Automated DNA fragment collection by capillary array gel electrophoresis in search of differentially...

8
Automated DNA fragment collection by capillary array gel electrophoresis in search of differentially expressed genes An automatic DNA fragment collector using capillary array gel electrophoresis has been developed. A sheath flow technique is used for not only detection but also collec- tion of DNA fragments. In a sheath flow cell, the DNA fragments separated by 16 capil- laries flow independently into corresponding sampling capillaries. The fraction collector consists of 16 sampling trays and each sampling tray is set beneath each end of the sampling capillaries to collect the flow-through DNA fragments. Certain DNA fragments are automatically sorted by controlling the movement of the sampling trays according to the signals from the system. The collector experimentally separated two mixtures of polymerase chain reaction (PCR) products: one prepared by using eight different sizes (base lengths from 161 to 562) of DNAs; and the other prepared by a differential dis- play (DD) method with cDNA fragments. Collected DNA fragments are amplified by PCR and measured by electrophoresis. DNA fragments with base length differences of one (base lengths 363 and 364) were successfully separated. A separated DNA frag- ment from the DD sample was also successfully sequenced. In addition, differentially expressed DNA fragments were automatically sorted by comparative analysis, in which two similar cDNA fragment groups, labeled by two different fluorophores, respectively, were analyzed in the same gel-filled capillary. These results show that the automatic DNA fragment collector is useful for gene hunting in research fields such as drug dis- covery and DNA diagnostics. Keywords: Capillary array gel electrophoresis / Fraction collector / Differential display gene hunting EL 3698 Takashi Irie 1 Tadahiro Oshida 2 Hideki Hasegawa 1 Yoshiko Matsuoka 1 Tao Li 1 Yukio Oya 2 Toshio Tanaka 3 Gozoh Tsujimoto 4 Hideki Kambara 1 1 Central Research Laboratory, Hitachi, Kokubunji, Tokyo, Japan 2 Genox Research, Teikyo University Biotechnology Center, Kawasaki, Kanagawa, Japan 3 Department of Molecular and Cellular Pharmacology, Mie University School of Medicine, Tsu, Mie, Japan 4 Department of Molecular Cell Pharmacology, National Children©s Medical Research Center, Setagaya-ku, Tokyo, Japan 1 Introduction As the genome project progresses, gene expression anal- ysis is becoming one of the major subjects in DNA analy- sis. For medical applications, such as DNA diagnostics and drug discovery, target genes corresponding to vari- ous common diseases (for example cancers, diabetes, and allergy-related diseases) are being intensively explored by comparing gene expression profiles in vari- ous tissues. Various methods (including differential dis- play (DD) [1, 2] and amplified fragment length polymor- phisms (AFLP) [3] for the gene expression profiling based on gel electrophoresis have been developed. However, these methods have two potentially major disadvantages. One is the large number of reaction products to be ana- lyzed. For example, in the DD method, more than 450 combinations of primers for polymerase chain reaction (PCR) are necessary in order to display a whole species (ca. 15 000) of expressed genes [2]. The other is the manual extraction of DNA fragments originating in the dif- ferentially expressed genes to obtain the sequence infor- mation of the fragments so that the genes can be identi- fied. The corresponding DNA fragments must be excised from a gel plate and purified. This is time-consuming and labor-intensive. A high-throughput and automatic DNA fragment collector is therefore important. We think that capillary array gel electrophoresis coupled with sheath flow detection [4] is very suitable for the automatic collec- tion of the DNA fragments. The DNA fragments eluted from a gel-filled capillary into the sheath flow can be col- lected easily without disturbing the electrophoresis. Several designs of DNA fragment collectors using capil- lary gel electrophoresis have already been developed [5], whereby one design presents a high-precision fraction collector that uses glass capillaries as collection vials. This system is designed to collect all the DNA fragments in a sample. However, this is not so convenient, espe- cially for the DD analysis with multiple capillaries, because more than one hundred DNA fragments are usu- ally contained in the DD sample. However, only a few DNA fragments in each sample are differentially ex- Correspondence: Dr. Takashi Irie, Biosystems Department, Central Research Laboratory, Hitachi, 1-280, Higashi-Koigakubo, Kokubunji-shi, Tokyo, 185-8601, Japan E-mail: [email protected] Fax: +81-42-327-7751 Abbreviations: AFLP, amplified fragment length polymorphism; DD, differential display Electrophoresis 2000, 21, 367±374 367 WILEY-VCH Verlag GmbH, 69451 Weinheim, 2000 0173-0835/00/0202-0367 $17.50+.50/0 CE and CEC

Transcript of Automated DNA fragment collection by capillary array gel electrophoresis in search of differentially...

��������� � ��� ���� ���������� �� �������������� �� ��������������� �� ������ �� ����������������������� ����

�� �������� �� � ������ ������ ����� ������ � � �� ��� ���� ���� ���� ������� ���������� � ������ ���� �������� �� ���� �� ��� ���� �������� ��� ���� ��������� �� �� � �������� �� � ������ ���� ���� ��� �� � ������� ���� ���� �� �� ������� ��� ���� ������������� ���� � ��������� �������� ������ ���� �� � ����� ������ ������� �� �� �������� � ��� ��� ��� �������� � �� �� ��� ������� ��� ��� �� ����������� ������ ��� �� ����� ��� ������� ���� �� � �������� !� ���� �� � �������� � ������������ �� ��� �� ��� ������ ��� �������� �� ��� �������� � ��� �� ������ ��� ������� � �� ��� ������� �� ������ �"�� ��������� ���� ���� ��� ��"�� �� �������� ��� ���� ������ #$!%& � �����' ��� � ��� �� �� ����� ����� ����� ��� ��(��#���� ������� � �� ��� �� )�*& �� ���+ ��� ��� ���� � ��� �� �� � ����� ������ �������� #& ������ ���� �� � �������� !������� �� � ������� � � ��������� ��$!% ��� ����� �� �� ���� ���� ����� �� � ������� ���� ���� ������ ����� ���� ����� #���� ������� ,�, ��� ,�-& �� � ���������� ���� ����� � ���� ���� �� � ������� � �� ��� ������ ��� ���� ���������� ��������� �� ��������� ����� ���������"� ����� �� � ������� �� � ������������ �� ��� �� ���� ����� ��������� �� ������� ������ �� � ������ � ����� ������� �� ��� ����� ��� ���� ���� ��� ������������� � �����(�� �� ��� ���� ���������� ������ �� ���� ������ ���� ���� ��� ���������� � ������ ������ �� ������ �� ���� ������� �� ���� � ������ ��� �� � �� ������� � ��� �� �����������

��������� !������ � � �� ��� ���� ���� ���� . / ����� ������ . ���� ������ ������� ����

������� 01 ,�23

������� �����

�������� ������

!����� !��� ����

"������ #��������

��� $��

"���� ���

������ ������%

&�'�� ���(�����)

!����� ��������

�!��� �� %���� �1��� ��� �� 4������5�6����7�� �6��� 8����*9���" %���� �� ��6��:���� ���� ;�����������!���� � 5�����6��5�������� 8����,��� ����� �� <������ ��� !������ $�� ��������<�� :���� ���� =���� ��<������� ��� <��� 8����-��� ����� �� <������ !��� $�� ���������������� !���� ��>� <�����%���� � !���� �=��������6�� �6��� 8����

� ������������

�� ��� ������ � �7�� � �� ������ ���� �"� ������ ��������� �� ������� ��� �� ��� ��7� ���7��� �� �� ���������� /� ������ ������������ ��� �� �� ������������� � �� ������ �� �� ��� ����� � ��������� �� �� ����� ����� �������� #�� �"����� ��� �� ������������ ���� ��� ������ ��������& � � ����� ������������"��� �� �� ���� ��� ���� �"� ������ � ������ �� �� ����� �������� ?� ���� ������� #�������� ����� ������ �������� #& @�� *A ��� ��������� � ������ ������ ������ ������� #�/1$& @,A �� ��� ���� �"� ������ � ������� ������� ��� ���� ���� ���� ���� ���� ���������� 4����� ������ ������� ���� ��� ����������� ��7� ��������������B�� �� ��� �� �� ����� �� ������ � ����� �� �� ������(��� /� �"������ �� ��� ������� �� � ���� -)C����������� �� � ��� � �� ������ ��� ���� ������

#$!%& � � ������ � �� � �� �� ������� � ����� ������#��� �) CCC& �� �"� ����� ����� @*A� �� ���� �� ��������� �"� ����� �� �� � ������� � ��������� �� ��� ������ �������� �"� ����� ����� �� ������ ��� ������� ���� ������� �� ��� � ������� �� ���� ��� ����� �� �� ������������ �� � ��������� �� � ������� ���� �� �"����� �� � ��� ����� ��� �� ������ ��� �� ������������� ������� ����������� � ������� ������� ��� �������� ��� ������ ������ �� ��� ��� � ���� ����� D� ����6 ���������� � � �� ��� ���� ���� ���� ������ ���� ���������� �������� @-A �� �� � �������� �� ��� �������� ��������� �� ��� �� � �������� �� �� � ������� ������� �� � ���������� ������ � ���� ��� ������ ���� �� �� �������� ������ ������� ����� ���� ��� ���� ���� �����

=��� �� ������� �� �� � ������ ������ � ����� ������� � ��� ���� ���� ���� ���� �� ���� ���� ��������� @)A���� ��� ��� ������ � ������ � ������ ������ � ����������� ���� ���� ����� ������ ��� �� �������� ������ ��� ������ �� �������� �� ����� ��� ��� �� � ��������� � ������� 4����� � ���� �� ��� �� ���������� ���������� �� ��� �������� ���� �������� ������ ���������� �� � ���� ��� ���� �� �� � ������� � � �������� �������� �� ��� ������� 4����� � ���� � ����� � ������� �� ��� ������ � � ����� �������� �"�

*�������������� � �6���� � ��� ;��������� ��� ������!��� �� %���� � 1��� ��� �� 4������ ��*3C� 4�������5����6����5�6����7������ �6��� �3)�3�C�� 8����+,����� ��6�� ��E �����������7�-��� F3��-*�,*G�GG)�

�����.�������� �-$/� ��������� � ������ ������ ������ �����+� ����� ������ �������

���������� � *CCC� ��� ,�GH,G- ,�G

I D�10J�?!4 ?� ��� 9��4� �2-)� D�������� *CCC C�G,�C3,).CC.C*C*�C,�G K�G�)CF�)C.C

*+��

�*+*

� ����� ���� ����� � � �� ���� ���� !������������ �� ������������ � � ����� ������ �� ������������ ����� ����� ���� �� � ������� �� ��������

#�������� ��� �������

0� ����������

�� ���� ����� ��� �������� �� �� � �� � ������������ ��� �� � ���� �"� ������ � ������� ���� �� ����� � � �/1$ ���� ��� ���� �������� �"� ����� ��� ������� ������ �� �"� ���� �� �������� �������� ����� �� ���������� �� ����� �� ����� �� � �������� �� � ���� �� ������� ���� ��� �"��� �����+ ��� ���� �� �� ������� ���� ��� ��"���� ����� �� �� ��� � �������� �� �� ��� ����� ��� ������ �� ����� ������ ���� ���� ����� ���� �� �� �� �� �� ��������+ ������� � ��� ���� ����� ��6� ��� ������ �����"� D���� ��� � ���� ��"���� ����� �� ��� ������� /��� � ������������ ������ ���� ��� �������� �� � ������ ������� � �� ������ � � �� ��� ���� ���� ���� ���� ��������� �� ���� ����� ��� � ���� ��� ������� ������ ������ ��� � �������� ��� ���� ������ @-A� 0��� ���� ���� ����� �� ��� �� G) �� �� *CC �� B� ����������� ������ ���� #$����� � ����������� $�����"� �L� :=�& ����� ���6 ��������� ������� �� ���J�9 ���� #),* ����C �D+ !��� ��� 8����� �6��� 8����& ��� ���� �� � �������� ���� ���� �� ������� �� ��� �� � �������� �� ���� ����� ������ �� � ������� �� � ����� !!����� #=GC�� �� ���� �C*-#4& � �*-#?& ��"���� *- � *-�� ��"�� ��(�+ 4�������� $�������� 4���������8����&� <������� ����������� �� � ������� ��� � ��) �

���� �� ��������������� � ��� ��� ��������� ����� � �� ����������� �� ))C� )3C� ��� ��C ��� ���� � �������� ��� �������� ����������� �� ��� ���� ���� �� ����'4�"� �<%�� ��� %�"� �� ���������� �� ����� ����� ��� � ����� *C ��� 1��� ��� ������� ������ � #4����� =����� =������� ��� ���� 8����& ��� ���� �� ������� ����������� �������� �� ��� �� ������� � �� ��� ������ ������ �� ��� ������ ��� � ����� ������ � �� � ���������� ��� ���� ��� #������ ���� ���& �� �������� ��� ��������� �� � ������� �� ����� �� /��� *� =�"���� ���������������� ��� �� � � ����� �� � ����� ���� C�3 �� �������B�� ��� �� ��� ���������� ������ � �� ���� ��� �� � ���#C�*� �� �� �����& �� � ��� �( ���� ��� ��� ��� �� ��"����� �������� ������ ��� �� ���� ����� �� ��� ��� �� ������� ������� ������� ���� ���� �� � ��� ;��� 6���� �������� ��� � � ������� ���� ��� ����������� ���� ���� C�*�� #������� ������� �� ��� ������ �& �� � �� �� ���������� �������6 #������������ � �� ������� ��� ���������������� ���&� �� �������� ������ ��� � � ��� ���� ������� ���� �� ���� ���� ����� ;���� �������� ����� ��� ����� �� ��� ��� ����� ��� ���������� ������ ���� �� ��� ������� ���� ���� �� ��� ������ � ��� � � ������ � ����� ������ � ���� � ������� �� ��� ���� � ��� ���� �������� ��� � ��������� �������� ������ �� �� ������ �� � ������ ��"�� �� ������� �� ��� ����� ��� ���� ����� �� � � �������������� �����(�� �� ��� ���������� ������� �� D��� ��� ��������� ��� ����� ������� ��� ��� ����� ���� �� �"���� � � ����� ����� �� ������ ������ ��������� ������ � ���������� ���� ��� ����� ��� ��������� ��� � ����� ������ �� � �� �� ����� ��� � ���������� ������� ���� �� � �������� ��� �� ��������� ����� �������� �����

,�3 � � �� �� ��� ���������� � *CCC� ��� ,�GH,G-

-� ��� �0 =������ � ����� ����� �������� �� � ������������ � �� ��� ���� ��"�������������� ������ ��� �� ��(� ����� ����� �� �� � �������� ������� ���� ��� �� ����������� �������� �� � ����������� ��"���� �������� ������ ����� � ����� ���� ��� �� � �������� �� � � ����� ������ ���������� �� �������� ��"���� �������� � ������� ��� ��� �� ������������� ������ � � �� ��� ������ ��� ��� #������ ��� ��� &�� ��� ������ ���� ��� #����� ��� ��� & �� �������� � ��������� ���� �������� ��� � � �� ���� � ����� ��� � �� ��� ���������� ��� �� ��� ����� ��� �� ���

� ����� ������ �� ���� ��� �������� ������ �� ��� � ����� ������ �� �� �� ��� �� � ���� �� ��� ����� �������� ��������� �� ��� ����� ��� ��� �� ������ ���� �� � ������ <������� ���� ���� �� ������� �� ����� ��� �� � ������ � ���� � �������� �� ����� �� ��������������� � ��� ������� ���� ��������� ����� � ��� � ����� !! � �� ����� �

0 -������� ���������

�� � ����� ������ ������� �� �� �������� ��� � �� ��������� � ��� ��� � ��� ����� ����� ��������� � � ���� ����� �������������� �� �� ���� ���� ������ � #�C ���� �6�+ 5������ !��� �6��� 8����& ���� ��� ��������� �� �� �� �������� ��� �� �(����� �� ������� ������������ � ���� ��������� �� ����� ����� #,C �1 ������ ���&���� � -�) �� ���� #,3- ���� �� ����� ����� ���������&�� ����� �� ��� �������� � ��� 0�� ���� �� ������ ���� *C�1 �� ���� �� ���� D��� ��� � ����� ������ ������ ������ ����� ������� ��� �������� � �� �������� �� ��� ������� ����� �� �� � ��� ���� ��� �� ���� ����� ��� ��������� �� ������ ��� � ��������� � ��� ���� ��� ��� ���� ������ �� ��� �������� ������ � ���� ���� ��� ���� �� ����� ���� � ������� #C�) �� ������� & �� ��� ������ �� ���� ��� ����� �� ������� ���� ����� �������� �� ������� ����� ���� �� 6������ ��� �������� � �� �� �� � � ����� ������ ���� #�������� ����&� �� ������� ������ ����� �"������� � �1� �� �������� ������� �������� ����������� ��� ��� �������� ���� ��� ���� ����� �"�� ���������� �� �C � ��� *C �� ����������� ���� ���������� �� ������(�� ��������� �� ��� ��� ��� ���� ��������� ��� �������� ������ � ��� ��� ������ �� ��� �������������� �� �� �"������� ���� #=����� ,��&� �� ������ ����� �������� ������ � ������ �� �� ��� � �� ��������� ����� ��� �� �* �� ���� ��� ������� �� ��������� ���� ����� ������ ���� �� 3 � ������

0% /���������� �� ��,������ �����������

9��������� ������ ��� �� � � ��� �� �� ���� �� � ��������� ��� ���� � ���� �� @�� GA� �� �������6�� ����� �������� ��� ��� � ���������� �� -M � ������� ���� )M �������6� #-M � )M! ���&� �� �� �������6�� ������ # ��������� ���& �� ��� �������� �� ���� ���������������� ��� ������ ���� ���� ��� �������� ������ ������ ���� ��� �������� �� �� � ������ �� ����� ���� ��� ������� �������� ��� � ��� �� �� �� 32 �< ����� ���� *�) �< 0 � ����� ��� G < � �� #�4 3�,&� �������� �� ��� ���������� ������ � ��� *C � �� ������� ���������

0) +��������������

=����� ������� �� � ����� �� ����� �� � ������ � ���D��� ��� ������� �� � �� �� ���� ���� ������� ��7�������� ��� ���������� ������ ���� ��� ��7����� ���� �� ������ �� ��� ���� ��� ������ ���� ��� ������ �������� �������� �� *) ?.� �� ������� �� *C � �� ��� ���� ��������� �� ��� ������ �� ��� ������ ���� ��7������ ��� ��7������ ���� �� � ������ �� � �CC �1 ����� #32 �< ����� ���� *�) �< 0 � ����� � G < � ��� �4 3�,& ��� ��� ��������� � �������� �� � ���� ���� �� ������� ��� ��� ����� ���� �� ���� �� ����� ������ �� ���� �� ��� ������� � ���' *) ?.� �� �C ���� )C ?.� �� *) ���� ���� ���� ��� ��� ������ #,CH3C ?.�&� � ����� �������� #32 �<

����� ���� *�) �< 0 � ����� � C�C*M �����*C� �4

���������� � *CCC� ��� ,�GH,G- ��������� �� � ������ �������� ,�2

-� ��� 0 =������ � ������� ��� ������ ���� ��� ��� ������� ����� ��������� =�"�������������� ������ ��� � � � � ����� �� � ����� ���� C�3 �������� ��� ��� �� ���� ���� ������ ��� �� � ��� �� ��� ��� �(���� B�� ��� �� ��� �� ��"������������ ������ ��� �� ��������� �� ��� ��� �� ���� ����6���� �� ���� � � ������� ���6��� ���� ������� �� � ���=����� �� � ������� ��� ��� ��� ���� ������� �� ����� ���� ���� ���� �� � � �����(���������������� �� ��� ���� ���������� ������ �� �� �� � �������� � � ������ � �� ��� �����

�� � ����� ������� ������������ ���� ��� �������� ������ ��� �� � ������ ����� ��� � ����� ��� �� ��� ����� �� � ���� �� ����������� ������ ���� =��� � ��������������� ����� #��� ����� �� ���� ���� �& ����� ���� ��� ��� �( ��� �� � ������� ��� ������ �������� �������� �� ��� ��� �( ��� ��� ��� �������� ������ ��� �� ���� � ������� �� ��� �� ��� ���� ���� �� ��� ����� �������� �� ��� ��� �( ��� ��� ��� �������� ������ ��� � � ������ ���� ����� �� � ������ � �������� � ���� ��������������� ������� ��� �� � ������� ������� � �� ��� ���������� ������ ���� �� � �� �� �� � ����� �������� �"� ����� �� � ���������������� �� ��� ����� ����� �� ��� � ����� ������ �� � ���� �� ���� ��� ����� ������� ���� ����� ����������� ������� ��� ���� ���� �� �"���� � � ���� �� ������ ����� #���� ����� ��������&�

3�,& ��� ���� �� ��6��� ��� ������ ����� �� � �� �� ����� � ��� ����� ���� �� �� � ������ ������� ��(� ������ �#9������)CC� �<%�+ $0�������� ;���������� /���� !���� !�� :=�& ��� �����(�� ������� ���� ��� ������ ����� ���� ������ �� �� ����������� ������� ��� ��� ������ ������ ��� ��� ��� ����� ���� ��� ���� ������� ���������� � ������� ���� � ��� ��� �� ���������� ���������

01 2����� �����������

�� 6���� �� ���� ���� ��������� �� ������� �� ����� �� ���� ������ B�� �� � ��"�� � �� ����� $!% � ��������� ���� ������� �� ���� *C�� *G�� ,�,� ,�-� -*�� -32���� )�*� �� ������� �� � ���� ����� �� ������������� � ���� �"�� ������ �� ��������� �� $!% �� �#�& ��(���' ��� �� ������ ��� #��� ���� $�� ����;������ 1����� !�������� ;�6�� :5&+ #��& ������ ��"�� �#)C �1&' C�G) : �� ��� �� ������ ���� ) �1 �� �C � �������� � ��� �"������� C�, ���� �� � �������� ����C ���� �� %�"�������� �� �� � � ��� #)>�����������������,>&� �C ���� �� ��� �� � ��� #)>�����������������,>& ��� �� $ ��"�� � #�C ���� �� ����� $&+ #���& �������' 2-�! �� * ���� ,) � ��� ��� ���#2-�! �� ,C �� )G�! �� ,C �� ��� G*�! �� �C �� ��� ����G*�! �� , ���+ ��� #��& ���� ����' ;����� � :�B� �� ������6 #;����� �� 4���� �� 9� ����&� %������� � ���� �� ����� ����� ��� ����� �� � ������ � �� ��� ��"��� � ���� � N�����6 < $!% �� �������� 6�� #N������=���� !�� ���� !�� :=�& ��� ������� � ����������� ��������� �� $!% � ����� �� � ��������� � �� ������� ����� �� *�C �� �� ����� � :? ���� ����� ���� ������ #=�,-CC+ 4�����&� �� ���� ������ ��� � ��� �� ��� ������� �� ������ �� � ������ � ���� �� ���������� �� $!% ���� � ��� ���� �� �� �� ���� � ��� ��� �� � ��� � � � ��� #�C��� &� �� 6���� �� ���� � ���� � ���� ��� ���� ��������� ������� #)>���#�)&��,>&��� ����� ��� ������� ���� ���� �� #4�" ��� %�"& �� ������ �� � ��� � � � ��� ��� ��� ��������� �������� �� ��������� �� $!% �� � #�& ��(��� ����' 9��������� �������� �� ������ ���� #$0�������� ;����������&+ #��& ������ ��"�� � #�C �1&' C�*) : ��� �� 9������� ��� �������� �� ������ ����� � �1 �� �C ��C 9������ ����� � � �� �� ���� ) ���� �� ���� ����� ��������� ���� � ��� � ) ���� �� � ��� � � � ��� ���� * ���� �� ��� �� $+ #���& �������' 2-�! �� , ����-C�! �� ) ���� G*�! �� ) ���� ,C � ��� ��� ��� #2)�!�� �) �� -C�! �� * ���� ��� G*�! �� �C �� ��� ���� G*�!�� ) ���&+ ��� #��& ���� ����' �;� 2�CC #$0�������� ;����������&� �� $!% � ����� �� � �� ����� ���� � ���#=������"�9)C+ ��� ���� $�� ���� ;�����& ����� �$ �� �� ��7������ ������� �� � ��������� �� � �1 ��������� ����� #2CM �� ������� �C �< 0 �&� ������ ��2)�! �� ) ���� ��� ���� ����� �� ��� �� ���� ����

�� � ������� � �� ��� ������� �� � ��������� �������� ��� ���� � ���� �� �� ����� ��� ���� �������"��� ���� ���� �������� #*�):& ��� ����� ��� ������������ ��� �� ����� �� )C �1� ��� ��� ����� �� ������� *)�

03 2�4������

��������� �������� �� �������� �� � ������� � ����� ������ �� � �����(�� ���� � �� ��������� ����� �� ������ ��������� � ���" 6�� #��� ���� $�� �

,GC � � �� �� ��� ���������� � *CCC� ��� ,�GH,G-

-� ��� %0 #�& ������� ��� #�& ����� �� ��� �� � �������� ������� �� ��� �������� �� � ������� �� ��� ������� �������� ��� #& ��� ����� �� � ������� �� ������ ����� �������� ������ �� �� ������� �� ��� �������� ������� � � � #�& *C � ��� #��& �C �� ����� �� ��� �� � ������� �������� ��� ���� ����� ����� �� ���� ����� �������

���� ;�����& ��� �� �;� ,G, �� =������ #$0�������� ;���������&� �� ������ ��"�� � #*C �1& ��������� - �1 �� ��������� ������ � ���"� ��� �"��������)C ���� �� �������� ��� ��� ) ���� �� ��������� � ���� � ���� �� ��� ���� �� ��� � ��� � � � ��� � �� ��"��� � ��� ������ �� 2��! �� �C �� ��� �� ��� ������ ,C����� ����� ��� ��������� �������' 2��! �� ,C �� -C�!�� ,C �� ��� �C�! �� �C �� �� � ���� ��� ���� �� ��������� � ����������� �� ��� ��������� �� - �1 �� ���������� ��� ������� �� ��� 6�� ��� ������ �� GC�!�� ) ���� ���� ����� �� �� ���� � ������� �� ���������� �

% 5������ ��� ����������

%0� *��������� ����� ��� ��������

�� � ������� ������� �� ��� ����������� ��� ������ ���� ��� �������� ������ � ���� � � ���� ��������� ���������� ��� ����� �� �� � �� �� ���� ���� �������������� �� ��� � ����� ������ � �� ���������� ������ � ��������� ���� %�"�������� �� � ������� #���� ������ �� *3&�� ��������� ���� ���� ��� ��7������ �� �� � �������� �� � ������ � �� ��� ���������� ������ � �� ��������� ������� �� � ��� � ���� #O) �&� ��� ������ ���� ����������� ������ � ��� �� � ������� �� ���� �� ���������#������� �& ����� ��� �������� ������ � �� ������������ � ���������

��� ��������� �� ��� ���� ����� ��������� ��� ��� �"�������� 9�������� $��6 ������ #��& ��� ����� #-�' �������� � ���������& �� ��� 9������� ���6 � � ����� ��/��� ,� ��� �� ����������� �� �������� �� ��� ��� ����������� #��& �� ��� �������� ������ �� �� ���6 ������ ������ ����� � � ��� �"������� � ��� ������ �� ��

H� ��� ��H�.*�

����������� �� ����� �� ���� � ��� ������ �� ��.* ������� �� /��� ,� ���� ������ �� �� ���� ��� ���� �����

� ������� ���� ��� ���� �� ��� ����� �������� �� ��� ��������� ������ � �� ��� $��������� �����

4��� ���� ������� ��� ��� � ������ �� ��� �������� ������� � � � � ��� ���� �� � �� �� �� ���� �������� ������ ������ ��� �������� ������ � ���� �� ���� ������ �� ������� ������� ���� ����� �������� �� ��� �����+ ��� ��� �������� ������� �� ����� ����������� �� ��������� =��� ��������� ��� ��� ���� ������� �� � ��� �� �* � ��� 3 ��.�#C��G ��.� �� ��� ������ ���� ���&� ����������� ��� ���6������ #��& ��� ��� ����� #-�& �� � ��������� �� �� *C ���� �G �� �� ��� �� ��� �������� ������� ���� �� ������� ��� ������� �������� ��� �������� ��� � #��& ����� ����� #��& ��� ��� �� �C � #�� P �� H ��.*& ��� *C �#�� Q-�&� �����������

� ���� � ��� ������� �� �������� ������� � ��"�� � �� ����� � ������� ���� ����� ��� ���� ������� � �� ��� ��)�* �� � �����(�� #��� ��� ���� ���� �� �� �� ��� ��"��� �� /��� -�&� �� ����� ������ �� ����� �� � �������� �� ��� ������� ����� �� � ��� �"������� � �<� ��������� ������� ��� 3C ?.�� �������� ��� , � �� � ���������� �� �CC� �� ���� ����� ���� �� �� � ������� ����� ���� ������ ����� ��� �� ��� �� ������ ��� ���� �� �������� #-�& �� ��� ������� ������� �� 3C ?.�� �� ��� ����� �� � ������� ����� ��� �� /��� -� ���� �� ����������� ������ ���� �� ����� �� � ������� �������� ����� � ����� �� � ��������� �� $!%� 0�� �� ��� ��������� ���� �� ��� ����� �� /��� -� ������� ���� ��� � � ��������� �� � �������� ��� ����� �������� ���� ����� � ������� � � ���������� �� ��� ���� ��� ���������������

%0 2��������� ������������

�� ���� ����� ����������� �� ��� �� ����� �� � ��6���� �������� ������������� ��� �� � ������� ���� ����������� �� ,�, ��� ,�-� /��� � )� ����� � �� � �� /��� -�

���������� � *CCC� ��� ,�GH,G- ��������� �� � ������ �������� ,G�

-� ��� )0 �� ���� ���� �� ���� � ��"�� � �� ����� �� � �������� ���� #�& ���� �������� �� ��� �� )�* ��� #�& �� ������� � �������� �� � �� �� �������� �� � ������� � � ���� ������ �� ���� �� ��� ��� ���� ����� � ����� ������ �� ��� ���6������ ���� ��� ���6 ����������"���� � � ���� ������ ��� ����� ������ ����� ���� ����������� ��� ��� �� ����� #���� ���� �� =����� ,��& �� ����� ��� ��� ���� � ��� �� ��� ��� ������� �� � ��������� ��

$!%� �� ����� ���� ���� �� ��� �� #�& �� � ��� ���� ����� �� 6� ��� ����� �� �������������� �� ��� ���� ������ �� �� ������� ������� ��� 3C ?.�� �� �������� ���6 , � �� �� � ���� ������ �� �CC�

�� ��� ����� �� ���� ������ � ���� ,�C� �� ���� ����� ���� �� ��� ��� ���6� ��� ,C �� 0��� ���� �� ��� ����� ������� �� � ������� �� ��� �� ����� � � ����� ��/��� )� #,�- ���� ������& ��� /��� ) #,�, ���� ������&�� ��� �������� ������� #�� �����' *C �& �������� ��/��� )�� �� ���� ����� ����������� � � ��� �� ���� ��������� �������� �� ��� �� ������ �� �� ��� �� � �������� � � ���������� �� ��� ��7� ����������

�� ���� ����� ��������� ���� �� ��� ���� ���� ��� ��������� ������ �� �� ��� ���� ��� ������ �� ���6������ ��� �� ��� ���� ���� �� ��� � ���� � ���� � ��������� ��� �� � ������� ���� ���� ������� �� ,�, ���,�- �� � ������� �� ��� ������� ������� #,C ?.�&� ������ ����� ��� �� ��� ��� ���6� ��� GC �� �� ��������������� � � ��� �� �� ;� ��� ! #�� ����� �� /��� ��&� ������ ���� �� ��� �� ��� ������� �� � ������� � ������ �� /��� ��� �� �������� ������ ��� ��� �� ����������� �� ,�- #������' �& � ,�, #������' !& ��� � ���������� � ������� �� � ��������� ��� ��� �������������� ��� ��� ������� � ��� !� �� ���� ���� � ��������� � ��������� ���� ������ �� ��� ��������� �� ���������� �� � ������� ������� ���� �� � ����������� � ���� ������ ����� ��� �� ��� �� �� ������������� ���� �� ��� ��� ��������

�� � ����� ���� ��� ������� ������� ���� �� ���� ���� ����� ���� ���� ��� �� � ������� �� ���� ��� ���� ��������� ��� �� ����� ��������� ������� =��� �� �������� �� �� � ������� � � �� ���� ��� �� � ����������� ������ ���� ��� � ����� �� ���� ��� �������� �����

=����� � �����(��� ��� ��������� ������ �� ��� ���� ������ ������ ��� ������ �� ��� �� ������� �� ��� ������������ �������� ������ #�"� ����� �� �� � ��������� ���� ��� �� ������ � ���� ���& ���� ������� ��������� ����� � ����� ��� ���� �� �� ������ �� ������� ��������

%0% 2�4������ �� ��� ��������� ��� �����

� � ��� �� ��������� ������� �� � ������� ��� � � ��� ��� ���� ��� ������� /��� � G� ����� ��� ���� ����� �� �� �� ��� � ������ ������� �������� �� �� ����� ������ �� �CC ������ -�) �� �� ������� � ������������� ��� �� ��� �� � ������ #�������� ���� �� � ���� /��� G�& �� � ��7� �������� �������� ���� ����������� ���6� � � ���� ����� �� /��� G�� �� ����������� ����� ���������� ���6� ������� �� ��� �������� ���6 � �������� �� ��� ����� �� $!% ����� ��� �������� ������� $!% ������������ �� ��� ��7� �������� �� ����� ���� ��� ���� ��� ��"������ � ������� � � �������(���;� �������� ��� ��������� ��� ���������� ���6� ��������� #/��� G&� ��� �������� ��� ����� ��� �� ��� ����� �� ��� � ������ �� �� ������ ���� ��� ����� ��������� ��� ��� ������������ �� *)���� $!%� ��� �� ����� � ������� �� � �������� �� ���� #������� � ������� � ����&� �� ���� ������� �� � ���� ��� ���� ������ ������� � �� ,>��� ����� #������& �� ����� �� /��� 3� ���� ���� � � ���� ������ �� ���� ������������� ������ �������� ��� ��

,G* � � �� �� ��� ���������� � *CCC� ��� ,�GH,G-

-� ��� 10 #�& 0"������ ���� �� /��� -� ��� ,�C ���������� ����� ��� #�& ������� �� � ������ ���� ���������� ��� �� ����� �� ��� �� ��� �� � ������� ���� ����������� �� ,�- ��� #& ,�,� �� ��������� �� $!% ������� ���� ���� �� � �� �� /��� -�

-� ��� 30 =��� ����� �� �� � ������� ���� ����������� �� ,�- ��� ,�, �� ��� ������� #,C ?.�&� #�& !��������� ������� #�� ;� ��� !& � � ������ #�& 0��� ����� �� ��� �� ��� ������� �� � ������� ���� ���$!%������������� � � ������ �� ��� �� � ����������� � ���� ������ ����� ��� �� ��� �� � ��������� ����� ����� =��� ��� � � � ��� �� ���� �� � ������ ������� ���� ��� �� � ������ #������� �C �� ��� ����&� �������� ����� ���� ������ �� ���� �� �������� ���� �� ���������� �� ������ ��� ������� ������� ���� �� ��� ���� ������ ��� �� � ������� �� ���� ��� � � ������� #��������� ��������&�

%0) ��������� ������ ���� ���������.��������� ����

�� �"����� �� ��� ���� ����� �������� �� ��� �������� �� ����� �� /��� 2� ��� ������ ������� ��� ������ �� � ������ � ���� ������� �� ��� 4�" ��� %�" ����� ���� ��� ����������� �� ������� ������� ��� 3C ?.�� �� �������� �� � ���� ������ �� �CC ���6 , �� �� ���� ����� �� �� �� ��� 4�"�������� �� � ������� ������������ ��� %�"�������� ��� �"��� �� ��� ���6 �� ������� ������ �� ��� �"������� *�C� ��� ��� ����� ������� ���� ��� �� ��� ���� � �������� �������� �������������� �� ����� � ���� ��� ��� � ����������� ���� ������ ����� ����� ������� ��� 4�" ��� %�" ���� ����� ������������ �� ���� ���6 �������� �"���� 3CM� �� ��� �������� �� ���� ������ � � ���� ���� ,CM� �� ��� �� ������� ���6 �� � ���� ������ �� ��� �"������� *�C ���� ���� ��� ������������ �� ������� � �� ������ ����� �� )CM� �� �� ��� �� � ������� ������ ��� �� ��� � ������ ��� �������� ��������� �������� ���� ���������� ���6��� � ������� �� ���� ���� ���� ���� ����� ��������� ���������� �� ��� � ����� �������� �� ���� ������������ �������� �� ��� �� ��� �� � ������� � �������� ���� ����� �� ����� � ������ � ����� =��� ������� ����� ���� �� ��� ���� �� ����� ��� ��������� �������� �� ��� � ������� ��� �� �� ���� �������� �� ���������

) *�������� �������

�� ����������� ���� �� ���� ������� ����� �� �"� ������� ������ ��� ���� ����� �� �������� ���� ���� �� ���������� ��� � ��� ��� ��� �� ���������� ��������� �� �������� � ������ ������ �� ������ �� �������� ������� � ���� � ��� ���� ���� ��� �� 6 �� ������� �� ������ �"� ����� �� �� � ������� � �� ����������

���������� � *CCC� ��� ,�GH,G- ��������� �� � ������ �������� ,G,

-� ��� 60 0��� ���� �� ��� �� #�& ����� ������ ������������� ��� �� ���� ���� �� � �������� #�& ���� �� ����������� ��� #& ���� ����� ��������� � ��� ���������� �� ��� �� � �������� �� ������� ������� ��)C ?.�� �� �� ��� �� ������� �� � ������� ����� ���� �� �������� ��� �������� � �����

-� ��� 70 �� ������� ���� �� ��� �� ��� � ������ ����� �� /��� G� �� ���� ������ �� � ���� ��� ���� �� ����������� � �� ,>��� ����� #������& ��� � � ���� ������ �� ���� ������������� �� ���� �������� ��� ��

��� ������ ���� � �� � ����� ��� � ��� ��� �� �� ���� ���� �! ��� ������� �"#� ���� � ��� $%& � ��'�( �� ������ � ����� ���� ����� '�� '��� ������ �'�� '�� )� ����� ��� '�� *�� �+� ����� ���� � ��� �� ����� �! � ��� ������ � ��� ��� �������,���� �� ����� !��� ��� ��� ����� '�� '����� ���� � � � ����� � � ��������� � ������

%������ <�� *3� �222

1 5���������

@�A 1����� $�� $� ���� �� ;�� )� ����� �22*� �-.� 2�GH2G��

@*A ���� �� 5���� 5�� ������ ��� <������ J�� 4����� �� 4�� =�6�6��J�� ��/) ����� �22-� (-�� *,�H*,��

@,A ?��� $�� 4��� �� %�� ;���6� � <�� %��7���� <�� ��� �� 1��� ��4� ���� <�� / �7�� � ��� $��� 8�� $������� 8�� 5���� � <��"���� � #� �� &��� �22)� �(� --CGH--�)�

@-A �6������� =�� <� �6���� 5�� ���(���� �� 5���� �� 4��#���� %���� �22-� 00� �C*�H�C*��

@)A <R��� � B�� /� ��� /�� 5� �� � ;� 1�� #���� %���� �22)� 0.�*2G-H*23C�

@�A 5����� �� <�� 5���� �� 4�� ���������� � �22�� �.��-G�H�-3-�

@GA ������� 4�� 1�6��� 8� ��� 5�����6�� �� 8�� >!����� 8��=����� 1� <�� #���� %���� �22C� 0�� 2CCH2C,�

,G- � � �� �� ��� ���������� � *CCC� ��� ,�GH,G-

-� ��� 80 �� �"����� �� ��������� �� ���� �� � ����� ���������"� ����� �� � ������ #����� ����� �������� ���� ���� ��������� �� � ���� ������� ��4�" ��� %�" ���� ���� �� � ���� �� �� ��� ������&� 0���� ���� �� ��� �� #�& ��� � ������������ ��� #�& ��� ��������� � �������� ������������ � ������ �� ������� ��������� 3C ?.��