m b i t r o n S u s e s t h e f o l l o w i n g f o r m u l a f o rl i n e a r i n t e r p o l a t i o n :

= d ( d - b ) ( c - x )y= c - a )T h e f o r m u l a a s s u m e s a s t r a i g h t l i n e b e t w e e n a n yt w o p o i n t s o n t h e c u r v e a n d t h i s i n t r o d u c e s a s m a l ld e g r e e o f e r r o r w h i c h h a s n o t b e e n f o u n d t o e x c e e d2 - 5 .T h e p r o g r a m w a s f e d i n t o t h e p u n c h e d t a p e r e a d e ra n d t h e a b s o r b e n c e v a l u e s o b t a i n e d f r o m t h es t a n d a r d s w e r e e n t e r e d i n t o t h e D i e h l C o m b i t r o n Sw h e r e t h e y w e r e m a t c h e d w i t h t h e s t a n d a r d c o n -c e n t r a t i o n s t h a t t h e y r e p r e s e n t , i e , 1 0 0 , 2 0 0 , 3 0 0 , 6 0 0 ,a n d 1 0 0 0 n g / l . T h e unknown v a l u e s w e r e t h e ne n t e r e d i n t o t h e m a c h i n e a n d a n u m b e r o f l o g i c a ld e c i s i o n s w e r e m a d e t o d e t e r m i n e b e t w e e n w h i c h t w op o i n t s on t h e c u r v e t h e u n k n o w n f i t t e d . T h e m a c h i n et h e n a p p l i e d t h e l i n e a r i n t e r p o l a t i o n f o r m u l a u s i n gt h e a p p r o p r i a t e v a l u e s f o r A , C , B a n d D , a n d t h er e s u l t i s p r i n t e d t o g e t h e r w i t h t h e o r i g i n a l a b s o r b e n c ev a l u e o n t o p a p e r t a p e .E x - - a m p l e ( f i g 2 )

x =2 6 7a =2 0 0 b = 3 0 0

d =6 0 0c =400 ( d - b ) c - x )y ~ ~ c a600_ 300 400 267~400200

3 0 0 ) 1 3 3 )2

=6 0 0 - 9 9 - 5= 4 0 0 5 n g / 1

When u s i n g s m a l l c a l c u l a t o r s i n t h i s way t h e t i m e

- 0 0

600 _

w 500zm0 4 00m

30 0

2 0 C

1 0 C

C

D

A

1 0 0 2 ( c : e C C YB 1 2 n g I l

F i g 2 P o i n t s e l e c t i o n f o r l i n e a r i n t e r p o l a t i o n i .

t a k e n f o r e a c h c a l c u l a t i o n e x t e n d s o v e r s e v e r a ls e c o n d s a n d t h i s m u s t n o t b e a l l o w e d t o e x c e e d t h et i m e t a k e n b y t h e M e c o l a b t o m e a s u r e s a m p l ea b s o r b e n c e . A maximum o f 2 0 s e c o n d s i s p e r m i t t e da n d t h i s r e s t r i c t s t h e n u m b e r o f s t a n d a r d s t h a t c a n b eu s e d .T h e o u t p u t o f t h e M e c o l a b m ay b e i n t e r f a c e dd i r e c t l y w i t h t h e C o m b i t r o n S ; t h e c a l c u l a t o r w i l lt h e n a u t o m a t i c a l l y p r i n t t h e a b s o r b e n c e v a l u e a n dt h e c o n c e n t r a t i o n i n n g / l .V i t a m i n B 1 2 w a s a l s o m e a s u r e d u s i n g E u g l e n ag r a c i l i s a s t h e t e s t o r g a n i s m ( N i c h o l a s a n d P i t n e y ,1 9 5 8 ) . T h e n o r m a l r a n g e f o r t h i s l a b o r a t o r y i s 1 6 0 -8 7 5 n g / l .A t o t a l o f 1 5 0 s e r a w a s a s s a y e d b y b o t h t h ea u t o m a t e d L . l e i c h m a n n i i a n d E . g r a c i l i s m e t h o d s .One h u n d r e d w e r e f r o m n o r m a l i n d i v i d u a l s a n d 5 0w e r e f r o m p a t i e n t s w i t h a v a r i e t y o f d i s o r d e r s w h i c hi n c l u d e d v i t a m i n B 1 2 m a l a b s o r p t i o n a n d l i v e rd i s e a s e .R e s u l t sT h e c o m p a r i s o n b e t w e e n t h e L . l e i c h m a n n i i a n d E .g r a c i l i s a s s a y s a r e s h o w n i n f i g 3 a n d t h e d i f f e r e n c e w a ss t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t 0 - 0 0 1 < p < 0 - 0 1 ) . H o w e v e r ,t h e d i f f e r e n c e w a s c o n s t a n t a t a l l l e v e l s . R e s u l t s u s i n gt h e p r e s e n t m e t h o d i f m u l t i p l i e d b y a f a c t o r o f 0 - 7 3 4g a v e r e s u l t s s i m i l a r t o t h o s e o b t a i n e d u s i n g E u g l e n aa n d r e s u l t s u s i n g E u g l e n a i f m u l t i p l i e d b y a f a c t o r o f1 - 3 g a v e r e s u l t s s i m i l a r t o t h o s e o b t a i n e d w i t h L .l e i c h m a n n f i ; u s i n g t h e s e f a c t o r s t h e c o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t w a s 0 - 9 5 1 . T h e l e a s t s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c eu s i n g a n a n a l y s i s o f d u p l i c a t e s w i t h L . l e i c h m a n n i iw a s 1 0 8 n g / l w i t h a c o e f f i c i e n t o f v a r i a t i o n o f 9 - 4 4 5 ;t h i s w a s n o t q u i t e a s g o o d a s t h a t o b t a i n e d w i t h t h eE u g l e n a a s s a y o f 8 2 - 9 n g / l a n d a c o e f f i c i e n t o f

4 9 7

600 1 C X ) U

8/13/2019 Automated Micobiology Method 4 Vit b12

5/5

R . E . D a v i s , J . M o u l t o n , a n i d A . K e l l y

E U B I E M A f l / 1F i g 3 C o m p a r i s o n o f v i t a m i n B 1 2 v a l u e s o b t a i n e d f i o m1 5 0 s e r a b Y E . g r a c i l i s a n d L . l e i c h m a n n i i a s s a y s .v a r i a t i o n o f 7 5 5 3 . T h e mean o f t h e 1 0 0 s e r a f r o mn o r m a l i n d i v i d u a l s w a s 4 1 0 n g / l r a n g e 1 5 0 - 1 0 0 0n g / l ) w h e n a s s a y e d u s i n g L . l e i c h m a n n i i . Te n s e r u ms a m p l e s h a d a l o w v i t a m i n B 1 2 c o n c e n t r a t i o n whena s s a y e d u s i n g L . l e i c h m a n n i i a s t h e t e s t o r g a n i s m . Thea s s a y w a s r e p e a t e d u s i n g E . g r a c i l i s a s t h e t e s to r g a n i s m a n d t h e r e s u l t s a r e s h o w n i n t a b l e I I I .A n u m b e r o f w o r k e r s h a v e r e c o m m e n d e d t h ea d d i t i o n o f c y a n i d e t o t h e a s s a y s y s t e m ( G i r d w o o d ,E u g l e n a g r a c i l i x L a c t o b a c i l l u s l e i c h i n a n n i i/ I g l ) n g l l ) 3 6 6 55 0 6 05 0 5 47 2 1 0 01 2 0 1 4 06 0 8 01 6 5 2 0 01 3 0 1 6 51 0 0 1 3 01 8 0 1 8 0T a b l e I I I C o m p a r i s o n o f r e s u l t s o b t a i n e d i n 1 0 s a m p l e sw i t h l o w l e v e l s u t s i n g E u g l e n a g r a c i l i s a n d L a c t o b a c i l l u sl e i c h m a n n i i .

1 9 6 0 ; B r a n d t a n d M e t z , 1 9 6 1 ; S p r a y , 1 9 6 2 ;M a t t h e w , , 1 9 6 2 ) s i n c e i t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t L .l e i c h m a n n i i i s o n l y s e n s i t i v e t o c y a n o c o b a l a m i n . Tod e t e r m i n e t h e e f f e c t o f c y a n i d e on t h e a s s a y 3 2s e r u m s a m p l e s w e r e a s s a y e d w i t h a n d w i t h o u t t h ea d d i t i o n o f s o d i u m c y a n i d e 0 - 0 1 2 5 g / l ) ; t h e r e s u l t ss h o w e d no s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e , Z = 0 - 0 2 9 4 1 .

D i s c u s s i o nA r a p i d , f u l l y a u t o m a t e d m e t h o d s u i t a b l e f o r t h em e a s u r e m e n t o f s e r u m v i t a m i n B 1 2 i n s e r u m h a sb e e n d e s c r i b e d . T h e m e t h o d u s e s a c h l o r a m p h e n i c o l -r e s i s t a n t s t r a i n o f L . l e i c h m a n n i i a s t h e t e s t o r g a n i s ma n d t h i s h a s r e m o v e d t h e n e e d f o r s t e r i l i z a t i o n o ra s e p t i c a d d i t i o n .P r e c i p i t a t i o n o f s e r u m p r o t e i n h a s b e e n o v e r c o m eb y t h e u s e o f a m a l i c / g l u t a m i c a c i d d i l u e n t b e f o r eh e a t i n g t h e s a m p l e s t o f r e e t h e v i t a m i n f r o m i t sp r o t e i n c a r r i e r . When c o m b i n e d w i t h a n a u t o m a t e df o l a t e a s s a y s y s t e m ( D a v i s e t a l , 1 9 7 0 ) a l a r g en u m b e r o f s a m p l e s c a n b e p r o c e s s e d a n d r e s u l t s f r o mb o t h a s s a y s a r e a v a i l a b l e w i t h i n 2 4 h o u r s .T h e mean l e v e l f o r 1 0 0 s e r a w a s * , 1 0 n g / l ( r a n g e1 5 0 - 1 0 0 0 ) c o m p a r e d w i t h a mean o f 4 7 1 ( r a n g e1 5 5 - 1 0 7 5 n g / l ) r e p o r t e d b y R a v e n a n d h i s c o l l e a g u e s 1 9 7 2 ) . A l t h o u g h r e s u l t s a r e h i g h e r t h a n t h o s eo b t a i n e d w i t h t h e E u g l e n a a s s a y t h e d i f f e r e n c e i sc o n s t a n t a n d a d j u s t e d r e s u l t s h a v e a c l o s e c o r r e -l a t i o n .T h e a c i d d i l u e n t i s o f l o w i o n i c s t r e n g t h a n d t h epH o f t h e a s s a y medium i s a d j u s t e d s o t h a t a f i n a lpH o f 5 9 i s a c h i e v e d .T h e m e t h o d i s p a r t i c u l a r l y w e l l s u i t e d f o r i n s t i t u -t i o n a l a n d p o p u l a t i o n s u r v e y s . R e s u l t s b e l o w 2 0 0n g / l may b e c o n f i r m e d u s i n g t h e E u g l e n a a s s a y .We w i s h t o t h a n k Mr D . J . N i c o l f o r h i s h e l p w i t ht h e s t a t i s t i c a l a n a l y s i s , a n d Dr J . M. J a c k s o n f o r h i se n c o u r a g e m e n t .R e f e r e n c e sA n n e a r , D. 1 . ( 1 9 6 2 ) . R e c o v e r i e s o f b a c t e r i a a f t e r d r y i n g on c e l l u l o s ef i b r e s . A u s t . J . e r p . B i o l . n t e d . S c i . , 4 0 , 1 - 8 .B r a n d t , V . , and M e t z , J . 1 9 6 1 ) . Serum v i t a m i n B 1 2 l e v e l s i n S o u t hA f r i c a n w h i t e a n d B a n t u s u b j e c t s . S . A f r . J . m e d . S c i . 2 6 , 1 - 3 .D a v i s , R . E . , N i c o l , D . J . , a n d K e l l y , A . 1 9 7 0 ) . An a u t o m a t e d methodf o r t h e measirement o f f o l a t e a c t i v i t y . J . c l i n . P a t h . , 2 3 , 4 7 - 5 3 .G i r d w o o d , R . H . 1 9 6 0 ) . M i c r o b i o l o g i c a l m e t h o d s o f a s s a y i n c l i n i c a lm e d i c i n e w i t h p a r t i c u l a r r e f e r e n c e t o t h e i n v e s t i g a t i o n o fd e f i c i e n c y o f v i t a m i n B , 2 a n d f o l i c a c i d . S c o t . n i t e d . J . , 5 , 1 0 - 2 2 .H u t n e r , S . H . , B a c h , M. K . , a n d R o s s , G . 1 . M. ( 1 9 5 6 ) . s u g a r -c o n t a i n i n g b a s a l medium f o r v i t a m i n B I 2 - a s s a y w i t h E u g l e n a ;a p p l i c a t i o n t o b o d y f l u i d s . J . P r o t o z o o l . , 3 , 1 0 1 - 1 1 2 .L a u . K - S . , G ot t li e b , C . , W a s s e r m a n , L . R . , an d H e r b e r t , V . ( 1 9 6 5 ) .

Measurement o f serum v i t a m i n B 1 . l e v e l u s i n g r a d i o i s o t o p ed i l u t i o n a n d c o a t e d c h a r c o a l . B l o o d 2 6 , 2 0 2 - 2 1 4 .M a t t h e w s , D . M. 1 9 6 2 ) . O b s e r v a t i o n s on t he e s t i m a t i o n o f s e r u mv i t a m i n B 1 . u s i n g L a c t o b a c i l l u s l e i c h m a n n i i . C l i n . S i . , 2 2 ,1 0 1 - 1 1 1 .N i c h o l a s , D e i r d r e R . , and P i t n e y , W. R . ( 1 9 5 8 ) . M i c r o b i o l og i c a l a s sa yo f v i t a m i n B 1 1 c o n t e n t o f s e r u m u s i n g E u g l e n a g r a c i i / i s . A u s t .J . e x p . B i o l . t o e d . S c i . , 3 6 , 6 0 3 - 6 0 8 .R a v e n , J . L . , R o b s o n , M. B . , M o r g a n , J . O . , a n d H o f f b r a n d , A . V .( 1 9 7 2 ) . Comparison o f t h r e e m e t h o d s f o r m e a s u r i n g v i t a m i nB 1 2 i n s e r u m : r a d i o i s o t o p i c , E u g l e n a g r a c i / i s an d L a c t o b a c i l / i u sl e i c h / m a n n i i . B r i t . J . H a e m a t . , 2 2 , 2 1 - 3 1 .R o s s , G . 1 . M. 1 9 5 0 ) . V i t a m i n B 1 , a s s a y i n body f l u i d s . . a t u r e L o n d . ) , 1 6 6 , 2 7 0 - 2 7 1 .S p r a y , G . H . 1 9 5 5 ) . An i m p r o v e d method f o r t he r ap i d e s t i m a t i o n o fv i t a m i n B 1 2 i n s e r u m . C / i n . S c i . , 1 4 , 6 6 1 - 6 6 7 .S p r a y , G . H . 1 9 6 2 ) . Th e e s t i m a t i o n o f s i g n i f i c a n c e o f t h e l e v e l o fv i t a m i n B 1 , i n s e r u m . P o s t g r a d . m e d . J . , 3 8 , 3 5 - 4 0 .

4 9 8