Aus der Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgischen Klinik

der

Friedrich – Alexander – Universität Erlangen – Nürnberg

Direktor: Prof. Dr. med. Dr. med. dent. F. W. Neukam

Polysaccharid-Template-strukturierte bioaktive

Keramiken mit modulierter Oberfläche

- eine tierexperimentelle Analyse

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung der Doktorwürde

der Medizinischen Fakultät

der

Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

Vorgelegt von:

Wolfgang Göthel

aus Schamhaupten

Erlangen, 2011

- 2 -

Gedruckt mit der Erlaubnis der Medizinischen Fakult ät der Friedrich –

Alexander – Universität Erlangen – Nürnberg

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h. c. J. Schüttler

Referent: Prof. Dr. med. Dr. med. dent. K. A. Schlegel

Koreferent: Prof. Dr. med. Dr. med. dent. F. W. Neukam

Tag der mündlichen Prüfung: 12.12.2011

Der Promovend ist Zahnarzt.

- 3 -

Meiner Familie gewidmet

- 4 -

Inhaltsverzeichnis

1. Zusammenfassung / Abstract .....................................................................- 6 -

1.1 Zusammenfassung ...............................................................................- 6 -

1.1.1 Hintergrund und Ziele .....................................................................- 6 -

1.1.2 Material und Methoden...................................................................- 6 -

1.1.3 Ergebnisse und Schlussfolgerungen ..............................................- 6 -

1.2 Abstract.................................................................................................- 7 -

1.2.1 Background and objective ..............................................................- 7 -

1.2.2 Study design...................................................................................- 7 -

1.2.3 Results and Conclusions ................................................................- 7 -

2. Einleitung....................................................................................................- 8 -

2.1 Hintergründe .........................................................................................- 8 -

2.2 Knochenheilung ....................................................................................- 9 -

2.3 Knochenmatrixproteine .......................................................................- 11 -

2.4 Grundlagen der verwendeten Materialgruppen...................................- 13 -

2.4.1 Bisphosphonate............................................................................- 13 -

2.4.2 Strontium ......................................................................................- 15 -

2.4.3 Cellulose.......................................................................................- 16 -

2.5 Fragestellung ......................................................................................- 17 -

3. Material und Methoden.............................................................................- 18 -

3.1 Untersuchte Cellulosegewirke.............................................................- 18 -

3.1.1 Herstellung der Cellulosegewirke .................................................- 18 -

3.1.2 Beschichtungen............................................................................- 19 -

3.2 Verwendetes Tiermodell .....................................................................- 20 -

3.3 Operatives Vorgehen ..........................................................................- 21 -

3.4 Aufbereitung der Proben.....................................................................- 22 -

3.5 Mikroradiographische Untersuchung ..................................................- 25 -

3.6 Histomorphometrische Untersuchung.................................................- 26 -

3.7 Immunhistologische Untersuchungen .................................................- 26 -

4. Ergebnisse................................................................................................- 29 -

4.1 Mikroradiographie ...............................................................................- 29 -

4.2 Lichtmikroskopie .................................................................................- 32 -

4.3 BMP 2/4 ..............................................................................................- 34 -

- 5 -

4.4 Kollagen I ............................................................................................- 36 -

4.5 Osteocalcin .........................................................................................- 38 -

4.6 Osteopontin.........................................................................................- 40 -

5. Diskussion ................................................................................................- 42 -

6. Literaturverzeichnis ..................................................................................- 48 -

7. Abkürzungsverzeichnis ............................................................................- 60 -

8. Anhang .....................................................................................................- 61 -

8.1 Färberezept BMP 2/4..........................................................................- 61 -

8.2 Färberezept Kollagen I........................................................................- 62 -

8.3 Färberezept Osteocalcin .....................................................................- 63 -

8.4 Färberezept Osteopontin ....................................................................- 64 -

9. Danksagung .............................................................................................- 65 -

- 6 -

1. Zusammenfassung / Abstract

1.1 Zusammenfassung

1.1.1 Hintergrund und Ziele

Hohe Morbidität bei der Gewinnung und begrenzte Verfügbarkeit von autolo-

gem Knochen fördern die Entwicklung immer neuer synthetischer Knochener-

satzmaterialien. In der vorliegenden Arbeit sollte das Einheilverhalten dreidi-

mensionaler Cellulosegewirke mit neuartigen Beschichtungsmethoden auf

Basis von bioaktivem Glas mit modernen Wirkstoffen wie Pamidronat und

Strontium untersucht werden.

1.1.2 Material und Methoden

Als Tierversuchsmodell wurde das Hausschwein gewählt, bei dem im Bereich

des Os frontale Critical-size Defekte gesetzt wurden. Diese wurden anschlie-

ßend durch Bioglas beschichtete, mit Strontium bzw. Pamidronat modifizier-

tem Bioglas beschichteten, mit Strontium direkt funktionalisierten, sowie mit

unbehandelten Cellulosegewirken gefüllt. Die gewonnenen Knochenproben

wurden an den postoperativen Tagen 3, 7, 14, 30, und 90 mikroradiogra-

phisch und histologisch untersucht. Zusätzlich wurde die Expression der Kno-

chenmatrixproteine BMP 2/4, Kollagen I, Osteocalcin und Osteopontin im-

munhistologisch bestimmt.

1.1.3 Ergebnisse und Schlussfolgerungen

Die untersuchten Materialien zeigten weder Osteokonduktivität oder Osteoin-

duktivität, noch wiesen sie eine Osseointegration auf. Der neu gebildete Kno-

chen konnte nicht zwischen die Cellulosefasern vordringen, die Gewirke wur-

den lediglich komprimiert. Somit sind sie als Knochenersatzmaterialien unge-

eignet.

Die Bioglasbeschichtungen wurden langsam über den ganzen Untersu-

chungszeitraum hin abgebaut, so dass von einer kontinuierlichen Abgabe von

Pamidronat und Strontium ausgegangen werden kann. Dies stellt ein vielver-

sprechendes zuverlässiges Slow-Release-System zur lokalen Applikation von

Pharmaka dar, das weiter untersucht werden sollte.

- 7 -

1.2 Abstract

1.2.1 Background and objective

The high morbidity of harvesting autologeous donor tissues and the limited

availability promote the steady development of new synthetic bone grafts. It

was the aim of the present study to evaluate the healing properties of cellu-

lose-based scaffolds coated with pure sodium silicate gel, sodium silicate gels

accumulated with different concentrations of the bisphosphonate pamidronate

and strontium and directly coated with strontianite.

1.2.2 Study design

An animal model in domestic pigs was chosen. Monocortical critical size bone

defects were created in the calvaria. Those were filled with sodium silicate gel

coated, strontium and pamidronate modified sodium silicate gel coated, pure

strontianite coated and unmodified knitted cellulose fibres. The harvested

bone samples were investigated histological and via microradiographs on

postoperative days 3, 7, 14, 30 and 90. Additionally the expression of the

bone morphogenetic proteins BMP 2/4, collagen I, osteocalcin and osteopon-

tin were determinated.

1.2.3 Results and Conclusions

The tested biomaterials showed neither osteoconductive or osteoinductive

properties, nor osseointegration. The newly formed bone was unable to pene-

trate between the cellulose yarns. Only a compression of the scaffolds was

observed. Therefore, the tested Biomaterials can not be considered fit for use

as bone-grafts.

The sodium silicate gel coatings were degraded steady and slow through the

whole duration of the study, so a steady delivery of pamidronate and stron-

tianite could be proposed. This makes for a promising and reliable slow-

release system for local drug delivery, which should be investigated further.

- 8 -

2. Einleitung

2.1 Hintergründe

Das Viscerocranium bildet die knöcherne Grundlage für das menschliche Ge-

sicht. In diesem hochkomplexen Körperteil finden wir auf engstem Gebiet die

biologischen Vorraussetzungen zur Atmung, Nahrungsaufnahme, Umge-

bungswahrnehmung und Orientierung im Raum, sowie zur Kommunikation.

Diese Funktionen werden durch Knochendefekte, -verluste und -

deformationen im Kiefer- und Gesichtsbereich erheblich behindert. Somit be-

steht eine wichtige Aufgabe der rekonstruktiven Mund-, Kiefer- und Gesichts-

chirurgie, sowie der plastischen Chirurgie darin, die Strukturen des knöcher-

nen Schädels durch Ersatz des fehlenden Knochens bestmöglich wiederher-

zustellen.

Autogene, besser noch vaskularisierte autogene Knochentransplantate gelten

immer noch als der Goldstandard [37, 79]. Da autologer Knochen als osteo-

konduktiv und durch seine Möglichkeit pluripotente Stammzellen in osteogene

Zellen umzuwandeln, sogar als osteoinduktiv betrachtet werden kann, zeigt er

das beste Osseointegrationsverhalten [21]. Dabei ist er allerdings nicht so vo-

lumenstabil wie allogene oder synthetische Knochenersatzmaterialien [80].

Die Hebung des Transplantats bringt außerdem nicht zu vernachlässigende

Belastungen und Risiken mit sich. Gerade bei Defekten, die ein extraorales

Knochentransplantat erfordern, treten, neben dem zusätzlichen Risiko einer

zweiten Operation, teilweise erhebliche postoperative Morbiditäten infolge von

Wundinfektionen, postoperativen Funktionseinschränkungen und Hämatom-

bildungen auf [2, 66, 86].

Diese Nachteile und die Entwicklung vielversprechender allogener und syn-

thetischer Knochenersatzmaterialien, haben zu einer kritischen Bewertung vor

Einsatz von autogenen Knochentransplantaten geführt [42]. Es konnte sich

- 9 -

bisher aber, trotz der steigenden Anzahl an Entwicklungen, noch kein dem

autologen Knochen vergleichbares Standardmaterial etablieren.

Ein ideales Knochenersatzmaterial sollte dabei folgende Anforderungen erfül-

len:

Es sollte eine direkte Verbindung zum ortsständigen Knochen, ohne Ausbil-

dung einer bindegewebigen Trennschicht entstehen und dadurch zur Osse-

ointegration des eingebrachten Materials kommen [23]. Des Weiteren werden

osteokonduktive Eigenschaften benötigt, die das Knochenwachstum an der

Knochenersatzmaterialoberfläche fördern. Durch Osteoinduktion sollen

ortsständige pluripotente Stammzellen zu Osteoblasten bzw. Osteoprogeni-

torzellen differenzieren. Ein ideales Knochenersatzmaterial sollte eine de novo

Osteogenese, d. h. Knochenbildung mittels Osteoblasten aus dem Knochen-

ersatzmaterial ermöglichen. Außerdem sind Volumenstabilität und eine dau-

erhafte mechanische Belastungsstabilität erforderlich. Die Verknüpfung all

dieser Punkte ist im Moment mit keinem auf dem Markt befindlichen Material

möglich.

Die Eigenschaften von Knochenersatzmaterialien können durch verschiedene

Oberflächenmodifikationen erheblich beeinflusst werden. Hierbei ist beson-

ders bemerkenswert, dass durch Änderung der Form und der Oberflächenge-

ometrie und -porosität, die Osteokonduktivität und die osseointegrativen Ei-

genschaften von Materialien deutlich veränderbar sind [48, 54, 107].

Weitere interessante Möglichkeiten bietet die Bioaktivierung der Oberflächen.

Eine aufgebrachte bioaktive Schicht soll die Osteokonduktion und Osseoin-

tegration fördern. Vielversprechende Beschichtungen bilden hierbei die Grup-

pe der Hydroxylapatite, sowie der bioaktiven Gläser [104, 105].

2.2 Knochenheilung

Die Heilung eines Knochendefekts, sowie die Einheilung von Knochentrans-

plantaten und Knochenersatzmaterialien ähneln prinzipiell stark der embryo-

nalen Osteogenese [98].

- 10 -

Nach dem Trauma wandern Zellen aus den eröffneten Markräumen sowie

dem Periost und dem umliegenden Gewebe zum Ort des Defekts und bauen

einen stabilisierenden Kallus auf. Ein Teil dieser Zellen bildet, entsprechend

der enchondralen Ossifikation, knorpelige Anteile, die später durch Knochen

ersetzt werden, während der andere Teil direkt zu Osteoblasten differenziert

und, der desmalen Ossifikation entsprechend, neues Knochengewebe bildet.

Die Anteile der beiden Ossifikationsformen werden von der mechanischen

Belastung des Gewebes, sowie vom Defektvolumen bestimmt. Bei größeren

Defekten oder starker Belastung erfolgt die Heilung überwiegend enchondral,

während bei kleineren, beziehungsweise wenig belasteten Defekten eher eine

desmale Ossifikation ermöglicht wird [78]. Danach erfolgt ein Umbau des neu

gebildeten Knochens durch Osteoklasten und Osteoblasten. Wird eine gewis-

se Defektgröße nicht überschritten, ist im Knochen im Gegensatz zu anderen

Geweben eine komplette Wiederherstellung, die „restitutio ad integrum“, mög-

lich.

Des Weiteren kann die Knochenheilung in mehrere, sich teilweise über-

schneidende Phasen eingeteilt werden. In der inflammatorischen Phase füllt

sich der Defekt zunächst mit Blut, wobei Hypoxie und ein saures Milieu vor-

liegt. Infolge der Ischämie kommt es hierbei auch zu Zellnekrosen. Leukozy-

ten, Erythrozyten, Thrombozyten und Fibroblasten erreichen nun den Defek-

tort. Ab dem dritten Tag beginnt, zu Beginn noch parallel zur inflammatori-

schen Reaktion, die proliferative Phase in der Wachstumsfaktoren die Diffe-

renzierung und Proliferation der Knochenmarksstammzellen, Fibroblasten und

Präosteoblasten initiieren, Makrophagen aktivieren und die Kollagen- und

Knochenmatrixbildung anregen. Nach zwei Wochen kommt es zur Rekapillari-

sierung des Defektes während der pH-Wert wieder den neutralen Bereich er-

reicht. Nun beginnt auch die Mineralisierungsphase in der zunächst Geflecht-

knochen gebildet wird, gefolgt von einer abschließenden Remodellationspha-

se in der der neu gebildete Knochen in Lamellenknochen umgewandelt wird

[23].

- 11 -

2.3 Knochenmatrixproteine

Sowohl die Osteoneogenese, als auch die Knochenheilung sind hochkomple-

xe Vorgänge an denen verschiedenste Wachstumsfaktoren und andere Prote-

ine beteiligt sind. Dabei laufen mehrere stark miteinander vernetzte Kaskaden

ab. Die Rolle der in dieser Arbeit ausgewerteten Knochenmatrixproteine soll

im Folgenden kurz erläutert werden.

Die Knochenmatrixproteine BMP-2 und BMP-4, die in hoher Konzentration in

der, durch Osteoblasten gebildeten, Knochenmatrix zu finden sind, sind Mit-

glieder TGF-ß Familie. Sie stimulieren mesenchymale Vorläuferzellen der

Osteoblasten und regen sie zur Proliferation und Differenzierung an. Sie wer-

den als osteoinduktiv bezeichnet, da sie eine De-novo-Osteosynthese induzie-

ren können und werden schon zu Beginn der Knochenheilung exprimiert [18,

72, 96, 103].

Kollagen ist einer der Hauptbestandteile der organischen Matrix des mensch-

lichen Körpers. Dabei ist Kollagen Typ I , mit einem Anteil von über 90 Ge-

wichtsprozent in der organischen Knochenmatrix, ein wesentliches Struktur-

protein [20, 70]. Früher nahm man an, dass Kollagen I die Mineralisation un-

terstützen würde [62]. Später wurde jedoch gezeigt, dass dazu weitere Kno-

chenmatrixproteine erforderlich sind [92]. Kollagen I bildet hierfür eine orientie-

rende Matrix.

Ein wichtiger Marker für die Mineralisierung ist Osteocalcin , ein nicht-

kollagenes Protein, das vor allem in Osteoblasten gebildet wird. Es bindet

Kalzium an die Knochenmatrix und kann als Marker für die

Knochenmineralisierung verwendet werden [18, 24]. Mit 2 % vom

Gesamtproteinanteil ist es das meistexprimierte nichtkollagene Protein im

Knochen [40] und erreicht sein Expressionsmaximum in der dritten bis fünften

Woche der Knochenneubildung [18, 24, 91].

- 12 -

Osteopontin , unter anderem auch als Bone Sialoprotein I bezeichnet, wird

am Anfang der Reifungsphase der extrazellulären Knochenmatrix durch Oste-

oprogenitorzellen exprimiert. Dabei erfüllt es eine regulative Rolle in der Ad-

häsion von Knochenzellen und der Matrixmineralisation, sowie in der Bindung

von Osteoklasten [36]. Es bindet, von TGF-1ß stimuliert, neben Calzium und

Kollagen auch Fibronectin und Osteocalcin, und ist somit schon früh an allen

Knochenbildungsvorgängen beteiligt [53, 93]. Weiterhin spielt Osteopontin

durch seine Bindung an Osteoklasten und Osteoklastenvorläuferzellen eine

wichtige Rolle bei sämtlichen Umbauvorgängen im Knochen, also auch in der

Phase der Remodellation [76, 85]. Die wichtige Rolle von Osteopontin für die

zelluläre Immunantwort [95] ist für die vorliegende Arbeit von untergeordneter

Bedeutung.

- 13 -

2.4 Grundlagen der verwendeten Materialgruppen

2.4.1 Bisphosphonate

Bisphosphonate wurden die letzten dreißig Jahre als potente Inhibitoren der

Osteoklastentätigkeit entwickelt. Sie finden verbreitet Anwendung in der The-

rapie der Osteoporose und bei Knochenmetastasen [75]. Bei ihnen handelt es

sich um synthetisch hergestellte Strukturanaloga von Pyrophosphat, das stark

an Calziumphosphat bindet und Calziumcarbonat lösen kann [32]. Die P-O-P-

Bindung im Pyrophosphat ist jedoch leicht enzymatisch und hydrolytisch

spaltbar. Ersetzt man den Sauerstoff nun durch ein Kohlenstoffatom (P-C-P)

wird die Spaltung verhindert, aber eine ähnliche pharmakologische Wirkung

erzielt.

Diese als Bisphosphonate bezeichneten Verbindungen binden sich wie Py-

rophosphat an Calziumphosphatkristalle und hemmen die Calziumphosphat-

bindung und -zerstörung. Dabei hemmen sie in vivo sowohl die Mineralisation,

als auch den Knochenabbau [32].

Abb.2.4.1-1: Zangenförmige Bindung des Bisphosphonates an Calziumionen. Umzeichnet

nach [9].

- 14 -

Neben dem erstgenannten physikalisch-chemischen Mechanismus, ist die

Erniedrigung der Mineralisation und der Knochenresorption zellulär bedingt

und besteht in der Hemmung der Proliferation, Lebensdauer und Aktivität der

Osteoklasten, wobei der genaue molekulare Mechanismus von der Struktur

der Bisphosphonate abhängt. Die strukturell einfacheren, nicht stickstoffhalti-

gen, Bisphosphonate der ersten Generation inkorporieren die P-C-P-

Verbindung in ATP enthaltende Moleküle und werden für die Osteoklasten

toxisch. Die hochpotenten Stickstoff enthaltenden Bisphosphonate der zwei-

ten und dritten Generation hemmen den Mevalonat-Stoffwechsel durch spezi-

fische Hemmung von Farnesylpyrophosphatsynthase. Dadurch wird Geranyl-

geranylpyrophosphat verringert, das eine essentielle Bedeutung für den Oste-

oklasten besitzt [27, 32]. Dies führt zur Zytostase und auch Apoptose von

Osteoklasten, wodurch das orthostatische Gleichgewicht in Richtung Minerali-

sation verschoben wird.

Negative Effekte von Bisphosphonaten auf die Differenzierung und Proliferati-

on von Osteoblasten wurden aber nicht festgestellt [33, 97].

Durch die schlechte Resorption oral verabreichter Bisphosphonate im Magen

werden häufig hochpotente Bisphosphonate intravenös verabreicht. Dadurch

und durch die lange Verweilzeit im Knochen werden mögliche Nebenwirkun-

gen potenziert [4]. Erhöhte zahnärztliche Aufmerksamkeit erhielten die

Bisphosphonate in den letzten Jahren, als vermehrt bisphosphonatassozierte

Kiefernekrosen diagnostiziert wurden [8, 11, 34, 77, 87]. Dabei ist mittlerweile

auch bei oraler Gabe von einem erhöhten Risiko für bisphosphonatassozierte

Osteonekrosen im Kieferbereich auszugehen [6]. Der Mechanismus hinter der

Entstehung dieser, nur im Kieferbereich auftretenden, Osteonekrosen ist noch

nicht vollständig geklärt. Einen vielversprechenden Ansatz bildet hierbei die

negative Wirkung der Bisphosphonate auf den Osteoklastendifferenzierungs-

faktor RANKL [65] und die, damit assoziierte kürzlich beschriebene, Vermin-

derung der Expression des, nur im Kiefer vorkommenden, Msx-1 im durch

Bisphosphonate kompromittierten Gewebe [99].

Dieses Risiko lässt sich aber bei lokaler Gabe minimieren, da so keine syste-

mische Wirkung zu erwarten ist und die Bisphosphonate bei einem Misserfolg

zusammen mit dem Implantat bzw. Knochenersatzmaterial wieder entfernt

werden könnten [5]. Die Beschichtung von Implantaten und Osteosynthe-

- 15 -

seschrauben hat, durch verbesserte mechanische Festigkeit in der initialen

Phase und vemehrten Knochen-Implantatkontakt, in einer Reihe von Experi-

menten und Studien vielversprechende Ergebnisse gezeigt [1, 60, 61, 88,

100, 106].

2.4.2 Strontium

Strontium (Sr) ist ein Spurenelement, das vergleichbar mit Calcium bei der

Mineralisation der Matrix in den Knochen eingebaut wird. Es wird mit der Nah-

rung und dem Trinkwasser aufgenommen.

Eine effektive Option zur Therapie der Osteoporose bietet Strontiumranelat

[19, 51]. Strontiumranelat setzt sich aus Strontium und der Tetracarbonsäure

Ranelicsäure, die eine höhere Resorption ermöglicht, zusammen. Sein Stron-

tiumanteil liegt bei circa 34 %.

Abb.2.4.2-1: Struktur von Strontiumranelat.

Durch Einwirkung auf die Osteoklastenbildung verringern die Strontiumionen

den Knochenabbau und fördern den Knochenaufbau durch die Aktivierung

calziumsensitiver Rezeptoren und einen kationensensitiven Mechanismus in

den Osteoblasten. Dadurch wird die Knochenstruktur gestärkt und die Kno-

chenqualität verbessert [15, 43, 57, 58]. Auch eine Verbesserung der Osse-

ointegration von Implantaten wurde beobachtet [52, 55]. Die Bildung von

osteoaktiven Oberflächen durch mit Strontium modifizierte Cellulosegewirke

in-vitro wurde von Brandt et al. vor einiger Zeit beschrieben [14].

- 16 -

2.4.3 Cellulose

Als Hauptbestandteil von pflanzlichen Zellwänden ist Cellulose die häufigste

organische Verbindung. Sie besteht aus mehreren bis zehntausenden β-1,4-

glykosidisch verknüpften ß-D Glucosemolekülen, die sich zu höheren Struktu-

ren zusammenlagern können [38].

Cellulosefasern haben aufgrund ihrer Biokompatibilität, ihrer idealen mechani-

schen Eigenschaften und ihrer einfachen und kostengünstigen Herstellung in

fast beliebigen Formen und Porositäten, ein hohes Potential für verschiedens-

te medizinische Anwendungen [13, 31, 90].

So wird oxidierte Cellulose als Haemostyptikum verwendet, wobei es eine

vergleichsweise lange Resorptionszeit aufweist und mittlerweile kontrovers

diskutiert wird [3, 25, 84]. Bei der Resorption von höher organisierter Cellulose

muss von deutlich längeren Standzeiten ausgegangen werden [59]. Außer-

dem ist der klinische Einsatz von unmodifizierter Cellulose als Knochener-

satzmaterial wegen ihrer insuffizienten Osseointegrationsfähigkeit begrenzt

[12].

Diese Eigenschaften gilt es durch Oberflächenmodifikation zu verbessern.

Dafür bieten sich bioaktive Gläser aufgrund ihrer hervorragenden osteoaktiven

Eigenschaften besonders an [39]. Sie zeigen in-vitro einen positiven Einfluss

auf Osteoblasten [46, 102] und verbinden sich in Knochen eingebracht mit

dem umgebenden Knochengewebe [22, 28]. Dabei erscheint die Oberflä-

chenbehandlung und Beschichtung mit Bioglaskeramiken vielversprechend

[10, 89]. In der vorliegenden Arbeit wurde deshalb, zur Verbesserung der Os-

seointegration, die Oberfläche der Cellulosegewirke mit einer bioaktiven Be-

schichtung aus flüssigem Natriumsilikat umhüllt. Dabei sollte einerseits das

interkonnektive Makroporensystem der Gewirke erhalten und gleichzeitig die

Oberfläche des Werkstoffes Cellulose vollständig ummantelt werden. Diese

bioglasbeschichteten Cellulosefasern wurden, auch mit Pamidronatanteil, be-

reits in-vitro getestet, wobei die Bioglasbeschichtung einen positiven Effekt auf

die Osteoblastenproliferation und Differenzierung hatte [71].

- 17 -

2.5 Fragestellung

In der vorliegenden Studie sollen nun bioglasbeschichtete, mit Strontium bzw.

Pamidronat modifizierte bioglasbeschichtete, mit Strontium direkt funktionali-

sierte sowie unbehandelte Cellulosegewirke in einem etablierten Tiermodell

[82] untersucht werden. Folgende Fragen sollten dabei beantwortet werden:

Inwiefern werden die allgemeinen Anforderungen an Knochenersatzmateria-

lien von den untersuchten Cellulosegewirken erfüllt.

Welche qualitativen Unterschiede bestehen in-vivo im zeitlichen Verlauf bei

der knöchernen Einheilung am organischen Interface modulierter Cellulose-

oberflächen im Vergleich zu nicht modulierten Celluloseoberflächen?

Welche quantitativen Unterschiede zeigt das Knochen-Werkstoff-Interface in-

vivo von modulierten Celluloseoberflächen im Vergleich zu nicht modulierten

Celluloseoberflächen, im zeitlichen Verlauf?

Dazu diente die Untersuchung der Knochenqualität und -quantität sowie der

Expression bestimmter Knochenmatrixproteine im zeitlichen Verlauf.

- 18 -

3. Material und Methoden

3.1 Untersuchte Cellulosegewirke

3.1.1 Herstellung der Cellulosegewirke

Die verwendeten Cellulosegewirke wurden vom Lehrstuhl für Werkstoffwis-

senschaften 3 der FAU-Erlangen hergestellt und beschichtet (WW 3, Prof. Dr.

rer. Nat. Peter Greil/ Dr. rer. nat. Heike Brandt). Mit der Raschelmaschine

(Racop TR 6, LIBA, Naila) wurde regeneratives Cellulose-II-Garn (Bor-

ckenstein AG, Neudau, Österreich) (Garnfeinheit 1,3 dtex), aus Cellulose-

Fasern (Lyocell®, Lenzing, Österreich), zu einem porösen Cellulosegewirk

gestrickt. Diese hierarchisch aufgebaute Struktur (Filament – Garn – Gewirk)

sorgte für Mikro- und Makroporosität, sowie interkonnektierende Poren. Nach

der Reinigung im Ultraschallbad (70 % Ethanol, 30 s) und in destilliertem

Wasser (80 °C, 4 h) wurden die getrockneten Gewirke in 10 cm lange und 1

cm breite, rechteckige Streifen geschnitten und zu einem Zylinder gerollt (s.

Abb.).

Abb.3.1.1: Verwendete Cellulosegewirke

- 19 -

3.1.2 Beschichtungen

Zur Bioaktivierung der Celluloseoberfläche wurden unterschiedliche Beschich-

tungsverfahren angewendet. Hier kam vor allem eine Bioglasbeschichtung

(Na2O*SiO2) (Natronwasserglas, Merck, Darmstadt) zum Einsatz. Neben der

reinen Bioglasbeschichtung wurden außerdem Proben mit dem Bisphospho-

nat Pamidronat (Universitätsapotheke Erlangen) sowie Strontiumchlorid (Sig-

ma-Aldrich, Taufkirchen) modifiziert. Die Wirkstoffkonzentration betrug dabei

jeweils 0.333 mg/ml¹. Bei einer weiteren Probengruppe wurde die unbe-

schichtete Cellulose durch Ankopplung von Strontium direkt funktionalisiert.

Als Kontrolle wurden unmodifizierte Cellulosegewirke verwendet.

Materialgruppe: Abkürzung: Beschreibung:

Cellulose Cell 1,4-ß-Glucose; Monofilament > Garn

> Gewirk

Cellulose mit

Bioglas

beschichtet

Cell+WG Bioaktivierung der Celluloseoberfläche

mit Bioglas (Natriumsilikat)

Cellulose mit

Bioglas / Pamidronat

beschichtet

Cell+WG+

BisP

Bioaktivierung der Celluloseoberfläche

mit Bioglas (Natriumsilikat)

Einbringung von Pamidronat

Cellulose mit

Bioglas / Strontium

beschichtet

Cell+WG+Sr Bioaktivierung der Celluloseoberfläche

mit Bioglas (Natriumsilikat)

Einbringung von Strontium

Cellulose direkt mit

Strontium-carbonat

beschichtet

Cell+Sr Direkte Funktionalisierung

des Cellulosegewirkes mit

Strontium-carbonat

Tab. 3.1.2: Oberflächenmodifikationen der Probengruppen.

Zur Beschichtung mit Natronwasserglas wurde ein modifiziertes zweistufiges

Sol-Gel-Beschichtungsverfahren angewendet. Nach einem Tauchvorgang in

ein, je nach Probengruppe zusammengesetztes, Natriumsilikat/Wirkstoff-

Gemisch (Natronwasserglas, Merck, Darmstadt, Pamidronat, Universitätsapo-

- 20 -

theke Erlangen bzw. Strontiumchlorid, Sigma-Aldrich, Taufkirchen) wurde das

flüssige Natriumsilikat durch einen Papierfilter mit einer Vakuumpumpe durch

die Mikroporenstruktur der Gewirke gesaugt. So lag nun eine gleichmäßige,

wasserlösliche Beschichtung vor. Durch tauchen der Gewirke in 1 M Phos-

phorsäure wurde die Kondensationsreaktion der Silanolgruppen des Natrium-

silikates bewirkt. Die Gelbildungszeit der Natriumsilikatlösung reduziert sich

durch die Änderung des pH-Wertes auf ca. 150 Sekunden [50].

Die direkte Ankopplung von Strontium an die Celluloseoberfläche wurde durch

Vorbehandlung der Cellulosegewirke in einem 100 °C heißen Gemisch aus 1

M Oxalsäure und 1 M Salzsäure und unmittelbares Tauchen der nassen und

heißen Cellulose in eine frisch angesetzte gesättigte Strontiumhydroxidlösung

(1 g Sr(OH)2, Sigma-Aldrich, Taufkirchen) durchgeführt. Überschüssige Oxal-

säure wurde durch Waschen entfernt. Danach wurden die Gewirke für drei

Tage in gesättigte Strontiumhydroxidlösung (4 °C) e ingelegt. Nach einem wei-

teren Waschgang erfolgte die Trocknung (37 °C) [14] .

3.2 Verwendetes Tiermodell

Das Hausschwein (Sus scrofa domestica) ist als Tiermodell für die

experimentelle Knochenchirurgie besonders geeignet. Seine Knochenneu-

bildungsrate und Knochendefektheilung liegt bei 1,2-1,5 µm pro Tag [41].

Damit ist sie anderen Tiermodellen, wie beispielsweise dem Hund (1,5-2,0

µm/d) oder dem Schaf (2,5-3,5 µm/d), in der Übertragbarkeit der Ergebnisse

auf den Menschen (1,0 – 1,5 µm/d) überlegen. Das Os frontale bietet sich

wegen seiner guten Zugänglichkeit und der geeigneten Knochenstruktur an,

mehrere nach Schlegel et al. modifizierte Critical-Size-Defekte zu setzen [82].

Der Begriff des Critical-Size-Defektes bezeichnet einen Knochendefekt

(Durchmesser hier: 1 cm), der ohne Zuhilfenahme eines entsprechenden

Ersatzmaterials vom Organismus nicht mehr vollständig knöchern durchbaut,

sondern teilweise nur mit Bindegewebe aufgefüllt werden kann [83].

Es wurden ausschließlich weibliche Schweine im Alter von 18 Monaten mit

einem Körpergewicht von 120 ± 20 kg ausgewählt, um hormonelle Effekte auf

- 21 -

den Knochenstoffwechsel auszuschließen. Die Tierversuche wurden von der

Regierung Mittelfranken, Ansbach (Tierversuchsantrag Nr. 54-2531.31-7/06)

genehmigt.

3.3 Operatives Vorgehen

Die Haltung der Tiere erfolgte, unter Einhaltung eines natürlichen

Tag/Nachtrhythmus, bei einer Raumtemperatur von 18 ± 1 °C in einem offe-

nen Gehege von 6 m² mit Stroheinstreu. Sie erhielten standardisiertes

Schweinemastfutter (Altromin, Lage) sowie Wasser nach Belieben.

Nach Prämedikation mit Midazolam (1 mg/kg KG) (Dormicum®, Hoffmann La-

Roche, Grenzach-Wyhlen), Ketavet® (10 mg/kg KG) (Ketavet®, Pharmacia,

Erlangen), sowie einmalig 10.000 I.E. Heparin (Liquemin®, Hoffmann La-

Roche, Grenzach-Whylen) subkutan zur Thrombembolieprophylaxe, erfolgten

die Operationen in Intubationsnarkose (Sauerstoff/Lachgas im Verhältnis 1:3;

Isofluran 0,3 - 0,5 Vol.%, Forene®, Abbott, Wiesbaden) in einem halbge-

schlossenen System (Servo Ventilator 900, Siemens-Elema AB, Schweden).

Die Sauerstoffkonzentration (Oxydig®, Dräger, Lübeck), die endexpiratorische

Kohlendioxidkonzentration (Kapnolog®, Dräger, Lübeck) sowie die Herzaktio-

nen (Sirecust 311 S, Siemens) wurden während der Narkose kontinuierlich

überwacht.

Die Haut wurde im Bereich der Kalotte sagittal inzidiert und die knöchernen

Anteile des Os frontale unter Mobilisierung des subkutanen Bindegewebes

und des Periosts dargestellt. Daraufhin erhielten die Tiere mittels bewässerten

Trepanbohrern (Straumann, Freiburg) jeweils zehn Critical-Size-Defekte mit

einem Durchmesser von 10 mm und einer Tiefe von 10 mm, wobei die Tabula

interna in ihrer Kontinuität erhalten blieb.

- 22 -

Abb.3.3.1: Schematische Übersicht der Defektlage auf der Schweinekalotte.

Nach Reposition des Periosts und der Haut erfolgte eine zweischichtige

Wundnaht mit resorbierbarem Nahtmaterial (Vicryl, 3.0 und 1.0; Ethicon, Nor-

derstedt).

Postoperativ erhielt jedes Tier 0,1 mg/kg KG Buprenorphin subkutan alle zwölf

Stunden für drei Tage zur Schmerzkontrolle, sowie eine Antibiotikaprophylaxe

mit Penicillin/Streptomycin (Grünenthal GmbH, Stolberg) (15 mg/kg KG) für

drei Tage.

Die Opferung der Versuchstiere erfolgte drei, sieben, vierzehn, dreißig, bzw.

neunzig Tage postoperativ. Durch intravasale Injektion von 20 prozentiger

Pentobarbitallösung in die Ohrvene wurde, nach vorheriger intramuskulärer

Injektion von Azaperone (1 mg/kg) und Midazolam (1 mg/kg) in die Nackenre-

gion, der Tod durch Herzstillstand herbeigeführt.

3.4 Aufbereitung der Proben

Die Kalotte wurde unmittelbar nach Eintritt des Todes im Ganzen entnommen

und sofort bei minus 80 °C tiefgefroren.

Die exakte Position der Proben wurde mit einem Tisch-Röntgengerät (Fa-

xitron®, Faxitron x-ray Corporation, Illinois, USA) bestimmt. Daraufhin wurden

die Proben inklusive des umliegenden Knochengewebes mit Hilfe des Stan-

- 23 -

dard-Trennsystems der Firma Exakt (Exakt Apparatebau, Norderstedt) einzeln

ausgesägt. Die Probenblöcke wurden zur Immersionsfixierung für mindestens

48 Stunden in vierprozentigem Paraformaldehyd bei vier Grad Celsius gela-

gert. Für die Herstellung von Dünnschliffen und -schnitten mussten die Proben

in einer aufsteigenden Ethanolreihe (70 % bis 100 %) jeweils für fünf bis sie-

ben Tage bei Raumtemperatur dehydriert werden, wobei die letzte Stufe (100

% Ethanol) zweimal erneuert wurde. Die Immersion mit dem Intermedium Xy-

lol erfolgte zweimal für maximal 24 Stunden und anschließend einmal im Xy-

lol/Technovit-Gemisch (Technovit® 9100 NEU, Heraeus-Kulzer, Wertheim) für

ebenso maximal 24 Stunden.

Danach konnte die Infiltration und Einbettung mit Technovit (Technovit® 9100

NEU, Heraeus/Kulzer, Wertheim), einem Kaltpolymerisationssystem auf Me-

thylmethacrylatbasis, welches unter Sauerstoffausschluss bei minus vier Grad

Celsius innerhalb von zwei Tagen auspolymerisiert, entsprechend den Her-

stellerangaben erfolgen. Technovit (Technovit® 9100 NEU, Heraeus-Kulzer,

Wertheim) ermöglicht einen quantitativen Nachweis von Knochenmatrixprotei-

nen und ist außerdem zur Anwendung der Trenn-Dünnschlifftechnik nach Do-

nath [26] geeignet.

Nach dem Trimmen der Probenblöcke auf einem Rotationstrimmgerät, zur

Abrundung der Ecken des Kunststoffblocks, wurden die eingebetten Proben

mit einem Exakt-Trennsystem (Exakt Apparatebau, Norderstedt) möglichst

mittig in zwei Hälften gesägt.

Abb.3.4-1: Schematische Darstellung des Probenwürfels vor dem Sägen.

- 24 -

Die zur Anwendung der Trenn-Dünnschlifftechnik vorgesehenen Hälften wur-

den mit doppelseitigem Klebeband mit der das Defektzentrum enthaltenden

Probenseite auf einem blanken Plexiglasobjektträger fixiert. In einer Präzisi-

onsklebepresse (Exakt Apparatebau, Norderstedt) wurde die Rückseite des

Probenblocks mit Technovit 4000 Kleber (Heraeus-Kulzer, Wertheim) auf ei-

nem angerauten Objektträger befestigt. Danach wurde der Probenblock vom

Klebeband gelöst und anschließend zur Parallelisierung mit einem gewässer-

ten Schleifpapier (Körnung 1200, 2500 und 4000) in einem Präzisionschleifge-

rät (Exakt Apparatebau, Norderstedt) möglichst plan geschliffen und poliert, so

dass die Proben nur noch eine Unebenheit von max. 4 µm aufwiesen. Die so

vorbereitete Probenseite konnte nun mit einem Tropfen Technovit 7210 VI-C

(Heraeus-Kulzer, Wertheim) in der Präzisionsklebepresse (Exakt Apparate-

bau, Norderstedt) unter UV-Licht-Bestrahlung (15 min) auf einem blanken Ob-

jektträger festgeklebt werden. Die Proben wurden mit dem Exakt-Trennsystem

(Exakt Apparatebau, Norderstedt) auf eine Dicke von ca. 180 µm gesägt.

Mit dem Präzisionschleifgerät (Exakt Apparatebau, Norderstedt) wurden die

Proben, nach erneuter Parallelisierung, auf ca. 125 µm reduziert und poliert.

Die verbliebenen Probenhälften wurden als Vorbereitung auf die Immunhisto-

logischen Färbungen auf Halteblöcke mit Technovit® 3040 gelb (Heraeus-

Kulzer, Wertheim) aufgeklebt.

Mit einem Rotationsmikrotom (Leica RM 2165, Leica Microsystems, Nussloch)

wurden 5 µm dicke Schnitte von den einzelnen Proben abgetrennt. Dabei

wurden eine 40 prozentige sowie eine 60 prozentige Alkohollösung beim

Schneidevorgang verwendet. In 60 prozentiger Alkohollösung wurden die

Schnitte auf Adhäsionsobjektträger (SuperFrost Plus, Firma Menzel) aufge-

bracht und mit Polyethylenfolie bedeckt. Nach Entfernung überschüssigen

Alkohols erfolgte die Trocknung ca. eine Woche in einem Brut-Schrank bei 57

°C. Die Folien wurden entfernt und die Proben, troc ken und lichtgeschützt, bei

Raumtemperatur bis zur Färbung gelagert.

- 25 -

3.5 Mikroradiographische Untersuchung

Im Faxitron® Tisch-Röntgengerät (Faxitron®, Faxitron x-ray Corporation, Illi-

nois, USA) wurden die mikroradiographischen Aufnahmen der einzelnen

Schliffe bei 13-14 kV Röhrenspannung und 2,5 mA für 2,5 Minuten angefer-

tigt. Hierbei beträgt der Objekt-Film-Abstand nahezu Null, um möglichst hohe

Auflösungen zu garantieren. Nach der Entwicklung der Filme, wurden diese

mit einem Durchlichtscanner eingescannt und unkomprimiert im Tif-Format

gespeichert.

Mit dem Bildanalyseprogramm Bioquant Osteo V 7.10.10 (Bioquant Image

Analysis Cooperation, Nashville, USA) wurde der Anteil an neu gebildetem

Knochen im Defektbereich erfasst.

Abb.3.5-1: Auswertung des Anteils an neu gebildetem Knochen mit dem Bildanalysepro-

gramm Bioquant Osteo V 7.10.10 am Beispiel einer mit Bioglas und Strontium beschichteten

Probe nach 14 Tagen.

- 26 -

3.6 Histomorphometrische Untersuchung

Danach wurden die Dünnschliffpräparate auf ca. 30 µm reduziert und erneut

poliert. Nach fünfzehnminütiger Inkubation in 30 prozentigem Wasserstoffpe-

roxid unter ständiger Bewegung wurden sie unter fließendem kaltem Lei-

tungswasser abgespült und getrocknet. Die Färbung erfolgte in Toluidinblau O

Lösung (0,8 % Na-Tetraborat, 0,8 % Toluidinblau O, 0,2 % Pyronin G, pH

>10) ca. 5 min. Überschüssiger Farbstoff wurde durch Abspülen unter flie-

ßendem Leitungswasser entfernt.

Hierbei stellt sich mineralisiertes Hartgewebe ungefärbt, beziehungsweise

blassblau dar. In unterschiedlichen Blautönen erscheinen die Zellen, Zellker-

ne, Osteoidsäume, Kittlinien, Kollagenfasern und das Weichgewebe, während

Knorpelmatrix, Mastzellgranula und die frühen Wundheilungsareale rotviolett,

sowie die calzifizierte Knorpelmatrix dunkelblau angefärbt werden [73].

Die Präparate wurden nun ausschnittsweise mit einem Lichtmikroskop (Axi-

oskop, Zeiss, Jena) und einer Kamera (Axiocam, Zeiss, Jena) Digital fotogra-

fiert und zusätzlich, zur besseren Übersicht, mit einem Durchlichtscanner

hochauflösend (4800 dpi) gescannt. Alle Aufnahmen wurden im unkompri-

mierten Tif-Format gespeichert.

Die mit Toluidinblau O gefärbten Präparate wurden mikroskopisch untersucht

um qualitative Aussagen über den Verlauf der Knochenheilung zu ermögli-

chen.

3.7 Immunhistologische Untersuchungen

Der immunhistologische Knochenregenerationsnachweis erfolgte mithilfe von

Antikörpern gegen BMP-2, Kollagen I, Osteocalcin und Osteopontin. Verwen-

det wurden kreuzreaktive Antikörper nach dem Protokoll StreptAB/HRP-

Komplex (DAKO Diagnostika GmbH, Hamburg). StreptAB/HRP-Methode be-

deutet Strept-Avidin-Biotin/Horseraddish-Peroxidase-Methode und ist ein Ver-

treter der indirekten Methoden, bei denen ein Sekundär-Antikörper zum Ein-

satz kommt an den schließlich der Farbstoff (3-Amino-9-Ethylcarbazol, AEC,

DAKO Diagnostika GmbH, Hamburg) bindet.

- 27 -

Die Proben wurden zunächst in MEA entakryliert, in einer absteigenden Alko-

holreihe rehydriert und anschließend in 10 % EDTA entkalkt. Nun wurden zu-

erst unspezifische Bindungsstellen mit Serum-Free Blocking Agent (DAKO

Diagnostika GmbH, Hamburg) blockiert und die endogene Peroxidaseaktivität

mit 3 % Wasserstoffperoxid in TBS geblockt. Die Schnitte wurden dann je-

weils mit Anti-BMP-2, anti-Kollagen I, anti-Osteocalcin bzw. anti-Osteopontin

Antikörpern inkubiert. Nach sorgfältiger Waschung in PBS-Lösung wurden der

biotinylierte Sekundärantikörper, sowie der Strept AB-Komplex HRP (DAKO

Diagnostika GmbH, Hamburg) zugesetzt. Die Entwicklung erfolgte in 3-Amino-

9-Ethylcarbazol (AEC; DAKO). Es wurden bei jedem Färbegang Kontrollfär-

bungen ohne Primärantikörper durchgeführt. Eine Gegenfärbung mit Haema-

laun fand anschließend an die Färbung nach der StreptAB/HRP-Methode

statt. Die genauen Färberezepte sind im Anhang hinterlegt. Sie wurden von

Dr. med. dent. Achim Geidl und Dr. med. dent. Rainer Lutz (FAU Erlangen)

etabliert.

Abb.3.7-1: Schematische Darstellung der Immunhistochemie, StreptAB/HRP-Methode [35].

- 28 -

Zur Bestimmung der Expression der Knochenmatrixproteine wurden jeweils

drei Regionen im Defektrandbereich (s.Abb.3.7-2) jeder gefärbten Probe mit

einem Lichtmikroskop (AxioImager.A1, Zeiss, Jena) und einer Kamera (Axio-

cam, Zeiss, Jena) digitalisiert.

Osteotomielinie

LinkerRandRand

Rechter Rand

Mittlerer Rand

Osteotomielinie Osteotomielinie

LinkerRandRand

Rechter Rand

Mittlerer Rand

Osteotomielinie

Abb.3.7-2: Auswahl der ausgewerteten Regionen. Es wurden jeweils drei auf der ursprüngli-

chen Osteotomielinie liegende Bildausschnitte ausgewählt und Fotografiert.

Für die Proben, bei denen eine Flächenauswertung erfolgen sollte (Kollagen I,

Osteocalcin, Osteopontin), wurden die Bilder mit 20-facher, und für die

Auswertung der BMP-2 Färbung in 40-facher Vergrößerung aufgenommen.

Bei ersteren wurde mit der Bioquant Osteo Software V 7.10.10 (Bioquant

Image Analysis Cooperation, Nashville, USA) eine Bestimmung des

Verhältnisses von positiv gefärbter Fläche zu ungefärbter Fläche

vorgenommen. Bei den BMP-2 Schnitten erfolgte stattdessen die Zählung

BMP-2-postiver und -negativer Zellen mithilfe eines Rasters und eines

mechanischen Zählers. Da die Expressionsmaxima der untersuchten Knochenmatrixproteine zu den

ersten vier Opferungszeitpunkten, nach drei, sieben, vierzehn und dreißig Ta-

gen, erwartet wurden, sind zur immunhistologischen Untersuchung nur Pro-

ben dieser Opferungszeitpunkte herangezogen worden [7,24,35,36].

- 29 -

4. Ergebnisse

4.1 Mikroradiographie

In allen Gruppen zeigte sich während der Studiendauer eine Knochenneubil-

dung um die Cellulosegewirke. Die Defekte konnten aber auch nach 90 Tagen

nicht alle komplett vom Knochen umschlossen werden. Es wurde eine Kom-

pression der Gewirke festgestellt, ohne dass es zum Einwachsen von Kno-

chen von peripher zwischen die Fasern kam. Ab dem 30. Tag konnten sehr

vereinzelt röntgenopake Stellen zwischen den Fasern festgestellt werden, die

sich nach 90 Tagen vermehrt zeigten und nun den größten Teil des Defektbe-

reichs durchzogen (s. Abb.4.1-1).

Abb.4.1-1: Mineralisierungen im Defektbereich nach 90 Tagen. Links unbehandelte Cellulose,

rechts strontiumhaltige Bioglasbeschichtung.

Quantitativ wurde der prozentuale Anteil der Fläche der Knochenneubildung

im Defektbereich an der Gesamtdefektfläche (Bone Volume/ Total defect Vo-

lume, kurz BV/TV) ermittelt. Dabei konnte ein kontinuierlicher Anstieg des

Knochenvolumens beobachtet werden.

An den ersten beiden Opferungszeitpunkten nach drei und sieben Tagen

konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Beschich-

- 30 -

tungen festgestellt werden. Hierbei betrugen die Werte der Knochenneubil-

dung nach drei Tagen 0,83 ± 0,80 % bei der unbehandelten Cellulose, 0,43 ±

0,27 % bei der reinen Bioglasbeschichtung, 1,05 ± 0,70 % bei der pamidro-

nathaltigen Bioglasbeschichtung, 1,09 ± 0,90 % bei der strontiumhaltigen Bio-

glasoberfläche und 0,00 ± 0,00 % bei der mit Strontium direkt funktionalisier-

ten Oberfläche.

Nach sieben Tagen wurden 1,55 ± 1,79 % bei der unbehandelten Cellulose,

1,73 ± 0,89 % bei der reinen Bioglasbeschichtung, 1,69 ± 0,95 % bei der pa-

midronathaltigen Bioglasbeschichtung, 1,71 ± 0,93 % bei der strontiumhalti-

gen Bioglasoberfläche und 2,17 ± 1,08 % bei der mit Strontium direkt funktio-

nalisierten Oberfläche ermittelt.

Nach vierzehn Tagen war der Knochenanteil der mit Strontium direkt funktio-

nalisierten Proben mit 6,73 ± 1,49 % gegenüber den unbeschichteten Cellulo-

seproben mit 3,69 ± 1,63 % signifikant erhöht (p=0,033). Außerdem wurden

zu diesem Zeitpunkt keine signifikanten Unterschiede festgestellt. Die Werte

der anderen Probengruppen betrugen 5,15 ± 3,14 % bei der reinen Bioglas-

beschichtung, 4,78 ± 3,76 % bei der pamidronathaltigen Bioglasbeschichtung

und 5,22 ± 4,20 % bei der strontiumhaltigen Bioglasoberfläche.

Nach dreißig Tagen zeigten sich die mit Strontium direkt funktionalisierten

Proben (15,63 ± 1,48 %) der reinen Bioglasoberfläche (11,28 ± 1,12 %

p=0,015), sowie der strontiumhaltigen Bioglasoberfläche (11,86 ± 1,63 %

p=0,041) überlegen. Ebenfalls signifikant höhere Werte konnten für die pa-

midronathaltige Bioglasbeschichtung (15,52 ± 2,28 %) gegenüber der reinen

Bioglasoberfläche festgestellt werden (p=0,045). Es ergaben sich zu diesem

Zeitpunkt keine weiteren signifikanten Unterschiede. Für die unmodifizierte

Cellulose wurde ein Wert von 12,45 ± 3,93 % ermittelt.

Zum letzten Opferungszeitpunkt nach neunzig Tagen zeigte die mit Strontium

direkt funktionalisierte Cellulose mit 11,14 ± 2,06 % niedrigere Werte als die

anderen Gruppen. Die größte Knochenneubildung konnte mit 19,67 ± 1,96 %

um die unbeschichtete Cellulose festgestellt werden. Sie war gegenüber der

- 31 -

mit Strontium Direkt funktionalisierten mit 11,14 ± 2,06 % (p=0,000) und der

pamidronathaltigen Bioglasbeschichtung mit 14,30 ± 3,36 % (p=0,015) signifi-

kant erhöht. Ebenfalls signifikant höhere Ergebnisse konnten bei der reinen

Bioglasbeschichtung mit 17,33 ± 4,18 % (p=0,018) sowie bei der strontiumhal-

tigen Bioglasbeschichtung mit 16,19 ± 4,23 % (p=0,043) im Vergleich zur di-

rekt funktionalisierten Cellulose festgestellt werden.

Abb.4.1-2: Übersicht über die Knochenneubildung im Defektbereich. Auswertung des Anteils

von neu gebildetem Knochen an der Defektfläche in Prozent.

- 32 -

4.2 Lichtmikroskopie

Abb.4.2-1: Beispiel der Toluidinblau-O Färbung. Interface zur Cellulose (hier: pamidronathal-

tige Bioglasbeschichtung) nach 14 Tagen. Eine schmale Bindegewebsschicht *, sowie neue

Knochentrabekel sind zu erkennen. [20x].

Bei der mikroskopischen Untersuchung der mit Toluidinblau-O gefärbten

Präparate wurden folgende Beobachtungen gemacht:

Nach drei Tagen konnten erste Resorptionslakunen in den Defektrandberei-

chen festgestellt werden. Teilweise waren große Abstände zwischen den De-

fekträndern und den Celluloseproben erkennbar.

Nach sieben Tagen traten im Zuge der inflammatorischen Phase vermehrt

Entzündungszellen (Plasmazellen und Lymphozyten) auf. Auf die Randgebie-

te begrenzt zeichnete sich eine beginnende Osteoidneubildung ab.

Am dritten Opferungszeitpunkt nach vierzehn Tagen konnte, vom Defektrand

ausgehend, die Formation von Geflechtknochen beobachtet werden. Sie blieb

- 33 -

aber auf den unmittelbaren Defektrand begrenzt und konnte nicht zwischen

die Cellulosefasern vordringen. Bei zwei von drei Tieren war eine breite bin-

degewebige Abkapselung der Probenkörper, mit zum Teil anhaftenden nekro-

tischen Knochenlamellen zu beobachten. Diesbezüglich gab es keine Unter-

schiede zwischen den einzelnen Probengruppen.

Am dreißigsten Tag nach der Implantation war die Knochenneubildung deut-

lich zu erkennen. Dabei kam es zu einer Kompression der Cellulosegewirke,

die weiterhin frei von einwachsendem Knochengewebe blieben. Von den

Randbereichen ausgehend konnte die Umwandlung in Lamellenknochen beo-

bachtet werden.

Nach neunzig Tagen waren an den Knochengrenzen im Defektrandbereich

kaum noch Osteoidsäume zu sehen. Es kam zur Ausbildung einer kompak-

taartigen Knochengrenzschicht. Lediglich an den oberen Defekträndern konn-

te noch eine, von der Oberflächenkompakta ausgehende, periostale Kno-

chenneubildung beobachtet werden. Im Gegensatz dazu fiel bei den mit

Strontium direkt funktionalisierten Proben sowie den Proben mit der pamidro-

nathaltigen Bioglasbeschichtung ein höherer Anteil von Geflechtknochen und

weniger Kompaktabildung auf.

Vereinzelt waren zwischen den Cellulosefasern im zentralen Defektbereich

mineralisierte Areale zu sehen, ohne dass regelrechtes Knochengewebe

nachgewiesen werden konnte.

Betrachtete man die Bindegewebsdicke zwischen dem knöchernen Defekt-

rand und den eingebrachten Cellulosegewirken, so fielen zu keinem Untersu-

chungsbereich bemerkbare Unterschiede zwischen den einzelnen Untersu-

chungsgruppen ins Auge. Die Knochenneubildung erfolgte dabei immer vom

Defektrand aus. Ein unmittelbarer, flächiger Kontakt der Cellulosefasern zum

Knochen wurde nicht festgestellt.

- 34 -

4.3 BMP 2/4

Abb.4.3-1: Auswertungsbeispiel einer BMP 2/4 Probe bei 40-facher Vergrößerung. Rote

Punkte entsprechen positiv gezählten Zellen, schwarze Punkte Negativen. Unten sind negati-

ve (links) sowie positive (rechts) Zellen vergrößert dargestellt. Rechts die Auszählung der

Probe mit Zählraster.

Der Anteil BMP-positiver Zellen im ortsständigen Knochen lag bei einem Mit-

telwert von 22,85 ± 5,10 %.

Im Untersuchungszeitraum wurde der höchste Anteil BMP-produzierender

Zellen am zweiten Opferungszeitpunkt nach sieben Tagen festgestellt. Auch

zum dritten bis fünften Opferungszeitpunkt lagen die Werte aller Gruppen sig-

nifikant über den beim ortsständigen Knochen ermittelten Werten.

Nach drei Tagen zeigte sich mit 31,44 ± 13,57 % ein signifikant erhöhter An-

teil BMP-positiver Zellen in der strontiumhaltigen Bioglasoberfläche verglichen

mit 20,93 ± 9,56 % bei der unbehandelten Cellulose (p=0,021) sowie den

Werten für ortsständigen Knochen (p=0,020). Zwischen den restlichen Pro-

bengruppen konnten, mit 29,21 ± 14,06 % bei der reinen Bioglasbeschich-

tung, 26,21 ± 11,77 % bei der pamidronathaltigen Bioglasbeschichtung und

26,00 ± 10,89 % bei der mit Strontium direkt funktionalisierten Oberfläche,

keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden.

Zum zweiten Opferungszeitpunkt nach sieben Tagen wurden zwischen den

einzelnen Oberflächenmodifikationen, sowie der unbehandelten Cellulose-

oberfläche keine signifikanten Unterschiede festgestellt. Der Anteil BMP-

positiver Zellen betrug hierbei 50,76 ± 13,89 % bei der unbehandelten Cellu-

- 35 -

lose, 47,95 ± 12,25 % bei der reinen Bioglasbeschichtung, 49,86 ± 11,92 %

bei der pamidronathaltigen Bioglasbeschichtung, 53,33 ± 11,27 % bei der

strontiumhaltigen Bioglasoberfläche und 52,52 ± 13,90 % bei der mit Stronti-

um direkt funktionalisierten Oberfläche.

Auch nach vierzehn Tagen konnten zwischen den einzelnen Untersuchungs-

gruppen keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden. Die hierbei

ermittelten Ergebnisse waren 40,54 ± 12,95 % für die unbehandelte Cellulose,

40,62 ± 12,15 % für die reine Bioglasbeschichtung, 34,21 ± 13,39 % für die

pamidronathaltige Bioglasoberfläche, 41,63 ± 6,94 % für die strontiumhaltige

Bioglasbeschichtung, sowie 43,33 ± 16,08 % für die mit Strontium direkt funk-

tionalisierte Oberfläche.

Signifikant erhöhte Werte gegenüber allen anderen Oberflächen wurden nach

dreißig Tagen mit 50,01 ± 11,02 % für die pamidronathaltige Bioglasoberflä-

che erzielt. Die restlichen Werte betrugen 35,36 ± 13,04 % für die unbehan-

delte Cellulose, 40,32 ± 13,15 % für die reine Bioglasbeschichtung, 35,60 ±

13,25 % für die strontiumhaltige Bioglasbeschichtung sowie 38,61 ± 12,80 %

für die mit Strontium direkt funktionalisierte Oberfläche.

Abb.4.3-2: Übersicht über den Anteil BMP-positiver Zellen an der Gesamtzahl der Osteozy-

ten.

- 36 -

4.4 Kollagen I

Abb.4.4-1: Auswertungsbeispiel einer gegen Kollagen I gefärbten Probe. Es ergibt sich hier-

bei eine Kollagen I Expression von 7,45 %.

Bei der Auswertung der Kollagen I-Färbung des ortsständigen Knochens er-

gab sich ein Mittelwert von 11,35 ± 5,24 %. Signifikant höhere Werte als die

Grundexpression im ortsständigen Knochen konnten zu keinem Untersu-

chungszeitpunkt festgestellt werden.

Drei Tage nach Implantation lagen alle Gruppen signifikant unter den Werten

im ortsständigen Knochen. Die hierbei ermittelten Ergebnisse waren 3,13 ±

3,47 % für die unbehandelte Cellulose, 3,57 ± 3,76 % für die reine Bioglasbe-

schichtung, 1,22 ± 1,98 % für die pamidronathaltige Bioglasoberfläche, 4,35 ±

3,16 % für die strontiumhaltige Bioglasbeschichtung, sowie 2,59 ± 2,90 % für

die mit Strontium direkt funktionalisierte Oberfläche. Signifikant höhere Ex-

pressionen als die pamidronathaltige Bioglasoberfläche zeigten, sowohl die

reine Bioglasbeschichtung mit p=0,041, als auch die strontiumhaltige Bioglas-

oberfläche mit p=0.003, was sogar als hochsignifikant gewertet werden kann.

Auch nach sieben Tagen waren die ermittelten Werte für die mit Strontium

direkt funktionalisierte Oberfläche mit 8,23 ± 4,96 %, sowie für die pamidro-

nathaltige mit 6,39 ± 5,48 % und die strontiumhaltige Bioglasbeschichtung mit

- 37 -

7,91 ± 5,85 % noch signifikant niedriger als im ortsständigen Knochen. Die

unmodifizierte Cellulose und die reine Bioglasbeschichtung zeigten mit 9,35 ±

6,76 % und 8,97 ± 5,45 % keine signifikanten Unterschiede.

Nach vierzehn Tagen konnten für die reine Bioglasbeschichtung mit 2,20 ±

2,27 % und die strontiumhaltige Bioglasbeschichtung mit 3,19 ± 1,98 % Er-

gebnisse ermittelt werden, die signifikant niedriger als bei den übrigen Grup-

pen ausfielen. Die Werte im ortsständigen Knochen waren gegenüber denen

für die pamidronathaltige Bioglasbeschichtung mit 6,52 ± 5,75 % (p=0,003)

und die mit Strontium direkt funktionalisierte Oberfläche mit 7,22 ± 5,59 %

(p=007) ebenfalls signifikant erhöht. Für die unmodifizierte Cellulose wurde

eine Kollagen I Expression von 10,53 ± 6,83 % ermittelt.

Am letzten immunhistologisch untersuchten Opferungszeitpunkt nach dreißig

Tagen waren nur noch die Werte für unmodifizierte Cellulose mit 7,97 ± 4,53

% und die mit Strontium direkt funktionalisierte Celluloseoberfläche mit 8,86 ±

3,55 % signifikant niedriger als die ermittelte Grundexpression. Die restlichen

Werte betrugen 9,89 ± 4,82 % für die reine Bioglasbeschichtung, 11,87 ± 6,82

% für die pamidronathaltige, sowie 10,56 ± 8,70 % für die strontiumhaltige

Bioglasbeschichtung.

Abb.4.4-2: Übersicht über die Expression von Kollagen I. Ausgewertet wurde jeweils der posi-

tiv gefärbte Flächenanteil in Prozent.

- 38 -

4.5 Osteocalcin

Abb.4.5-1: Auswertungsbeispiel einer zur Bestimmung von Osteocalcin gefärbten Probe. Es

ergibt sich eine Osteocalcinexpression von 13,74 %.

Die Auswertung der Osteocalcinexpression des ortsständigen Knochens er-

gab einen Mittelwert von 14,22 ± 5,12 %.

Zum ersten Opferungszeitpunkt nach drei Tagen lagen alle Gruppen signifi-

kant unter den Ergebnissen im ortsständigen Knochen. Die ermittelte Osteo-

calcinexpression betrug hierbei 6,07 ± 4,38 % bei der unbehandelten Cellulo-

se, 5,79 ± 7,58 % bei der reinen Bioglasbeschichtung, 7,64 ± 7,68 % bei der

pamidronathaltigen Bioglasbeschichtung, 9,31 ± 6,36 % bei der strontiumhal-

tigen Bioglasoberfläche und 6,14 ± 6,34 % bei der mit Strontium direkt funkti-

onalisierten Oberfläche.

Nach sieben Tagen konnten für die mit Strontium direkt funktionalisierte O-

berfläche mit 14,55 ± 8,19 % signifikant (p=0,044) höhere Werte gemessen

werden als für die reine Bioglasbeschichtung mit 8,81 ± 6,67 %. Zwischen den

restlichen Gruppen wurden mit 13,68 ± 8,72 % bei der unbehandelten Cellulo-

se, 10,71 ± 6,00 % bei der pamidronathaltigen und 13,80 ± 9,68 % bei der

- 39 -

strontiumhaltigen Bioglasoberfläche keine signifikanten Unterschiede festge-

stellt. Die Werte im ortsständigen Knochen lagen dabei signifikant höher als

bei der reinen (p=0,004) und bei der strontiumhaltigen Bioglasbeschichtung

(p=0,031).

Vierzehn Tage nach der Implantation waren alle Werte, außer für die mit

Strontium direkt funktionalisierte Oberfläche mit 11,47 ± 10,38 %, deutlich

niedriger als nach sieben Tagen, sowie signifikant niedriger als im ortsständi-

gen Knochen. Die mit Strontium direkt funktionalisierte Oberfläche (p=0,014)

sowie die unmodifizierte Cellulose (9,93 ± 7,40 %, p=0,011) zeigten dabei ge-

genüber der reinen Bioglasbeschichtung (3,73 ± 4,80 %) eine signifikant er-

höhte Osteocalcinexpression. Für die pamidronathaltige und die strontiumhal-

tige Bioglasoberfläche wurden 7,36 ± 4,90 % und 7,45 ± 6,00 % gemessen.

Nach dreißig Tagen konnten keine signifikanten Unterschiede mehr festge-

stellt werden. Die ermittelten Werte betrugen 13,42 ± 11,37 % für die unbe-

handelte Cellulose, 17,37 ± 9,93 % für die reine, 14,35 ± 10,04 % für die pa-

midronathaltige und 17,55 ± 7,87 % für die strontiumhaltige Bioglasbeschich-

tung, sowie 12,95 ± 9,44 % für die mit Strontium direkt funktionalisierte Ober-

fläche.

Abb.4.5-2: Übersicht über die Osteocalcinexpression. Ausgewertet wurde jeweils der positiv

gefärbte Flächenanteil in Prozent.

- 40 -

4.6 Osteopontin

Abb.4.6-1: Auswertungsbeispiel einer zur Auswertung der Osteopontinexpression gefärbten

Probe. Es ergibt sich eine Osteopontinexpression von 2,68 %.

Für Osteopontin wurde im ortsständigen Knochen eine Grundexpression von

1,00 ± 0,96 % festgestellt.

Nach drei Tagen zeigten sich zwischen den einzelnen Probengruppen keine

signifikanten Unterschiede, wobei die Grundexpression jeweils signifikant hö-

her lag. Die ermittelte Osteopontinexpression betrug 0,12 ± 0,31 % für die un-

behandelte Cellulose, 0,12 ± 0,16 % für die reine, 0,19 ± 0,20 % für die pa-

midronathaltige und 0,28 ± 0,44 % für die strontiumhaltige Bioglasbeschich-

tung, sowie 0,08 ± 0,17 % für die mit Strontium direkt funktionalisierte Ober-

fläche.

Auch nach sieben Tagen wurden mit 0,25 ± 0,31 % für die unbehandelte Cel-

lulose, 0,22 ± 0,33 % für die reine, 0,13 ± 0,20 % für die pamidronathaltige

und 0,12 ± 0,19 % für die strontiumhaltige Bioglasbeschichtung, sowie 0,09 ±

0,16 % für die mit Strontium direkt funktionalisierte Oberfläche, ähnlich niedri-

ge Werte ermittelt. Die Grundexpression war ebenfalls gegenüber allen unter-

suchten Gruppen signifikant erhöht.

Zum dritten Opferungszeitpunkt nach vierzehn Tagen war die Grundexpres-

sion gegenüber allen untersuchten Gruppen weiterhin signifikant erhöht. Die

mit Strontium direkt funktionalisierte Cellulose zeigte mit 0,33 ± 0,33 %

(p=0,011), ebenfalls wie die Unbehandelte, mit 0,26 ± 0,21 % (p=0,010), eine

- 41 -

signifikant höhere Osteopontinexpression als die pamidronathaltige Bioglas-

beschichtung mit 0,08 ± 0,13 %. Die weiteren Werte betrugen 0,15 ± 0,20 %

für die unmodifizierte, sowie 0,33 ± 0,49 % für die strontiumhaltige Bioglas-

oberfläche.

Dreißig Tage nach der Implantation konnten deutliche Unterschiede zwischen

den Probengruppen festgestellt werden. Dabei zeigten sich die Werte für die

strontiumhaltige Bioglasoberfläche mit 1,84 ± 0,81 % und die mit Strontium

direkt funktionalisierte Cellulose mit 1,98 ± 0,92 %, sowohl gegenüber den

anderen Probengruppen, als auch gegenüber dem ortsständigen Knochen als

hochsignifikant (p jeweils ≤ 0,001) erhöht. Für die unbehandelte Cellulose

wurden 0,68 ± 0,68 %, für die reine Bioglasoberfläche 0,89 ± 0,55 % und für

die pamidronathaltige Bioglasoberfläche 0,68 ± 0,55 % Osteopontinexpressi-

on ermittelt. Außerdem waren die Werte für die pamidronathaltige Bioglas-

oberfläche weiterhin signifikant niedriger (p=0,035) als im ortsständigen Kno-

chen.

Abb.4.6-2: Übersicht über die Osteopontinexpression. Ausgewertet wurde jeweils der positiv

gefärbte Flächenanteil in Prozent.

- 42 -

5. Diskussion

In unserer Studie galt es die verwendeten Cellulosegewirke, nach erfolgten in-

vitro Studien [14,71], in-vivo zu erproben. Dabei kann man bei dem verwende-

ten Tiermodell von einer hohen Übertragbarkeit der Ergebnisse auf den

menschlichen Organismus ausgehen, da sowohl die Stoffwechselrate als

auch die Knochenneubildungsrate des Schweins den Werten der diskutierten

alternativen Modellen an Ratten, Hasen und Schafen als Vergleichswert zur

Stoffwechsel- und Knochenneubildungsrate des Menschen überlegen ist [82,

83, 101].

Eine Bioaktivität der verwendeten modifizierten Oberflächen konnte erwartet

werden, da in einem vorhergehenden in-vitro Versuch nach siebentägiger

Auslagerung in simulierter Körperflüssigkeit (simulated body fluid, SBF) eine

deutliche Hydroxylapatitbildung auf der Oberfläche nachgewiesen werden

konnte. Bei der unbeschichteten Cellulose kam es in-vitro jedoch zu keiner

Hydroxylapatitbildung [14, 71]. Außerdem blieb durch das Beschichtungsver-

fahren die Makroporosität der Cellulosegewirke erhalten, womit die Möglich-

keit des Einwachsens von Knochengewebe und einer späteren Vaskularisie-

rung bestehen bleiben sollte. Die mittleren Wirkstoffkonzentrationen von Pa-

midronat und Strontium zeigten in den in-vitro Untersuchungen, insgesamt

gesehen, die besten Ergebnisse [71], weshalb Wirkstoffkonzentrationen von

0.333 mg/ml¹ zur in-vivo Testung herangezogen wurden.

Cellulosefasern können nur durch bestimmte Bakterien und Pilze, sowie in

sehr starken Säuren gespalten werden [38]. Die hier verwendeten Fasern

wurden auch durch die Vorbehandlung in Oxalsäure bei der Aktivierung mit

Strontiumchlorid nur oberflächlich angelöst. Sie sind gegenüber dem Abbau

im Wirtsorganismus nahezu vollständig resistent. So blieben alle Cellulose-

gewirke während des ganzen Untersuchungszeitraumes vollständig intakt. Die

Gewirke wurden durch das neu gebildete Knochengewebe lediglich etwas

komprimiert, wodurch ihr Volumen abnahm.

Die interkonnektierende Makroporosität der Cellulosegewirke sollte eine

Vaskularisierung des Defektbereiches und das Einwachsen von Knochentrab-

ekeln zwischen die Cellulosegarne ermöglichen. In der Literatur wird für die

- 43 -

Migration von Zellen, das Einwachsen von Geweben und schließlich für die

Vaskularisation eine Porengröße von mindestens 100 µm, aber besser mehr

als 300 µm gefordert [47, 49]. Obwohl auch noch nach der Bioglasbeschich-

tung Poren von 100-300 µm zwischen den Garnsträngen festzustellen waren,

kam es im ganzen Untersuchungszeitraum nicht zum Einwachsen von Kno-

chentrabekeln in die Gewirke.

Um den Abbau der Bioglasbeschichtung und die damit verbundene Freiset-

zung von Pamidronat und Strontium besser beurteilen zu können wurden von

Dr. Heike Brandt (Lehrstuhl für Werkstoffwissenschaften 3 der FAU-Erlangen)

Aufnahmen jedes Untersuchungszeitpunktes im Rasterelektronenmikroskop

angefertigt. Dabei konnte ab dem ersten Opferungszeitpunkt, von den Rand-

bereichen ausgehend, eine stetige Auflösung der Bioglasbeschichtung beo-

bachtet werden, wobei auch am 90. Tag noch Bioglas im zentralen Defektbe-

reich zu erkennen war.

Durch diesen kontinuierlichen Abbau kann die Freisetzung von Pamidronat

und Strontium aus den Bioglasoberflächen als mindestens dreimonatiger Pro-

zess angesehen werden. Man kann die verwendete Bioglasbeschichtung so-

mit als langzeitwirksames Slow-Release-System der ausgewählten Pharmaka

betrachten.

Bei den in der Mikroradiographie, nach 30 und vermehrt nach 90 Tagen, fest-

gestellten röntgenopaken Stellen zwischen den Cellulosegarnen wurde eine

Elementanalyse mittels der energiedispersiven Röntgenspektroskopie zur ge-

naueren Beurteilung durchgeführt. Diese zeigte einen hohen Anteil an Calci-

um und Phosphor, was auf die Formation von Hydroxylapatit schließen lässt.

Somit kann auch in-vivo von einer Bioaktivität der verwendeten Beschichtun-

gen ausgegangen werden, die in-vitro bereits mehrfach für vergleichbare O-

berflächen beschrieben wurde [14, 45, 68]. Da diese Hydroxylapatitformatio-

nen auch bei der unbehandelten Cellulose, in vergleichbarem Maße, festzu-

stellen waren, kann bei dieser, in der verwendeten Untersuchungskonstellati-

on, ebenfalls von einer Bioaktivität ausgegangen werden. Eine quantitative

Auswertung der Hydroxylapatitformationen in der Mikroradiographie wurde

nicht vorgenommen, da die Schichtdicke einiger Proben im zentralen Defekt-

bereich zu dünn erschien und so nicht genügend Daten für eine repräsentati-

- 44 -

ve Auswertung vorlagen. Untersucht man diese Areale lichtmikroskopisch, ist

keinerlei Osteoblastentätigkeit zu erkennen.

Die Biokompatibilität eines potentiellen Knochenersatzmaterials ist für die me-

dizinische Verwendbarkeit von großer Bedeutung [29]. In-vitro wurde die Bio-

kompatibilität der untersuchten Cellulosematerialen bereits bestätigt [14,71].

Um ihre Biokompatibilität in-vivo zu beurteilen, wurden die Proben lichtmikro-

skopisch untersucht. Ab dem dritten Opferungszeitpunkt nach vierzehn Tagen

waren, außer bei zwei Tieren, keine größeren Entzündungen mehr zu sehen.

Diese beiden Tiere wurden nach vierzehn Tagen euthanasiert und wiesen bei

sämtlichen Defekten eine breite bindegewebige Abkapselung der Cellulose-

gewirke und teilweise anhaftenden avitalen Knochengewebes auf. Darum

kann nach dieser Studie der Biokompatibilität der untersuchten Werkstoffe nur

eingeschränkt zugestimmt werden.

Die Bindegewebsdicke war ansonsten kaum vom Opferungszeitpunkt abhän-

gig und meistens für alle Proben eines Versuchstiers sehr ähnlich. Da kein

unmittelbarer, flächiger Kontakt der Cellulosefasern zum Knochen beobachtet

wurde, kann für die verwendeten Cellulosegewirke keine Osseointegration

[23] festgestellt werden.

Weil der neu gebildete Knochen auch nach 90 Tagen nicht in die Cellulose-

gewirke vordringen konnte, wurde keiner der untersuchten Defekte vollständig

knöchern durchbaut. Mit autologem Knochen, aber auch mit nanopartikulärem

Hydroxylapatit, ist ein Defekt dieser Größe, am verwendeten Untersuchungs-

modell, jedoch schon nach acht Wochen vollständig knöchern durchbaut [81].

Die verwendeten Cellulosegewirke reichen somit nicht entfernt an die Leistun-

gen von Referenzmaterialien heran.

Die Bildung des neuen Knochengewebes erfolgte ausschließlich vom Defekt-

rand aus, man kann hier also von einer Distanzosteogenese sprechen [23,

94]. Da keinerlei Knochenbildung an der Oberfläche der untersuchten Cellulo-

segewirke festzustellen war, kann die Osteokonduktivität, sowie die Ostein-

duktivität aller untersuchten Materialien als negativ beurteilt werden.

Beim quantitativen Vergleich des neu gebildeten Knochens in der Mikroradio-

graphie zeigen sich keine bemerkenswerten Unterschiede zwischen den Pro-

- 45 -

bengruppen. Auffällig ist jedoch, dass die mit Strontium direkt funktionalisier-

ten Proben und jene mit der pamidronathaltigen Bioglasbeschichtung nach 30

Tagen die höchsten Werte aller Gruppen zeigten, während sie am letzten Op-

ferungszeitpunkt, nach 90 Tagen, sogar niedrigere Knochenanteile als nach

30 Tagen aufwiesen. Wohingegen alle anderen Oberflächen zu diesem Zeit-

punkt einen kontinuierlichen Anstieg des neu gebildeten Knochens im Defekt-

bereich, gegenüber dem vorigen Untersuchungszeitpunkt, zeigten.

Untersucht man die Proben lichtmikroskopisch auf diesen Unterschied, fällt

ein höherer Anteil von Geflechtknochen bei den mit Strontium direkt funktiona-

lisierten Proben sowie den Proben mit der pamidronathaltigen Bioglasbe-

schichtung nach 90 Tagen auf, während die restlichen untersuchten Gruppen

stattdessen deutlich mehr von Kompakta bedeckten Lamellenknochen auf-

weisen. Man kann also von einer Störung der Remodellation des neu gebilde-

ten Knochens ausgehen. Eventuell ist dies auf eine Hemmung der Oste-

oklastentätigkeit durch Pamidronat [27] bzw. Strontium [58] zurückzuführen.

In der vorliegenden Studie wurde die Expression der Knochenmatrixproteine

BMP 2/4, Kollagen I, Osteocalcin und Osteopontin immunhistochemisch im

Defektrandbereich, sowie im ortsständigen Knochen bestimmt. Die Expressi-

on dieser Proteine weist in der Literatur, abhängig von den verwendeten Un-

tersuchungsmethoden große Schwankungen auf [16, 17, 30, 44, 56, 63, 64,

67, 69, 74]. Daher sollen die ermittelten Expressionen nur untereinander in

Relation gebracht werden und vor allem die Expressionsprofile im zeitlichen

Verlauf beurteilt werden. Berücksichtigt man außerdem den hohen Anteil an

Proben mit kompromittierter Einheilung (15 von insgesamt 25 Defekten) nach

14 Tagen, scheint es ratsam den Ergebnissen dieses Untersuchungszeit-

punkts tendenziell eine geringere Aussagekraft zuzusprechen.

Für BMP 2/4 wurde das Expressionsmaximum nach einer Woche festgestellt,

dabei lag es für alle Proben signifikant über der Expression im ortsständigen

Knochen. An den weiteren Opferungszeitpunkten fielen die Werte zwar ab,

blieben aber signifikant über der Grundexpression. Lediglich die Proben der

pamidronathaltigen Bioglasoberfläche zeigten auch noch nach 30 Tagen eine

dem siebten Tag vergleichbare Expression, diese war gegenüber den ande-

ren Gruppen signifikant erhöht. Die Proben der strontiumhaltigen Bioglasober-

- 46 -

fläche zeigten auch schon nach drei Tagen signifikant über der Grundexpres-

sion liegende Werte.

BMP 2 und 4 stimulieren die Proliferation und Differenzierung der Präoste-

oblasten [18, 72, 96, 103]. Ihre Expression ist daher ein Anzeichen für begin-

nende Knochenbildung. Die hohe Expression nach sieben Tagen spricht also

für eine rege Osteoblastenbildung im Defektrandbereich aller Proben. Ein

diesbezüglicher Vorteil einer bestimmten Beschichtung konnte hierbei nur für

die pamidronathaltigen Bioglasoberflächeoberfläche festgestellt werden.

Kollagen Typ I ist, mit einem Anteil von über 90 Gewichtsprozent, ein wesent-

liches Strukturprotein in der organischen Knochenmatrix [20, 70]. Es bildet

das Gerüst für die Zelladhäsion und Mineralisation. Der Kollagen I - Anteil war

generell nach sieben und vor allem nach 30 Tagen am höchsten. Ihr Expres-

sionsmaximum, das kaum von der Grundexpression abweicht, erreichten alle

modifizierten Proben nach 30 Tagen, während es bei der unmodifizierten Cel-

lulose bei sieben, beziehungsweise 14 Tagen lag. Dieses Ergebnis korreliert

aber nicht mit einer verbesserten Knochenbildung nach dreißig Tagen.

Osteocalcin bindet Kalzium an die Knochenmatrix und kann somit als Marker

für die Knochenmineralisierung verwendet werden [18, 24]. In der Literatur

erreicht Osteocalcin sein Expressionsmaximum in der dritten bis fünften Wo-

che der Knochenneubildung [91]. In der vorliegenden Studie erreichte Osteo-

calcin sein Expressionsmaximum bei der Unbeschichteten, sowie der mit

Strontium direkt funktionalisierten Cellulose bereits nach einer Woche, wäh-

rend die Expressionsmaxima aller Bioglasbeschichtungen erst nach 30 Tagen

erreicht wurden. Für die bioglashaltigen Oberflächen kann daher von einer, im

Vergleich zu den restlichen Materialien, verzögerten Knochenmineralisation

gesprochen werden, die sich aber nicht in der, nach sieben bzw. 14 Tagen,

gemessenen Knochenquantität widerspiegelt.

Das Expressionsmaximum erreichte Osteopontin bei allen Proben am 30.

Tag. Osteopontin spielt neben seiner regulativen Rolle in der Adhäsion von

Knochenzellen und der Matrixmineralisation [53, 93], eine wichtige Rolle bei

sämtlichen Umbauvorgängen im Knochen, da es Osteoklasten und Oste-

oklastenvorläuferzellen an die Matrix bindet [36]. Eine überdurchschnittliche

Expression kann also als Indikator für eine starke Remodellierungstätigkeit im

Knochen gelten. Die Expression von Osteopontin lag für die pamidronatbe-

- 47 -

schichteten Proben nach 30 Tagen noch signifikant unter der Grundexpressi-

on, was in Verbindung mit den Ergebnissen der Mikroradiographie und Licht-

mikroskopie auf eine Hemmung der Osteoklastentätigkeit durch Pamidronat

[27] schließen lässt. Gleichzeitig zeigten beide strontiumhaltigen Cellulosege-

wirke nach 30 Tagen eine signifikant höhere Osteopontinexpression als alle

anderen Proben und der ortsständige Knochen. Bei diesen Proben muss also

von einer überproportionalen Mineralisierungs- und / oder Osteoklastentätig-

keit ausgegangen werden.

Eine langsame Degradation der Cellulosegewirke wäre im Sinne der Kno-

chenregeneration idealerweise zu fordern. Diese wäre aber nur bei einer Zer-

setzung in kleinste Partikel möglich, die dann von Makrophagen abtranspor-

tiert werden könnten. Durch Modifikation der chemischen Kettenstruktur der

Cellulosefasern könnten resorbierbare Sollbruchstellen eingebaut werden.

Gleichzeitig müsste die neue Kettenstruktur aber die Belastungen der Be-

schichtungsvorgänge unbeschadet überstehen.

Durch die fehlende Osteokonduktivität der Oberflächen, die zu gering erschei-

nende Porengröße der Gewirke und die fehlenden Degradations- und

Resorptionsmöglichkeiten der Cellulosefasern, wird eine stabilisierende

knöcherne Durchbauung des Defektes effektiv verhindert, was einem

medizinischen Einsatz von Cellulosegewirken als Knochenersatzmaterialien in

der untersuchten Form entgegensteht.

Keines der verwendeten Cellulosegewirke ist also für den klinischen Einsatz

geeignet. Die angewendete Bioglasbeschichtung zeigt jedoch Potential als

Slow-Release-System zur kontinuierlichen, lokalen Abgabe von Pharmaka

aus Knochenersatzmaterialien. Die Wirksamkeit dieses Systems wird auch

durch die oben beschriebene Hemmung der Knochenremodellation durch

Pamidronat bestätigt. Weitere Studien der angewandten Bioglasbeschichtun-

gen auf einem kristallinen oder großporigen etablierten Knochenersatzmateri-

al erscheinen vielversprechend.

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7 Abkürzungsverzeichnis Seite: Abkürzung: Bedeutung:

6 BMP Bone Morphogenetic Protein

10 pH potentia Hydrogenii

11 TGF Transforming Growth Factor

14 ATP Adenosintriphosphat

14 RANKL Receptor Activator of NF- κB Ligand

15 Sr Strontium

15 et al. et alia

18 dtex decitex: Gramm pro 10.000 Meter Faserlänge

18 s. Abb. siehe Abbildung

19 mg/ml Milligramm pro Milliliter

19 Cell Cellulose

19 Cell+WG Cellulose mit Bioglas beschichtet

19 Cell+WG+ BisP Cellulose mit Bioglas / Pamidronat beschichtet

19 Cell+WG+Sr Cellulose mit Bioglas / Strontium beschichtet

19 Cell+Sr Cellulose direkt mit Strontium-carbonat be-

schichtet

20 µm Mikrometer

20 µm/d Mikrometer pro Tag

21 mg/kg KG Milligram pro Kilogramm Körpergewicht

21 I.E Ioneneinheiten

21 Vol.% Volumenprozent

24 UV Ultraviolet

25 Tif-Format Tagged Image File - Dateiformat

26 dpi dots per inch

26 StreptAB/HRP Strept-Avidin-Biotin/Horseraddish-Peroxidase

27 MEA Monoethanolamin

27 EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

27 TBS Tris-buffered Saline

29 BV/TV Bone Volume/ Total defect Volume

42 SBF simulated body fluid

- 61 -

8. Anhang

8.1 Färberezept BMP 2/4

BMP 2/4 (H51, sc-9003, Santa Cruz)

Zeit: Temperatur: Arbeitsschritt:

1 h RT Entakrylieren in MEA

RT absteigende Alkoholreihe in Aqua Dest

20’ RT EDTA 10 %, pH 7,4

10’ RT Fließendes Leitungswasser

2x2’ RT Aqua Dest

3x2’ RT TBS

15’ 99 °C Citratpuffer, pH 6,0

30’ Abkühlen

3x2’ RT TBS

15’ RT 3 % H2O2 in TBS (Peroxidase Blocken)

3x2’ RT TBS

20’ RT Proteinblock Dako

1h RT Primärantikörper BMP 2/4 - 1:25

3x2’ RT TBS

30’ RT Sekundärantik. (biotinyliert Ziege: Kaninchen

1:400)

3x2’ RT TBS

30’ RT StreptAB/HRP

3x2’ RT TBS

5’-20’ RT AEC (Sichtkontrolle)

5’ RT Aqua Dest

10’’-30’’ RT Haemalaun (Dako) 1:4 mit Aqua Dest verdünnt

5’ RT Fließendes Leitungswasser

5’ RT Aqua Dest

RT mit Faramount eindecken

- 62 -

8.2 Färberezept Kollagen I

Kollagen I (Abcam 6308 (COL-1))

Zeit: Temperatur: Arbeitsschritt:

1 h RT Entakrylieren in MEA

RT absteigende Alkoholreihe in Aqua Dest

20’ RT EDTA 10 %, pH 7,4

10’ RT Fließendes Leitungswasser

2x2’ RT Aqua Dest

3x2’ RT TBS

15’ 37 °C Trypsin pH 7,8

10’ RT Fließendes Leitungswasser

3x2’ RT Aqua Dest

3x2’ RT TBS

15’ RT 3 % H2O2 in TBS (Peroxidase Blocken)

3x2’ RT TBS

30’ RT normales Kaninchenserum 1:5 (Dako X 0902)

verdünnt mit Antibodydiluent (Dako 2022)

8-12h 4°C Primärantikörper Kollagen I (1:4000)

3x2’ RT TBS

30’ RT Sekundärantik. (biotinyliert Kaninchen: Maus 1:400)

3x2’ RT TBS

30’ RT StreptAB/HRP

3x2’ RT TBS

5’-20’ RT AEC (Sichtkontrolle)

5’ RT Aqua Dest

10’’-30’’ RT Haemalaun (Dako) 1:4 mit Aqua Dest verdünnt

5’ RT Fließendes Leitungswasser

5’ RT Aqua Dest

RT mit Faramount eindecken

- 63 -

8.3 Färberezept Osteocalcin

Osteocalcin (Takara 0C4-30)

Zeit: Temperatur: Arbeitsschritt:

1 h RT Entakrylieren in MEA

RT absteigende Alkoholreihe in Aqua Dest

20’ RT EDTA 10 %, pH 7,4

10’ RT Fließendes Leitungswasser

2x2’ RT Aqua Dest

3x2’ RT TBS

15’ RT 3 % H2O2 in TBS (Peroxidase blocken)

3x2’ RT TBS

20’ RT Proteinblock Dako

1h RT Primärantikörper Osteocalcin (1:1500)

3x2’ RT TBS

30’ RT Sekundärantik. (biotinyliert Ziege: Kaninchen

1:500)

3x2’ RT TBS

30’ RT StreptAB/HRP

3x2’ RT TBS

5’-20’ RT AEC (Sichtkontrolle)

5’ RT Aqua Dest

10’’-30’’ RT Haemalaun (Dako) 1:4 mit Aqua Dest verdünnt

5’ RT Fließendes Leitungswasser

5’ RT Aqua Dest

RT mit Faramount eindecken

- 64 -

8.4 Färberezept Osteopontin

Osteopontin (Chemicon AB 187)

Zeit: Temperatur: Arbeitsschritt:

1 h RT Entakrylieren in MEA

RT absteigende Alkoholreihe in Aqua Dest

20’ RT EDTA 10 %, pH 7,4

10’ RT Fließendes Leitungswasser

2x2’ RT Aqua Dest

3x2’ RT TBS

15’ RT 3 % H2O2 in TBS (Peroxidase blocken)

3x2’ RT TBS

20’ RT Proteinblock Dako

1h RT Primärantikörper Osteopontin

3x2’ RT TBS

30’ RT Sekundärantik. (biotinyliert Ziege: Kaninchen

1:500)

3x2’ RT TBS

30’ RT StreptAB/HRP

3x2’ RT TBS

5’-20’ RT AEC (Sichtkontrolle)

5’ RT Aqua Dest

10’’-30’’ RT Haemalaun (Dako) 1:4 mit Aqua Dest verdünnt

5’ RT Fließendes Leitungswasser

5’ RT Aqua Dest

RT mit Faramount eindecken

- 65 -

9. Danksagung

Mein besonderer Dank gilt meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. med. Dr. med.

dent. Karl Andreas Schlegel für die freundliche Überlassung des Themas, die

Planung des Versuchsvorhabens und für die regelmäßigen Doktorandenbe-

sprechungen. Diese sorgten für eine gewissenhafte Betreuung und Motivati-

on.

Bei Herrn Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Friedrich Wilhelm Neukam möchte ich

mich für die Möglichkeit bedanken, diese Arbeit an der Mund-, Kiefer-, Ge-

sichtschirurgischen Klinik der Friedrich – Alexander Universität Erlangen –

Nürnberg durchführen zu können.

Für die Hilfestellung bei praktischen Fragen zu Trenn-Dünnschlifftechnik und

Histologie bedanke ich mich herzlich bei Herrn Dr. med. dent. Safwran Srour.

Herzlichst bedanken möchte ich mich auch bei Herrn Dr. med. dent. Cornelius

von Wilmovsky und Herrn Dr. med. dent. Rainer Lutz. Sie unterstützten mich

als Betreuer jederzeit bei der Bewältigung von Problemen bei der Durchfüh-

rung der praktischen sowie der theoretischen Arbeit.

Außerdem gilt mein Dank auch den medizinisch-technischen Assistentinnen

des Genlabors, Frau Heidemarie Heider und Frau Susanne Schönherr.

Bei Frau Dr. Heike Brandt vom Lehrstuhl für Werkstoffwissenschaften 3 der

FAU-Erlangen möchte ich mich für die Anfertigung der rasterelektronischen

Aufnahmen bedanken.

Ganz besonders danke ich meinen Eltern, sie haben mir mein Studium und

damit diese Arbeit ermöglicht. Ihnen und meinen Großeltern danke ich auch

herzlich für ihre Anteilnahme und stetige Motivation.