Aus dem Institut für Versuchstierkunde der Medizinischen ......Aus dem Institut für...
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Aus dem Institut für Versuchstierkunde der Medizinischen Hochschule Hannover
Genetische Charakterisierung der LEW/Ztm-ci2 (circling2)
und der BH.7A/Ztm-ci3 (circling3) Ratte als Modelle
für Taubblindheit des Menschen (USH1)
bzw. Lateralisierung von Hirnfunktionen und Hyperlokomotion
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Wojciech Chwalisz
aus Kattowitz
Hannover 2003
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. H. J. Hedrich
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H. J. Hedrich
2. Gutacher: Univ.-Prof. Dr. O. Distl
Tag der mündlichen Prüfung: 24.11.2003
Gefördert durch ein Promotionsstipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft
(Graduiertenkolleg GK705)
Teile der vorliegenden Dissertation wurden bereits in folgender Originalarbeit
veröffentlicht:
Chwalisz, W. T., Koelsch, B. U., Kindler-Röhrborn, A., Hedrich, H. J. und Wedekind,
D. (2003):
The circling behavior of the deafblind LEW-ci2 rat is linked to a segment of RNO10
containing Myo15 and Kcnj12.
Mamm Genome 14, 620-627
Meiner Familie
Inhaltsverzeichnis
Seite
1. Einleitung 15
2. Literaturübersicht 18
2.1 Die LEW/Ztm-ci2 Rattenmutante 18
2.2 Die BH.7A/Ztm-ci3 Rattenmutante 22
2.2.1 Komplementationstest (cis-trans-Test) 24
2.3 Weitere Mutanten mit Rotationsverhalten und/oder 25
Innenohrdegeneration
2.3.1 Rattenmutanten 25
2.3.1.1 Die spinner-Rattenmutanten (spn) 25
2.3.1.2 Die jerker-Rattenmutante (je); 25
Synonym: stargazer-Rattenmutante (stg)
2.3.1.3 Die waltzing-Rattenmutante (2001) 26
2.3.2 Mausmutanten 27
2.3.2.1 Die shaker1-Mausmutanten (Myo7ash1) 27
2.3.2.2 Die shaker2-Mausmutanten (Myo15sh2) 28
2.3.2.3 Die Snell´s waltzer-Mausmutante (Myo6sv) 28
2.4 Potentielle Kandidatengene für den ci2- und ci3-Phänotypen 29
und damit verbundene Erkrankungen
2.4.1 Unkonventionelle Myosine: Funktionen und Mutationen 29
2.4.1.1 Das „Usher Syndrom“ 33
2.4.2 Kaliumeinzelkanäle und ihre Bedeutung für die Funktion des 34
Innenohres und der Netzhaut
2.4.3 Rezeptoren des dopaminergen Systems 36
2.5 Literatur zur Methodik 37
2.5.1 Mikrosatelliten 37
2.5.1.1 Kopplungskarten und Kopplungsanalyse 38
2.5.2 Neurophysilogische Verhaltensuntersuchung 39
3. Material und Methoden 40
3.1 Versuchstiere und Organentnahme 40
3.1.1 Versuchstiere 40
3.1.2 Organentnahme 42
3.2 Neurophysiologische Verhaltensuntersuchungen 42
3.2.1 Untersuchung des Rotationsverhaltens 43
3.2.2 Untersuchung des auditiven und vestibulären Systems der 44
(LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2 Ratten
3.2.2.1 Akustischer Stimulus 44
3.2.2.2 „Air-Righting”-Test 44
3.2.2.3 „Balance“-Test 45
3.2.2.4 Schwimmtest 45
3.2.3 Überprüfung der Sehfähigkeit der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x 46
LEW/Ztm-ci2 Ratten
3.2.3.1 Verhalten der Tiere an einer sichtbaren Kante 46
(modifizierter „Visual-Cliff“-Test)
3.2.3.2 Hell-Dunkel-Transfer-Test 47
3.3 Molekularbiologische Untersuchungen 48
3.3.1 Isolierung von Desoxyribonukleinsäure (DNA) 48
3.3.2 Einstellen der DNA-Konzentration 49
3.3.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 50
3.3.4 Agarosegel-Elektrophorese 51
3.4 Mikrosatellitenmarker-gestützte Kopplungsanalyse 52
3.4.1 Auswahl geeigneter anonymer Mikrosatellitenmarker 53
3.4.2 Untersuchung der Mikrosatellitenmarker auf Polymorphismen 54
3.5 Computer- und Datenbank-gestützte genetische Analysen 55
3.5.1 Identifikation geeigneter funktioneller Kandidatengene 55
3.5.2 Identifikation geeigneter gengekoppelter Mikrosatelliten 56
3.5.3 Amplifikation der gengekoppelten Mikrosatelliten, Untersuchung 57
auf SSLPs und Genotypisierung der N2-Individuen
3.5.4 Virtueller Aufbau einer physikalischen Karte der nicht 58
rekombinanten Region (LEW-ci2)
3.5.5 Nachweis einzelner Exone eines Kanidatengens 59
im Genom der BH.7A/Ztm-ci3 Ratte
3.6 Statistische Auswertung 61
3.6.1 Statistische Auswertung der genetischen Befunde 61
3.6.2 Statistische Auswertung der Verhaltensuntersuchungen 62
3.7 Lösungen und Reagenzien 63
3.7.1 DNA Aufarbeitung 63
3.7.2 PCR 63
3.7.3 Elektrophorese 64
3.8 Geräte und Verbrauchsmaterialien 65
3.8.1 Geräte 65
3.8.2 Verbrauchsmaterialen 66
3.9 Statistik- und Genetik-Programme 66
3.10 World-Wide-Web Adressen 67
4. Ergebnisse 68
4.1 Neurophysiologische Verhaltensuntersuchungen 68
4.1.1 Untersuchung des Rotationsverhaltens 68
4.1.2 Untersuchung des auditiven und vestibulären Systems 69
der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2 Ratten
4.1.2.1 Akustischer Stimulus 69
4.1.2.2 „Air-Righting”-Test 69
4.1.2.3 „Balance“-Test 69
4.1.2.4 Schwimmtest 70
4.1.3 Überprüfung der Sehfähigkeit der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1x 71
LEW/Ztm-ci2 Ratten
4.1.3.1 Verhalten der Tiere an einer sichtbaren Kante 71
(modifizierter „Visual-Cliff“-Test)
4.1.3.2 Hell-Dunkel-Transfer-Test 76
4.2 Mikrosatellitenmarker-gestützte Kopplungsanalyse 79
4.2.1 Anonyme Mikrosatellitenmarker und Assoziation 79
mit den Phänotypen
4.3 Computer- und Datenbank-gestützte genetische Analysen 82
4.3.1 Identifikation geeigneter funktioneller Kandidatengene 82
4.3.2 Identifikation geeigneter gengekoppelter Mikrosatelliten 83
4.3.3 Amplifikation der genassozierten Mikrosatelliten, Untersuchung 85
auf SSLPs und Genotypisierung der N2-Ratten
4.3.4 Virtueller Aufbau einer physikalischen Karte der nicht 91
rekombinanten Region (LEW-ci2)
4.3.5 Nachweis einzelner Exone eines Kanidatengens 93
im Genom der BH.7A/Ztm-ci3 Ratte
5. Diskussion 97
5.1 Untersuchungen zum Phänotypen und zur Genetik 97
der LEW/Ztm-ci2 Rattenmutante
5.1.1 Neurophysiologische Verhaltensuntersuchungen 97
5.1.1.1 Untersuchungen des Rotationsverhaltens sowie des auditiven 98
und vestibulären Systems
5.1.1.2 Überprüfung der Sehfähigkeit der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x 99
LEW/Ztm-ci2 Ratten
5.1.1.2.1 Verhalten der Tiere an einer sichtbaren Kante 100
(modifizierter „Visual-Cliff“-Test)
5.1.1.2.2 Hell-Dunkel-Transfer-Test 101
5.1.1.2.3 Abschliessende Betrachtung der Tests zur Überprüfung der 102
Sehfähigkeit der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x
LEW/Ztm-ci2 Ratten
5.1.2 Genetische Analysen zur LEW/Ztm-ci2 Rattenmutante 104
5.1.2.1 Mikrosatellitenmarker-gestützte Kopplungsanalyse 104
5.1.2.1.1 Anonyme Mikrosatellitenmarker und ihre Assoziation mit dem 104
ci2-Phänotypen
5.1.2.2 Computer- und Datenbank-gestützte genetische Analysen 106
5.1.2.2.1 Gengekoppelte Marker und ihre Assoziation mit 106
dem ci2-Phänotypen
5.1.2.2.2 Physikalische Karte der nicht rekombinanten Region 108
auf RNO10 (LEW-ci2)
5.2 Untersuchungen zum Phänotypen und zur Genetik 111
der BH.7A/Ztm-ci3 Ratte
5.2.1 Neurophysiologische Verhaltensuntersuchungen 111
5.2.1.1 Untersuchungen des Rotationsverhaltens 111
5.2.2 Genetische Analysen zur BH.7A/Ztm-ci3 Rattenmutante 112
5.2.2.1 Vorläufige Mikrosatellitenmarker-gestützte Kopplungsanalyse 112
5.2.2.1.1 Anonyme Marker und ihre Assoziation mit dem ci3-Phänotypen 112
5.2.2.2 Computer- und Datenbank-gestützte genetische Analysen 113
5.2.2.2.1 Gengekoppelte Marker und ihre Assoziation mit 113
dem ci3-Phänotypen
5.2.2.2.2 Nachweis einzelner Exone des Kandidatengens Drd3 115
im Genom der BH.7A/Ztm-ci3 Ratte
5.3 Vergleich der LEW/Ztm-ci2 bzw. BH.7A/Ztm-ci3 Ratte mit 116
genetisch bedingten Erkrankungen des Menschen und
die Bedeutung beider Rattenmutanten als mögliche Tiermodelle
5.4 Abschließende vergleichende Betrachtung der LEW/Ztm-ci2 122
und BH.7A/Ztm-ci3 Ratte
5.5 Ausblick 123
6. Zusammenfassung – Summary 127
7. Literaturverzeichnis 133
8. Anhang 161
Abkürzungsverzeichnis
A Adenin
Abb. Abbildung
ALMS „Alstrom Syndrom”
ATP Adenosintriphosphat
Aqua dest. aqua destillata
BAC bacterial artificial chromosome
BBS „Bardet-Biedl Syndrom”
BH Black-hooded (Rattenstamm)
BLAST basic local alignment search tool
BN Brown Norway (Rattenstamm)
bp Basenpaare
bzw. beziehungsweise
C Cytosin
ca. circa
cd/m2 Candela pro Quadratmeter
cds/m2 Candelasekunden pro Quadratmeter
CH230 CHORI-230 (Rattenklone)
ci circling (Rattenmutanten)
cm Centimeter
cM centi-Morgan
CO2 Kohlendioxid
D Dopamin
DFG Deutsche Forschungsgemeinschaft
DNA deoxyribonucleic acid
dNTP 2`-Deoxynukleosidtriphosphat
DRD Dopamin-Rezeptor
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EEG Elektroencephalogramm
EP endocochleäres Potential
ERG Elektroretinogramm
et al. et alii (und andere)
f forward
FERM Four-point-one (4.1), Ezrin, Radixin, Moesin
G Guanin
HSA Bezeichnung für Chromosomen von Homo sapiens
je jerker (Maus- bzw. Rattenmutante)
K+ Kaliumionen
kb Kilobasenpaare
Kir Inwardly rectifying K+-channel
LEW Lewis (Rattenstamm)
LOD logarithm of the odds
mA Milliampere
Mb Megabasenpaare
min Minuten
mg Milligramm
ml Milliliter
mm Millimeter
mM millimolar
MMU Bezeichnung für Chromosomen von Mus musculus
MRT Magnetresonanztomograpie
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µM mikromolar
N2 1. Rückkreuzungsgeneration
ng Nanogramm
nm Nanometer
p p(petit)-Arm eines Chromosoms = kurzer Arm eines
Chromosoms
PAC P1-bacteriophage artificial chromosome
PAR Paris (Rattenstamm)
PCR polymerase chain reaction
PET Positronemissionstomographie
q q-Arm eines Chromosoms = langer Arm eines
Chromosoms.
r reverse
RNO Bezeichnung für Chromosomen von Rattus
norvegicus
RPE Pigmentepithel der Netzhaut
s Sekunden
sh shaker (Mausmutante)
spn spinner (Rattenmutante)
SRS subretinaler Raum
SSLP simple sequence length polymorphism
SSR simple sequence repeats
stg stargazer (Rattenmutante); Synonym: je (jerker)
STR simple tandem repeats
sv Snell´s waltzer (Mausmutante)
T Thymin
U unit (internationale Einheit)
u. A. unter Anderem
USH „Usher Syndrom“
UV ultraviolett
vs. versus
w waltzing (Rattenmutante)
z.B. zum Beispiel
Ztm Haltersymbol des Zentralen Tierlaboratoriums der
Medizinischen Hochschule Hannover
15
1. Einleitung
Bei den LEW/Ztm-ci2 (circling2) und BH.7A/Ztm-ci3 (circling3) Ratten handelt es
sich um zwei Spontanmutanten, deren gemeinsames phänotypisches
Chrakteristikum ihr spontanes und lateralisiertes Rotationsverhalten ist.
Als Rotationsverhalten (synonym: Drehverhalten; „circling“) bezeichnet man eine
aktive, stereotype Bewegung um die eigene Körperachse (PYCOCK, 1980), wobei
diese Drehungen sowohl als enge Rotationen, als auch in Form von Rotationen auf
weiten Kreisen gezeigt werden können (KOSHIKAWA, 1994).
Die Phänotypen beider Rattenmutanten wurden bereits in mehreren Untersuchungen
gut charakterisiert (LÖSCHER et al., 1996; RICHTER et al., 1999; FEDROWITZ,
1999; FEDROWITZ et al., 2000; KAISER et al., 2001; LESSENICH et al., 2001;
LINDEMANN et al., 2001; LESSENICH, 2002). Festgestellt wurde, dass beide
Mutationen neben dem Drehverhalten auch Hyperaktivität verursachen. Zusätzlich
zeichnet sich die LEW/Ztm-ci2 Ratte durch Ataxie und einen Opisthotonus aus.
Untersuchungen zu den Basalganglien zeigten, dass sowohl bei der LEW/Ztm-ci2 als
auch bei der BH.7A/Ztm-ci3 Ratte eine neurochemische Lateralität im dopaminergen
System vorliegt, wobei die ci3-Mutation auch eine morphologische Lateralität
hinsichtlich dopaminerger Neurone verursacht. Darüber hinaus wurde nur bei der
LEW/Ztm-ci2 Mutante auch eine Innenohrdegeneration vom neurosensorischen Typ
festgestellt, die sowohl das cochleäre, als auch das vestibuläre System betrifft. Folge
dieser Degeneration ist eine profunde Taubheit und vestibuläre Fehlfunktion
betroffener Tiere. Rotationsverhalten als Folge solcher Veränderungen ist sowohl für
die Ratte als auch für die Maus beschrieben. Als Beispiele seien an dieser Stelle die
jerker-Rattenmutante (TRUETT et al., 1994) sowie die unter dem Sammelbegriff
shaker zusammengefassten Mausmutanten (DOBROVOLSKAIA-ZAVASDKAIA,
1928; LORD und GATES, 1929; ANDERSON et al., 2000) genannt.
Entsprechend den bisher festgestellten Befunden gilt die LEW/Ztm-ci2 Ratte
insbesondere als mögliches Modell für neurosensorische Taubheitsformen des
Menschen (KAISER et al., 2001), während die BH.7A/Ztm-ci3 Ratte bei der
16
Untersuchung von funktioneller Lateralität bestimmter Hirnfunktionen und der
Untersuchung hyperkinetischer Bewegungsstörungen hilfreich sein könnte
(LESSENICH et al., 2001).
Die Genetik beider Rattenmutanten wurde bisher mit Hilfe von klassischen
Kreuzungsanalysen untersucht. Festgestellt wurde, dass beide Mutationen
autosomal rezessiv vererbt werden (LÖSCHER et al., 1996; LESSENICH et al.,
2001).
Die bei der Verpaarung einer LEW/Ztm-ci2 mit einer BH.7A/Ztm-ci3 Ratte
(Komplementationstest) hervorgegangene Nachkommenschaft wies keinerlei
phänotypische Auffälligkeiten auf, woraus geschlossen wurde, dass die
verantwortlichen Mutationen unterschiedliche Gene betreffen müssen (LESSENICH
et al., 2001).
Hauptziel dieser Arbeit sollte eine genauere genetische Charakterisierung beider
Mutanten sein, um so weitere Aspekte der Tiere aufzudecken, die möglicherweise
auf Parallelitäten zu genetisch bedingten Erkrankungen des Menschen hinweisen.
Mit Hilfe einer genomweiten Kopplungsanalyse unter Einsatz anonymer
Mikrosatellitenmarker sollten die chromosomalen Lokalisationen beider Mutationen
identifiziert und anschließend die Suszeptibilitätsregionen feinkartiert werden. Als
Grundlage hierfür sollten zwei Rückkreuzungspopulationen (N2) dienen, die bereits
vor Beginn dieser Arbeit am Zentralen Tierlaboratorium der Medizinischen
Hochschule Hannover gezüchtet und phänotypisiert worden sind. Diese beiden
Populationen sollten zudem durch die Zucht neuer N2-Individuen erweitert werden.
Neugezüchtete N2-Individuen sollten mittels neurophysiologischer
Verhaltensuntersuchungen eindeutig phänotypisiert werden, um sie auf diese Weise
- als Vorraussetzung für die Kopplungsanalyse - in homozygote und heterozygote
Merkmalsträger einteilen zu können. Des Weiteren sollten neurophysiologische
Verhaltensuntersuchung auch eingesetzt werden, falls die Ergebnisse der
17
genetischen Untersuchungen Hinweise auf Veränderungen in weiteren
Organsystemen der beiden Mutanten liefern sollten, die bisher noch nicht untersucht
wurden.
Neben der Bestimmung der Lokalisation beider Mutationen sollten auch mögliche
funktionelle Kandidatengene für beide Phänotypen vorgestellt werden. Hierzu sollten
Vergleiche der zu ermittelnden Suszeptibilitätsregionen mit dem Genom des
Menschen und der Maus vorgenommen werden („comparative mapping“).
Gene, die aufgrund ihrer Funktion oder bereits beschriebener Mutationen als
Kandidaten in Frage kamen, sollten auf ihre Assoziation mit dem ci2- bzw. ci3-
Phänotypen geprüft werden. Hierzu sollten unter anderem Mikrosatelliten identifiziert
werden, die an solche Gene gekoppelt sind.
18
2. Literaturübersicht
2.1 Die LEW/Ztm-ci2 Rattenmutante
Die ci2-Mutation trat 1991 spontan in der 96. Filialgeneration des LEW/Han-
Inzuchtstamms des Zentralinstituts für Versuchstierzucht der DFG in Hannover auf.
Als auffälligstes Charakteristikum betroffener Tiere wurde eine Bewegungsstörung in
Form eines Rotationsverhaltens festgestellt. Entsprechend wurde diese Mutation mit
dem Symbol „ci“ für „circling“ (Rotationsverhalten) belegt. Der Zusatz „2“ war nötig,
weil bereits 1986 in demselben Inzuchtstamm eine drehende Rattenmutante
aufgetreten war (DEERBERG et al., 1989), die als „ci1“ benannt, aber nicht näher
charakterisiert wurde. Ein Vergleich zwischen beiden Mutanten war nicht mehr
möglich, da es nicht gelang kryokonservierte Embryonen, die homozygote Träger der
ci1-Mutation waren, zu revitalisieren.
Es konnte ein als LEW-ci2 bezeichneter coisogener Stamm etabliert werden, der seit
1993 am Zentralen Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannover (Ztm)
weitergezüchtet wird, indem homozygote mit heterozygoten Merkmalsträgern
verpaart werden (segregierende Inzucht).
Die Vererbung der Mutation erfolgt autosomal rezessiv. Neben dem Drehverhalten
sind bereits im Absatzalter weitere motorische Anomalien, wie ein Opisthotonus (ab
dem 18. bis 20. Lebenstag), also ein Überstrecken des Kopfes nach caudo-dorsal,
welches auch als „stargazing“ bezeichnet wird, Ataxie und Hyperaktivität zu
beobachten. Das intensive spontane Drehverhalten, das in Form von engen „nose-
to-tail“ Rotationen salvenartig ausgeführt wird, ist ab der 3. bis 4. Lebenswoche zu
beobachten und wird durch Stressfaktoren, wie das Verbringen der Tiere in eine
neue Umgebung (z.B. Fremdkäfig), noch verstärkt (LÖSCHER et al., 1996).
Heterozygote Merkmalsträger zeigen kein Rotationsverhalten oder sonstige
Verhaltensauffälligkeiten. Aufgrund des Rotationsverhaltens und der insgesamt
gesteigerten Bewegungsaktivität zeichnen sich betroffene Ratten durch geringere
Gewichtszunahmen im Vergleich zu heterozygoten Geschwistertieren aus, wobei
ihre Vitalität jedoch nicht beeinträchtigt ist (LÖSCHER et al., 1996;
19
FEDROWITZ, 1999).
Untersuchungen zum Drehverhalten haben gezeigt, dass ein Großteil der
betroffenen Ratten eine eindeutige Richtungspräferenz aufweist und es sich somit
um ein lateralisiertes Rotationsverhalten handelt. Ebenso wurde die Motorik der
Vorderextremitäten überprüft, wobei sich eine ausgeprägte einseitige Defizienz der
Vorderextremität contralateral zur spontanen Drehpräferenz feststellen ließ
(LÖSCHER et al., 1996).
Weiterhin weist die LEW-ci2 Ratte Ähnlichkeiten im Phänotyp zum induzierten
Ungerstedt-Modell auf. Dieses wird häufig als geeignetes Tiermodell für den Morbus
Parkinson, der häufigsten Basalganglienerkrankung des Menschen, angesehen. Die
Basalganglien stellen eine Gruppe komplex untereinander verschalteter
Gehirnregionen dar, denen eine wichtige Bedeutung bei der Kontrolle der Motorik
zukommt (GRAYBIEL, 1990). Im Ungerstedt-Modell zeigten nach unilateraler
Injektion des Neurotoxins 6-Hydroxydopamin, welches eine selektive Zerstörung
dopaminerger und noradrenerger Neurone bewirkt (UNGERSTEDT, 1968), in
Strukturen der Basalganglien (Substantia nigra, pars compacta) entsprechend
behandelte Ratten spontane Rotationen zur Seite mit der geringeren dopaminergen
Aktivität (HASHITANI et al., 1998). Die Gabe von Amphetamin (Freisetzung von
Dopamin aus den präsynaptischen Nervenendigungen; GLICK und COX, 1976)
verstärkte das Rotationsverhalten (CLAUSING et al., 1996), während eine Injektion
von Apomorphin (Dopamin-Rezeptor Agonist) eine Umkehrung der Drehpräferenz
bewirkte (HUDSON et al., 1993).
Entsprechend wurden in pharmakologischen Testreihen den LEW-ci2 Ratten
Amphetamin und Apomorphin in verschiedenen Dosen appliziert. Nachdem eine
Injektion von Amphetamin eine signifikante Erhöhung der Rotationsrate bei den
Tieren bewirkte, wurde dieses Ergebnis auf eine Imbalanz des dopaminergen
Systems zurückgeführt (LÖSCHER et al., 1996), da durch die Wirkung des
Amphetamins eine bestehende Ungleichheit im Dopamingehalt verstärkt würde.
Apomorphin wurde sowohl in einer Dosierung, welche nur die präsynaptischen
Dopamin D2-Rezeptoren erregt, als auch in einer höheren Dosis, die auf prä- und auf
postsynaptische Rezeptoren stimulierend wirkt, injiziert. In beiden Fällen kam es zu
20
einer Abnahme spontaner Rotationen bei den LEW-ci2 Ratten. Diese Ergebnisse
wurde dahingehend interpretiert, dass bei reiner Erregung der präsynaptischen
Dopamin D2-Rezeptoren, welche einen Überschuss an freiem Dopamin im
synaptischen Spalt signalisiert, die Freisetzung dieses Transmitters reduziert wurde
und somit auch die Rotationszahl abnahm. Aus der Tatsache, dass die Erregung der
postsynaptischen Dopamin-Rezeptoren die Rotationsrate ebenfalls verminderte,
wurde gefolgert, dass keine einseitige Hypersensitivität von Dopamin-Rezeptoren
vorliegt (LÖSCHER et al., 1996).
Neurochemische Untersuchungen, bei denen Homogenate von Bereichen der
Basalganglien (u. A. Striatum) hergestellt und der Dopamingehalt bestimmt wurde,
zeigten, dass LEW-ci2 Ratten mit ausgeprägter Seitenpräferenz im
Rotationsverhalten im Striatum der Hemisphärenseite, zu der ihre Rotationspräferenz
ausgebildet war, eine signifikant geringere Konzentrationen an Dopamin und seinen
Metaboliten aufwiesen (LÖSCHER et al., 1996).
Trotz dieser pharmakologischen und neurochemischen Gemeinsamkeiten mit dem
Ungerstedt-Modell, konnte die Annahme, dass die LEW-ci2 Ratte das erste
genetische Tiermodell für Morbus Parkinson darstellt, nicht bestätigt werden.
Immunhistochemische Studien zeigten, dass im Gegensatz zu der Parkinsonschen
Erkrankung die Anzahl dopaminerger Neurone und die Dichte der dopaminergen
Terminalen im Bereich der Basalganglien keine bilaterale Asymmetrie aufwiesen.
Auch der Vergleich zu LEW/Ztm Kontrollratten erbrachte keine signifikanten
Unterschiede (RICHTER et al., 1999). Des Weiteren wiesen die Rattenmutanten eine
Hyperlokomotion und stereotype Kopfbewegungen auf, so dass daraus die
Schlussfolgerung getroffen wurde, dass sie als Modell für hyperkinetische
Bewegungsstörungen geeignet sein könnten (RICHTER et al., 1999; FEDROWITZ et
al., 2000), während der Morbus Parkinson, eine hypokinetische Bewegungsstörung
darstellt.
Es ist bekannt, dass neben Innnenohrinfektionen auch hereditäre Erkrankungen des
Innnenohres häufig Rotationsverhalten bei Ratten und Mäusen durch
Beeinträchtigung des vestibulären Apparats auslösen können (Kapitel 2.3). Nachdem
eine Infektion des Innenohres bei betroffenen LEW-ci2 Ratten ausgeschlossen
21
werden konnte, wurden das vestibuläre und auch das cochleäre System der Tiere
funktionell und histologisch auf pathologische Abweichungen untersucht.
Die Ableitung auditorisch evozierter Potentiale zeigte einen signifikanten Unterschied
zu Kontrolltieren, der für eine vollständige Taubheit der Mutante spricht. Bei
histologischen Untersuchungen der Cochlea konnte ein nahezu vollständiger Verlust
des sensorischen Epithels (Haarzellen) festgestellt werden. Ebenso wurden
Degenerationen der Zellen der cochleären Kerngebiete im Hirnstamm nachgewiesen
(KAISER et al., 2001).
Die Funktionsfähigkeit des vestibulären Systems wurde anhand eines Schwimmtests
(PORSOLT et al. , 1978) sowie weiterer neurophysiologischer
Verhaltensuntersuchungen („Air-Righting“-Test: OSSENKOPP et al., 1990;
RABBATH et al., 2001; „Tail-Hanging“-Test: HUNT et al., 1987; RABBATH et al.,
2001) analysiert. Auch hier wurden Fehlfunktionen bei der LEW-ci2 Ratte festgestellt,
die sich in der Unfähigkeit zu schwimmen (korkenzieherförmiges Abtauchen) sowie
Defiziten beim „Air-Righting“- und „Tail-Hanging“-Test ausdrückten (KAISER et al.,
2001; LESSENICH, 2002). Diese Befunde deckten sich mit den Ergebnissen der
histologischen Untersuchungen des vestibulären Apparates und seiner Kerngebiete.
Es zeigte sich zwar bei adulten LEW-ci2 Ratten kein Verlust der vestibulären
Haarzellen, jedoch wiesen diese kleine Protrusionen des Cytoplasmas in den
endolymphatischen Raum auf, aus denen auf Veränderungen des Cytoskelettes der
Haarzellen geschlossen wurde. Da bei jungen LEW-ci2 Ratten (ca. vier Wochen alt)
jedoch auch ein Verlust vestibulärer Haarzellen zu beobachten war, wurde eine
Regeneration der vestibulären Haarzellen während der späteren Entwicklung
angenommen. Die vestibulären Kerngebiete wiesen ebenfalls signifikante
Abweichungen hinsichtlich Volumen und Neuronendichte auf (KAISER et al., 2001).
Die LEW-ci2 Ratten wurde darüber hinaus auf die Möglichkeit untersucht, ob ihr
Rotationsverhalten im Zusammenhang mit epileptischen Anfällen stehen könnte, da
beim Menschen eine Form der Epilepsie beschrieben ist, die mit Rotationen um die
eigene Körperlängsachse einher geht (GASTAUT et al., 1986). Im Vergleich zu
nachweislich epileptischen WAG/Rij Ratten („petit Mal“-Anfälle) konnten bei den
LEW-ci2 Ratten keine epileptiformen Anomalien während der durchgeführten
22
Elektroencephalogramm (EEG)-Untersuchungen festgestellt werden (LINDEMANN
et al., 2001).
Aufgrund der bisher festgestellten Befunde gilt folglich die LEW/Ztm-ci2 Ratte somit
als potentielles Modell für neurosensorische Taubheitsformen des Menschen
(KAISER et al., 2001).
2.2 Die BH.7A/Ztm-ci3 Rattenmutante
Die ci3-Mutation trat im Jahre 1997 spontan am Zentralen Tierlaboratorium der
Medizinischen Hochschule Hannover (Ztm) in dem Inzuchtstamm BH.7A(LEW)/Won
auf. Der BH.7A-Stamm ist ein zum BH-Stamm congener Rattenstamm, der das a-
Allel des Gens Ptprc (Protein Tyrosin Phosphatase Rezeptor Typ c; Synonym: Cd45,
Lca, RT7) exprimiert. Das von dem LEW/Ztm-Inzuchtstamm stammende Allel wurde
durch Verdrängungskreuzung innerhalb von 12 Rückkreuzungsgenerationen auf
BH/Ztm-Ratten übertragen (HEDRICH, 1990). Die Mutation, die autosomal rezessiv
vererbt wird (LESSENICH et al., 2001) wurde mit dem Symbol „ci3“ belegt, da sich
auch hier betroffene Tiere durch Rotationsverhalten auszeichnen.
Es konnte ein als BH.7A-ci3 bezeichneter coisogener Stamm etabliert werden, der
am Zentralen Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannover
weitergezüchtet wird, indem homozygote Merkmalsträger miteinander verpaart
werden.
Neben dem Rotationsverhalten konnte eine deutliche Hyperaktivität der Tiere
festgestellt werden (LESSENICH et al., 2001). Zu erkennen sind diese Auffälligkeiten
bei betroffenen Tieren bereits im Absatzalter.
Untersucht wurde bei diesem Stamm durch LESSENICH et al. (2001) insbesondere
das Rotationsverhalten, die Basalganglien sowie die Funktionsfähigkeit des
Innenohres und die histologische Struktur der dazugehörigen Kerngebiete im
Hirnstamm.
Festgestellt wurde, dass das Rotationsverhalten, welches wie bei der LEW-ci2 Ratte
in Form von engen „nose-to-tail“ Rotationen salvenartig ausgeführt wird, sowohl
23
spontan, als auch unter Stress (Fremdkäfig; „Open Field“-Apparatur) auftritt. Ein
überwiegender Teil der untersuchten Tiere zeigte eine Richtungspräferenz
(lateralisiertes Rotationsverhalten).
Durch Applikation von Amphetamin konnte die Hyperaktivität jedoch nicht das
Rotationsverhalten verstärkt werden.
Die Basalganglien wurden neurochemischen Untersuchungen - bei denen
Homogenate von Bereichen der Basalganglien (u. A. Striatum) hergestellt und der
Dopamingehalt bestimmt wurde - und histologischen Studien unterzogen. Die
neurochemischen Untersuchungen zeigten, dass BH.7A-ci3 Ratten mit ausgeprägter
Seitenpräferenz im Rotationsverhalten im Striatum der Hemisphärenseite, zu der ihre
Rotationspräferenz ausgebildet war, eine signifikant höhere Konzentrationen an
Dopamin und seinen Metaboliten aufwiesen. Durch histologische Untersuchungen
der Basalganglien konnte nachgewiesen werden, dass in einem fokussierten Bereich
dieser Strukturen eine signifikante Lateralität in der Dichte dopaminerger Neurone
vorlag. Die Zelldichte war auf der Hemisphärenseite erhöht, zu der die BH.7A/Ztm-
ci3 Ratten ihre Rotationspräferenz zeigten (LESSENICH et al., 2001).
Bei histologischen Untersuchungen der cochleären und vestibulären Kerngebiete im
Hirnstamm konnten keine Veränderungen festgestellt werden. Die Ableitung
auditorisch evozierter Potentiale zeigte keinen Unterschied zu Kontrolltieren des
Hintergrundstamms, was für eine physiologische Funktionsfähigkeit des auditiven
Systems bei den BH.7A-ci3 Ratten spricht. Zur Überprüfung des vestibulären
Systems wurde zunächst ein Schwimmtest (PORSOLT et al., 1978) durchgeführt.
Hierbei zeigte sich, wie bei den Kontrolltieren des Hintergrundstamms die bei Ratten
natürlich ausgeprägte Fähigkeit zu schwimmen. Auch die durchgeführten „Air-
Righting“- (OSSENKOPP et al., 1990; RABBATH et al., 2001) und „Tail-Hanging“-
(HUNT et al., 1987; RABBATH et al., 2001) Tests wiesen nicht auf Fehlfunktionen
des vestibulären Systems hin.
LESSENICH et al. (2001) schlossen aus den Ergebnissen dieser Untersuchungen,
dass es sich bei der BH.7A-ci3 um die ihres Wissens nach erste beschriebene
Rattenmutante mit Rotationsverhalten, aber funktionsfähigem cochleärem und
vestibulärem System handelt und führten die festgestellten phänotypischen
24
Abweichungen auf die lateralisierten Abnormitäten im Bereich der Basalganglien
zurück.
2.2.1 Komplementationstest (cis-trans-Test)
Aufgrund der phänotypischen Gemeinsamkeiten der LEW-ci2 und der BH.7A-ci3
Ratte wurden homozygote Merkmalsträger beider Stämme miteinander verpaart.
Hierbei konnten bei keinem der Individuen der Nachkommenschaft phänotypische
Auffälligkeiten beobachtet werden (LESSENICH et al., 2001). Daraus wurde
geschlossen, dass die verantwortlichen Mutationen unterschiedliche Gene betreffen
müssen.
2.3 Weitere Mutanten mit Rotationsverhalten und/oder
Innenohrdegenerationen
Beschreibungen von Ratten- und Mausmutanten mit Rotatationsverhalten bzw.
Bewegungsstörungen reichen bis in die erste Hälfte des 20. Jahrhunderts zurück,
wobei in den meisten Fällen Veränderungen im Bereich des Innenohres beschrieben
werden. Entsprechend werden diese Mutanten als Tiermodelle für hereditäre
Erkrankungen des Innenohres des Menschen gehandelt. Nachfolgend ist eine
Auswahl an Mutanten mit Rotationsverhalten und/oder Innenohrdegenerationen
aufgeführt.
25
2.3.1 Rattenmutanten
2.3.1.1 Die spinner-Rattenmutanten (spn)
Bereits im Jahr 1973 wurden zwei Rattenmutanten mit Rotationsverhalten
beschrieben.
Die spinner-1 (spn-1)-Mutante trat im B/1N-Stamm spontan auf und weist einen
autosomal rezessiven Erbgang auf. Homozygote Tiere haben den Hang, in
Uhrzeigerrichtung zu drehen. Zudem wird ein leichter Hydrocephalus beobachtet
(HANSEN, 1973; HEDRICH, 1990).
Auch die spinner-2 (spn-2)-Mutante trat spontan auf, und zwar im N:SDN
Auszuchtstamm. Phänotypisch ist diese Mutante der spn-1-Mutante ähnlich. Ein
Komplementationstest wies allerdings auf zwei unabhängige Mutationen hin
(HANSEN, 1973; HEDRICH, 1990).
2.3.1.2 Die jerker-Rattenmutante (je);
Synonym: stargazer-Rattenmutante (stg)
Die 1994 von TRUETT et al. beschriebene und ursprünglich als stargazer (stg)
bezeichnete Mutation wurde in einer Kolonie von Zucker-Ratten (Crl:ZUC-Leprfa)
entdeckt und wird autosomal rezessiv vererbt. Betroffene Tiere zeichnen sich ab der
3. Lebenswoche unter anderem durch einen Opisthotonus („stargazing“),
Hyperaktivität, Rückwärtsbewegungen und Rotationsverhalten aus und weisen somit
einen der LEW-ci2 Ratte sehr ähnlichen Phänotypen auf. Mit Hilfe der Ableitung
auditorisch evozierter Potentiale und eines Schwimmtests wurde eine vestibuläre
Fehlfunktion und profunde Taubheit nachgewiesen. Histologische Untersuchungen
zeigten eine progressive Degeneration der Zellen des akustischen Ganglions und der
Haarzellen (TRUETT et al., 1994). Das Reaktionsmuster der Mutante sowie
gesunder Kontrollen auf Stimulation und Inhibition der Dopamin D2-/D3-Rezeptoren
mittels der Applikation von Quinpirol und Haloperidol wies auf eine verringerte
26
Sensitivität dieser Rezeptoren hin, so dass weiterhin auf eine Fehlfunktion des
zentralen dopaminergen Systems geschlossen wurde (BROCK und ASHBY, 1996).
Durch genetische Untersuchungen mittels Mikrosatellitenmarkern konnte die
Mutation im distalen Bereich von Chromosom 5 der Ratte (RNO5) kartiert werden.
Dieser Bereich weist große Homologien zu einem Segment von Chromosom 4 der
Maus (MMU4) auf, auf dem das verantwortliche Gen für die jerker-Mausmutante (je)
(DEOL, 1954; STEEL und BOCK, 1983) lokalisert ist. Es wurde vermutet, dass eine
Mutation in dem homologen Gen der Ratte für den Phänotyp der stargazer-Mutante
verantwortlich ist und vorgeschlagen die Mutation von stargazer (stg) in jerker (je)
umzubenennen (TRUETT et al., 1996).
2.3.1.3 Die walzing-Rattenmutante (2001)
Im Jahre 2001 wurde von RABBATH et al. in einem nicht näher definierten
Rattenstamm der Universität Pavia eine neue waltzing-Mutante beschrieben. Diese
Mutante steht aller Wahrscheinlichkeit nach in keinem Zusammenhang mit der
ursprünglich von KING (1936) beschriebenen waltzing-Rattenmutante (w). Die neue
Mutante zeichnet sich durch Rotationsverhalten, sowie vestibuläre Fehlfunktionen in
der Haltung (Kopfhaltung nach abwärts) und Blick (Defizit des horizontalen vestibulo-
oculären Reflexes) aus. Da bei histologischen Untersuchungen das vestibuläre
Epithel (Haarzellen) keine Veränderungen aufwies, wurde in diesem Fall
angenommen, dass das Rotationsverhalten in Verbindung zu einer Fehlfunktion in
der Transduktion oder der Prozessierung von Signalen im vestibulären System
stehen könnte.
27
2.3.2 Mausmutanten
2.3.2.1 Die shaker1 – Mausmutanten (Myo7ash1)
Die shaker1-Mausmutanten zeichnen sich durch Hyperaktivität, stereotype
Kopfbewegungen und Rotationsverhalten vestibulären Ursprungs aus.
Histopathologisch zeigen sich typische cochleäre und vestibuläre Defekte vom
neuroepithelialen Typ (LORD und GATES, 1929; DEOL, 1956; KIKUCHI und
HILDING, 1965; STEEL und BOCK, 1983; RICHARDSON et al., 1997; SELF et al.,
1998; RICHARDSON et al., 1999). Die ursprüngliche sh1-Mutation entstand auf dem
genetischen Hintergrund des Mäuseinzuchtstamms BALB/c (LORD und GATES,
1929). Bei der Myo7ash1-6J-Mutation handelt es sich um eine spontane Remutation in
dem Stamm C57BLKS/J-m Leprdb (LETTS et al., 1994). In beiden Fällen geht man
von einer Punktmutation in Myo7a (MMU7) aus, die zu einer Veränderung in der
Motordomäne von Myosin VIIa führt (Kapitel 2.4.1).
Myo7as h 1 - 8 J (genetischer Hintergrund: B6;SJL-TgN(c177-lacZ)226Bri) und
Myo7ash1-9J (genetischer Hintergrund: C3.MRL-Tnfrsf6lpr) stellen zwei weitere
spontane Remutationen dar (Jackson Laboratories Mouse Genome Informatics
(MGI), www.informatics.jax.org).
Daneben existiert eine Reihe von chemisch induzierten shaker1-Mausmutanten
(Myo7a26SB, Myo7a3336SB, Myo7a4494SB, Myo7a4626SB, Myo7a816SB, Myo7ash1-1R)
basierend auf dem Stamm BALB/cR1 (Ausnahme: Myo7ash1-1R; nicht näher
charakterisierter genetischer Hintergrund) (RINCHIK et al., 1990; MGI,
www.informatics.jax.org). Betroffen sollen wiederum die Motordomäne (Myo7a4494SB,
Myo7a4626SB, Myo7a816SB) bzw. die Schwanzregion (Kapitel 2.4.1) sein (MGI,
www.informatics.jax.org).
Die Mutationen im Myo7a Gen führen vor allem zu Veränderungen des sensorischen
Neuroepithels des Innenohres (Desorganisation der Stereozilienbündel der
Haarzellen) (GIBSON et al., 1995; SELF et al., 1998).
Ebenso zeigten Untersuchungen zur Netzhaut der shaker1-Mäuse Abweichungen.
Bei Elektroretinographie-(ERG)-Messungen wurde eine verminderte
28
Photorezeptorantwort festgestellt (LIBBY und STEEL, 2001). GIBBS et al.
beschreiben (2003) eine Störung in der Phagozytose der von den Photorezeptoren
abgegebenen äußeren Segmente durch die Zellen des retinalen Pigmentepithels und
schlossen daraus auf eine verminderte Lebensfähigkeit der Photorezeptoren.
2.3.2.2 Die shaker2 – Mausmutanten (Myo15sh2)
Den shaker2-Mausmutanten sind ebenfalls profunde Taubheit und vestibuläre
Fehlfunktion, die zu Rotationsverhalten führt, eigen (PROBST et al., 1998; WANG et
al., 1998; ANDERSON et al., 2000).
Shaker2-(Myo15sh2) wurde bereits 1928 in der Nachkommenschaft einer mit
Röntgenstrahlung behandelten Maus entdeckt (DOBROVOLSKAIA-ZAVASDKAIA,
1928). Bei dieser Mausmutante konnte eine Punktmutation in Exon 18 des Myo15
Gens, welches auf MMU11 lokalisiert ist, nachgewiesen werden. Dieses Exon kodiert
für einen Bereich der Motordomäne des Proteins (Kapitel 2.4.1). Bei histologischen
Untersuchungen des Innenohres wurde vor allem eine starke Verkürzung der
Stereozilien der Haarzellen festgestellt (PROBST et al., 1998).
Auch Myo15sh2J resultiert aus einer Spontanmutation in Myo15. Sie entstand auf dem
genetischen Hintergrund des spontan diabetischen Stamms C57BLKS/J-m Leprdb
(MGI, www.informatics.jax.org). In diesem Fall wurde eine Deletion in den Exonen
nachgewiesen, die für die FERM (Four-point-one (4.1), Ezrin, Radixin, Moesin)-
Domäne (Kapitel 2.4.1) kodieren. Wiederum sind die Haarzellen des Innenohres
durch stark verkürzte Stereozilien gekennzeichnet (ANDERSON, et al., 2000).
2.3.2.3 Die Snell´s waltzer – Mausmutante (Myo6sv)
Die Snell´s waltzer-(Myo6sv)-Spontanmutation wurde erstmals von DEOL und
GREEN (1966) beschrieben. Die Mutation betrifft das Myo6 Gen, das auf MMU9
lokalisiert ist. Homozygote Individuen weisen Rotationsverhalten, stereotype
29
Kopfbewegungen und Hyperaktivität auf.
Nahezu das gesamte Neuroepithel des Innenohres ist bei dieser Mausmutante
betroffen. Ab dem dritten Lebenstag erscheinen die Haarzellen desorganisiert, wobei
es zu einer Fusionierung ihrer Stereozilien kommt. Funktionelle Untersuchungen
weisen auf eine Taubheit dieser Tiere ab dem 20. bis 30. Lebenstag hin (AVRAHAM
et al., 1997; SELF et al., 1999; MELCHIONDA et al., 2001).
2.4 Potentielle Kandidatengene für den ci2- und ci3-Phänotypen und
damit verbundene Erkrankungen
Im Verlauf der Untersuchungen der vorliegenden Arbeit zur Genetik der LEW-ci2 und
BH.7A-ci3 Rattenmutante verdichteten sich die Hinweise auf eine mögliche
Beteiligung der Gene Myo15 (Myosin XV) und Kcnj12 (Kir2.2) am ci2-Phänotypen
bzw. Drd3 (Dopamin D3-Rezeptor) am ci3-Phänotypen. Entsprechend soll
nachfolgend auf diese Gene bzw. Genfamilien sowie auf das „Usher Syndrom“, eine
Erkrankung des Menschen, welche unter Anderem durch eine Mutation in MYO7A
(Myosin VIIa) hervorgerufen wird, eingegangen werden.
2.4.1 Unkonventionelle Myosine: Funktionen und Mutationen
Zu den über 40 bislang identifizierten Genen, die in Zusammenhang mit
syndromartiger und nicht syndromartiger Taubheit beim Menschen stehen (CALL
und MORTON, 2002), gehört auch eine Reihe von Genen, die für unkonventionelle
Myosine kodieren.
Die Familie der unkonventionellen Myosine besteht aus über einem Dutzend
strukturell unterschiedlicher Klassen. Sie wurden in verschiedenen Geweben und
Zelltypen nachgewiesen, darunter Neurone und sensorische Zellen (HASSON und
MOOSEKER, 1997). Unkonventionellen Myosine sind funktionell an
Endozytosevorgängen, Zellmigration und sensorischer Transduktion beteiligt (WU et
30
al., 2000). Myosine stellen im Zusammenspiel mit Aktinfilamenten unter Verbrauch
von Adenosintriphosphat (ATP) molekulare Motoren dar, die verschiedene Prozesse
regulieren, wie die dynamische Neuanordnung des Aktinzytoskeletts, die Spannung
der Aktinfilamente und den Transport von Organellen (MERMALL et al., 1998).
Sämtliche Myosine besitzen eine identische Grundstruktur. Die Motordomäne bindet
ATP und Aktinfilamente. An sie schließt sich eine flexible Nackenregion an, gefolgt
von einer schwanzförmigen Struktur, die bei den einzelnen Klassen unterschiedlich
aufgebaut ist (MOOSEKER und CHENEY, 1995).
Im Bereich des Innenohres sind verschiedene unkonventionelle Myosine
nachgewiesen worden. Sie sind dort unter anderem Bestandteil der Stereozilien, die
aktinreiche Strukturen repräsentieren. Diese Strukturen werden von dem
sensorischen Epithel des Innenohres, den Haarzellen, benutzt, um akustische
Signale und Bewegungen im Raum zu erfassen (HASSON et al., 1997; FRIEDMAN
et al., 1999; REDOWICZ, 1999). Myosin VIIa wurde auch in aktinreichen Strukturen
der Netzhaut des Menschen und der Maus nachgewiesen (HASSON et al., 1995; LIU
et al., 1997).
Mutationen in vier Genen, die für die unkonventionellen Myosine VI, VIIa, IX und XV
kodieren, führen beim Menschen und/oder der Maus zu Taubheit und vestibulärer
Funktionsstörung. Zusätzlich verursacht eine Mutation in MYO7A des Menschen eine
progressive Degeneration der Netzhaut.
Bei der Snell’s waltzer-Maus liegt eine Mutation im Myo6 Gen vor, die zu einer
Fusion der Stereozilien führt (AVRAHAM et al., 1995). Die propagierte Funktion von
Myosin VI ist die Aufrechterhaltung der Spannung innerhalb der Aktinbündel der
Stereozilien, um so deren Integrität aufrecht zu erhalten (CRAMER, 2000), was die
Veränderungen bei dieser Mausmutante erklären würde. Des weiteren soll dieses
Protein die Zellmembran mit dem Aktinzytoskelett verbinden (SELF et al., 1999).
Beim Menschen ist eine Mutation in MYO6 verantwortlich für eine nicht
syndromartige, dominant vererbte Taubheitsform (DFNA22) (MELCHIONDA et al.,
2001). Das Gen ist auf Chromosom 6 des Menschen (HSA6q14.1) lokalisiert.
Myosin VIIa wird auf Grund seiner FERM-Domäne eine vermittelnde Rolle bei der
Interaktion von Membranen mit Zelloberflächenrezeptoren zugesprochen (CHISHTI
31
et al., 1998). Ebenso werden eine regulative Rolle des Proteins bei mechanisch
gesteuerten Ionenkanälen (RICHARDSON et al., 1999) und die Beteiligung an
intrazellulären Transportprozessen (LIBBY und STEEL, 2001) diskutiert. Bei den
shaker1-Mäusen resultieren Mutationen in Myo7a in einer Desorganisation der
Stereozilienbündel (GIBSON et al., 1995; HASSON et al., 1997; SELF et al., 1998).
Beim Menschen können Mutationen in dem homologen Gen (MYO7A; HSA11q13.5)
zu drei verschiedenen Formen genetisch bedingter Taubheit führen. Zum einen ist
eine nicht syndromartige, rezessiv vererbte Taubheitsform (DFNB2) und eine nicht
syndromartige, dominant vererbte Taubheitsform (DFNA11 ) beschrieben
(FRIEDMAN et al., 1999). Weiterhin wird eine Mutation in diesem Gen für das „Usher
Syndrom“ Typ 1B (Kapitel 2.4.1.1) verantwortlich gemacht (WEIL et al., 1995).
Hierbei zeigen betroffene Patienten neben einem Innenohrdefekt eine tapetoretinale
Degeneration. Tatsächlich wurde Myosin VIIa durch genetische Studien als essentiell
für die Sehfähigkeit des Menschen eingestuft (HASSON und MOOSEKER, 1997). Es
wird vermutet, dass es an Transportprozessen im Bereich des Pigmentepithels der
Netzhaut (RPE) beteiligt ist (LIBBY und STEEL, 2001). Die von den sich in ständiger
Erneuerung befindlichen Photorezeptoren abgegebenen äußeren Segmente werden
von den Zellen des RPE phagozytiert und somit abgebaut. Die Aufnahme und der
Transport der phagozytierten Substanzen ist ein Prozess, der durch aktinreiche
Strukturen der Zellen des RPE durchgeführt wird und deren Bestandteil Myosin VIIa
ist (HASSON, 1999). Ursprünglich wurde davon ausgegangen, dass die Expression
dieses Myosins bei Nagetieren auf dieses Pigmentepithel beschränkt ist (HASSON,
et al., 1995), während beim Menschen dagegen das Protein auch in den
Photorezeptoren selbst nachgewiesen werden konnte (EL-AMRAOUI et al., 1996).
Die shaker1-Mausmutanten weisen auch keine Degeneration der Netzhaut auf
(HASSON et al., 1997; LIU et al., 1998; TITUS, 1999). Daraus wurde geschlossen,
dass die Ausbildung der progressiven Retinopathie bei dem Typ 1B des „Usher
Syndroms“ auf Veränderungen in den Photorezeptoren (Stäbchen und Zapfen) und
nicht in den Zellen des Pigmentepithels zurückzuführen ist (HASSON und
MOOSEKER, 1997). Tatsächlich wurde aber Myosin VIIa in den Zilien der Stäbchen
und Zapfen, die den Zellkörper der Photorezeptoren mit ihren inneren und äußeren
32
Segmenten verbinden sowohl beim Menschen, als auch bei der Maus nachgewiesen
(LIU, et al., 1997). LIBBY und STEEL (2001) diskutieren die Möglichkeit, dass es bei
den shaker1-Mausmutanten nicht zur Ausbildung einer retinalen Degeneration
kommt, weil die Mäuse nicht das entsprechende Alter erreichen und/oder nicht der
Lichtmenge ausgesetzt sind wie ein durchschnittlicher „Usher Syndrom“ Typ 1B-
Patient.
Eine Mutation im MYH9 Gen (HSA22q12.3), welches für Myosin IX kodiert ist für eine
nicht syndromartige, dominant vererbte Taubheitsform (DFNA17) des Menschen
verantwortlich. Die Expression des homologen Gens (Myh9) wurde auch in der
Cochlea der Ratte nachgewiesen (LALWANI et al., 2000). Dieses Gen kartiert auf
RNO7.
Wie Myosin VIIa besitzt auch Myosin XV eine FERM-Domäne, die dazu dient mit den
zytoplasmatischen Domänen integraler Zellmembranproteine, wie CD44, CD43 und
ICAM-2 zu interagieren. Dadurch könnte das Protein als Verbindung zwischen der
Zellmembran und dem Aktinzytoskelett fungieren (YONEMURA et al., 1998).
Bezüglich der Ausstattung mit weiteren Domänen und deren struktureller Anordnung
weisen Myosin VIIa und XV ebenfalls große Ähnlichkeit auf. Die Gesamtlänge des
Myo15 Gens beträgt bei der Maus ca. 60 Kilobasenpaare (kb), wobei 66 Exone
nachgewiesen wurden (LIANG et al., 1999).
Sowohl eine Punktmutation in der Motordomäne von Myo15, als auch eine Deletion
in den Exonen, die für die FERM-Domäne kodieren, führen bei den shaker2-Mäusen
zu einer autosomal rezessiv vererbten Taubheit und vestibulärer Fehlfunktion
(PROBST, et al., 1998; LIANG, et al., 1999; ANDERSON, et al., 2000). Auch beim
Menschen sind verschiedene Mutationen in MYO15 (HSA17p11.2) beschrieben, die
als Folge eine nicht syndromartige, rezessiv vererbte Taubheitsform (DFNB3) haben
(WANG, et al., 1998).
33
2.4.1.1 Das „Usher Syndrom“
Das „Usher Syndrom“ zählt zu den über 40 beschriebenen Syndromen des
Menschen, die mit Taubheit und Beeinträchtigung des optischen Apparates
einhergehen (PETIT, 2001). Tatsächlich handelt es sich bei mehr als 50 % dieser
Fälle um eine Form dieses Syndroms (VERNON, 1969). Seine Prävalenz beträgt
basierend auf Studien der skandinavischen (NUUTILA, 1970; GRONDAHL, 1987;
ROSENBERG et al., 1997) kolumbianischen (TAMAYO et al., 1991), britischen
(HOPE et al., 1997) und nordamerikanischen Bevölkerung (BOUGHMAN et al.,
1983) zwischen 1 zu 16.000 und 1 zu 50.000.
Das „Usher Syndrom“ (USH) zeichnet sich durch neurosensorische Taubheit mit und
ohne Beeinträchtigung des vestibulären Systems sowie eingeschränktes
Sehvermögen auf Grund einer Retinitis pigmentosa (tapetoretinale Degeneration)
aus (PETIT, 2001). Es werden drei klinische Subtypen, Usher Typ 1 (USH1), Typ 2
(USH2) und Typ 3 (USH3), unterschieden (DAVENPORT und OMENN, 1977). USH1
repräsentiert dabei die klinisch schwerwiegendste Form. Patienten, die am Typ 1
leiden zeigen eine angeborene schwere neurosensorische Taubheit, konstante
vestibuläre Funktionsstörung und einen vorpubertären Beginn der Retinitis
pigmentosa (PETIT, 2001). Betroffene Kinder können ohne Hilfe in einem Alter von
sechs Monaten nicht sitzen und häufig nicht laufen, bevor sie ein Alter von 18
Monaten erreichen (MOLLER et al., 1989; SMITH et al., 1994). Dabei sind zum Teil
Ataxien vestibulären Ursprungs zu beobachten. USH2 unterscheidet sich vom Typ 1
durch eine moderatere Form der Taubheit (moderater Hörverlust bei niedrigen
Frequenzen; schwerer Hörverlust bei hohen Frequenzen), ein Fehlen der
vestibulären Funktionsstörung sowie eine höhere Variabilität im Fortschreiten der
Sehstörung (Beginn einer Nachtblindheit meist während der Pubertät) (PETIT, 2001).
USH3 unterscheidet sich wiederum von den Typen 1 und 2 durch eine progressive
Form der Taubheit, die zum Teil mit vestibulären Funktionsstörungen verbunden ist
(KARJALAINEN et al., 1989).
Der genetische Ursprung des Syndroms weist eine noch größere Heterogenität als
die klinische Ausprägung auf. Mindestens 12 Loci sollen an den drei Subtypen der
34
Erkrankung beteiligt sein. Zu den bereits identifizierten Genen gehören MYO7A
(USH1B; Protein: Myosin VIIa; Kapitel 2.4.1), USH1C (USH1C; Protein Harmonin),
CDH23 (USH1D; Protein: Cadherin 23), PCDH15 (USH1F; Protein: Protocadherin
15), USH1G (USH1G; Protein SANS), USH2A (USH2A; Protein Usherin) sowie
USH3A (USH3A; Protein Clarin 1) (AHMED et al., 2003).
2.4.2 Kaliumeinzelkanäle und ihre Bedeutung für die Funktion des
Innenohres und der Netzhaut
Zelleinwärts gerichtete K+-Einzelkanäle (Kir: „Inwardly rectifying K+-channel“)
repräsentieren eine im Körper weit verbreitete Klasse von Membranproteinen. Zu
den Zellfunktionen, an denen sie beteiligt sind, gehören die Generierung von
Membranpotenialen, die Regulation der Aktionspotenialdauer und der Erregbarkeit
von Membranen sowie die Sekretion und Absorption von Kaliumionen (LAGRUTTA
et al., 1996; ISOMOTO et al., 1997; REIMANN und ASHCROFT, 1999).
Als gemeinsames Charakteristikum dieser Gen- bzw. Protein-Familie ist
erwähnenswert, dass sie Kaliumionen bevorzugt in die Zelle einschleusen. Ihnen
wird auch eine Schlüsselrolle beim Transport von Kaliumionen in der Netzhaut des
Auges und in der Cochlea zugesprochen (MARCUS et al., 2002; YUAN et al., 2003).
Untersuchungen zu Veränderungen der Kaliumkonzentration im subretinalen Raum
(SRS) sind von OAKLEY und GREEN (1976) sowie STEINBERG et al. (1980)
beschrieben. Der SRS befindet sich zwischen den äußeren Segmenten der
Photorezeptoren und dem Pigmentepithel der Netzhaut (RPE), das die
Photorezeptoren von der Aderhaut trennt. Eine Illumination der dunkeladaptierten
Retina verursacht einen rapiden Abfall der Kaliumkonzentration in dem SRS durch
eine Veränderung der Aktivität der Photorezeptoren. Dieser Abfall wird dann zum Teil
kompensiert durch einen Efflux von K+ aus dem RPE und den Müller-Zellen
(KARWOSKI et al., 1989). An der Regulation des Kaliumhaushalts im SRS soll auch
der Kaliumeinzelkanal Kir7.1 (Kcnj13) beteiligt sein (SHIMURA et al., 2001). Es gibt
auch Hinweise auf die Existenz dieses Kanals (Kcnj13; RNO9) sowie der
35
Kaliumeinzelkanäle Kir4.1 (Kcnj10; RNO13) und Kir6.2/SUR1 (Kcnj11; RNO1) im
RPE der Ratte (KUSAKA et al., 1999; ETTAICHE et al., 2001; KUSAKA et al., 2001).
Die Expression des Kaliumeinzelkanals Kir4.1 wurde bei der Ratte auch für die
Intermediärzellen der Stria vascularis der Cochlea bestätigt (ANDO und TAKEUCHI,
1999). Bei der Stria vascularis handelt es sich um ein stark vaskularisiertes
mehrschichtiges Epithel, das in der Lateralwand der Cochlea dem Ligamentum
spirale angelagert ist und aus Marginal-, Intermediär- und Basalzellen besteht
(JAHNKE, 1975). Die Marginalzellen sezernieren Kaliumionen in die Endolymphe der
Cochlea, während die Basalzellen zum einen mit den zwischen Marginal- und
Basalzellen lokalisierten Intermediärzellen und zum anderen mit dem Ligamentum
spirale in Verbindung stehen (MARCUS, et al., 2002).
Die Stria vascularis ist als Ursprung des endocochleären Potentials (EP) bekannt,
welches zusammen mit der hohen Kaliumkonzentration in der Endolymphe der
Cochlea für die sensorische Transduktion in den Haarzellen sorgt. Man geht davon
aus, dass Kaliumeinzelkanäle vom Typ Kir4.1, die für einen Kaliumeinstrom in die
Intermediärzellen sorgen, für die Generierung des endocochleären Potentials
verantwortlich sind (MARCUS, et al., 2002). Gestützt wird diese Hypothese durch die
Tatsache, dass in Mausmutanten, denen die Intermediärzellen fehlten, kein EP
gemessen werden konnte (CARLISLE et al., 1990) und man das EP durch Einsatz
von Kaliumeinzelkanalblockern beeinflussen konnte (MARCUS et al., 1985; HIBINO
et al., 1997; TAKEUCHI et al., 2000). Ebenso ist eine Mausmutante (Kcnj10tm1Pkj) mit
einem genetisch inaktivierten Kir4.1 Kaliumeinzelkanal (Kcnj10; MMU1) beschrieben.
Dieses Tier weist eine Innenohrdegeneration in Verbindung mit Hörverlust auf
(KOFUJI et al., 2000; MARCUS, et al., 2002; ROZENGURT et al., 2003).
Bei der Kcnj12tm1Swz-Mausmutante wurde der Kir2.2 Kaliumeinzelkanal (Kcnj12;
MMU11) durch gerichtete Mutation inaktiviert (ZARITSKY et al., 2000). Sie wurde
zusammen mit der Kcnj2tm1Swz-Mausmutante (genetisch inaktivierter Kir2.1
Kaliumeinzelkanal; Kcnj2; MMU11) für Untersuchungen zu Kaliumionen abhängigen
Dilatationen von cerebralen Arterien herangezogen. Aus ihren Untersuchungen
schlossen ZARITSKY et al. (2000), dass die Expression von Kir2.1, nicht aber von
Kir2.2 in den glatten Muskelzellen der Arterien für die durch Kaliumionen gesteuerte
36
Dilatation notwendig ist. Untersuchungen zur Expression und Funktion von Kcnj12
für das Innenohr und die Netzhaut sind noch nicht beschrieben.
2.4.3 Rezeptoren des dopaminergen Systems
Als Zielstrukturen des Neurotransmitters Dopamin dienen G-Protein gekoppelte
Rezeptoren (DRD), die in 5 Typen (DRD1 – DRD5) aufgeteilt werden. Die zuerst
identifizierten Dopamin D1- und D2-Rezeptoren übertreffen zahlenmäßig bei weitem
die später gefundenen Dopamin D3- bis D5-Rezeptoren. Entsprechend werden die
Rezeptoren heute in zwei Unterfamilien gegliedert. DRD1 und DRD5 werden als D1-
ähnliche während DRD2, DRD3 und DRD4 als D2-ähnliche Rezeptoren bezeichnet
(Strange, 1996).
Zwischen den Rezeptoren bestehen Unterschiede hinsichtlich Lokalisation,
physiologischer Funktion und biochemischer Reaktion. In den Basalganglien
(Striatum) findet man hauptsächlich D1- und D2-Rezeptoren während im Cortex und
im limbischen System alle Subtypen vorkommen. In der Hypophyse gibt es fast
ausschließlich D2-Rezeptoren und im Gefäßsystem herrschen D1-, D2- und D4-
Rezeptoren vor. Die D1-Rezeptoren sind somit für die Bewegungsmodulation, für
kognitive und kardiovaskuläre Funktionen wichtig. D2-Rezeptoren vermitteln
Bewegungsmodulation und Verhalten, sowie die Prolaktinsekretion in der
Hypophyse. D3- und D4-Rezeptoren sind wahrscheinlich an kognitiven und
emotionalen Vorgängen und Verhalten beteiligt, während die Bedeutung der
D5-Rezeptoren noch weitgehend unklar ist (JABER et al., 1996).
Die D3-Rezeptoren repräsentieren in etwa nur 1 % der D2-ähnlichen Rezeptoren
(SOKOLOFF und SCHWARTZ, 1995). Sie wurden längere Zeit auch auf eine
Beteiligung an der Ausprägung von Schizophrenie beim Menschen untersucht, wobei
neuere Untersuchungen Veränderungen in D R D 3 (HSA3q13.31) eine
prädispositionierende Rolle aberkennen (ANNEY et al., 2002; CHONG et al., 2003).
Interessanterweise beschrieben ACCILI et al. (1996) eine Mausmutante (Drd3tm1Dac)
mit einem genetisch inaktivierten D3-Rezeptor, die sich vor allem durch eine starke
37
Hyperaktivität - wie sie auch bei der BH.7A-ci3 Rattenmutante vorliegt (LESSENICH
et al., 2001) - auszeichnet, und schlossen daraus, dass dieser Rezeptor-Typ eine
inhibitorische Rolle in der Beeinflußung bestimmter Verhaltensabläufe spielen
könnte. Das für diesen Rezeptor kodierene Gen (Drd3) ist bei der Maus auf
Chromosom 16 lokalisiert.
2.5 Literatur zur Methodik
2.5.1 Mikrosatelliten
Mikrosatelliten, auch „simple tandem repeats“ (STRs) oder „simple sequence
repeats“ (SSRs), sind definiert als kurze 1-6 Basenpaare (bp) lange DNA
Sequenzen, die sich unterschiedlich oft hintereinander wiederholen (BECKMANN
und WEBER, 1992). Die Anzahl dieser Wiederholungen ist dabei der Gesamtlänge
des Mikrosatelliten proportional. Daraus resultierende Fragmentlängenunterschiede,
wie sie z.B. beim Vergleich zweier Ratteninzuchtstämme auftreten können, werden
auch als „simple sequence length polymorphism“ (SSLPs) bezeichnet (COPELAND
et al., 1993; DIETRICH et al., 1994). Solche Polymorphismen lassen sich einfach
mittels PCR-Amplifikation darstellen (WEBER und MAY, 1989).
Man unterscheidet zwischen anonymen und gengekoppelten Mikrosatelliten. Bei den
anonymen Markern ist zwar die chromosomale Lokalisation aufgrund von
genetischen Kopplungskarten beschrieben, deren physikalischer Abstand zu
benachbarten Genen ist jedoch unbekannt. Gengekoppelte Mikrosatellitenmarker
dagegen liegen meist in Introns und 3´- und 5´- „untranslated regions“ von Genen.
Bei der Ratte wurden Mikrosatelliten erstmals 1992 beschrieben (SERIKAWA et al.).
Seitdem wurde eine stetig ansteigende Anzahl von Mikrosatelliten, die über das
gesamte Genom der Ratte verteilt sind, identifiziert und für genetische
Untersuchungen (Kopplungsanalysen) herangezogen (KURAMOTO et al., 1993;
PROKOP et al., 1993; YEUNG et al., 1993). Angaben zu ihrer Lokalisation und den
38
benötigten Primersequenzen findet man bei Datenbanken wie z.B. der „Rat Genome
Database“ (www.rgd.mcw.edu).
2.5.1.1 Kopplungskarten und Kopplungsanalyse
Biologische Grundlage für eine Kopplungsanalyse sind Crossover-Vorgänge
zwischen zwei Nicht-Schwester-Chromatiden. Hierbei kann es zu reziprokem
Austausch von homologen Chromosomen-Abschnitten und somit zur Entkopplung
benachbarter Gene bzw. Loci kommen. Die Austauschhäufigkeit zwischen zwei Loci
ist abhängig von ihrer gegenseitigen Entfernung und ist somit ein Maß für ihre
relative Entfernung. Maßeinheit ist das centi-Morgan (cM), wobei ein cM einer
Austauschhäufigkeit von 1 % entspricht (STRICKBERGER 1988).
Die Austauschhäufigkeit zwischen zwei Loci wird mit Hilfe von
Kreuzungspopulationen bestimmt. Hierzu kann beispielsweise eine
Rückkreuzungspopulation dienen (KURAMOTO et al., 1993; PROKOP et al., 1993;
YEUNG et al., 1993). Durch Genotypisierung der Individuen der
Kreuzungspopulation mittels polymorpher Marker (beispielsweise Mikrosatelliten)
bestimmt man die Austauschhäufigkeit zwischen zwei Loci/Markern, die sich aus
dem prozentualen Anteil der Austauschkombinationen an den Gesamtkombinationen
ergibt. Durch solch eine Kopplungsanalyse können Kopplungsgruppen und darauf
basierend Kopplungskarten ermittelt werden. Ist die chromosomale Position eines
Locus einer Kopplungsgruppe bekannt, kann diese als Ganzes dem entsprechenden
Chromosom zugeordnet werden (SERIKAWA et al., 1992).
Parallel zu der Ermittlung der chromosomalen Position einzelner Marker
(beispielsweise SSLPs) kann auch deren Assoziation zu einem bestimmten
phänotypischen Merkmal untersucht werden. Hierbei wird die Austauschhäufigkeit
(Rekombinationsfrequenz) zwischen einem Marker und dem Gen, welches für das
entsprechende Merkmal verantwortlich ist, überprüft.
39
2.5.2 Neurophysiologische Verhaltensuntersuchungen
Für die vielfältigen neurologischen Störungen des Menschen stehen noch nicht
genügend brauchbare Tiermodelle zur Verfügung. Gentechnologische Modifikationen
(klassische und konditionale „Knockout“-Mausmutanten) haben zwar zu guten neuen
Modellen geführt, setzten aber die Kenntnis des ursächlichen Defektgens voraus und
erfordern eine vollständige Phänotypisierung. Bestandteil einer vollständigen
Phänotypisierung sollten neben immunologischen, endokrinologischen,
histologischen und genetischen Analysen auch verhaltensbiologische
Beobachtungen sein. Entsprechend haben Untersuchungen zum Verhalten von
Versuchstieren in der jüngsten Vergangenheit zunehmende Bedeutung erhalten
(CRAWLEY, 1999).
Neben diesen genetisch veränderten Tieren bedarf es natürlich auch bei
Spontanmutanten einer genauen Abklärung sämtlicher Züge des Phänotypen.
Im Rahmen eines vollständigen „Screening“-Verfahrens ist es von essentieller
Bedeutung, vorab die Physis der Untersuchungstiere zu prüfen. Hierbei sollten auch
die sensorischen Fähigkeiten untersucht werden. Diese Voruntersuchungen schaffen
die Voraussetzung, um daran anschließend entsprechend untersuchte Tiere komplex
aufgebauten Verhaltenstests zu unterziehen (CRAWLEY und PAYLOR, 1997).
Auf Grund individueller Unterschiede in den Verhaltensreaktionen der Tiere ist es
unabdingbar ihre neurophysiologischen und sensorischen Funktionen durch
unterschiedliche Versuchsaufbauten zu prüfen, um falsch positive Ergebnisse
ausschliessen zu können (KARL et al., 2003).
40
3. Material und Methoden
3.1 Versuchstiere und Organentnahme
3.1.1 Versuchstiere
Die Haltung und Zucht sämtlicher Tiere erfolgte am Zentralen Tierlaboratorium der
Medizinischen Hochschule Hannover (Haltersymbol: Ztm).
Sämtliche Ratten wurden in Gruppen (2-3 Tiere) in Makrolonkäfigen Typ III gehalten
und wöchentlich in saubere Käfige umgesetzt. Als Futter wurde handelsübliches
Haltungsfutter (Altromin 1324) bzw. Zuchtfutter (Altromin 1310) ad libitum eingesetzt
und Wasser in Makrolonflaschen ebenfalls ad libitum zur Verfügung gestellt. Die
Einstreu bestand aus staubfreiem Weichholzgranulat. Die relative Luftfeuchtigkeit lag
bei 55 ± 5%, die Temperatur bei 22 ± 2°C. Das Lichtprogramm war auf einen 12/12
Stunden Licht-/Dunkel-Zyklus eingestellt (Lichtphase begann ab 6.00 Uhr
mitteleuropäischer Zeit).
Für die Verhaltensuntersuchungen (Kapitel 3.2) sowie für die genetischen Analysen
(Kapitel 3.4) wurden zwei Rückkreuzungspopulationen ((LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x
LEW/Ztm-ci2 und (BN/Ztm x BH.7A/Ztm-ci3)F1 x BH.7A/Ztm-ci3) angelegt. Ein Teil
der Individuen dieser Rückkreuzungspopulationen (N2) war zum Zeitpunkt des
Dissertationsbeginns bereits im Zentralen Tierlaboratorium phänotypisiert
(Rotationsverhalten; Funktionsfähigkeit des vestibulären Systems (Schwimmtest,
Kapitel 3.2.2.4)) und euthanasiert worden, so dass die bei -20 °C gelagerten
Organproben (Schwanz; Milz, Ohren) dieser Tiere nach einer Aufreinigung der DNA
für die Genotypisierung zum Einsatz kamen.
Im Verlauf der vorliegenden Arbeit wurden 55 weitere (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x
LEW/Ztm-ci2 Individuen gezüchtet und phänotypisiert (Kapitel 3.2), so dass
insgesamt 208 N2-Individuen für die genetischen Analysen (Kapitel 3.4) zur
Verfügung standen.
41
Die bereits vorhandene (BN/Ztm x BH.7A/Ztm-ci3)F1 x BH.7A/Ztm-c i 3
Rückkreuzungspopulation (n=125) wurde im Verlauf dieser Dissertation durch 154
neue N2-Individuen ergänzt, die entsprechend phänotypisiert (Kapitel 3.2) wurden.
Insgesamt entstand somit bis Juni 2003 eine 279 Individuen starke Population.
(LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2:
Es wurden weibliche LEW-ci2 Ratten mit männlichen Ratten des Inzuchtstammes
BN/Ztm verpaart. Die weiblichen Tiere der resultierenden F1 (LEW-ci2 x BN)
Generation wurden mit männlichen LEW/Ztm-ci2 Ratten verpaart, so dass eine
segregierende Rückkreuzungspopulation ((LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-
ci2) entstand.
(BN/Ztm x BH.7A/Ztm-ci3)F1 x BH.7A/Ztm-ci3:
Es wurden Rückkreuzungstiere basierend auf dem Inzuchtstamm BN/Ztm und dem
Inzuchtstamm BH.7A/Ztm-ci3 gezüchtet. Hierzu wurden männliche BH.7A/Ztm-ci3
Ratten mit weiblichen BN/Ztm Tieren verpaart. Die weiblichen Tiere der
resultierenden F1 (BN/Ztm x BH.7A/Ztm-ci3) Generation wurden mit den männlichen
Elterntieren verpaart, so dass eine segregierende Rückkreuzungspopulation
((BN/Ztm x BH.7A/Ztm-ci3)F1 x BH.7A/Ztm-ci3) entstand.
Sämtliche Individuen beider N2-Populationen wurden zur Organentnahme (Schwanz,
Milz, Ohren) nach vorheriger CO2 Betäubung durch cervikale Dislokation getötet.
Ebenso wurden jeweils ein männliches adultes Tier der beiden coisogenen Stämme
LEW/Ztm-ci2 bzw. BH.7A/Ztm-ci3 sowie jeweils ein männliches adultes Tier der
Hintergrundstämme LEW/Ztm und BH.7A/Ztm bzw. BH/Ztm zur Organentnahme
(Schwanz, Milz, Ohren) wie oben beschrieben getötet. Die DNA dieser Tiere diente
als Kontrolle bei der Auswahl geeigneter Mikrosatelliten (Kapitel 3.4.1 und 3.5.3)
sowie zum Nachweis einzelner Exone eines Kandidatengens (Kapitel 3.5.5).
42
3.1.2 Organentnahme
Die Milz, die Ohren und die Schwanzspitze wurden nach Tötung eines Tieres unter
aspetischen Bedingungen entnommen, in ein steriles 2 ml Reaktionsgefäß verbracht
und sofort in flüssigen Stickstoff überführt. Dabei wurde strengstens darauf geachtet,
dass keine Probenkontamination von Tier zu Tier entstand (Reinigung des
Operationsbesteckes zwischen zwei Organentnahmen). Die Lagerung der Organe
erfolgte bei -80 °C.
3.2 Neurophysiologische Verhaltensuntersuchungen
Die durchgeführten neurophysiologischen Verhaltensuntersuchungen wurden der
Bezirksregierung Hannover angezeigt und sind von dieser zur Kenntnis genommen
worden (Aktenzeichen: 509c-42502-02A139).
Die im Verlauf dieser Dissertation gezüchteten N2-Tiere beider Rückkreuzungen
wurden, wie es bei den vorab gezüchteten N2-Individuen bereits geschehen war, auf
das Vorhandensein der charakteristischen Merkmale des ci2- bzw. ci3-Phänotyps
getestet, um so die jeweiligen Individuen in homozygote und heterozygote
Merkmalsträger aufteilen zu können. Diese eindeutige phänotypische
Charakterisierung ist als Grundvorrausetzung anzusehen, um die bei der
Kopplungsanalyse (Kapitel 3.4) ermittelten Genotypen mit den Phänotypen der
Rückkreuzungsindividuen abgleichen zu können und somit einen Hinweis auf
Kopplung des untersuchten Markers zur jeweiligen Mutation zu erlangen.
Hierbei handelte es sich in beiden Fällen um das für die Parentalstämme
beschriebene Rotationsverhalten (LINDEMANN et al., 2001; LESSENICH et al.,
2001). Zusätzlich sollten die (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2 Individuen
auf die von der LEW-ci2 Ratte bekannten Fehlfunktionen des auditiven und
vestibulären Systems geprüft werden (KAISER et al., 2001).
43
Wie bei den bereits phänotypisierten und euthanasierten N2-Individuen sollte das
Rotationsverhalten im Heimatkäfig und in einer „Open Field“-Apparatur und die
vestibuläre Funktion mit Hilfe eines Schwimmtests bei den neu gezüchteten Tieren
untersucht werden. Zusätzlich sollte das vestibuläre System, wie bereits bei den
Parentalstämmen (KAISER et al., 2001; LESSENICH et al., 2001), mit Hilfe des
„Balance“- und „Air-Righting”-Tests geprüft werden.
Des Weiteren sollte die Sehfähigkeit der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2
Individuen überprüft werden. Der Grund für diese Untersuchungen war der auf den
Ergebnissen der genetischen Untersuchungen dieser Arbeit basierende Hinweis auf
Parallelität des ci2-Phänotypen zu dem „Usher Syndrom“ Typ 1B des Menschen, das
mit einer progressiven Retinopathie einhergeht (Kapitel 5.3.1). Hierbei war das Ziel
neurophysiologische Verhaltentests zu etablieren, mit denen eine große Anzahl von
Individuen vergleichsweise einfach auf ihre Sehfähigkeit geprüft werden konnte.
3.2.1 Untersuchung des Rotationsverhaltens
Die im Verlauf dieser Dissertation gezüchteten Individuen der (LEW/Ztm-ci2 x
BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2 Rückkreuzung (n=55; Alter zum Zeitpunkt dieser
Untersuchung: zwischen 6 und 10 Wochen) sowie der (BN/Ztm x BH.7A/Ztm-ci3)F1 x
BH.7A/Ztm-ci3 Rückkreuzung (n=154; Alter zum Zeitpunkt dieser Untersuchung:
zwischen 4 und 8 Wochen) wurden hinsichtlich ihres Rotationsverhalten untersucht.
Hierzu erfolgte zunächst eine Beobachtung der Tiere in der ihnen gewohnten
Umgebung des Heimatkäfigs (Makrolonkäfig Typ III; Gruppenhaltung (2-3 Tiere) –
„Homecage Behavior“). Danach wurden die Tiere einzeln in eine runde „Open Field“-
Apparatur verbracht (Durchmesser 105 cm; Höhe 40 cm) und ihr Verhalten in dieser
für sie neuen Umgebung, die bei den Tieren Stress erzeugen sollte, beobachtet.
Das für den ci2 -Phänotypen bzw. c i 3-Phänotypen charakteristische
Rotationsverhalten lag vor, wenn die Tiere sowohl im Heimatkäfig als auch in der
„Open Field“-Apparatur wiederholt schnelle Drehbewegungen um die eigene Achse
zeigten.
44
3.2.2 Untersuchung des auditiven und vestibulären Systems der
(LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2 Ratten
Die 55 N2-Individuen waren zum Zeitpunkt der folgenden Untersuchungen (Kapitel
3.2.2.1 bis 3.2.2.4) zwischen 6 und 10 Wochen alt.
3.2.2.1 Akustischer Stimulus
Zur Überprüfung ihres Hörvermögens wurden die N2-Individuen mit einem
definierten akustischen Stimulus (Blechfeder mit Resonanzkörper: „Knackfrosch“;
VON HÖRSTEN et al., 1993) konfrontiert und eine etwaige Schreckreaktion
(Zusammenzucken des Flankenbereichs; heftiges Zucken der Kopfregion)
aufgezeichnet.
3.2.2.2 „Air-Righting”-Test
Der „Air-Righting“-Test überprüft bestimmte Funktionen (Stellreflexe) des
vestibulären Systems (OSSENKOPP et al., 1990; RABBATH et al., 2001). Die Tiere
wurden auf den Rücken gedreht und aus einer Höhe von ca. 50 cm auf eine
gepolsterte Unterlage fallengelassen. Die Fähigkeit der Tiere, sich auf dieser kurzen
Strecke so zu drehen, dass sie auf den Gliedmaßen landen, wurde beurteilt. Dieser
Test wurde dreimal hintereinander durchgeführt. Nur bei Ratten, die in allen drei
Tests ein Defizit zeigten (auf der Seite oder auf dem Rücken landeten), wurde dieses
auf einen Defekt des vestibulären Systems zurückgeführt.
45
3.2.2.3 „Balance“-Test
Beim „Balance“-Test wird ebenfalls die Funktionsfähigkeit des Gleichgewichtorgans
der Tiere überprüft (CRAWLEY, 1999). Die N2-Ratten wurden in einen Makrolonkäfig
Typ III plaziert und dieser jeweils zehnmal in seiner Längs- und Querachse gekippt.
Zusätzlich wurde der Käfig durch schnelle Bewegungen in seiner Vertikalachse
verschoben. Die Fähigkeit der Tiere diese Bewegungen des Käfigs durch gespreizte
Stellung ihrer Pfoten und durch Ruderbewegungen mit dem Schwanz auszugleichen,
um eine aufrechte Position zu erhalten, wurde beobachtet und diejenigen Tiere, die
solch ein Verhalten zeigten als positiv bewertet.
3.2.2.4 Schwimmtest
Ebenso wurde ein Schwimmtest (modifiziert nach PORSOLT et al., 1978)
durchgeführt, um Aussagen über die Funktion des vestibulären Systems zu erhalten.
Die Ratten wurden hierzu in ein quadratisches Wasserbecken (Breite x Höhe x Tiefe:
50 x 42 x 50 cm) verbracht, aus welchem sie nicht entrinnen konnten. Die
Wassertemperatur betrug 32 – 36°C. Die Ratten wurden für 5 Minuten in diesem
Becken beobachtet und ihr Schwimmvermögen beurteilt. Nach Ablauf der 5 Minuten
wurden die Tiere aus dem Becken entnommen. Tauchten die Tiere ab, weil sie nicht
in der Lage waren, zu schwimmen, so erfolgte eine sofortige Entnahme aus dem
Wasserbecken.
46
3.2.3 Überprüfung der Sehfähigkeit der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x
LEW/Ztm-ci2 Ratten
Die in der Literatur beschriebenen Verhaltensuntersuchung, aus denen man
Rückschlüsse auf die Sehfähigkeit von Ratten und Mäusen ziehen kann („Foreign
Stimulus“-Test: CRAWLEY, 1999; „Ringtest“: KARL et al., 2003), konnten auf Grund
des Rotationsverhaltens und der Defizite in der Funktion des vestibulären Systems
der den ci2-Phänotypen aufweisenden N2-Individuen nicht durchgeführt werden.
Es kamen zwei Testaufbauten zum Einsatz, die trotz dieses spezifischen
Verhaltensmusters Rückschlüsse auf das Sehvermögen der den ci2-Phänotypen
tragenden N2-Tiere zuließen. Sämtliche Tiere wurden wie oben beschrieben (Kapitel
3.2.1 und 3.2.2) vor der Durchführung beider Untersuchungen auf das
Vorhandensein der charakteristischen Merkmale der ci2-Mutation geprüft und in zwei
Gruppen (homozygote Merkmalsträger: Rotationsverhalten, Defizite in der Funktion
des vestibulären Systems vs. heterozygote Merkmalsträger: kein Rotationsverhalten,
physiologische Funktion des vestibulären Systems) unterteilt. Die N2-Individuen
waren zum Zeitpunkt der folgenden Untersuchungen (Kapitel 3.2.3.1 und 3.2.3.2)
zwischen 3 und 5 Monate alt.
3.2.3.1 Verhalten der Tiere an einer sichtbaren Kante (modifizierter
„Visual-Cliff“-Test)
Es wurde das Verhalten der 55 im Verlauf dieser Arbeit gezüchteten N2-Individuen
bei der Positionierung auf einem Rundhocker (Höhe: 50 cm; Durchmesser der
Sitzfläche: 30 cm), welcher von einer Schaumstoffunterlage umgeben war,
untersucht. Die Tiere wurden somit einer exponierten Situation ausgesetzt, um zu
überprüfen, ob sie in der Lage sind, die optische Begrenzung dieser Fläche (Kante
der Sitzfläche) zu registrieren. Hierzu wurden die N2-Ratten zentral plaziert und für 3
Minuten ihr Verhalten beobachtet. Es wurde die Latenzzeit bis zu dem Zeitpunkt
gemessen, an dem die Tiere erstmalig über die Kante der Sitzfläche des Hockers
47
hinabblickten („Head Dipping“). Ebenso wurde die Häufigkeit dieses „Head Dipping“-
Verhaltens gezählt. Des Weiteren wurde die Anzahl der Stürze auf den gepolsterten
Boden protokolliert. Nach einem Sturz wurde der Test unterbrochen, die Tiere wieder
zentral auf der Sitzfläche des Hockers positioniert und anschließend die
Untersuchung wieder fortgesetzt. Bei einem absehbaren Sturz wurde dieser als
solcher gewertet, die Tiere aber rechtzeitig von der Kante entfernt und ebenfalls
wieder zentral plaziert, um jegliche Verletzungen zu vermeiden. Stürze, die sich auf
Grund des Rotationsverhaltens ergaben, wurden nicht aufgezeichnet. Die Anzahl der
während der Beobachtungsdauer abgesetzten Kot-Boli wurde als Indikator für die
Emotionalität und die Stressreaktion der Tiere (Hall, 1934) ebenfalls protokolliert.
3.2.3.2 Hell-Dunkel-Transfer-Test
Diese Untersuchung wurde lediglich mit jeweils 10 N2-Individuen, die den ci2-
Phänotypen aufwiesen und 10 nicht betroffenen N2-Individuen durchgeführt, um
mögliche Hinweise aus dem vorherigen Test (Kapitel 3.2.3.1) zu prüfen.
Zur Feststellung einer eventuell verminderten Sehfähigkeit der N2-Individuen wurde
als zweite Verhaltensuntersuchung ein Hell-Dunkel-Transfer-Test in einer „Shuttle-
Box“ (Hell-Dunkel-Kammer) durchgeführt (CRAWLEY, 1985). Die Shuttle-Box (Abb.
13) bestand aus einem hell ausgeleuchteten (575 Lux) und einem durch eine Wand
abgetrennten abgedunkelten Kompartiment (0.5 Lux). Die Tiere wurden in das helle
Kompartiment gesetzt. Nagetiere meiden natürlicherweise helle, offene Bereiche; so
dass das Einsetzen der Tiere in einen derartigen Bereich Ängstlichkeit induzieren
sollte. Nach einer Gewöhnungsphase von 10 Sekunden wurde eine in der
Trennwand plazierte Schubtür geöffnet, um den Zugang zum dunklen Kompartiment
zu ermöglichen und somit eine Ausweichmöglichkeit zu schaffen. Gemessen wurde
die Latenzzeit zwischen der Öffnung der Tür und dem Übergang der Tiere ins dunkle
Kompartiment („Light Dark Transversion Time“). Ebenso wurde gezählt, wie oft die
Ratten mit dem Kopf durch die Öffnung in den dunklen Bereich eintauchten, ohne
diesen zu betreten. Gezählt wurde auch die Anzahl der abgesetzten Kot-Boli
48
(Indikator für Emotionalität und Stressreaktion). Der Test wurde nach Übergang der
Ratten in das dunkle Kompartiment bzw. nach einer Zeitspanne von fünf Minuten
abgebrochen.
3.3 Molekularbiologische Untersuchungen
3.3.1 Isolierung von Desoxyribonukleinsäure (DNA)
Die DNA der N2-Ratten sowie Kontroll-DNA der Parentalstämme und der
Hintergrundstämme wurde unter Verwendung eines Aufarbeitungskits
(„NucleoSpinTM Tissue kit“; Firma Macherey-Nagel) isoliert.
Für die DNA-Gewinnung wurden ca. 25 mg des tiefgefrorenen Ohrmuschel- oder
Schwanzgewebes in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß mit 180 µl Pre-Lysispuffer
versetzt und mit einer sterilen Schere grob zerkleinert. Nach Zugabe von 25 µl
Proteinase K-Lösung wurde der Ansatz etwa 15 Sekunden gut durchmischt (Vortex)
und 2 bis 4 Stunden in einem Thermomixer bei 56 °C inkubiert. Anschließend wurden
200 µl eines Lysispuffers hinzugefügt, die Proben etwa 15 Sekunden gut durchmischt
und bei 70 °C für 10 Minuten inkubiert. Die ungelösten Gewebe- und Zellreste
wurden durch fünfminütige Zentrifugation (Biofuge) bei 12.000 Umdrehungen/min
abgetrennt und der Probenüberstand in ein neues 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt.
Nach Zugabe von Ethanol (96 %) und erneutem durchmischen wurde die Lösung auf
eine Silicium-Gelmembran-Säule, die sich in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß befand,
aufgetragen. Nach einminütiger Zentrifugation bei 12.000 Umdrehungen/min erfolgte
ein zweimaliger Waschvorgang der in der Säule enthaltenen DNA mit 500 µl bzw.
600 µl Waschpuffer und anschließender jeweils einminütiger Zentrifugation bei
12.000 Umdrehungen/min, um restliche Verunreinigungen zu entfernen.
Abschließend wurde die DNA mit 100 µl eines auf 70 °C erwärmten Elutionspuffers
und nach einminütiger Zentrifugation bei 12.000 Umdrehungen/min gewonnen.
49
3.3.2 Einstellen der DNA-Konzentration
Nachdem jede DNA-Probe 1:10 mit sterilem Aqua dest. verdünnt war, folgte eine
photometrische Bestimmung des DNA-Gehaltes bei 260 nm in einer 1 ml
Quarzküvette.
Zur Berechnung der DNA-Menge pro µl Probe galt folgende Formel:
OD260 x 50/ 1000 = µg DNA/ml
Im Anschluss an die Ermittlung der DNA-Konzentration erfolgte deren Einstellung auf
50 ng/ml mit sterilem Aqua dest. Die eingestellten DNA-Proben wurden bis zur
Weiterverwendung bei 4°C, zur längeren Aufbewahrung bei -18°C gelagert.
50
3.3.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Zum Nachweis sämtlicher in dieser Arbeit untersuchten genomischen DNA-
Sequenzen wurde das in Tabelle 1 beschriebene Protokoll benutzt.
Tabelle 1: PCR-Ansatz pro DNA-Probe
MgCl2: Magnesiumchlorid; 10 x Reaktionspuffer Y: 200 mM Tris-HCl (pH 8,55), 160
mM (NH4)2SO4, 20 mM MgCl2 ; dNTP: 2`-Desoxynukleosidtriphosphat;
Taq-DNA-Polymerase: SAWDAY Taq-DNA-PolymeraseTM
Volumen Endkonzentration
DNA-Lösung (50ng/ml) 2µl 100 ng
Mastermix:
Aqua dest. (steril) 4,6 µl
dNTP-Mix
(pro dNTP 2,5 mM)
1,2 µl pro dNTP 0,3 mM
10x Reaktionspuffer Y
(Tris-HCl)
((NH4)2SO4)
( MgCl2)
1 µl
(20 mM)
(16 mM)
( 2 mM)
25 mM MgCl2 0,6 µl 1,5 mM
6,7 µM Forward-Primer 0,25 µl 0,17 µM
6,7 µM Reverse-Primer 0,25 µl 0,17 µM
5U/µl Taq-DNA-
Polymerase
0,1 µl 0,5 U
Gesamt 10 µl
51
Alle Pipettierarbeiten wurden auf Kühlplatten durchgeführt, um vorzeitige Reaktionen
zu minimieren. Zunächst wurden 2 µl DNA-Lösung in 96er-Mikrotiterplatten, die als
PCR-Reaktionsgefäße dienten, vorgelegt und dann eine der Probenzahl
entsprechende Menge (8 µl pro DNA-Probe) des in Tabelle 1 beschriebenen
Mastermixes in ein 2 ml Reaktionsgefäß gegeben und durchmischt. Anschließend
wurden je 8 µl des Mastermixes in die vorgelegte DNA-Lösung gegeben. Die
Mikrotiterplatten wurden mit Silikonmatten verschlossen, das Gemisch wurde kurz
zentrifugiert und in einen Thermocycler verbracht. Das Temperaturprofil der PCR
begann mit einem Denaturierungsschritt von 4 min bei 95 °C. Es folgten 35 Zyklen je
15 s bei 94 °C (Denaturierung), 1 min bei 55 °C bis 60 °C (Anlagerung) und 2 min
bei 72 °C (Elongation). Nach dem letzten Zyklus folgte für 7 min ein abschließender
Schritt bei einer Temperatur von 72 °C. Bis zu ihrer Entnahme hielt der Thermocycler
die Proben auf 8 °C gekühlt.
3.3.4 Agarosegel-Elektrophorese
Zum Nachweis sämtlicher PCR-Produkte wurden 3 %ige Agarose-Gele verwendet.
Die Agarose wurde in 1 x TBE-Puffer (10 x TBE : Aqua dest = 1 : 10) durch
fünfminütiges Erhitzen in einer Mikrowelle und durch anschließendes Rühren
aufgelöst.
Unter ständigem Rühren mittels eines Magnetrührers wurde die Agaroselösung bis
auf etwa 50 °C abgekühlt. Es wurde 5 ml Ethidiumbromidlösung oder 5 ml „Gel Star“
pro 100 ml Gellösung zugesetzt. Die Gellösung wurde in eine 18 cm x 15 cm große
Kunststoffkammer gegossen. Zuvor wurde die Kunststoffkammer an den Enden mit
Klebeband abgedichtet und mit jeweils vier Kunstoffkämmen (2 mm stark mit 25
Zähnen) versehen. Die Gelstärke betrug 0,5 bis 0,7 cm.
Nachdem das Gel polymerisiert war (ca. 15 bis 20 min) wurden die Kunststoffkämme
und die Klebestreifen entfernt. Die Gelkammer wurde samt Gel in eine horizontal
ausnivellierte, mit 1x TBE-Puffer gefüllte und an ein Netzgerät angeschlossene
Elektrophoresekammer verbracht.
52
Die PCR-Proben wurden mit je 4 ml Ladepuffer (0,05 %iges Orange G) versetzt. Von
diesem Gemisch wurden je 12 ml in die einzelnen Geltaschen pipettiert. In die erste
Tasche jeder Probenreihe wurde ein 100 bp DNA-Standardgrößenmarker zur
Überprüfung der Länge der PCR-Produkte pipettiert. Die Elektrophorese erfolgte mit
einer Spannung von 60 bis 100 Volt und bei einer Stromstärke von 90 mA für eine
Dauer von 90 bis zu 240 Minuten.
Die Ergebnisse wurden auf einem UV-Transilluminator bei 312 nm Wellenlänge
ausgewertet und mit einer Digitalkamera dokumentiert.
3.4 Mikrosatellitenmarker-gestützte Kopplungsanalyse
Es wurde in beiden Fällen eine genomweite Kopplungsanalyse durchgeführt, um die
Lokalisation der mutierten Gene im Genom der LEW-ci2 bzw. BH.7A-ci3 Ratten bzw.
die mit den jeweiligen Phänotypen assozierten genomischen Regionen ausfindig zu
machen. Hierzu wurde die DNA der Individuen beider Rückkreuzungspopulationen
zunächst mit anonymen Mikrosatellitenmarkern untersucht. Es erfolgte bei jedem N2-
Individuum am jeweiligen Mikrosatellitenlocus eine Zuordnung der Allele zum LEW-
ci2- bzw. BH.7A-ci3- oder BN-Stamm. Somit wurde eine Kopplung des jeweiligen
Locus zu den mutierten Genen bzw. eine Assoziation des jeweiligen Mikrosatelliten
zu dem ci2- bzw. ci3-Phänotypen untersucht (Kapitel 2.5.1).
Für die Kopplungsanalyse standen aufgereinigte Gewebeproben sämtlicher 208
Individuen der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2 Rückkreuzung zur
Verfügung.
Für die vorläufige grobe Untersuchung des Genoms der BH.7A-ci3 Rattenmutante
wurden die aufgereinigten Gewebeproben der vorab gezüchteten 125 Individuen der
(BN/Ztm x BH.7A/Ztm-ci3)F1 x BH.7A/Ztm-ci3 Rückkreuzungspopulation benutzt. Die
Gewebeproben der neu gezüchteten 154 N2-Individuen standen erst in einem
Zeitraum zur Verfügung (Oktober 2002 bis Juni 2003), als die vorläufige
Untersuchung bereits abgeschlossen war. Aufgrund der Problematik eine
ausreichende Anzahl polymorpher Marker für diese Rückkreuzung zu finden, die für
53
eine Feinkartierung unabdingbar sind (Kapitel 3.4.1), wurden diese Gewebeproben
zunächst einmal für mögliche Nachfolgeuntersuchungen (Kapitel 5.5) zurückgestellt.
3.4.1 Auswahl geeigneter anonymer Mikrosatellitenmarker
Herangezogen wurden Mikrosatellitenmarker, die in der Internet-Datenbank „Rat
Genome Database“ (www.rgd.mcw.edu) samt der für die PCR-Amplifikation
benötigten entsprechenden Primer-Sequenzen für die 20 Autosomen der Ratte
beschrieben sind.
Im Falle der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2 Rückkreuzung wurden
Mikrosatelliten mit einem durchschnittlichen Markerabstand von 25 cM ausgewählt.
Als Orientierung dienten hierbei beschriebene Polymorphismen von mindestens 5 bp
für die Stämme LEW/Pit und BN/Cup, die am Ztm mit Hilfe der DNA einer LEW/Ztm-
ci2 und einer BN/Ztm Ratte überprüft wurden (Kapitel 3.4.2).
Bei der Auswahl von Mikrosatelliten für die Untersuchung der (BN/Ztm x BH.7A/Ztm-
ci3)F1 x BH.7A/Ztm-ci3 Rückkreuzung konnte nicht auf durch „Rat Genome
Database“ beschriebene Polymorphismen zwischen den Stämmen BN und BH
zurückgegriffen werden, da der Stamm BH nicht in dem Untersuchungspanel der
Datenbank enthalten ist. Entsprechend mussten sämtliche eingesetzten Marker am
Ztm auf Polymorphismen zwischen den Stämmen BH.7A/Ztm-ci3 und BN/Ztm
untersucht werden (Kapitel 3.4.2), wobei sich ein Großteil (über 70 %) als nicht
polymorph erwies.
Folglich wurde bei der Untersuchung der (BN/Ztm x BH.7A/Ztm-ci3)F1 x BH.7A/Ztm-
ci3 Rückkreuzung für jedes Autosom zunächst ein möglichst zentral lokalisierter
Mikrosatellitenmarker herangezogen. Mit Hilfe dieser im Vergleich zu der
Untersuchung der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2 Rückkreuzung weniger
detaillierten Analyse, sollte im Sinne eines vorläufigen und groben Übersichts- bzw.
„Screening“-Verfahrens das Chromosom identifiziert werden, auf welchem die ci3-
Mutation lokalisiert ist.
54
Nach Bestimmung der entsprechenden Chromosomen wurde in beiden Fällen zur
Eingrenzung der Kandidatenregion (ci3-Mutation) bzw. Feinkartierung der Mutation
(ci2-Mutation) die Anzahl der anonymen Mikrosatelliten erhöht.
Die zur Amplifikation der Mikrosatelliten benötigten Primer wurden als Lyophilisat von
der Firma Roth bezogen und nach Herstellerangaben mit sterilem Aqua dest.
rekonstituiert. Es wurden 100 µl Aliquots 6,7 mM Primerlösungen hergestellt und bei
4 °C gelagert.
3.4.2 Untersuchung der Mikrosatellitenmarker auf Polymorphismen
Alle für die Kopplungsanalysen in Frage kommenden Marker wurden mit Hilfe der
beschriebenen Polymerase-Kettenreaktion- (Kapitel 3.3.3) und Elektrophorese-
Protokolle (Kapitel 3.3.4) und unter Verwendung der DNA der Parentalstämme
LEW/Ztm-ci2 und BN/Ztm bzw. BH.7A/Ztm-ci3 und BN/Ztm sowie der Individuen
beider N2-Populationen auf Polymorphismen getestet.
Ein Marker war für die Analyse geeignet, wenn ein Polymorphismus sowohl zwischen
den jeweiligen Parentalstämmen, als auch bei den N2-Individuen deutlich
differenzierbar war.
55
3.5 Computer- und Datenbank-gestützte genetische Analysen
3.5.1 Identifikation geeigneter funktioneller Kandidatengene
Auf der Suche nach Genen, die ausgelöst durch Veränderungen in der DNA-
Sequenz für die Phänotypen der LEW-ci2 und BH.7A-ci3 Tiere verantwortlich sein
könnten, wurden Informationen aus Genom-Datenbanken der Ratte, des Menschen
und der Maus herangezogen. Nach Ermittlung der zentralen Assoziationsbereiche,
also der genomischen Regionen, die die ci2- bzw. ci3-Muation tragen
(Suszeptibilitätsregionen), wurden diese Regionen des Rattengenoms bzw. die zu
diesen Regionen homologen Bereiche des Menschen- und Mausgenoms auf
geeignete funktionelle Kandidaten untersucht („Comparative Mapping“). Die im
Internet zu Verfügung stehenden und das Genom des Menschen und der Maus
beschreibenden Datenbanken waren insofern hilfreich, als sie deutlich umfangreicher
und vollständiger sind, als die des Rattengenoms (Stand: Mai 2003). Insbesondere
wurde nach Genen gesucht, für die Mutationen beschrieben sind, die zu
Rotationsverhalten (Ratte, Maus), Innenohrdegeneration und Retinopathien führen
können. Ebenso wurde jenen Genen besonderes Augenmerk gewidmet, die für
Faktoren des dopaminergen Systems (z.B. Rezeptoren) kodieren.
Zum Einsatz kam zum einen die Internet Datenbank der „Jackson Laboraties“ (MGI,
www.informatics.jax.org), die genetische Kopplungskarten der Maus und Homologien
zur Ratte beschreibt. Des weiteren standen genetische Kopplungskarten aus den
Datenbanken „Ratmap“ (www.ratmap.gen.gu.se) und „Rat Genome Database“
(www.rgd.mcw.edu) zur Verfügung. Ebenso wurden für die Suche nach
Kandidatengenen die physikalischen und cytogenetischen Karten der Datenbank
„UCSC Genome Bioinformatics“ (genome.ucsc.edu) herangezogen, die das Genom
der Ratte, des Menschen und der Maus beschreiben.
56
3.5.2 Identifikation geeigneter gengekoppelter Mikrosatelliten
Es wurden Mikrosatelliten innerhalb bzw. in direkter Nachbarschaft möglicher
Kandidatengene identifiziert, um die genomische Position dieser Gene und somit ihre
Assoziation mit dem ci2- bzw. ci3-Phänotypen zu ermitteln. Hierzu wurden zunächst
die DNA-Sequenzen der in Frage kommenden Gene über die Internet Datenbank
des „National Center for Biotechnology Information“ (NCBI) (www.ncbi.nlm.nih.gov/)
abgefragt. Anschliessend wurden mittels BLAST (=basic local alignment search tool;
ALTSCHUL et al., 1990) die DNA-Sequenzen von Rattenklonen identifiziert die
Sequenzübereinstimmungen mit diesen Genen aufwiesen.
Bei BLAST handelt es sich um ein Programm, welches in der Lage ist,
Übereinstimmungen zwischen zwei DNA-Sequenzen ausfindig zu machen. Der
Gebrauch sämtlicher nachfolgend erwähnter BLAST-Programme (siehe auch Kapitel
3.5.4 und 3.5.5) erfolgte unter den von NCBI vorgegebenen Standardbedingungen
hinsichtlich der Signifikanz von Sequenzübereinstimmungen (BLAST Search main
parameters; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/newoptions.html). Benutzt wurde
hier das von der NCBI Datenbank angebotene „Blast the Rat Genome“-Programm
(www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/RnBlast.html).
Die Klon-Sequenzen entstammen von Ratten-BAC (= bacterial artificial
chromosome)-Klonen aus dem „CHORI-230 Rat BAC library sequencing” Projekt
(www.chori.org/bacpac/). Sie basieren auf der DNA einer drei Monate alten
weiblichen BN (BN/SsNHsd/MCW) Ratte. Diese Klone repräsentieren in Bakterien
amplifizierte und im Schnitt 250 kb lange Fragmente des Rattengenoms.
Klone, bei denen mittels BLAST Sequenzübereinstimmungen zu den fraglichen
Genen gezeigt werden konnten, entsprechen den Bereichen des Rattengenoms, auf
denen diese Gene lokalisiert sind. Die Sequenz solcher Klone wurde anschließend
auf Mikrosatelliten untersucht, die innerhalb der genomischen Sequenz oder wenige
kb von entsprechenden Genen entfernt auf dem Klon lokalisiert sind. Benutzt wurde
hierbei das Programm „Tandem Repeats Finder“ („Mount Sinai / The Department of
Biomathematical Science“; c3.biomath.mssm.edu/trf.basic.submit.html). Somit
57
konnten Mikrosatelliten mit eindeutiger Kopplung zu den in Frage stehenden
Kandidatengenen ermittelt werden.
3.5.3 Amplifikation der gengekoppelten Mikrosatelliten, Untersuchung
auf SSLPs und Genotypisierung der N2-Individuen
Mit Hilfe des Programms OligoTM4.0 wurden die für die PCR Amplifikation der
gengekoppelten Mikrosatelliten benötigten Primer-Sequenzen identifiziert. Basierend
auf der DNA-Sequenz des entsprechenden Ratten Klons wurden 19-25 bp lange den
gengekoppelten Mikrosatelliten flankierende Primer ermittelt und ihre
Anlagerungstemperatur berechnet. Durch Variation des Abstandes zwischen den
Primern sollte eine Anlagerungstemperatur von 55 bis 60 °C erreicht werden, um
eine ausreichend starke Amplifikation zu erhalten. Mit Hilfe des „Blast the Rat
Genome“-Programms wurde dann untersucht, ob mögliche Kreuzreaktionen mit
anderen Loci im Genom der Ratte zu erwarten waren.
Die entsprechenden Primer wurden als Lyophilisat von der Firma Roth bezogen und
nach Herstellerangaben mit sterilem Aqua dest. rekonstituiert. Es wurden 100 µl
Aliquots 6,7 µM Primerlösungen hergestellt und bei 4 °C gelagert.
Eine Untersuchung der neu identifizierten gengekoppelten Mikrosatelliten auf
Polymorphismen wurde mit Hilfe der oben beschriebenen Polymerase-
Kettenreaktion- (Kapitel 3.3.3) und Elektrophoreseprotokolle (Kapitel 3.3.4) und unter
Verwendung der DNA der Parentalstämme LEW/Ztm-ci2 und BN/Ztm bzw.
BH.7A/Ztm-ci3 und BN/Ztm sowie der N2-Populationen durchgeführt. Zum Einsatz
kamen diejenigen Marker, bei denen ein deutlich sichtbarer SSLP sowohl zwischen
den Parentalstämmen als auch bei den N2-Individuen vorlag.
Anschließend erfolgte bei jedem N2-Individuum für den jeweiligen gengekoppelten
Mikrosatellitenlocus eine Zuordnung der Allele zum LEW-ci2- bzw. BH.7A-ci3- oder
BN-Stamm. Ziel war es, die Assoziation der Mikrosatelliten bzw. der Gene mit den
beiden Phänotypen festzustellen. Ebenso wurde die Kopplung dieser Mikrosatelliten
zu den bereits untersuchten anonymen Mikrosatellitenmarkern untersucht, um eine
58
genetische Kopplungskarte des jeweiligen Chromosoms erstellen und die Position
der einzelnen Marker bzw. Gene ermitteln zu können (Kapitel 3.6.1).
3.5.4 Virtueller Aufbau einer physikalischen Karte der nicht
rekombinanten Region (LEW-ci2)
Nachdem mittels genomweiter Kopplungsanalyse und Feinkartierung die zentrale
Assoziationsregion für den ci2-Phänotypen identifiziert worden war, erfolgte die
Generierung einer physikalischen Karte dieser Region, um die Position weiterer
möglicher Kandidatengene aufzeigen zu können. Ausgehend von den Genen bzw.
ihren genassozierten Mikrosatelliten, die keine Rekombination zum ci2-Phänotypen
mehr zeigten, wurde ein Fragment des Mausgenoms, das die Homologe zu diesen
Rattengenen trägt, von der Datenbank „Ensembl Mouse Genome Server“
(www.ensembl.org/Mus_musculus/exportview) ü b e r n o m m e n . D i e s e 1
Megabasenpaar (Mb) lange DNA-Sequenz des homologen Maus Chromosoms
diente als Gerüst für die physikalische Karte. Zunächst wurden mittels BLAST
(„BLAST the Rat Genome“, NCBI) überlappende Ratten-BAC-Klone („CHORI-230
Rat BAC library sequencing project”) identifiziert, die Sequenzübereinstimmung zu
dem 1 Mb langen Maus Fragment aufwiesen und somit dem zu diesen Fragment
homologen Bereich des Rattengenoms entsprachen. Solch ein aus überlappenden
Klonen entstandener Strang wird als „Contig“ bezeichnet. Zusätzlich erfolgte eine
Verankerung der Rattenklone untereinander durch Sequenzvergleiche ihrer
überlappenden Enden mittels des Programms „BLAST 2 Sequences“ (NCBI
Datenbank; www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html).
Im zweiten Schritt erfolgte ebenfalls mit Hilfe des „BLAST the Rat Genome“
Programms die Identifikation von exprimierten Gensequenzen der Ratte, die sowohl
zu dem Mausgenomfragment, als auch zu den entsprechenden Rattenklonen
Sequenzübereinstimmung aufwiesen. Auf diese Weise sollte die Position dieser
Gene innerhalb der Klone und somit innerhalb des Rattengenoms ermittelt werden.
59
Absch l ießend er fo lg te unter E insatz der NCBI-Programme
„BLAST the Mouse Genome“ (www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/MmBlast.html) und
„BLAST the Human Genome“ (www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq
/page.cgi?F=HsBlast.html&&ORG=Hs) die Identifikation von exprimierten
Gensequenzen des Menschen und der Maus, die ebensfal ls
Sequenzübereinstimmungen zu den untereinander verankerten Ratten-Klonen
aufwiesen. Somit sollten Homologien zwischen den Genomen von Ratte, Mensch
und Maus aufgezeigt werden. Zudem war die Sequenzierung des Rattengenoms
zum Zeitpunkt dieser Untersuchung (Oktober/November 2002) noch nicht
abgeschlossen. Durch den Vergleich mit dem Menschen und der Maus sollten somit
zusätzliche Gensequenzen innerhalb der Klone identifiziert werden, die zwar noch
nicht für die Ratte, wohl aber für den Menschen und/oder die Maus bereits
beschrieben sind.
3.5.5 Nachweis einzelner Exone eines Kanidatengens im Genom der
BH.7A/Ztm-ci3 Ratte
Es sollte geprüft werden, ob ein mögliches Kandidatengen für den ci3-Phänotypen im
Genom der BH.7A-ci3 Ratte nachweisbar ist. Hierzu erfolgte eine Amplifikation
einzelner Exone dieses Gens mittels PCR unter Verwendung der DNA von
BH.7A-ci3 Ratten. Es wurden zunächst Ratten-BAC-Klone („CHORI-230 Rat BAC
library sequencing project”) identifiziert („BLAST the Rat Genome“), welche sowohl
die flankierende Sequenz des Gens als auch dessen Intronregionen und die
exprimierten genomischen Bereiche beinhalteten. Basierend auf der Sequenz
solcher Klone wurden anschließend mit Hilfe des Programms OligoTM4.0 die zur
Amplifikation benötigten Primersequenzen, die jeweils direkt vor bzw. hinter einem
Exon in den dazwischen liegenden Intronbereichen binden ermittelt. Bei der
Ermittlung der optimalen Anlagerungstemperatur und Überprüfung auf
Kreuzreaktionen wurde die in Kapitel 3.5.3 beschriebene Strategie übernommen.
60
Die entsprechenden Primer wurden als Lyophilisat von der Firma Roth bezogen und
wie in Kapitel 3.5.3 beschreiben rekonstituiert und gelagert.
Die PCR-Amplifkation und der anschließende Nachweis der PCR Produkte im
Agarosegel erfolgte gemäß den oben beschriebenen Protokollen (Kapitel 3.3.3 und
3.3.4).
Zusätzlich wurden die Exone auch unter Verwendung von DNA des congenen
Hintergrundstammes BH.7A/Ztm bzw. auch des Inzuchtstammes BH/Ztm mittels
PCR amplifiziert. Diese PCR Produkte dienten als Kontrollen. Aus dem Vergleich der
im 3 %igen Agarosegel zu detektierenden Produktlängen identischer Exone, die
jeweils unter Verwendung von DNA des mutierten Rattenstammes und des
entsprechenden Hintergrundstammes amplifiziert wurden, sollten Rückschlüsse auf
mögliche Deletionen beim mutierten Stamm innerhalb der einzelnen Exone gezogen
werden können.
61
3.6 Statistische Auswertung
3.6.1 Statistische Auswertung der genetischen Analysen
Mit Hilfe des Programms StatViewTM5.0 wurden die bei der Mikrosatellitenmarker-
gestützten Kopplungsanalyse erhobenen Daten ausgewertet. Sämtliche verwendeten
Marker wurden bei den Individuen beider Rückkreuzungspopulationen unter
Verwendung des c2-Tests auf Kopplung zur ci2- bzw. ci3-Mutation untersucht. Dabei
wurden die N2-Individuen in zwei Gruppen, bestehend aus homozygoten und
heterozygoten Merkmalsträgern, aufgeteilt. Da es sich in beiden Fällen um
Rückkreuzungspopulationen handelte, waren pro Markerlocus innerhalb der beiden
Gruppen homozygote LEW-ci2- bzw. BH.7A-ci3- und heterozygote LEW-ci2/BN-
bzw. BH.7A-ci3/BN-Genotypen im Verhältnis 1:1 zu erwarten. Mittels des c2-Tests
wurden die beobachteten Werte auf Abweichungen von dem erwarteten
Verteilungsverhältnis überprüft. Ein Wert von p £ 0,05 galt dabei als ein Hinweis auf
Abweichung vom zu erwarteten Verhältnis. Ein Überwiegen an homozygoten LEW-
ci2- bzw. BH.7A-ci3-Genotypen in der Gruppe der betroffenen N2-Individuen galt
wiederum als Hinweis auf eine Kopplung des Markers zur ci2- bzw. ci3-Mutation.
Diejenigen Mikrosatelliten, die eine Kopplung zur jeweiligen Mutation und somit eine
Assoziation mit dem jeweiligen Phänotyp zeigten, wurden unter Verwendung des
Programms JoinMapTM2.0 zu Kopplungsgruppen zusammen gefaßt. Ziel war es
hierbei eine genetische Kopplungskarte des Merkmal-tragenden Rattenchromosoms
zu erstellen. Berechnet wurde basierend auf der Rekombinationsfrequenz die relative
Entfernung zwischen den einzelnen Mikrosatelliten in cM.
Die graphische Darstellung der Kopplungskarten erfolgte mit Hilfe des Programms
MapChartTM2.0. Die c2-Werte der Mikrosatelliten, die Bestandteil dieser
Kopplungskarten sind, wurden für die graphische Darstellung in „logarithm of the
odds“ (LOD)-Score-Werte umgerechnet (c2-Wert/4,6052; LIU, 1998).
62
3.6.2 Statistische Auswertung der Verhaltensuntersuchungen
Die bei beiden Verhaltensuntersuchungen zur Überprüfung der Sehfähigkeit (Kapitel
3.2.2) ermittelten Daten wurden ebenfalls mit Hilfe des Programms StatViewTM5.0
ausgewertet. Diese Daten wurden einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) mit
dem Faktor „Genotyp“ unterzogen, um signifikante Unterschiede im Verhalten der
nicht betroffenen und der den ci2-Phänotypen aufweisenden N2-Tiere festzustellen.
Ein Wert von p £ 0,05 galt dabei als signifikant.
Bei Feststellung signifikanter Unterschiede wurden die entsprechenden Daten
zusätzlich durch einen posthoc-Test ausgewertet. Dabei handelte es sich um den
Fisher´s PLSD Test. Die mit diesem Test ermittelten möglichen signifikanten
Unterschiede der Gruppe der Ratten mit ci2-Phänotyp gegenüber der Gruppe der
nicht betroffenen Ratten wurden nach folgendem Schlüssel in den Abbildungen in
Kapitel 4.1.3 dargestellt: * = p £ 0,05; ** = p £ 0,01; *** = p £ 0,001.
Alle Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler dargestellt.
63
3.7 Lösungen und Reagenzien
3.7.1 DNA Aufarbeitung
„NucleoSpinTM Tissue kit“ Firma Macherey-Nagel, Düren, Deutschland
bestehend aus:
Pre-Lysispuffer T1
Proteinase K
Lysispuffer B3
1. Waschpuffer BW
2. Waschpuffer B5
Elutionspuffers BE
Ethanol (96%) Firma Merck, Darmstadt, Deutschland
3.7.2 PCR
MgCl2-Lösung, Reaktionspuffer Y, Firma Peqlab Biotechnologie, Erlangen,
dNTP-Gemisch, Deutschland
SAWDAY Taq-DNA-PolymeraseTM
Primer Firma Roth, Karlsruhe, Deutschland
DNA-Standardgrößenmarker Firma Roche, Basel, Schweiz
„DNA Molecular Weight Marker
XIV, 100 base pair lader“
64
3.7.3 Elektrophorese
Agarose „NuSieveTM 3:1" Firma Bio Whittaker Molecular Applications,
Rockland (Me), USA
10 x TBE (pH-Wert 8,3)
bestehend aus:
Tris(hydroxymethyl)- Firma Roth, Karlsruhe, Deutschland
aminomethan (89 mM)
Borsäure (89 mM) Firma Roth, Karlsruhe, Deutschland
EDTA (2 mM) Firma Roth, Karlsruhe, Deutschland
Ethidiumbromidlösung (10 mg/ml) Firma Serva, Heidelberg, Deutschland
„Gel Star“ (10.000fach konzentriert) Firma Biozym, Hessisch Oldendorf,
Deutschland
Ladepuffer Orange G
Bestehend aus:
Glycerin (99 %) Firma Serva, Heidelberg, Deutschland
Orange G Firma Sigma, St.Louis (Mo), USA
Aqua dest. (steril) Eigenproduktion
65
3.8 Geräte und Verbrauchsmaterialien
3.8.1 Geräte
Biofuge „fresco“ Firma Heraeus Instruments, Osterode, Deutschland
Digitalkamera „DC 120 Zoom“ Firma Kodak, Rochester (N.Y.), USA
Elektrophoresekammer Forschungswerkstätten, Medizinische Hochschule
Hannover, Deutschland
Magnetrührer „MR 2002“ Firma Heildolph, Schwabach, Deutschland
Mikrowelle „R-2V16“ Firma Sharp (Europe), Hamburg, Deutschland
Netzgerät „PP2200“ Firma Biometra, Göttingen, Deutschland
Netzgerät „Desatronic“ Firma, Desaga, Heidelberg, Deutschland
Open Field 105 x 40 cm Forschungswerkstätten, Medizinische Hochschule
Hannover, Deutschland
Photometer „GeneQuant II“ Firma Pharmacia Biotech, Cambridge, England
Shuttle-Box „Passive Firma TSE-Systems, Bad Homburg, Deutschland
Avoidence System“
Thermocycler „PTC-200“ Firma MJ Research, Watertown (Ma), USA
Thermomixer „5436“ Firma Eppendorf-Nethler-Hinz, Hamburg,
Deutschland
UV-Transilluminator 312 nm Firma Bachofer, Reutlingen, Deutschland
Vortex „Vibrofix VF1“ Firma Janke & Kunkel, Staufen, Deutschland
66
3.8.2 Verbrauchsmaterialien
Pipetten Firma Eppendorf, Köln, Deutschland
Firma Gilson, Middelton (Wi), USA
Pipetenspitzen Firma Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland
Firma Roth, Karlsruhe, Deutschland
Reaktionsgefäße Firma Eppendorf, Köln, Deutschland
Silicium-Gelmembran-Säulen Firma Macherey-Nagel, Düren, Deutschland
Silikonmatten „Thermosprint" Firma Bilatec, Mannheim, Deutschland
96er-Mikrotiterplatten Firma Roth, Karlsruhe, Deutschland
„Multi-Rigid Ultra Plates“
3.9 Statistik- und Genetik-Programme
JoinMapTM2.0 Anbieter: Centre for Plant Breeding and
Reproduction Research (CPRO-DLO),
Wageningen, Holland
MapChartTM2.0 Anbieter: CPRO-DLO, Wageningen, Holland
OligoTM4.0 Anbieter: Molecular Biology Insights, Cascade (Co),
USA
StatViewTM5.0 Anbieter: SAS Institute, Cary (NC), USA
67
3.10 World-Wide-Web Adressen
http://www.rgd.mcw.edu (Rat Genome Database)
http://www.informatics.jax.org (Jackson Laboratories Mouse Genome Informatics)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (National Center for Biotechnology Information)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html (NCBI Blast 2 Sequences)
http://www.ratmap.gen.gu.se (Ratmap)
http://c3.biomath.mssm.edu/trf.basic.submit.html (Tandem Repeats Finder)
http://www.ensembl.org/Mus_musculus/exportview(Ensembl Mouse Genome Server)
http://genome.ucsc.edu/ (UCSC Genome Bioinformatics)
http:// www.chori.org/bacpac/ (BACPAC Resources)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/RnBlast.html (NCBI Rat Genome Blast)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/MmBlast.html (NCBI Mouse Genome Blast)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/page.cgi?F=HsBlast.html&&ORG=Hs
(NCBI Human Genome Blast)
http://www.well.ox.ac.uk/~bihoreau/ (Genetic Linkage Maps of the Rat Genome
(1997))
68
4. Ergebnisse
4.1 Neurophysiologische Verhaltensuntersuchungen
4.1.1 Untersuchung des Rotationsverhaltens
Es wurden sämtliche im Verlauf dieser Arbeit gezüchteten Individuen der (LEW/Ztm-
ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2 Rückkreuzung (n=55) untersucht. Die Tiere waren
zum Zeitpunkt der Untersuchung zwischen 6 und 10 Wochen alt.
Bei der Untersuchung sowohl im gewohnten Heimatkäfig, als auch in der „Open
Field“-Apparatur zeigten 26 der N2-Tiere das für die ci2-Mutation charakteristische
Rotationsmuster (anfallsartige, wiederholte, enge Rotationen). Bei den restlichen 29
N2-Ratten konnte solch ein Verhalten weder im Heimatkäfig, noch im „Open Field“
registriert werden (Anhang Tabelle 9).
Ebenso wurden sämtliche im Verlauf dieser Arbeit gezüchteten Individuen der
(BN/Ztm x BH.7A/Ztm-ci3)F1 x BH.7A/Ztm-ci3 Rückkreuzung (n=154) untersucht. Die
Tiere waren zum Zeitpunkt der Untersuchung zwischen 4 und 8 Wochen alt.
Bei der Untersuchung sowohl im gewohnten Heimatkäfig als auch in der „Open Field“
Apparatur zeigten 73 der N2-Tiere das für die ci3-Mutation charakteristische
Rotationsmuster (anfallsartige, wiederholte, enge Rotationen). Bei den restlichen 81
N2-Ratten konnte solch ein Verhalten weder im Käfig noch im „Open Field“ registriert
werden (Anhang Tabelle 10).
69
4.1.2 Untersuchung des auditiven und vestibulären Systems der
(LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2 Ratten
Die 55 N2-Individuen waren zum Zeitpunkt der folgenden Untersuchungen (Kapitel
4.1.2.1 bis 4.1.2.4) zwischen 6 und 10 Wochen alt.
4.1.2.1 Akustischer Stimulus
Die 29 Tiere ohne Rotationsverhalten zeigten alle eine Schreckreaktion auf einen
akustischen Stimulus hin, während solch eine Reaktion bei den übrigen 26 Tieren
auch bei wiederholtem Stimulus nicht auszulösen war (Anhang Tabelle 9).
4.1.2.2 „Air-Righting”-Test
Beim „Air-Righting“-Test landeten alle 29 Tiere, die kein Rotationsverhalten
aufwiesen, bei mindestens zwei von drei Versuchen auf ihren Gliedmaßen. Die
übrigen 26 Ratten besaßen bei allen drei Versuchen nicht die Fähigkeit, sich auf der
kurzen Fallstrecke so zu drehen, dass sie auf den Gliedmaßen landeten (Anhang
Tabelle 9).
4.1.2.3 „Balance“-Test
Ein ähnliches Bild ergab sich beim „Balance“-Test. Alle 29 Ratten, die kein
Rotationsverhalten zeigten, besaßen die Fähigkeit, mit ausgestreckten Gliedmaßen
die Bewegungen des Käfigs auszugleichen. Die Tiere, die Rotationsverhalten
aufwiesen, waren dazu nicht in der Lage (Anhang Tabelle 9).
70
4.1.2.4 Schwimmtest
Auch beim Schwimmtest konnte bei den N2-Tieren ohne Rotationsverhalten keine
Beeinträchtigung festgestellt werden. Alle 29 Ratten waren in der Lage, sich durch
Schwimmbewegungen während des Untersuchungszeitraums von fünf Minuten über
Wasser zu halten. Die übrigen 26 Tiere zeigten deutliche Einschränkungen in ihrer
Schwimmfähigkeit. Fünfundzwanzig dieser Ratten begannen direkt, nachdem sie ins
Wasser verbracht worden waren mit Rotationsbewegungen um die eigene
Längsachse und tauchten korkenzieherförmig ab, so dass eine sofortige Entnahme
aus dem Wasserbecken zwingend erforderlich war. Bei einem N2-Tier mit
Rotationsverhalten war eine Abweichung feststellbar. Diese Ratte begann zwar auch
mit Rotationen um die Längsachse unmittelbar nach Verbringung in das
Wasserbecken. Nachdem sie jedoch einmal abgetaucht war, kam sie wieder an die
Wasseroberfläche und war in der Lage, sich mühsam und kurzfristig mit kreiselnden
und rotierenden Schwimmbewegungen an der Wasseroberfläche zu halten. Da das
Tier jedoch immer wieder zwischendurch abtauchte, wurde die Beobachtung nach 30
Sekunden abgebrochen.
Daraufhin wurden die N2-Tiere mit Rotationsverhalten nach ca. sechs Wochen
wiederholt diesem Schwimmtest unterzogen. Hierbei zeigten fünf weitere Ratten
diese zuvor nur bei einem Tier beobachtete Form der partiellen Schwimmfähigkeit
(Anhang Tabelle 9).
71
4.1.3 Überprüfung der Sehfähigkeit der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1x
LEW/Ztm-ci2 Ratten
Die N2-Individuen waren zum Zeitpunkt der folgenden Untersuchungen (Kapitel
4.1.3.1 und 4.1.3.2) zwischen 3 und 5 Monate alt.
4.1.3.1 Verhalten der Tiere an einer sichtbaren Kante (modifizierter
„Visual-Cliff“-Test)
Es wurde das Verhalten der 55 im Verlauf dieser Arbeit gezüchteten N2-Individuen
bei der Positionierung auf einem Rundhocker untersucht. Dabei handelte es sich um
26 Tiere, die den ci2-Phänotypen (Rotationsverhalten; Defizite in der Funktion des
vestibulären Systems) aufwiesen, und 29 Tiere, die bei den vorherigen
Untersuchungen (Kapitel 4.1.1 und 4.1.2) keine Verhaltensaufälligkeiten besaßen.
Bei allen vier ausgewerteten Parametern ließen sich signifikante Unterschiede im
Verhalten beider Gruppen feststellen.
Zunächst wurde die Latenzzeit für die Verhaltensweise „Head Dipping“ protokolliert.
Hierbei zeigten die 29 N2-Individuen ohne Rotationsverhalten eine signifikant kürzere
Latenzzeit.
Zwanzig der insgesamt 26 N2-Individuen, die den ci2-Phänotypen aufwiesen,
stürzten zwischen ein- und fünfmal an der Hockerkante. Nur eines der 29 nicht
betroffenen Tiere stürzte einmalig.
Des Weiteren blickten die 29 nicht betroffenen N2-Tiere signifikant häufiger an der
Kante des Hockers stehend von dieser auf den Boden und die Umgebung herab
(„Head Dipping“-Verhalten).
Die Anzahl abgesetzter Kot-Boli war bei den 26 N2-Individuen, die den ci2-
Phänotypen aufwiesen, größer, als bei den 29 nicht betroffenen Individuen.
72
Die einfaktorielle Varianazanalyse ergab eine signifikant längere Latenzzeit der
Ratten, die den ci2-Phänotypen aufwiesen bis zum Verhalten „Head Dipping“ (F(1,
53)=11,28; p=0,002; Abb.1).
Abb1: Latenzzeit bis zum Erreichen der sichtbaren Kante im modifizierten
„Visual-Cliff“-Test
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Sekunden
nicht betroffen ci2-Phänotyp
**
73
Zwanzig der 26 betroffenen N2-Ratten stürzten zwischen ein- und fünfmal. Diese
Stürze ergaben sich zum einen daraus, dass die Tiere von der Mitte der Sitzfläche
aus auf die Kante des Hockers zu liefen und ohne abzubremsen über diese
hinwegtraten. Zum anderen zeigten sie ein besonders tiefes Eintauchen des Kopfes
über die Kante hinweg („Head Dipping“), welches anschließend zum Sturz führte.
Nur ein Tier aus der Gruppe der nicht betroffenen N2-Ratten stürzte einmalig bei
dem Versuch sich direkt an der Kante umzudrehen, wobei es den Halt mit den
hinteren Extremitäten verlor. Die einfaktorielle Varianzanalyse ergab für diesen
Parameter einen signifikanten Unterschied zwischen den Tieren mit ci2-Phänotyp
und den nicht betroffenen Ratten (F(1, 53)=35,76; p<0,0001; Abb.2).
Abb.2: Anzahl der Stürze im modifizierten „Visual-Cliff“-Test
0
0,25
0,5
0,75
1
1,25
1,5
1,75
2
2,25
Stürze
nicht betroffen ci2-Phänotyp
***
74
Die einfaktorielle Varianzanalyse ergab eine signifikant höhere Frequenz der
Verhaltensweise „Head Dipping“ bei den nicht betroffenen N2-Tieren (F(1, 53)=15,3;
p=0,0003; Abb.3).
Abb.3: Häufigkeit des „Head Dipping“-Verhaltens im modifizierten „Visual-Cliff“-
Test
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Head D
ippingnicht betroffen ci2-Phänotyp
***
75
Die einfaktorielle Varianzanalyse ergab für den Parameter „Kot-Boli“ einen
signifikanten Unterschied zwischen den Tieren mit ci2-Phänotyp und den nicht
betroffenen Ratten (F(1, 53)=6,47; p=0,01; Abb.4).
Abb.4: Anzahl der abgesetzten Kot-Boli im modifizierten „Visual-Cliff“-Test
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8 Kot -B
olinicht betroffen ci2-Phänotyp
*
76
4.1.3.2 Hell-Dunkel-Transfer-Test
Diese Untersuchung wurde lediglich mit jeweils 10 N2-Individuen, die den ci2-
Phänotypen aufwiesen und 10 nicht betroffenen N2-Individuen durchgeführt, um die
Hinweise aus dem vorherigen Test (Kapitel 4.1.3.1) zu prüfen. Hierbei wurden
signifikante Unterschiede hinsichtlich der Latenzzeit bis zum Übergang in das dunkle
Kompartiment und dem Parameter „Eintauchen des Kopfes in das dunkle
Kompartiment“ festgestellt.
Die einfaktorielle Varianzanalyse ergab eine signifikant längere Latenzzeit der 10
Ratten, die den ci2-Phänotypen aufwiesen, bis zum Übergang in das dunkle
Kompartiment (F(1, 8)=7,23; p=0,015; Abb.5).
Abb.5: Latenzzeit während des Hell-Dunkel-Transfer-Tests
0
20
40
60
80
100
120
140 S
ekunden
nicht betroffen ci2-Phänotyp
*160
77
Nur die N2-Tiere, die den ci2-Phänotypen aufwiesen, zeigten ein Eintauchen des
Kopfes in das dunkle Kompartiment, ohne dieses im Anschluss zu betreten. Die
einfaktorielle Varianzanalyse ergab für diesen Parameter einen signifikanten
Unterschied zwischen den Tieren mit ci2-Phänotyp und den nicht betroffenen Ratten
(F(1, 8)=9,85: p=0,006; Abb.6).
Abb.6: Anzahl der Eintauchvorgänge in das dunkle Kompartiment während des
Hell-Dunkel-Transfer-Tests
0
0,25
0,5
0,75
1
1,25
1,5
1,75
2
2,25
2,5
Eintauchen
nicht betroffen ci2-Phänotyp
**
78
Die einfaktorielle Varianzanalyse ergab für den Parameter „Kot-Boli“ keinen
signifikanten Unterschied zwischen den Tieren mit ci2-Phänotyp und den nicht
betroffenen Ratten (F(1, 8)=2,67; 0,1198; Abb.7).
Abb.7: Anzahl der abgesetzten Kot-Boli während des Hell-Dunkel-Transfer-
Tests
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
Kot-B
oli
nicht betroffen ci2-Phänotyp
79
4.2 Mikrosatellitenmarker-gestützte Kopplungsanalyse
Von den 208 Ratten der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2 Rückkreuzung,
die für die Kopplungsanalyse zur Verfügung standen, zeigten 94 die phänotypischen
Charakteristika der ci2-Mutation.
Neunundfünfzig der vorab gezüchteten 125 Ratten der (BN/Ztm x BH.7A/Ztm-ci3)F1
x BH.7A/Ztm-ci3 Rückkreuzung, die für die Kopplungsanalyse eingesetzt wurden,
wiesen den ci3-Phänotypen auf.
Somit lag die Inzidenz bezüglich des ci2-Phänotypen bei 45,2 % und bezüglich des
ci3-Phänotypen bei 46,8 %.
4.2.1 Anonyme Mikrosatellitenmarker und Assoziation mit den
Phänotypen
Die DNA der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2 Tiere wurde insgesamt mit
86 anonymen und für diese Kreuzung polymorphen Mikrosatellitenmarkern
untersucht (Tabelle 2 und Anhang Tabelle 11). Im Falle der (BN/Ztm x BH.7A/Ztm-
ci3)F1 x BH.7A/Ztm-ci3 Rückkreuzung kamen 32 anonyme und für diese Population
polymorphe Marker zum Einsatz (Tabelle 3 und Anhang Tabelle 12).
(LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2:
Die Auswertung der erhobenen Daten mit dem c2-Tests ergab insgesamt keine
signifikanten p-Werte für die auf den Rattenchromosomen (RNO) 1 bis 9 und 11 bis
20 lokalisierten Marker mit Ausnahme der Marker D1Mit2, D4Mgh3, D8Mit7,
D19Mgh2 und D19Rat17. Für diese Marker wurde ein signifikanter p-Wert (p£0,05)
ermittelt (Anhang Tabelle 11).
Im Gegensatz zu D1Mit2, D4Mgh3 und D8Mit7 zeigten sämtliche übrigen Marker auf
den Chromosomen 1, 4 und 8 keine signifikanten Abweichungen von dem zu
erwarteten Genotypenverhältnis (1:1).
80
Die bei den Markern D19Mgh2 und D19Rat17 festgestellte signifikante Abweichung
ergab sich daraus, dass bei diesen Markern eine größere Anzahl an heterozygoten
LEW-ci2/BN-Genotypen in der Gruppe der den ci2-Phänotypen aufweisenden
Individuen vorlag.
Für sämtliche 18 auf RNO10 lokalisierten Mikrosatellitenmarker konnte eine
signifikante Abweichung (p<0,0001; Ausnahme: D10Rat218; p=0.0144) vom zu
erwarteten Genotypenverhältnis mittels c2-Tests errechnet werden. Es zeigte sich ein
stetiger Anstieg der c2-Werte bzw. LOD-Score-Werte zum zentralen Bereich des
Chromosoms hin. Der Marker D10Rat164 zeigte dabei die stärkste Assoziation mit
dem ci2-Phänotypen („Peak Marker“). An diesem Locus rekombinierten vier der 94
den ci2-Phänotypen aufweisenden N2-Individuen (Tabelle 2 und Anhang Tabelle 14).
Die in Tabelle 2 beschriebenen Lokalisationen der RNO10 Mikrosatellitenmarker sind
mit Hilfe des Programms JoinMapTM2.0 errechnet worden.
Tabelle 2: Untersuchte Mikrosatellitenmarker auf dem Rattenchromosom 10
SSLP-Marker c2-Wert p-Wert Chromosom Lokalisation in cM
D10Rat218 5,988 0,0144 RNO10 0D10Rat47 18,294 < 0,0001 RNO10 5,1D10Rat45 24,092 < 0,0001 RNO10 13,3D10Mgh10 96,702 < 0,0001 RNO10 32,5D10Rat168 90,906 < 0,0001 RNO10 35,2D10Rat171 106,502 < 0,0001 RNO10 38,7D10Rat164 121,149 < 0,0001 RNO10 41,2D10Rat166 116,041 < 0,0001 RNO10 42,1D10Rat126 119,605 < 0,0001 RNO10 42,1D10Rat32 116,044 < 0,0001 RNO10 47,8
D10Rat116 113,266 < 0,0001 RNO10 48,8D10Rat31 104,292 < 0,0001 RNO10 50,1D10Mgh6 111,768 < 0,0001 RNO10 53,5D10Mit2 93,264 < 0,0001 RNO10 55,7
D10Rat26 85,076 < 0,0001 RNO10 59D10Ppy 46,133 < 0,0001 RNO10 75,2
D10Mgh4 23,768 < 0,0001 RNO10 85,1
81
(BN/Ztm x BH.7A/Ztm-ci3)F1 x BH.7A/Ztm-ci3:
Die Auswertung der erhobenen Daten mit dem c2-Test ergab insgesamt keine
Hinweise auf Kopplung zu der ci3-Mutation für die auf den Chromosomen 1 bis 10
und 12 bis 20 lokalisierten Marker. Sämtliche auf diesen Chromosomen untersuchten
Marker zeigten keine signifikanten Abweichungen von dem zu erwarteten
Genotypenverhältnis (1:1) (Anhang Tabelle 12).
Von 21 untersuchten RNO11-Markern erwiesen sich 12 als polymorph für die
eingesetzte Rückkreuzung. Für sämtliche dieser 12 Mikrosatellitenmarker konnte
eine signifikante Abweichung (p<0,0001; Ausnahme: D11Wox6, p=0.0019) von dem
zu erwarteten Genotypenverhältnis mittels c2-Tests errechnet werden. Der Marker
D11Rat67 zeigte dabei die stärkste Assoziation mit dem ci3-Phänotypen („Peak
Marker“). An diesem Locus rekombinierten fünf der 59 den ci3-Phänotypen
aufweisenden N2-Individuen (Tabelle 3 und Anhang Tabelle 15).
Die in Tabelle 3 beschriebenen Lokalisationen der RNO11 Mikrosatellitenmarker sind
mit Hilfe des Programms JoinMapTM2.0 errechnet worden.
Tabelle 3: Untersuchte Mikrosatellitenmarker auf dem Rattenchromosom 11
SSLP-Marker c2-Wert p-Wert Chromosom Lokalisation in cM
D11Rat28 35,967 < 0,0001 RNO11 0D11Rat27 38,272 < 0,0001 RNO11 2,4D11Mit4 52,705 < 0,0001 RNO11 10,2
D11Rat24 47,53 < 0,0001 RNO11 14,1D11Rat67 57,234 < 0,0001 RNO11 18,8D11Rat10 54,075 < 0,0001 RNO11 20,1D11Rat65 37,078 < 0,0001 RNO11 27,7D11Mgh4 44,661 < 0,0001 RNO11 29,8D11Rat93 34,718 < 0,0001 RNO11 33,1D11Mgh3 31,582 < 0,0001 RNO11 33,9D11Rat56 19,796 < 0,0001 RNO11 42,7D11Wox6 9,598 0,0019 RNO11 53,9
82
4.3 Computer- und Datenbank-gestützte genetische Analysen
4.3.1 Identifikation geeigneter funktioneller Kandidatengene
Eine vergleichende Betrachtung des Ratten-, Menschen- und Mausgenoms
(„Comparative Mapping“) wurde anhand der Datenbank der „Jackson Laboratories“
(MGI) und der „UCSC Genome Bioinformatics“ Datenbank vorgenommen.
Kandidatengene für die LEW-ci2 Ratte:
Die zentrale Assoziationsregion mit dem ci2-Phänotypen auf RNO10, markiert durch
D10Rat164, weist homologe Regionen auf dem Chromosom 17 des Menschen
(HSA17) und dem Chromosom 11 der Maus (MMU11) auf (MGI). Als
Kandidatengene für die taubblinde LEW-ci2 Ratte kam aufgrund seiner Funktion und
der beschriebenen Mutationen (Kapitel 2.4.1) insbesondere Myo15 sowie ein
weiteres für ein unkonventionelles Myosin kodierendes Gen (Myo1c; Synonym:
Myr4) in Betracht. Laut MGI sind diese beiden Gene bei 33,9 cM (Myo15) und 44,13
cM (Myo1c) auf MMU11 lokalisiert. Die homologen Gene des Menschen kartieren
gemäß der „UCSC Genome Bioinformatics“ Datenbank bei 17p11.2 (MYO15A) und
17p13.3 (MYO1C) auf HSA17.
Kandidatengene für die BH.7A-ci3 Ratte:
Die zentrale Assoziationsregion mit dem ci3-Phänotypen auf RNO11, markiert durch
D11Rat67, besitzt ihre homologen Regionen auf HSA3 und MMU16 (MGI). Aufgrund
seiner Lokalisation auf MMU16 (von bp 45 833 129 bis bp 45 846 531; „UCSC
Genome Bioinformatics“) und Funktion (Kapitel 5.2.2.1.1) kam das Gen Tagln3,
welches für das Neuroprotein Transgelin 3 kodiert, als Kandidatengen für den ci3-
Phänotypen in Betracht.
83
Nach Angaben „UCSC Genome Bioinformatics“ Datenbank ist das Drd3 Gen auf
RNO11 mit einem Abstand von ca. 5 Mb zu D11Rat67 lokalisiert. Dieses Gen kodiert
für den Dopamin D3-Rezeptor (Kapitel 2.4.3) und ist somit ein mögliches
Kandidatengen für die BH.7A-ci3 Ratte, bei der Abnormitäten im dopaminergen
Systems nachgewiesen worden waren (Kapitel 2.2).
4.3.2 Identifikation geeigneter gengekoppelter Mikrosatelliten
Mikrosatelliten für die Kandidatengene der LEW-ci2 Ratte:
Es wurde nach gengekoppelten Mikrosatelliten für die Kandidatengene Myo1c und
Myo15 gesucht. Des Weiteren sollten gengekoppelte Mikrosatelliten für die in
direkter Nachbarschaft zu Myo15 lokalisierten Gene Znf179 und Aldh3a1 identifiziert
werden (Zfp179: 34,35 cM; Aldh3a1 34,25 cM; Genetische Kopplungskarte von
MMU11; MGI). Diese sollten zur Absicherung der Position von Myo15 mitkartiert
werden.
Die von der Maus bekannte cDNA-Sequenz von Myo15 (NM_010862; PROBST et
al., 1998; LIANG et al., 1999) wurde für die Untersuchung benutzt, da die Sequenz
der Ratte noch nicht beschrieben ist (Stand Mai 2003). Mittels BLAST wurden
ca. 90 % dieser cDNA-Sequenz auf den Ratten Klonen CH230-5O22/AC129460 und
CH230-38B5/AC120677 wiedergefunden. Die Sequenz beider Klone beinhaltet einen
(AC)20-Mikrosatelliten, der basierend auf dem Vergleich mit dem humanen MYO15A
(UCSC Genome Bioinformatics Datenbank) zwischen Exon 36 und 37 lokalisiert ist.
Der Klon CH230-10J14/AC095925 enthält die für die Ratte beschriebene cDNA-
Sequenz von Znf179 (NM_138613; MATSUDA et al., 1996; INOUE et al., 1997).
Etwa sechs kb stromabwärts dieser cDNA Sequenz konnte ein (AC)170-Mikrosatellit
identifiziert werden.
Die Ratten cDNA-Sequenz von Aldh3a1 (NM_0311972; JONES et al., 1988; ASMAN
et al., 1993) sowie ein (AG)29-Mikrosatellit sind innerhalb der Sequenz des Klons
CH230-6D21/AC094934 vorzufinden. Ein Vergleich mit dem humanen ALDH3A1
84
(„UCSC Genome Bioinformatics“) erbrachte, dass dieser Mikrosatellit zwischen Exon
sechs und sieben des Gens lokalisiert ist. Mit einem physikalischen Abstand von ca.
29 kb zu Aldh3a1 konnte auch die Ratten-Sequenz von Aldh3a2 (NM_031731;
MIYAUCHI et al., 1991) auf diesem Klon identifiziert werden.
Die Sequenz des Klons CH230-256G19/AC111613 beinhaltet die Ratten cDNA-
Sequenz von Myo1c (Synonym: Myr4; NM_012983; BAHLER et al., 1994). Ebenso
sind zwei hintereinander lokalisierte Mikrosatelliten ((CT)30, (CA)20) auf diesem Klon
detektierbar. Der physikalische Abstand zwischen diesen Mikrosatelliten und der
Sequenz des Gens beträgt ca. 7 kb.
Mikrosatelliten für die Kandidatengene der BH.7A-ci3 Ratte:
Mikrosatelliten innerhalb der Sequenz der beiden möglichen Kandidatengene Tagln3
und Drd3 sollten identifiziert werden. Des Weiteren wurde nach einem Mikrosatelliten
innerhalb der Sequenz von Morc (33,7 cM; Genetische Kopplungskarte von MMU16;
MGI), einem Nachbargen von Tagln3, gesucht. Dieses sollte zur Absicherung der
Position von Tagln3 mitkartiert werden.
Die cDNA-Sequenz von Tagln3 (NM_031676; FAN et al., 2001) wurde innerhalb der
Sequenz des BAC-Klons CH230-225H18/AC109930 wiedergefunden. Zwischen dem
ersten und zweiten Exon dieses Gens wurde ein (AC)25-Mikrosatellit identifiziert.
Bei dem Gen Morc (XM_221483) handelt es sich um eine aus dem NCBI „Contig“
NW_042731 vorhergesagte Modell-cDNA-Sequenz die als „Similar to Morc Mus
musculus“ bezeichnet wird. Diese Sequenz wurde auf dem Ratten-Klon CH230-
230P11/AC106331 wiedergefunden. Zwischen dem 17. und 18. Exon dieses Gens
ist ein (GT)41-Mikrosatellit auf dem Klon lokalisiert.
Insgesamt wurden 13 Mikrosatelliten identifiziert, welche auf 4 verschiedenen
Ratten-Klonen (Anhang Tabelle 11) lokalisiert sind, die gemäß der „UCSC Genome
Bioinformatics“ Datenbank entweder die Sequenz von Drd3 (NM_017140; SNYDER
et al., 1991) beinhalten oder die unmittelbar benachbarte genomische Sequenz von
RNO11 zu diesem Gen repräsentieren.
85
4.3.3 Amplifikation der genassozierten Mikrosatelliten, Untersuchung
auf SSLPs und Genotypisierung der N2-Ratten
LEW-ci2:
Für alle vier identifizierten gengekoppelten Mikrosatelliten wurden entsprechende
Primerpaare mit einer Anlagerungstemperatur von 56 bis 58 °C ermittelt (Tabelle 4).
Tabelle 4: PCR- und Gelelektrophoresedaten der gengekoppelten Mikrosatelliten
auf RNO10
Locus Primer sequenzen Repetitive Errechnete OptimaleSymbol (5/ fi 3/) Sequenz Produkt- Anlagerungs-
größe temperatur
D10Ztm1 f:GCC TGG GAA TAG AC 135 bp 58 °C(Myo15) GTG ACC ATG GTG
r:CCT TCA TCC ACAGGC AGG CTG TTT
D10Ztm2 f:TGG ATT TGC TGG AC 471 bp 57 °C(Znf179) CCT GCC AGT CTA T
r:CTT CAT GGC CTCAGG ATC ACT TGC C
D10Ztm3 f:CCA GAA TTT GGT CT; CA 284 bp 56 °C(Myo1c) AGG TGG AGG CAG
GAr:GAG CCG GGA GCCTCT GCC TGC TAGGC
D10Ztm4 f:AAA GTG TTT ATC AC; AG 315 bp 56 °C(Aldh3a1) TGG GGG AAG GGC C
r:AGG GAC CTA GCA ACA CCT TAA GTC A
86
Die als D10Ztm1 (Myo15), D10Ztm2 (Znf179), D10Ztm3 (Myo1c) und D10Ztm4
(Aldh3a1) bezeichneten Mikrosatelliten wiesen deutlich detektierbare SSLPs sowohl
zwischen den Parentalstämmen, als auch bei den N2-Tieren auf.
Nach anschließender Genotypisierung der N2-Tiere konnte für diese vier Marker eine
signifikante Abweichung (p<0,0001) von dem zu erwarteten Genotypenverhältnis
mittels c2-Test errechnet und somit ein signifikanter Hinweis auf Kopplung zu der ci2-
Mutation bestimmt werden. D10Ztm1 (Myo15), D10Ztm2 (Znf179) und D10Ztm4
(Aldh3a1) wiesen dabei eine stärkere Assoziation mit dem ci2-Phänotypen als der
anonyme „Peak Marker“ D10Rat164 auf. An diesen Loci rekombinierte keines der 94
den ci2-Phänotypen aufweisenden N2-Individuen. D10Ztm3 (Myo1c) zeigte dagegen
eine deutlich schwächere Assoziation als die drei übrigen Loci. An diesem Locus
rekombinierten 15 der 94 den ci2-Phänotypen aufweisenden N2-Individuen (Tabelle
5 und Anhang Tabelle 14).
Tabelle 5: Untersuchte gengekoppelte Marker auf RNO10
SSLP-Marker c2-Wert p-Wert Chromosom Lokalisation in cM
D10Ztm1 (Myo15) 130,812 < 0,0001 RNO10 43,5D10Ztm4 (Aldh3a1) 132,457 < 0,0001 RNO10 43,5D10Ztm2 (Znf179) 133,396 < 0,0001 RNO10 43,5D10Ztm3 (Myo1c) 70,88 < 0,0001 RNO10 64,1
Es erfolgte eine Bestimmung der Rekombinationsfrequenzen zwischen den 17
anonymen auf RNO10 untersuchten Mikrosatelliten (Tabelle 2) und den vier
gengekoppelten Markern (Tabelle 5). Basierend hierauf wurde eine genetische
Kopplungskarte des Rattenchromosoms 10 erstellt und somit die Position der vier
gengekoppelten Mikrosatelliten bestimmt. Diese Karte beschreibt die Position von
D10Ztm1 (Myo15), D10Ztm2 (Znf179) und D10Ztm4 (Aldh3a1) bei 43,5 cM.
D10Ztm3 (Myo1c) kartiert bei 64,1 cM (Abb. 8). Für die Darstellung der Assoziation
des jeweiligen Mikrosatelliten Markers zu dem ci2-Phänotypen in Abb. 8 wurden die
einzelnen c2-Werte in LOD-Score-Werte umgerechnet.
87
Abb. 8: Genetische Kopplungskarte von RNO10 einschließlich der Assoziation
der Mikrosatelliten mit dem ci2-Phänotypen in LOD-Score-Werten
Grauer Balken = nicht rekombinante Region
LOD-Score
cM 0.0
5.1
13.3
32.535.238.741.242.142.143.543.543.547.848.850.153.555.759.064.1
75.2
85.1
D10Rat218 10 20
D10Rat47
D10Rat45
D10Mgh10D10Rat168D10Rat171D10Rat164D10Rat166D10Rat126D10Ztm1(Myo15)D10Ztm4(Aldh3a1)D10Ztm2(Znf179)D10Rat32D10Rat116D10Rat31D10Mgh6D10Mit2D10Rat26D10Ztm3(Myo1c)
D10Ppy
D10Mgh4
88
BH.7A-ci3:
Für alle 15 identifizierten gengekoppelten Mikrosatelliten wurden entsprechende
Primerpaare mit einer Anlagerungstemperatur von 53 bis 62 °C ermittelt (Tabelle 6
und Anhang Tabelle 13).
Tabelle 6: PCR- und Gelelektrophoresedaten der gengekoppelten Mikrosatelliten
für Morc und Tagln3
Locus Primer sequenzen Repetitive Errechnete OptimaleSymbol (5/ fi 3/) Sequenz Produkt- Anlagerungs-
größe temperatur
D11Ztm1 f:TGC CGC CCT CCC GC 345 bp 54 °C(Morc) CCC ATA GAC TAG T
r:GGA ACG TCA GCATCA CAC CCT CGA T
D11Ztm2 f:TCA GTG GTC CTG AC 337 bp 59 °C(Tagln3) ACG CCA TAG ACC TC
r:TCC GGT TGC AAGATA GCT GTG GTC A
Bei sämtlichen 13 mit Drd3 assoziierten Mikrosatelliten (Anhang Tabelle 13) konnten
weder zwischen den Parentalstämmen noch bei den N2-Tieren deutlich detektierbare
SSLPs identifiziert werden.
Die als D11Ztm1 (Morc) und D11Ztm2 (Tagln3) bezeichneten Mikrosatelliten wiesen
deutlich sichtbare SSLPs sowohl zwischen den Parentalstämmen, als auch bei den
N2-Tieren auf.
Nach anschließender Genotypisierung der N2-Tiere konnte für diese zwei Marker
eine signifikante Abweichung (p<0,0001) von dem zu erwarteten
Genotypenverhältnis mittels c2-Tests errechnet und somit ein signifikanter Hinweis
89
auf Kopplung zu der ci3-Mutation bestimmt werden. D11Ztm1 (Morc) und D11Ztm2
(Tagln3) wiese dabei eine schwächere Assoziation mit dem ci3-Phänotypen als der
anonyme „Peak Marker“ D11Rat67 auf. An diesen Loci rekombinierten jeweils fünf
N2-Individuen, die den ci3-Phänotypen aufwiesen (Tabelle 7 und Anhang Tabelle
15).
Tabelle 7: Untersuchte gengekoppelte Marker auf RNO11
SSLP-Marker c2-Wert p-Wert Chromosom Lokalisation in cM
D11Ztm1 (Morc) 53,232 < 0,0001 RNO11 24,7D11Ztm2 (Tagln3) 47,981 < 0,0001 RNO11 28,8
Es erfolgte eine Bestimmung der Rekombinationsfrequenzen zwischen den 12
anonymen auf RNO11 untersuchten Mikrosatelliten (Tabelle 3) und den zwei
gengekoppelten Markern (Tabelle 7). Basierend hierauf wurde eine genetische
Kopplungskarte des Rattenchromosoms 11 erstellt und somit die Position der beiden
gengekoppelten Mikrosatelliten bestimmt. Diese Karte beschreibt die Position von
D11Ztm1 (Morc) bei 24,7 cM. D11Ztm2 (Tagln3) kartiert bei 28,8 cM (Abb. 9). Für die
Darstellung der Assoziation des jeweiligen Mikrosatellitenmarkers mit dem ci3-
Phänotypen in Abb. 9 wurden die einzelnen c2-Werte in LOD-Score-Werte
umgerechnet.
90
Abb. 9: Genetische Kopplungskarte von RNO11 einschließlich der Assoziation
der Mikrosatelliten mit dem ci3-Phänotypen in LOD-Score-Werte
LOD-Score
D11Rat28 cM 0.0
D11Rat272.4
D11Mit410.2
D11Rat2414.1
D11Rat6718.8D11Rat1020.1
D11Ztm1 (Morc)24.7
D11Rat6527.7D11Ztm2 (Tagln3)28.8D11Mgh429.8
D11Rat9333.1D11Mgh333.9
D11Rat5642.7
D11Wox653.9
5 10 15
91
4.3.4 Virtueller Aufbau einer physikalischen Karte der nicht
rekombinanten Region (LEW-ci2)
Mit Hilfe der Sequenzen von Ratten-BAC-Klonen wurde eine physikalische Karte der
nicht rekombinanten Region auf RNO10 (D10Ztm1 – D10Ztm2) erzeugt.
Als Grundgerüst für diese Karte diente ein 106 bp großer Bereich (61. Mb bis 62. Mb;
„Ensembl Mouse Genome Server“) des Mauschromosoms 11 der die Sequenzen der
homologen Gene zu Myo15, Znf179 und Aldh3a1 beinhaltet (Abb. 10 E). Mittels
BLAST wurden 11 überlappende Rattenklone („Contig“) identifiziert, die diesem
Bereich des Mausgenoms entsprechen (Abb. 10 D). Die überlappenden Enden
benachbarter Klone wurden auf Sequenzübereinstimmung überprüft und somit diese
untereinander verankert.
Die cDNA-Sequenzen von neun Rattengenen, darunter Myo15, Znf179 und Aldh3a1,
wurden auf diesen Rattenklonen wiedergefunden. Gensequenzen, die in den
überlappenden Bereichen zweier Klone lagen, wurden auf beiden jeweils
benachbarten Klonen nachgewiesen.
Somit konnte die Position der Gene auf der durch die verankerten Klone gebildeten
physikalischen Karte bestimmt werden (Abb. 10 B). Der so ermittelte physikalische
Abstand, der bei 43,5 cM der genetischen Kopplungskarte lokalisierten Gene Myo15,
Znf179 und Aldh3a1 betrug in etwa 800 kb. Unter den sechs weiteren lokalisierten
Rattengenen befindet sich das Gen Kcnj12 (NM_053981; KOYAMA et al., 1994),
welches für den Kaliumeinzelkanal Kir2.2 kodiert (Kapitel 2.4.2).
Auch die für Mensch und Maus beschriebenen Sequenzen, der zu diesen neun
Rattengenen homologen Gene zeigten signifikante Sequenzübereinstimmungen zu
den 11 Rattenklonen (Abb. 10 A und B). Darüber hinaus wurden bei weiteren vier
Genen des Menschen und 12 Genen der Maus Sequenzübereinstimmungen zu
diesen Rattenklonen gefunden. Hierbei handelt es sich um Gene deren Sequenzen
für die Ratte noch nicht beschrieben sind (Stand Mai 2003).
92
Abb. 10: Physikalische Karte der nicht rekombinanten Region auf RNO10
basierend auf überlappenden Rattenklonen der „CHORI-230 Rat BAC
library sequencing project” Datenbank
61. Mb
61,5. Mb
62. Mb
CH230-38B5 CH230-5O22
CH230-68E7
CH230-13K13
CH230-30B23
CH230-103A8
CH230-6D21
CH230-311A11
CH230-1E4
CH230-10J14
CH230-255K6
Drg2
Myo15
LglhFliih
LOC194946,(SMCR7)Top3a
LOC237782,(SMCR8)
Shmt1
Gtlf3b
Gtlf3a
Map2k3
Kcnj12
Tnfrsf13b
Aldh3a1
Aldh3a2
Zfp179
Mapk7
Eppb9
Epn2
UbcUba52Lglh
Kcnj12
D10Ztm4(Aldh3a1)
Aldh3a2
D10Ztm2/Znf179
Epn2
MYO15A
KCNJN12
MAPK7
ALDH3A2
EPN2
ZNF179
DRG2
ALDH3A1
SMCR8
SMCR7
A) cDNA-Sequenzen B) cDNA-Sequenzen C) cDNA-Sequenzen D) BAC-Klone E) MMU11 Homo sapiens Rattus norvegicus Mus musculus Rattus norvegicus Mus
musculus
D10Ztm1(Myo15)
93
4.3.5 Nachweis einzelner Exone eines Kanidatengens im Genom der
BH.7A/Ztm-ci3 Ratte
Das Ziel war es, die laut der „UCSC Genome Bioinformatics“ Datenbank sieben
vorhandenen Exone des Kandidatengens Drd3 im Genom der BH.7A/Ztm-ci3 und,
als Kontrolle, der BH.7A/Ztm bzw. BH/Ztm Ratte mittels PCR-Amplifikation
nachzuweisen.
Wie von der Datenbank beschrieben findet man die für die Ratte beschriebene
cDNA-Sequenz von Drd3 (NM_017140; SNYDER et al., 1991) als sieben
voneinander getrennte Fragmente auf dem Rattenklon CH230-3C10/AC094353
wieder. Die Sequenz dieses Klons wurde benutzt, um Primer zu identifizieren, die in
den flankierenden Regionen der sieben Exone des Gens binden (Tabelle 8).
94
Tabelle 8: PCR- und Gelelektrophoresedaten der sieben nachgewiesenen Exone
von Drd3 (NM_017140)
Drd3 Primer sequenzen Errechnete OptimaleExone (5/ fi 3/) Produkt- Anlagerungs-
größe temperatur
Exon 1 f: AGA GCC TGA TTT 426 bp 60 °CAGC CCA CAT TGr: TCC CCA GTC CTCTGA GCA CTA AC
Exon 2 f: GAT GAA CAG CTC 308 bp 55 °CAGG GGA GGC Ar: GGC AAG TTC CCTTGG AAG TGA CC
Exon 3 f: AAC CAC TGC TCC 247 bp 58 °CCAT CAT GCC Tr: CCA CCC GGG AATGAT GTG GA
Exon 4 f: CCA TAC CAT GCC 328 bp 56 °CATA TGG ACT TAr: GGA GAC TGA GGGCTG CTA TGT
Exon 5 f: GGT TCA AGT TTG 186 bp 54 °CTAG AGC TTA TCC Cr: GGG AAA GAC ATCTCA CTC TTC CC
Exon 6 f: CAC TTC CCA GGG 488 bp 61 °CTCC CAC CGr: GCC CCC ATG GTACTC GCT TCA
Exon 7 f: GAC TTG TGA GTT 386 bp 57 °CGCT TTT CGT GTT Cr: ACA TTA CCA GAGCCC AGT GCA G
95
Mit Hilfe dieser Primer konnten die sieben Fragmente sowohl im Genom der BH.7A-
ci3 Ratte, als auch des Hintergrundstamms BH.7A bzw. BH nachgewiesen werden.
Die im 3 %igen Agarosegel detektierten Banden zeigten dabei die vorher berechnete
Fragmentlänge. Unterschiede zwischen den beiden Stämmen in der Fragmentlänge
der sieben Exone konnten dabei nicht beobachtet werden (Abb. 11 bis 14).
Abb. 11: PCR-Produkte des Exon 1 von Drd3 basierend auf der DNA von Ratten
der Stämme BH (A), BH.7A (B) und BH.7A-ci3 (C)
Abb. 12: PCR-Produkte des Exon 2 von Drd3 basierend auf der DNA von Ratten
der Stämme BH (A), BH.7A (B) und BH.7A-ci3 (C)
A B C
A B C
96
Abb. 13: PCR-Produkte der Exone 3, 4 und 5 von Drd3 basierend auf der DNA
von Ratten der Stämme BH (A), BH.7A (B) und BH.7A-ci3 (C)
Abb. 14: PCR-Produkte der Exone 6 und 7 von Drd3 basierend auf der DNA von
Ratten der Stämme BH (A), BH.7A (B) und BH.7A-ci3 (C)
97
5. Diskussion
5.1 Untersuchungen zum Phänotypen und zur Genetik der LEW/Ztm-
ci2 Rattenmutante
5.1.1 Neurophysiologische Verhaltensuntersuchungen
Ziel der Verhaltensuntersuchungen war zum einen eine Bestimmung der Phänotypen
der 55 im Laufe dieser Arbeit gezüchteten Individuen der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1
x LEW/Ztm-ci2 Rückkreuzungspopulation (N2). Hierdurch sollten die N2-Individuen
ermittelt werden, die homozygote Träger der ci2-Mutation waren und den
entsprechenden Phänotypen (Rota t ionsverha l ten ; ves t ibu lä re
Ausfallserscheinungen) aufwiesen. Diese eindeutige phänotypische
Charakterisierung diente als Grundvorrausetzung, um die bei der Kopplungsanalyse
(Kapitel 4.2) ermittelten Genotypen mit den Phänotypen der
Rückkreuzungsindividuen abgleichen zu können und somit einen Hinweis auf
Kopplung des untersuchten Markers zur ci2-Mutation zu erlangen.
Der zweite Teil der Verhaltensuntersuchungen beschäftigte sich mit dem
Sehvermögen der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2 Individuen. Festgestellt
werden sollte, ob eine Beeinträchtigung des Sehvermögens, wie es für den
Parentalstamm LEW/Ztm-ci2 beschrieben wurde (GOCKELN et al., 2003), bei den
Tieren vorlag. Hierzu wurden Verhaltensuntertests durchgeführt, mit deren Hilfe man
vergleichsweise unkompliziert die Sehfähigkeit bei einer großen Anzahl von Tieren
überprüfen kann.
98
5.1.1.1 Untersuchungen des Rotationsverhaltens sowie des auditiven und
vestibulären Systems
Mit Hilfe der angewendeten Verhaltensuntersuchungen konnte bei 26 der 55
untersuchten N2-Individuen das für den Parentalstamm (LEW/Ztm-ci2) beschriebene
Rotationsverhalten (LINDEMANN et al., 2001) und die Taubheit (KAISER et al.,
2001) nachgewiesen werden.
Beim Schwimmtest traten Abweichungen innerhalb der Gruppe der N2-Individuen mit
Rotationsverhalten auf. Sechs Tiere aus dieser Gruppe waren, im Gegensatz zu dem
Parentalstamm LEW/Ztm-ci2 (KAISER et al., 2001; LESSENICH 2002), in der Lage
sich mühsam und kurzfristig an der Wasseroberfläche zu halten.
Als mögliche Erklärung für diese Abweichung ist der Einfluss von modulierenden
Genen des zweiten für die Rückkreuzung eingesetzten Parentalstammes BN/Ztm zu
diskutieren.
Als zweite Möglichkeit ist die Entkopplung von zwei für den ci2-Phänotypen
verantwortlichen Genen bei den N2-Individuen in Betracht zu ziehen. Hierbei müsste
es sich jedoch gemäß den Ergebnissen der Kopplungsanalyse (Kapitel 4.2) um zwei
eng benachbarte Gene handeln. Sechs von 26 N2-Individuen mit Rotationsverhalten
zeigten jedoch dieses beim Schwimmtest festgestellte Phänomen. Dies entspräche
einer Rekombinationsfrequenz von 23 % und somit einem Abstand von 23 cM
zwischen zwei für den ci2-Phänotypen möglicherweise verantwortlichen Genen und
widerspricht somit den Ergebnissen der Kopplungsanalyse. Somit ist diese zweite
Möglichkeit eher auszuschließen.
Bei den beiden weiteren Untersuchungen zur vestibulären Funktion („Air-Righting“-
Test; „Balance“-Test) konnten solche Varianzen innerhalb der beiden Gruppen (N2-
Individuen mit Rotationsverhalten vs. N2-Individuen ohne Rotationsverhalten)
allerdings nicht festgestellt bzw. bestätigt werden.
Somit lässt sich zusammenfassend festhalten, dass - mit Ausnahme der Varianz im
Phänotypen hinsicht l ich des Schwimmverhaltens - durch die
Verhaltensuntersuchungen 26 der 55 gezüchteten Rückkreuzungstiere eindeutig der
99
ci2-Phänotyp zugewiesen werden konnte, während die übrigen 29 Tiere
phänotypisch unauffällig waren.
5.1.1.2 Überprüfung der Sehfähigkeit der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x
LEW/Ztm-ci2 Ratten
Parallel zu den phänotypischen und genetischen Untersuchungen zur LEW-ci2
Ratte, die Bestandteil dieser Arbeit waren, wurden adulte LEW-ci2 Ratten von Dr.
Roland Gockeln aus der Augenklinik der Medizinischen Hochschule Hannover auf ihr
Sehvermögen untersucht. Der Grund für diese Untersuchungen war der auf den
Ergebnissen der genetischen Untersuchungen dieser Arbeit basierende Hinweis auf
Parallelität des ci2-Phänotypen zu dem „Usher Syndrom“ Typ 1B des Menschen.
Hierbei handelt es sich um eine Erkrankung, die mit progressiver Retinopathie
einhergeht (Kapitel 5.3.1 und 5.4).
Bei der durchgeführten extrazellulären Elektroretinographie (ERG) zeigte sich eine
generalisierte Funktionsstörung der Photorezeptoren, und zwar unter skotopischen
(Stäbchensystem) und photopischen (Zapfensystem) Bedingungen (Anhang Abb.
12). Dieser retinale Funktionsverlust wurde durch histologische Untersuchungen, bei
denen ein Verlust der Photorezeptorzellen nachgewiesen werden konnte, bestätigt.
Unter Berücksichtigung dieser Befundsituation ist der visuelle Funktionsverlust bei
den LEW-ci2 Ratten durch progressive Netzhautdystrophie zu erklären (Gockeln et
al., 2003). Erste Anzeichen einer Netzhautdegeneration sind bereits bei vier Monate
alten Tieren festzustellen (ERG-Messungen). Der Zeitpunkt der Manifestation der
progressive Netzhautdystrophie scheint bei sechs Monaten zu liegen (GOCKELN,
persönliche Mitteilung).
Um diesen beim Parentalstamm festgestellten Verlust der Sehfähigkeit bei den N2-
Individuen zu überprüfen, kamen ein modifizierter „Visual-Cliff“-Test und – zur
Absicherung der Ergebnisse – ein Hell-Dunkel-Transfer-Test zum Einsatz.
100
5.1.1.2.1 Verhalten der Tiere an einer sichtbaren Kante (modifizierter
„Visual-Cliff“-Test)
Die signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen (N2-Individuen mit
Rotationsverhalten und vestibulären Fehlfunktionen = ci2-Phänotyp vs. nicht
betroffene N2-Individuen) deuten auf Unterschiede in der Sehfähigkeit der N2-Tiere
hin.
Aus der längeren Latenzzeit bis zur Verhaltensweise „Head Dipping“ und der
größeren Anzahl an Stürzen bei den 26 N2-Individuen, die den ci2-Phänotypen
aufwiesen, lässt sich ableiten, dass diese N2-Tiere die Hockerkante als Begrenzung
der exponierten Fläche (Sitzfläche des Hockers) optisch nicht wahrnahmen. Erste
Kantenkontakte könnten sich bei diesen Tieren eher als Zufallsprodukt einer
vorsichtigen Exploration der neuen Umgebung oder als Folge einer ungezielten
Fluchtreaktion, die allerdings meist mit einem Sturz an der Hockerkante (Tiere traten
ohne abzubremsen über diese hinweg) verbunden war, ergeben haben, während die
nicht betroffenen N2-Individuen sofort nachdem sie die für sie unbehagliche Situation
erfasst hatten, zur Hockerkante eilten und von dieser herabblickten, um so
möglicherweise Fluchtwege aus dieser Situation zu erkunden. Neben dem
Übertreten der Hockerkante spricht auch das zweite Verhaltensmuster, aus dem sich
Stürze ergaben (tiefes Eintauchen des Kopfes von der Kante aus in den Abgrund),
für ein eingeschränktes Sehvermögen der N2-Tiere mit Rotationsverhalten. Es kann
angenommen werden, dass diese N2-Individuen optisch den Boden des
Untersuchungsraumes nicht erfassen konnten und somit versuchten über taktile
Reize den Abgrund zu explorieren.
Die Tatsache, daß die 29 nicht betroffenen N2-Tiere signifikant häufiger von der
Kante aus auf den Boden und die Umgebung herabblickten („Head Dipping“-
Verhalten), untermauert die Vermutung, dass sie diese optisch wahrnahmen und,
nachdem sie beim ersten Versuch keinen Fluchtweg erkannten, gezielt weitere
Positionen an der Hockerkante auf Fluchtmöglichkeiten untersuchten. Bei den 26 N2-
Individuen, die den ci2-Phänotypen aufwiesen, können neue Kontakte mit der
Hockerkante wiederum als Zufallsprodukte vorsichtiger Exploration gewertet werden,
101
die dann ausgenutzt wurden, um durch tiefes Eintauchen den Abgrund
möglicherweise zu ertasten.
Die größere Anzahl abgesetzter Kot-Boli bei den 26 N2-Individuen mit ci2-
Phänotypen ist ein klarer Hinweis dafür, dass sie einem größeren Stress ausgesetzt
waren als die 29 nicht betroffenen Individuen, was möglicherweise durch die
eingeschränkte Fähigkeit des Erfassens der neuen Umgebung (fehlende optischen
Wahrnehmung) und somit der Einschätzung der unbehaglichen Situation erklärbar
ist.
5.1.1.2.2 Hell-Dunkel-Transfer-Test
Die signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Parameter „Latenzzeit“ und
„Exploration des Eingangsbereiches zum dunklen Kompartiment, ohne dieses zu
betreten“, die sich bei diesem Test ergeben haben, stützen die Hinweise aus dem
vorherigen Test (Kapitel 5.1.1.2.1), dass bei den N2-Individuen mit
Rotationsverhalten eine eingeschränkte Sehfähigkeit vorliegt.
Die im Mittel vierfach längere Latenzzeit zwischen Öffnung der Schiebetür und
Übergang in das dunkle Kompartiment der N2-Tiere, die den ci2-Phänotypen
aufwiesen, lässt den Schluss zu, dass diese Individuen das helle Kompartiment nicht
als in dem Maße unbehaglich registrierten bzw. das dunkle Kompartiment nicht als
geschützten Bereich erkannten. Eine mögliche Erklärung hierfür wäre, dass sie den
Unterschied in der Beleuchtungsstärke beider Kompartimente nicht ausmachen
konnten. Aus der Tatsache, dass alle nicht betroffenen Ratten das dunkle
Kompartiment im Mittel nach 30 Sekunden betraten, kann gefolgert werden, dass sie
diesen Bereich als dunkel und somit geschützt erkannten.
Zudem zeigten lediglich N2-Individuen, die den ci2-Phänotypen aufwiesen, eine
vorsichtige Exploration des Eingangsbereiches zum dunklen Kompartiment, ohne
dieses zu betreten. Dieses Verhalten ist ein weiterer Hinweis dafür, dass sie diesen
Bereich nicht als dunkel und geschützt erkannten und zunächst eine Erkundung
dieses Teils der „Shuttle-Box“ mit ihrem Tast- und Geruchsinn vornahmen. Alle
102
phänotypisch unauffälligen Individuen betraten den dunklen Bereich dagegen, ohne
ein solches Verhalten zu zeigen, so dass man wiederum davon ausgehen kann, dass
sie das Kompartiment auch als Dunkles erkannten.
Der Unterschied zwischen beiden Gruppen in der Anzahl der während der
Untersuchungszeit abgegebenen Kot-Boli war nicht signifikant. Es ließ sich jedoch
der Trend erkennen, dass N2-Tiere mit ci2-Phänotyp mehr defäkieren als nicht
betroffene Tiere, was darauf schließen lässt, dass ihnen die neue unbekannte
Umgebung aufgrund der möglicherweise fehlenden optischen Informationen
größeren Stress bereitet. Da es sich bei der Messung der abgesetzten Kot-Boli
während einer Untersuchung um einen sehr groben Parameter für Stressempfinden
handelt (HALL, 1934; HUNT und OTIS, 1953), ist auch ein solcher nicht signifikanter
Trend im Zusammenhang mit den anderen Befunden zumindest als Faktor zu
werten, der als unterstützender Parameter für eine unterschiedliche Stressantwort
der Tiere gelten kann.
5.1.1.2.3 Abschliessende Betrachtung der Tests zur Überprüfung der
Sehfähigkeit der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2 Ratten
Abschließend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse beider Untersuchungen auf eine
eingeschränkte Sehfähigkeit der Rückkreuzungsindividuen mit ci2-Phänotyp
(homozygote Merkmalsträger) im Vergleich zu phänotypisch unauffälligen N2-Ratten
(heterozygote Merkmalsträger) schließen lassen. Eine Validierung der Ergebnisse
sollte anhand von ERG-Untersuchungen vorgenommen werden, zumal bei
heterozygoten LEW-ci2 Ratten durch GOCKELN et al. (2003) sehr wohl eine
eingeschränkte Sehfähigkeit festgesellt wurde (Anhang Abb. 12).
Zum Zeitpunkt dieser neurophysiologischen Untersuchungen war allerdings das
Lebensalter, in dem das Einsetzen der progressiven Retinopathie bei der LEW-ci2
Ratte beginnt, noch nicht bekannt. Die in dieser Arbeit untersuchten N2-Tiere waren
in einem Alter (3 bis 5 Monate) in dem sich zwar erste Anzeichen einer Retinopathie
bei LEW-ci2 Ratten beobachten lassen, eine vollständige Manifestation der
103
Erkrankung (6. Lebensmonat; Gocklen, persönliche Mitteilung) aber aller
Wahrscheinlichkeit nach noch nicht statt gefunden hat. Möglicherweise bestehen
Unterschiede bei den N2-Individuen zwischen homozygoten und heterozygoten
Merkmalsträgern in der Entwicklung der progressiven Retinopathie durch den Einfluß
modulierender Gene des Kreuzungspartners BN/Ztm.
104
5.1.2 Genetische Analysen zur LEW/Ztm-ci2 Rattenmutante
5.1.2.1 Mikrosatellitenmarker-gestützte Kopplungsanalyse
Die mittels anonymer Mikrosatellitenmarker untersuchte (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x
LEW/Ztm-ci2 Rückkreuzungspopulation bestand aus einer Gruppe von Tieren mit
abnormen Phänotyp und einer Gruppe von phänotypisch unauffälligen Tieren. Dabei
zeigte sich eine Inzidenz bezüglich des ci2-Phänotypen von nahezu 50 %. Dies kann
als deutlicher Hinweis gewertet werden, dass es sich hierbei um ein monogenetisch
verursachten Phänotypen handelt.
Ziel der Kopplungsanalyse war die Identifikation und Eingrenzung der Regionen,
welche die ci2-Mutation trägt.
5.1.2.1.1 Anonyme Mikrosatellitenmarker und ihre Assoziation mit dem ci2-
Phänotypen
Von den auf den Chromosomen 1 bis 9 und 11 bis 20 untersuchten Markern wiesen
lediglich fünf (D1Mit2, D4Mgh3, D8Mit7, D19Mgh2, D19Rat17) einen signifikanten p-
Wert auf. Die Möglichkeit, dass es sich hierbei um fälschlicherweise für die
Chromosomen 1, 4, 8 und 19 beschriebene Marker handelt ist mit Ausnahme von
D8Mit7 auszuschließen. D1Mit2, D4Mgh3, D19Mgh2 und D19Rat17 sind in den
physikalischen Karten der Datenbank „UCSC Genome Bioinformatics“
(genome.ucsc.edu/) auf den entsprechenden Chromosomen wiederzufinden. Bei
D8Mit7 besteht die Möglichkeit, dass dieser Marker nicht korrekt kartiert wurde.
Da aber für sämtliche übrigen untersuchten Mikrosatellitenmarker auf den
Chromosomen 1, 4 und 8 keine signifikante Abweichung vom zu erwarteten
Genotypenverhältnis ermittelt werden konnten, ist davon auszugehen, dass es sich
bei diesen isoliert vorliegenden Abweichungen (D1Mit2, D4Mgh3, D8Mit7) eher um
Zufallsbefunde handelt, und sie nicht als Hinweis auf Kopplung zur ci2-Mutation
einzustufen sind.
105
Interessanterweise ergaben sich die bei den beiden auf Chromosom 19 lokalisierten
Mikrosatelliten festgestellten signifikanten p-Werte aus einem Überwiegen an
heterozygoten LEW-ci2/BN-Genotypen in der Gruppe der den ci2-Phänotypen
aufweisenden Individuen. Tatsächlich muss aber ein Überwiegen an homozygoten
LEW-ci2-Genotypen in dieser Gruppe als Hinweis auf Kopplung zur ci2-Mutation
gewertet werden, da diese Tiere aufgrund des rezessiven Erbgangs ebenfalls
homozygot für diese Mutation sein müssen. Da aber zwei benachbarte Marker diese
Form der signifikanten Abweichung aufweisen, ist dieses Ergebnis nicht als
Zufallsbefund einzustufen. Zu diskutieren ist hier dagegen die Möglichkeit, dass die
festgestellte Abweichung ein Hinweis auf den Einfluss von auf Chromosom 19
lokalisierten, modulierenden Genen des Kreuzungspartners BN/Ztm ist.
Für sämtliche 18 auf Chromosom 10 lokalisierten Mikrosatellitenmarker konnte eine
signifikante Abweichung vom zu erwarteten Genotypenverhältnis mittels c2-Tests
errechnet werden. Bei diesen Markern überwog jeweils die Anzahl an homozygoten
LEW-ci2-Genotypen in der Gruppe, der den ci2-Phänotypen aufweisenden
Individuen, womit ein signifikanter Hinweis auf Kopplung zu der Mutation gegeben
war. Tatsächlich wiesen 90 der 94 phänotypisch betroffenen Tiere bei dem Marker
mit der stärksten Assoziation mit dem ci2-Phänotypen (D10Rat164; „Peak Marker“)
einen homozygoten LEW-ci2-Genotypen auf. Diese Anzahl entspricht einer
Rekombinationsfrequenz von 4,3 % (4 / 94), was einer wahrscheinlichen Entfernung
dieses Markers zur ci2-Mutation von 4,3 cM entspricht.
Folglich konnte die ci2-Mutation mit Hilfe der Kopplungsanalyse eindeutig auf
Chromosom 10 kartiert werden. Die Region, die diese Mutation trägt, ist gemäß
diesen Daten im zentralen Bereich des Chromosoms lokalisiert und wird von den
Markern D10Rat164 (41,2 cM) und D10Rat32 (47,8 cM) flankiert.
106
5.1.2.2 Computer- und Datenbank-gestützte genetische Analysen
5.1.2.2.1 Gengekoppelte Marker und ihre Assoziation mit dem ci2-
Phänotypen
Die vergleichende Betrachtung des Rattengenoms mit denen des Menschen und der
Maus („comparative mapping“) brachte zwei Gene (Myo15, Myo1c) die für
unkonventionelle Myosine kodieren, als mögliche Kandidaten für die taubblinde
LEW-ci2 Ratte hervor. Diese beiden Gene sowie zwei benachbarte Gene (Aldh3a1,
Znf179) von Myo15 wurden mit Hilfe gengekoppelter Mikrosatelliten Marker
untersucht, um festzustellen, ob sie innerhalb der zentralen Assoziationsregion auf
RNO10 kartieren.
Myo15 kodiert für das unkonventionelle Myosin XV, dem eine essentielle Bedeutung
für die Struktur und Funktion des Sinnesepithels des Innenohres (Haarzellen)
zugesprochen wird (ANDERSON et al., 2000). Mutationen in diesem Gen sind
sowohl für den Menschen, als auch für die Maus beschrieben worden.
Bei den shaker2-Mäusen (Myo15sh2, Myo15sh2J) resultieren zum einen eine
Punktmutation und zum anderen eine Deletion in Myo15 in einer autosomal rezessiv
vererbten Taubheit und einer Schädigung des vestibulären Systems, die zu
Rotationsverhalten führt. In beiden Fällen findet man pathologisch verkürzte
Stereozilien der Haarzellen in der Cochlea und im vestibulären Apparat (LIANG et
al., 1998; PROBST et al., 1998; ANDERSON et al., 2000). Im Gegensatz hierzu
äußern sich allerdings die histologischen Veränderungen im Innenohr der LEW-ci2
Ratte in einem nahezu vollständigen Verlust der Haarzellen der Cochlea. Ein Teil der
vestibulären Haarzellen zeigt dagegen Protrusionen in den endolymphatischen
Raum, die für einen cytoskeletalen Schaden dieser Zellen sprechen (KAISER et al.,
2001). Diese Veränderungen sind wiederum ein Indiz für eine Beteiligung eines
Strukturproteins an dem ci2-Phänotypen, wie es z.B. Myosin XV darstellt.
Auch beim Menschen führen Punktmutationen in MYO15 zu einer rezessiv
vererbten, nicht syndromartigen Taubheit (DFNB3). Diese Punktmutationen wurden
107
bei drei nicht miteinander verwandten DFNB3 Familien durch Sequenzanalysen
nachgewiesen (Wang et al., 1998). Des weiteren sind Mutationen in MYO7A,
welches für ein zu Myosin XV strukturell eng verwandtes Protein kodiert (CHEN et
al., 1996; MBURU et al., 1997; LIANG, et al., 1999), beschrieben, die zum „Usher
Syndrom“ Typ 1B führen. Patienten, die an diesem Syndrom leiden, zeigen
angeborene Taubheit mit Beeinträchtigung des vestibulären Systems sowie eine
tapetoretinale Degeneration, die sich meist im vorpubertären Alter manifestiert. Auch
Ataxien vestibulären Ursprungs sind bisweilen zu beobachten (PETIT, 2001).
Tatsächlich entspricht damit dieser Typ des „Usher Syndroms“ dem Phänotypen der
taubblinden LEW-ci2 Ratte (Kapitel 5.4) und liefert somit einen weiteren Hinweis auf
eine mögliche Beteiligung eines unkonventionellen Myosins an der Entstehung des
ci2-Phänotypen.
Mit Hilfe eines innerhalb der genomischen Sequenz von Myo15 lokalisierten und
polymorphen Mikrosatellitenmarkers (D10Ztm1) konnte erstmalig die Lokalisation
dieses Gens innerhalb des Genoms der Ratte (RNO10; 43,5 cM) und gleichzeitig die
Assoziation des Markers und folglich von Myo15 mit dem ci2-Phänotypen bestimmt
werden. Tatsächlich zeigten sämtliche N2-Individuen, die den betroffenen
Phänotypen aufwiesen, bei den Markern D10Ztm1 (Myo15), D10Ztm2 (Znf179) und
D10Ztm4 (Aldh3a1), die alle drei bei 43,5 cM auf RNO10 lokalisiert sind, einen
homozygoten LEW-ci2-Genotypen. Entsprechend lässt die fehlende Rekombination
zwischen diesem Locus und der ci2-Mutation den Schluss zu, dass diese Region an
der Entstehung des ci2-Phänotypen beteiligt ist. Unter den in diesen Bereich
kartierenden Genen ist Myo15 aufgrund seiner Funktion und den beschriebenen
Mutationen als Kandidatengen besonders hervorzuheben.
Bei dem zweiten ebenfalls für ein unkonventionelles Myosin kodierenden Gen
handelt es sich um Myo1c (Synonym: Myr4). Die mRNA dieses Gens wurde aus der
Cochlea von Mäusen isoliert und das Gen auf Chromosom 11 der Maus und
Chromosom 17 des Menschen, welche die homologen Chromosome zu RNO10
darstellen, kartiert (CROZET et al., 1997). Durch gerichtete Inaktivierung des Gens
108
konnte seine Beteiligung an der Mechanotransduktion im Bereich der sensorischen
Haarzellen des Innenohres gezeigt werden (ZUO, 2002).
Aufgrund seiner Funktion und Lokalisation auf den homologen Chromosomen von
Mensch und Maus wurde auch Myo1c als mögliches Kandidatengen für den ci2-
Phänotypen in Betracht gezogen. Mit Hilfe eines gengekoppelten
Mikrosatellitenmarkers konnte die Lokalisation des Gens auf RNO10 bei 64,1 cM
bestimmt und eine signifikante Kopplung zur ci2-Mutation nachgewiesen werden.
Allerdings rekombinierten an diesem Locus 15 der 94 N2-Individuen, die einen
betroffenen Phänotypen aufwiesen. Aufgrund dieser Tatsache kann eine Beteiligung
des Gens am ci2-Phänotypen ausgeschlossen werden.
5.1.2.2.2 Physikalische Karte der nicht rekombinanten Region auf RNO10
(LEW-ci2)
Myo15 und seine beiden benachbarten Gene Aldh3a1 und Znf179 wurden mit Hilfe
ihrer gekoppelten Marker bei 43,5 cM auf RNO10 kartiert. Um den tatsächlichen
physikalischen Abstand zwischen den Genen zu bestimmen und weitere,
möglicherweise dazwischen lokalisierte Gene aufzudecken, wurde eine physikalische
Karte dieser Region von RNO10 generiert.
Basierend auf der homologen chromosomalen Region der Maus (MMU11) konnten
überlappende Ratten-BAC-Klone zu einem „Contig“ zusammengefügt und auf
Sequenzübereinstimmung zu Referenz-cDNA-Sequenzen von Genen der Ratte
geprüft werden. Hierbei wurden das Intervall, in dem die drei Gene lokalisiert sind
(ca. 800 kb), bestimmt und weitere sechs in diesem Bereich lokalisierte Gene der
Ratte identifiziert. Auch die entsprechenden homologen Gene des Menschen und der
Maus zeigten Sequenzübereinstimmungen zu den Ratten-Klonen. Daraus lässt sich
ableiten, dass diese Region eine deutliche Homologie unter den drei Spezies,
bezüglich Gehalt und Anordnung der Gene, aufweist. Darüber hinaus wiesen weitere
Referenzsequenzen von Genen des Menschen und der Maus Übereinstimmungen
zu den Ratten-Klonen auf. Hieraus ist zu schließen, dass weitere Gene der Ratte in
109
dieser Region lokalisiert sein müssen, deren entsprechende Sequenzen noch nicht
beschrieben worden sind.
Unter den mit dieser Methode kartierten Genen der Ratte befindet sich auch Kcnj12
(RNO10: 47182207 bp bis 47228820 bp; „UCSC Genome Bioinformatics“) , welches
für die Kaliumeinzelkanal-Alphauntereinheit Kir2.2 kodiert.
Zelleinwärts gerichtete K+-Kanäle spielen eine Schlüsselrolle in dem Transport von
Kaliumionen in und aus dem subretinalen Raum (YUAN, et al., 2003). Die
Untereinheiten Kir 1.1 (Kcnj1; unbekannte Lokalisation), 2.1 (Kcnj2; RNO10:
100589355 bp bis 100590638 bp), 2.3 (Kcnj4; RNO7), 3.1 (Kcnj3; RNO3), 3.2 (Kcnj6;
RNO11), 3.3 (Kcnj9; RNO13) und 4.2 (Kcnj15; RNO11) konnten bereits in
verschiedenen Bereichen der Netzhaut der Ratte immunhistochemisch
nachgewiesen werden (TIAN et al., 2003).
Darüber hinaus sind verschiedene Mutationen in einem Kaliumkanal nachgewiesen
worden, die zur dominant vererbten nicht syndromartigen Taubheit (DFNA2) beim
Menschen führen (VAN CAMP et al., 2002). Ebenso ist eine Maus (Kcnj10tm1Pkj) mit
einem genetisch inaktivierten Kir4.1 Kaliumeinzelkanal (Kcnj10; MMU1) beschrieben.
Dieses Tier weist eine Innenohrdegeneration in Verbindung mit Hörverlust auf
(KOFUJI et al., 2000; MARCUS et al., 2001; ROZENGURT et al., 2003).
Aufgrund der Bedeutung von Kaliumeinzelkanälen für die Funktion der Zellen im
Innenohr und der Netzhaut (Kapitel 2.4.3) sowie seiner Lokalisation innerhalb eines
Intervalls von RNO10, das keine Rekombination zu der ci2-Mutation zeigt, muss
Kcnj12 als weiteres potentielles Kandidatengen für die taubblinde LEW-ci2 Ratte
betrachtet werden. Einschränkend ist aber zu erwähnen, dass zur Zeit ein Nachweis
dieser speziellen Untereinheit im Innenohr und/oder der Retina noch nicht erbracht
bzw. publiziert worden ist (Stand Juni 2003). Bisher sind Untersuchung mit einer
Kcnj12tm1Swz-Mausmutante zur Kaliumionen abhängigen Dilatation von cerebralen
Arterien vorgenommen worden (ZARITSKY et al., 2000). Zudem besteht noch kein
Hinweis auf Beteiligung von Kaliumeinzelkanälen an syndromalen
Taubblindheitsformen.
110
Basierend auf dem geringen physikalischen Abstand von ungefähr 500 kb zwischen
Myo15 und Kcnj12 (Kapitel 4.3.4, Abb. 10) ist auch durchaus die Möglichkeit zu
diskutieren, dass eine Mutation, die beide Gene betrifft (Deletion), für den ci2-
Phänotypen verantwortlich sein könnte (siehe auch Kapitel 5.5). Dies würde auch
nicht dem Inzidenzwert von nahezu 50 % bezüglich des betroffenen Phänotypen bei
der untersuchten N2-Population widersprechen, der auf einen monogenetischen
Erbgang hinweist. Aufgrund des geringen Abstands zwischen den beiden
Kandidatengenen ist davon auszugehen, dass die beiden eng gekoppelten Gene
miteinander vererbt werden und Rekombinationsereignisse zwischen beiden Loci
äußerst selten auftreten. Dies spiegelt auch die Tatsache wieder, dass die gesamte
chromosomale Region, auf der beide Gene lokalisiert sind, keine Rekombination bei
den Untersuchten N2-Individuen mit der ci2-Mutation gezeigt hat. Entsprechend
würde ein Phänotyp, der durch Mutationen in zwei so eng gekoppelten Genen
verursacht wird, bei einer Kreuzungspopulation die entsprechende Inzidenz eines
monogenetischen Erbgangs aufweisen.
Myo15 ist sicherlich aufgrund seiner bereits für den Menschen und die Maus
beschriebenen Mutationen sowie der Bedeutung unkonventioneller Myosine im
Zusammenhang mit Taubheitsformen bzw. syndromaler Taublindheit (Kapitel 2.4.1
und 5.3.1) gegenüber Kcnj12 als Kandidatengen vorzuziehen ist.
Letztendlich können aber sowohl mit Myo15 als auch mit Kcnj12 zwei sehr
interessante Kandidatengene für die LEW-ci2 Rattenmutante in der vorliegenden
Arbeit vorgestellt werden. Die Identifikation des Gens, das für den ci2-Phänotypen
verantwortlich ist, erfordert eine positionelle Klonierung, die in Folgeuntersuchungen
(Kapitel 5.5) vorgenommen werden muss.
111
5.2 Untersuchungen zum Phänotypen und zur Genetik der BH.7A/Ztm-
ci3 Ratte
5.2.1 Neurophysiologische Verhaltensuntersuchungen
Ziel der Verhaltensuntersuchungen war wiederum eine Bestimmung der Phänotypen
der Individuen der (BN/Ztm x BH.7A/Ztm-c i3 )F1 x BH.7A/Ztm-c i 3
Rückkreuzungspopulation (N2). Wie zuvor beschrieben (Kapitel 5.1.1) sollten die N2-
Individuen, die homozygote Träger der ci3-Mutation (Rotationsverhalten) waren,
ermittelt werden, um die bei der Kopplungsanalyse (Kapitel 4.2) festgestellten
Genotypen mit den Phänotypen der Rückkreuzungsindividuen abgleichen zu können
und somit einen Hinweis auf Kopplung des untersuchten Markers zur ci3-Mutation zu
erlangen.
5.2.1.1 Untersuchungen des Rotationsverhaltens
Bei 73 der 154 untersuchten N2-Individuen konnte Rotationsverhalten nachgewiesen
werden. Dabei wurde dieses Verhalten, wie es für den Parentalstamm BH.7A/Ztm-ci3
beschrieben ist (LESSENICH et al., 2001), sowohl unter Stress, als auch spontan
auftretend beobachtet. Mögliche Varianzen im Phänotyp – ausgelöst durch
modulierende Gene des Kreuzungspartner BN/Ztm – traten bei betroffenen N2-
Tieren nicht auf.
112
5.2.2 Genetische Analysen zur BH.7A/Ztm-ci3 Rattenmutante
5.2.2.1 Vorläufige Mikrosatellitenmarker-gestützte Kopplungsanalyse
Die mittels anonymer Mikrosatellitenmarker untersuchte Rückkreuzungspopulation
bestanden jeweils aus einer Gruppe von Tieren mit abnormen Phänotypen und einer
Gruppe von phänotypisch unauffälligen Tieren. Dabei zeigte sich eine Inzidenz
bezüglich des ci3-Phänotypen (Rotationsverhalten) von nahezu 50 %. Dies kann als
deutlicher Hinweis gewertet werden, dass es sich hier um einen monogenetisch
verursachten Phänotypen handelt.
Ziel der Kopplungsanalyse war die Identifikation und Eingrenzung der Region,
welche die ci3-Mutation trägt.
5.2.2.1.1 Anonyme Marker und ihre Assoziation mit dem ci3-Phänotypen
Sämtliche auf den Chromosomen 1 bis 10 und 12 bis 20 untersuchten Marker wiesen
keine signifikanten Abweichungen von dem zu erwarteten Genotypenverhältnis (1:1)
innerhalb beider N2 Gruppen auf und lieferten somit kein Hinweis auf Kopplung zu
der ci3-Mutation. Hierdurch kann allerdings nicht ausgeschlossen werden, dass auf
diesen Autosomen möglicherweise Gene lokalisiert sind, die einen modulierenden
Einfluß auf den ci3-Phänotypen haben, da hier nur ein Marker pro Chromosom
untersucht wurde. Nach Identifikation einer ausreichend großen Anzahl polymorpher
Mikrosatelliten sollte in Folgeuntersuchungen (Kapitel 5.5) dieser Möglichkeit durch
eine vollständige Kopplungsanalyse (Intermarker-Abstand von ca. 25 cM)
nachgegangen werden.
Lediglich 12 von 21 untersuchten RNO11-Markern erwiesen sich als polymorph für
die eingesetzte Rückkreuzung. Bei den 12 auf Chromosom 11 untersuchten Markern
konnte ein signifikanter Hinweis auf Kopplung zu der ci3-Mutation festgestellt
werden. Bei dem „Peak-Marker“ D11Rat67 wurde eine Rekombinationsfrequenz von
8,5 % innerhalb der Gruppe, der den ci3-Phänotypen aufweisenden N2-Individuen,
113
festgestellt. Dies entspricht einem wahrscheinlichen Abstand dieses Markers zu der
ci3-Mutation von 8,5 cM.
Somit konnte die Lokalisation der ci3-Mutation eindeutig auf Chromosom 11
bestimmt werden. Für eine Feinkartierung dieser Mutation sollten in Folgearbeiten
(Kapitel 5.5) weitere polymorphe RNO11-Marker eingesetzt werden, die bis dahin zur
Verfügung stehen könnten. Sollte dies nicht der Fall sein bestünde als Alternative die
Möglichkeit einen Kreuzungspartner mit ausgeprägter genetischer Divergenz zum
BH.7A/Ztm-ci3 Stamm (z.B. PAR/Ztm) für die Zucht einer neuen Rückkreuzung
einzusetzen.
5.2.2.2 Computer- und Datenbank-gestützte genetische Analysen
5.2.2.2.1 Gengekoppelte Marker und ihre Assoziation mit dem ci3-
Phänotypen
Der Vergleich mit dem Genom der Maus („UCSC Genome Bioinformatics“) brachte
das Gen Tagln3, welches für ein neuronales Protein kodiert, als mögliches
Kandidatengen hervor. Es wurde - zusammen mit dem Nachbargen Morc, welches
zur Absicherung der Lokalisation von Tagln3 mitkartiert wurde - mittels eines
gengekoppelten Markers kartiert und auf Assoziation mit dem ci3-Phänotypen
geprüft. Des Weiteren sollte das Gen Drd3, welches laut der „UCSC Genome
Bioinformatics“ Datenbank auf RNO11 lokalisiert ist, mit Hilfe eines gengekoppelten
Markers untersucht werden.
Tagln3 (Synonym: NP25) kodiert für das Protein Transgelin 3 (Synonym: NP25). Das
Gen wurde als cDNA-Klon aus dem Gehirn der Ratte isoliert. Es ist spezifisch für das
Gehirn und wird dort ubiquitär exprimiert. Aufgrund dieser Verbreitung wird
Transgelin 3 eine bedeutende Rolle in der Funktion neuronaler Systeme
zugesprochen (REN et al., 1994).
114
Eine mögliche Beteiligung dieses Gens an dem ci3-Phänotypen wurde mittels eines
in der genomischen Sequenz von Tagln3 lokalisierten Markers (D11Ztm2) geprüft.
Die Lokalisation des Gens konnte mit dieser Methode auf RNO11 bei 28,8 cM
bestimmt werden, wobei eine signifikante Kopplung zu der ci3-Mutation vorlag.
Allerdings rekombinierten an diesem Locus fünf der 59 N2 Individuen, die einen
betroffenen Phänotypen aufwiesen. Aufgrund dieser Tatsache kann Tagln3 als
Kandidatengen für den ci3-Phänotypen ausgeschlossen werden.
Drd3 kodiert für den Dopamin-D3-Rezeptor (DRD3). Dieser Rezeptor wurde längere
Zeit auf eine Beteiligung an der Ausprägung von Schizophrenie beim Menschen
untersucht, wobei neuere Untersuchung Veränderungen in DRD3 eine
prädispositionierende Rolle aberkennen (ANNEY, et al., 2002; CHONG, et al., 2003).
Interessanterweise ist aber eine gezielte Mutation in der Drd3tm1Dac-Mausmutante
beschrieben, bei der die Funktion des Rezeptors eliminiert wurde. Homozygote
Individuen wiesen gesteigerte lokomotorische Aktivität und ein gehäuftes Aufrichten
(„rearing behavior“) auf. Dieses Verhalten lässt den Schluss zu, dass dieser
Rezeptor eine inhibitorische Rolle in der Beeinflussung bestimmter
Verhaltensabläufe spielt (ACCILI et al., 1996). Tatsächlich ist eine deutlich
gesteigerte motorische Aktivität neben dem Rotationsverhalten das prägende
Charakteristikum des ci3-Phänotypen. Des Weiteren repräsentieren die
morphologische und neurochemische Asymmetrie bezüglich des dopaminergen
Systems die einzigen festgestellten pathologischen Abweichungen der BH.7A-ci3
Ratte (LESSENICH et al., 2001). Aufgrund dieser Befunde und seiner Lokalisation
auf RNO11 muss Drd3 als funktionelles Kandidatengen für den ci3-Phänotypen
betrachtet werden.
Eine Überprüfung der Assoziation dieses Gens mit dem ci3-Phänotyp mit Hilfe eines
gekoppelten Mikrosatelliten war nicht möglich, da sich sämtliche 13 untersuchten
Marker als nicht polymorph für die N2 Individuen erwiesen. An dieser Stelle sei
jedoch darauf hingewiesen, dass sich die Lokalisation von Drd3 auf RNO11
beginnend ab dem 30270000. bp („UCSC Genome Bioinformatics“) in einem Intervall
befindet, welches von den Markern D11Rat24 (beginnend ab 25718102. bp; „UCSC
115
Genome Bioinformatics“) und D11Rat67 (beginnend ab 45325473. bp; „UCSC
Genome Bioinformatics“) flankiert wird. Da es sich bei D11Rat67 um den Marker mit
der stärksten Assoziation mit dem ci3-Phänotypen handelt, kann davon
ausgegangen werden, dass Drd3 in der zentralen Assoziationsregion lokalisiert sein
müsste. Entsprechend wurden weitere Untersuchungen (PCR-Nachweis der Exone;
Kapitel 5.2.2.2.2) dieses Gens vorgenommen.
Allerdings ist die zentrale Assoziationsregion auf RNO11 noch nicht ausreichend
feinkartiert worden, um sich auf Drd3 als einziges Kandidatengen festzulegen. Eine
weitere Untersuchung dieser Region mit Hilfe von Mikrosatellitenmarkern (Kapitel
5.5) ist daher unabdingbar, um mögliche weitere Kandidatengene zu identifizieren.
5.2.2.2.2 Nachweis einzelner Exone des Kandidatengens Drd3 im Genom
der BH.7A/Ztm-ci3 Ratte
Aufgrund seiner wahrscheinlichen Lokalisation innerhalb des zentralen
Assoziationsbereiches auf RNO11 und seiner Bedeutung als potentielles
Kandidatengen für den ci3-Phänotypen (Kapitel 5.3.1) wurde Drd3 weiter untersucht.
Mit Hilfe von Computer-generierten Primern konnten die sieben Exone dieses Gens
im Genom der BH.7A/Ztm-ci3 Ratte nachgewiesen werden. Mit Hilfe dieser Primer
wurde auch genomische DNA des Hintergrundstammes BH.7A/Ztm bzw. BH/Ztm
analysiert. Aus dem Vergleich der PCR-Produkte lässt sich ableiten, dass keine
größeren Deletionen innerhalb der exprimierten Sequenz dieses Gens bei der
BH.7A-ci3 Ratte vorliegen können. Damit können jedoch Veränderungen innerhalb
dieses Gens, die zu einer Fehlfunktion des Dopamin D3-Rezeptors führen können,
nicht ausgeschlossen werden. Denkbar wären Punktmutationen oder im Agarosegel
nicht erfassbare, kleinere Deletionen. Solche Veränderungen in der Erbsubstanz sind
nur durch Sequenzanalysen der einzelnen PCR-Produkte nachzuweisen bzw.
auszuschließen. Diese Untersuchungen sollten als weiterführende Analysen dieser
Mutante durchgeführt werden (Kapitel 5.5).
116
5.3 Vergleich der LEW/Ztm-ci2 bzw. BH.7A/Ztm-ci3 Ratte mit genetisch
bedingten Erkrankungen des Menschen und die Bedeutung beider
Rattenmutanten als mögliche Tiermodelle
LEW/Ztm-ci2:
Aufgrund der bisherigen funktionellen Befunde wurde die LEW/Ztm-ci2 Ratte als
mögliches Tiermodell für hereditäre Taubheitsformen vom neurosensorischen Typ
beim Menschen eingestuft (KAISER et al., 2001). Mit der stargazer (stg)- bzw. jerker
(je)-Ratte (TRUETT et al., 1994) existiert bereits eine Rattenmutante, die ebenfalls
Innenohrdegenerationen aufweist und auch in weiteren Aspekten ihres Phänotypen
der LEW-ci2 Ratte ähnelt, so dass anfangs Überlegungen bestanden, beide
Mutanten einem cis-trans-Test (Komplementationstest) zu unterziehen. Für je
(Synonym: stg) konnte jedoch eine Kopplung mit dem Pigmentierungslocus B (black)
sowie weiteren anonymen Markern auf RNO5 (TRUETT et al., 1996) und somit ein
Unterschied zur LEW-ci2 Rattenmutante gezeigt werden.
Aus den jüngsten Befunden zur Retina (Netzhautdegeneration in Form einer Retinitis
pigmentosa) von homo- und heterozygoten LEW-ci2 Ratten (Gockeln et al., 2003),
die erst durch den Hinweis auf Myo15 als mögliches Kandidatengen durchgeführt
wurden, kann die LEW/Ztm-ci2 Ratte jetzt eindeutig als Modell für syndromale
Taubblindheit angesehen werden.
Über 40 dieser Syndrome sind beim Menschen beschrieben (PETIT, 2001). Zu
diesen Erkrankungen gehört das „Kearns-Sayre Syndrom“ (KSS). Neben einer
Netzhaut-Aderhautdystrophie, Hörstörungen und vestibulärer Fehlfunktion ist hierbei
aber auch eine Muskeldystrophie zu beobachten (KEARNS, 1965), welche bei der
LEW-ci2 Ratte nicht vorliegt. Zudem wird dieses Syndrom mitochondrial vererbt
(LESTIENNE und PONSOT, 1988).
Beim „Bardet-Biedl Syndrom“ (BBS) kann die Netzhaut-Aderhautdystrophie mit einer
Polydaktylie, einer congenitalen Fettsucht, neurosensorischer Taubheit, geistiger
117
Retardierung und Hypogonadismus vergesellschaftet sein (AMMANN, 1970). Von
den bisher sieben identifizierten BBS-Loci (KATSANIS et al., 2001) kartiert keiner auf
Chromosom 17 des Menschen, welches das Homolog zu RNO10 darstellt, dem
Chromosom auf dem die ci2-Mutation lokalisiert ist.
Das „Alstrom Syndrom“ (ALMS) wird autosomal rezessiv vererbt und ist dem
Phänotypen des BBS bis auf die Polydaktylie, der geistigen Retardierung und dem
Hypogonadismus sehr ähnlich (ALSTORM et al., 1959). Verantwortlich für das ALMS
sind Mutationen im ALMS1 Gen, welches auf Chromosom 2 des Menschen lokalisiert
ist (COLLIN et al., 1997; COLLIN et al., 2002).
Patienten mit „Refsum Syndrom“ entwickeln ebenfalls der Retinitis pigmentosa
ähnliche Symptome, die sich oft durch Nachtblindheit ankündigen und
Schwerhörigkeit (ASHENHURST et al., 1958). Weitere Symptome des „Refsum
Syndroms“ sind periphere Neuropathien und Ataxien. Als Ursache werden
Mutationen im PHYH (HSA10p-11.2) oder dem PEX7 Gen (HSA6q22-q24) vermutet
(NADAL et al., 1995; JANSEN et al., 1997; MIHALIK et al., 1997).
Eine Bedeutung der LEW-ci2 Ratte als mögliches Tiermodell für eine dieser oben
genannten Erkrankungen muss folglich aufgrund der die Taubblindheit begleitenden
Symptome bei diesen Syndromen sowie den bisherigen Erkenntnissen zu deren
genetischem Ursprung eher ausgeschlossen werden.
Weitreichende Homologien weist der ci2-Phänotyp dagegen zu dem „Usher
Syndrom“ Typ1 des Menschen (Kapitel 2.4.1.1) auf. Das „Usher Syndrom“ macht
über 50 % der hereditären syndromalen Taubblindheitsformen des Menschen aus
(VERNON, 1969). Von den drei klinischen Erscheinungsformen [Usher Typ 1
(USH1), Typ 2 (USH2) und Typ 3 (USH3); DAVENPORT und OMENN, 1977]
repräsentiert USH1 den schwerwiegendsten Subtypen. Tatsächlich ist die gesamte
Symptomatik des USH1 bei der LEW-ci2 Ratte wiederzufinden. Wie betroffene
Patienten zeichnen sich homozygote Merkmalsträger der ci2-Mutation durch
angeborene Taubheit und vestibuläre Fehlfunktion neurosensorischen Ursprungs
aus (KAISER et al., 2001). Auch die teilweise beim Menschen auftretenden Ataxien
(PETIT, 2001) sind bei diesen Ratten zu beobachten (LÖSCHER et al., 1996).
118
Entscheidend ist, dass ein visueller Funktionsverlust bei den LEW-ci2 Ratten vorliegt,
der wie beim Menschen durch eine progressive Netzhautdystrophie rückzuführen ist
(Gockeln et al., 2003).
Die bisher als mögliches Tiermodell für das „Usher Syndrom“ Typ 1B (USH1B)
gehandelten shaker1-Mausmutanten zeigen zwar cochleäre und vestibuläre Defekte
vom neuroepithelialen Typ und eine bei ERG-Messungen festgestellte reduzierte
Photorezeptorantwort, die allerdings keinesfalls auf völligen visuellen
Funktionsverlust schließen lässt (LORD und GATES, 1929; DEOL, 1956; KIKUCHI
und HILDING, 1965; STEEL und BOCK, 1983; RICHARDSON et al., 1997; SELF et
al., 1998; RICHARDSON et al., 1999; LIBBY und STEEL, 2001). Jedoch fehlen
diesen Mausmutanten Degenerationen der Netzhaut (HASSON, et al., 1997; LIU, et
al., 1998; LIU et al., 1999; TITUS, 1999).
Der in dieser Arbeit mit Hilfe eines gengekoppelten Mikrosatellitenmarkers erbrachte
Hinweis auf ein unkonventionelles Myosin-Gen (Myo15), als eines von zwei
möglichen funktionellen Kandidatengenen für den ci2-Phänotypen (Kapitel 5.3.1) fügt
sich nahtlos in das Bild der LEW-ci2 Ratte als hereditäres Modell für USH1 ein. Auch
wenn für USH1B eine Mutation im MYO7A Gen verantwortlich ist, welches wie
Myo15 für ein unkonventionelles Myosin kodiert, handelt es sich doch bei Myosin XV
und Myosin VIIa um strukturell eng verwandte Proteine innerhalb der Familie der
unkonventionellen Myosine (CHEN et al., 1996; MBURU et al., 1997; LIANG et al.,
1999). Es ist vorstellbar, dass Unterschiede hinsichtlich Expression und Aufgaben
beider Myosine im Bereich der Netzhaut zwischen Mensch und Ratte (sowie Maus)
vorliegen könnten. So wurde zwar Myosin VIIa beim Menschen und der Maus sowohl
in den Photorezeptoren, als auch im Pigmentblatt, aber nur beim Menschen auch in
den Synapsen der Photorezeptoren nachgewiesen (El-Amraoui et al., 1996; Liu et
al., 1997). Möglicherweise ist ein Unterschied zwischen Mensch und Ratte wie auch
Maus in der funktionellen Aufgabe beider Myosine im Bereich der Netzhaut eine
Erklärung dafür, dass bisher beschriebene Mutationen in MYO15 nur in einer nicht
syndromartigen Taubheitsform (DFNB3) des Menschen resultieren (WANG et al.,
119
1998), während die shaker1-Mausmutanten, die verschiedene Mutationen in Myo7a
aufweisen, keine progressive Netzhautdystrophie ausbilden.
Obwohl eine progressive Netzhautdystrophie auch bei Mäusen nicht zu finden ist, die
Mutationen in Myo15 aufweisen (shaker2: LIANG et al., 1998; PROBST et al., 1998;
ANDERSON et al., 2000), muss doch festgehalten werden, dass auch beim
Menschen Mutationen in MYO7A nicht zwangsläufig zum „Usher Syndrom“ Typ 1B
führen müssen. Sie können vielmehr auch in einer nicht syndromartigen, rezessiv
vererbten Taubheitsform (DFNB2) und einer nicht syndromartigen, dominant
vererbten Taubheitsform (DFNA11) resultieren (FRIEDMAN et al., 1999).
Untersuchungen zur Funktion und Morphologie der Netzhaut der LEW-ci2 Ratte
zeigten, dass auch heterozygote Träger der ci2-Mutation von der progressiven
Netzhautdystrophie betroffen sind (Anhang Abb. 12; GOCKELN et al., 2003), jedoch
keine Veränderungen des Innenohres aufweisen. Dies entspricht der Befundsituation
beim Menschen. Hier wird davon ausgegangen, dass knapp ein Viertel aller Retinitis
pigmentosa Patienten auch taub bzw. an einer Form des „Usher Syndroms“ erkrankt
sind (BOUGHMAN et al., 1983).
In jüngster Vergangenheit (Juni 2003) wurde ein neues Mausmodell für das „Usher
Syndrom“ vorgestellt. Bei der C57BL/6;129S5/SvEvBrd-Slc4a7tm1-Mausmutante
wurde das Slc4a7 Gen (MMU14), welches für einen Natriumbicarbonat-Kotransporter
(NBC3) kodiert, durch gerichtete Mutation inaktiviert. Homozygote Träger dieser
Mutation zeichnen sich durch Beeinträchtigungen des retinalen und cochleären
Systems aus. Histologische Veränderungen im vestibulären System und damit
verbundene Funktionsausfälle sind - im Gegensatz zu der LEW-ci2 Mutante und
USH1 Patienten - nicht zu beobachten (BOK et al., 2003). Entsprechend wird diese
Mutante als Modell für USH2 gehandelt (BOK et al., 2003), zumal SLC4A7
(HSA3p22) ein Kandidatengen für USH2B darstellt (HMANI et al., 1999).
Basierend auf den aktuellen Erkenntnissen zur Genetik und aufgrund des in
sämtlichen Zügen USH1 entsprechenden Phänotypen kann somit die LEW/Ztm-ci2
Ratte als hereditäres Tiermodell für das „Usher Syndrom“ Typ1 des Menschen
120
eingestuft werden. Dennoch sind weitere funktionelle Studien, insbesondere zu den
Veränderungen an der Netzhaut, und genetische Analysen (Positionsklonierung und
Sequenzierung der Defektgene) zwingend notwendig (Kapitel 5.5).
BH.7A/Ztm-ci3:
Die in dieser Arbeit vorgenommenen Untersuchungen zur Genetik der BH.7A-ci3
Ratte weisen bisher auf Drd3 als funktionelles Kandidatengen hin, welches für den
Dopamin D3-Rezeptor kodiert. Dies passt zur Hypothese, dass die phänotypischen
Abweichungen (Rotationsverhalten, Hyperaktivität) mit den festgestellten
lateralisierten Abnormitäten im Bereich des dopaminergen Systems der
Basalganglien zusammenhängen (LESSENICH et al., 2001).
Sollte sich in weitergehenden genetischen Untersuchungen (Kapitel 5.5) tatsächlich
eine Mutation in diesem Gen als verantwortlich für den ci3-Phänotypen erweisen, so
würde es doch schwierig bleiben auf eine spezifische Erkrankung des Menschen
hinzuweisen. Dies liegt in der Tatsache begründet, dass die Bedeutung des D3-
Rezeptors für Erkrankungen des Menschen nicht geklärt ist.
Hervorzuheben sind hier noch die Untersuchungen zur Assoziation von DRD3 mit
der Ausbildung von Schizophrenie beim Menschen. Insgesamt wird aber über eine
solche Beteiligung kontrovers diskutiert (ANNEY et al. 2002; CHONG et al., 2003).
Nachgewiesen wurde die Assoziation einer Mutation in D R D 3 mit der
Empfänglichkeit für die Dyskinesia tarda, die durch den Einsatz von
antipsychotischen Medikamenten ausgelöst wird (LERER et al., 2002).
Der Zusammenhang von Polymorphismen in D R D 3 und dem
Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitäts-Syndrom (ADHS) des Menschen wurde
ebenfalls untersucht. Dies erscheint insofern interessant, als sowohl die BH.7A-ci3
Ratte, als auch eine Maus mit Modifikationen in Drd3 (Drd3tm1Dac) sich durch
Hyperaktivität auszeichnen (ACCILI et al., 1996; LESSENICH et al., 2001). Ein
Zusammenhang von Mutationen in DRD3 und der Ausbildung des ADHS konnte
jedoch noch nicht nachgewiesen werden (MUGLIA et al., 2002).
121
Somit könnte die Bedeutung der BH.7A-ci3 Ratte in der weiteren Erforschung des
dopaminergen Systems liegen. Falls sich in nachfolgenden Studien (Kapitel 5.5) eine
Mutation in Drd3 als ursächlich für den ci3-Phänotypen nachweisen ließe, könnten
mit dieser Mutante insbesondere Abläufe untersucht werden, die durch den D3-
Rezeptor vermittelt werden.
Des Weiteren ist die BH.7A-ci3 Ratte gegenüber anderen Mutanten mit
Rotationsverhalten, wie z.B. der jerker (je)- bzw. stargazer (stg)-Rattenmutante
(TRUETT et al., 1994), hervorzuheben, da sie ein funktionsfähiges cochleäres und
vestibuläres System aufweist (LESSENICH et al., 2001). Entsprechend muss nach
dem bisherigen Erkenntnisstand tatsächlich davon ausgegangen werden, dass der
ci3-Phänotyp auf die Veränderungen im dopaminergen System zurückzuführen ist,
während die jerker-Mutante und die LEW-ci2 Ratte zwar auch Veränderungen in
diesem System aufweisen (BROCK und ASHBY, 1996; LÖSCHER et al., 1996), aber
gleichzeitig durch Innenohrdegenerationen charakterisiert sind.
122
5.4 Abschließende vergleichende Betrachtung der LEW/Ztm-ci2 und
BH.7A/Ztm-ci3 Ratte
Mit der LEW/Ztm-ci2 und BH.7A/Ztm-ci3 Ratte wurden in der vorliegenden Arbeit
zwei Mutanten untersucht, die sich beide durch spontanes und lateralisiertes
Rotationsverhalten sowie Hyperaktivität auszeichnen. Trotz dieser starken
Ähnlichkeiten im Phänotyp konnte durch die genetischen Untersuchungen der
vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass es sich hierbei um zwei vollkommen
unterschiedliche Tiermodelle handelt.
Bei der BH.7A/Ztm-ci3 Ratte verdichteten sich durch den Hinweis auf Drd3 (RNO11)
als potentielles Kandidatengen die Anzeichen, dass die Veränderungen im
dopaminergen System der Basalganglien als ursächlich für den ci3-Phänotyp
eingestuft werden können. Somit ist die BH.7A/Ztm-ci3 Mutante weiterhin als
mögliches Modell zur Untersuchung dieses Systems einzustufen.
Die Befunde aus den Untersuchungen zur Genetik der LEW/Ztm-ci2 Mutante
(Kandidatengene auf RNO10: Myo15, Kcnj12) weisen dagegen klar auf die schon
zuvor festgestellten Veränderungen im akustischen und vestibulären System
(KAISER et al., 2001) hin. Darüber hinaus konnte neben der neurosensorischen
Degeneration des Innnenohres eine progressive Retinopathie als weiterer
Bestandteil des ci2-Phänotypen durch GOCKELN et al. (2003) festgestellt werden.
Folglich repräsentiert die LEW/Ztm-ci2 Rattenmutante ein hereditäres Modell für das
„Usher Syndrom“ Typ1 des Menschen.
Somit bietet sich für mögliche Folgeuntersuchungen (Kapitel 5.5) nicht ein weiterer
Vergleich beider in dieser Arbeit beschriebenen Mutanten, sondern viel mehr eine
vergleichende Betrachtung der LEW/Ztm-ci2 mit der PAR/Ztm-ci4 Ratte an. Die
PAR/Ztm-ci4 Ratte stellt eine neue Mutante dar, die spontan im Jahre 2002 am Ztm
auftratt, ebenfalls Rotationsverhalten aufweist und ersten Erkenntnissen nach taub
und blind ist (GLAGE et al., 2003). Aufgrund dieser vorläufigen Befunde könnte es
sich bei dieser Rattenmutante möglicherweise um ein Tiermodell für das „Usher
Syndrom“ Typ3 (USH3) handeln, womit ein Vergleich mit der LEW/Ztm-ci2 Mutante
äußerst interessant wäre.
123
5.5 Ausblick
Bei den im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten genetischen Untersuchungen zur
LEW/Ztm-ci2 und BH.7A/Ztm-ci3 Rattenmutante konnte klar gezeigt werden, dass
die Mutationen auf Chromosom 10 (ci2) bzw. Chromosom 11 (ci3) des
Rattengenoms lokalisiert sind. Innerhalb der zentralen Assoziationsbereiche
(Suszeptibilitätsregionen) konnten Myo15 und Kcnj12 für den ci2-Phänotypen und
Drd3 für den ci3-Phänotypen als Kandidatengene ausgemacht werden.
Zur Abklärung einer möglichen Beteiligung dieser Gene (Myo15, Kcnj12, Drd3) an
der Ausprägung des ci2- bzw. ci3-Phänotypen sind weitere Analysen angebracht. Es
würde sich zunächst anbieten, wie es bereits in dieser Arbeit für das Drd3 Gen
durchgeführt wurde, die Exone der beiden anderen Kandidaten mittels PCR-
Amplifikation im Genom der LEW/Ztm-ci2 Ratte nachzuweisen. Es sollte sich dann
eine Klonierung sämtlicher PCR-Produkte von Myo15 und Kcnj12 sowie auch Drd3 in
Bakterien anschließen, um diese Sequenzanalysen unterziehen zu können, die
mögliche Mutationen innerhalb dieser drei Gene aufdecken könnten. Des Weiteren
sollte eine positionelle Klonierung der Kandidatengene-tragenden Regionen unter
Verwendung von BAC- und PAC (= P1-bacteriophage artificial chromosome)-Klonen
durchgeführt werden.
Zusätzlich sollten Expressionsanalysen der drei Kandidatengene in für beide
Phänotypen kritischen Geweben (Gehirn, Innenohr, Netzhaut) vorgenommen
werden. Hier würden sich insbesondere „Northern Blot“- und „Real Time“-PCR-
Untersuchungen anbieten. Ebenso könnten mit Positronemissionstomographie
(PET)-Geräten der neuesten Generation, die sich durch eine auch für Mäuse und
Rat ten notwend ige Auf lösung ausze ichnen, n ich t invas ive
Longitudinaluntersuchungen zu den Expressionsmustern der Kandidatengene
durchgeführt werden.
Ein Vergleich der Ergebnisse aus Sequenz- und Expressions-Analysen würde auch
Schlüsse darauf zu lassen, ob möglicherweise nicht die eigentliche Sequenz der
Gene, sondern stromaufwärts lokalisierte Promoter-Regionen von den Mutationen
betroffen sind.
124
Aus den Untersuchungen von GOCKELN et al. (2003) geht hervor, dass auch
heterozygote Träger der ci2-Mutation eine Retinitis pigmentosa aufweisen, während
sie aber keine Degeneration des sensorischen Epithels des Innenohres und auch
kein Rotationsverhalten zeigen. Es sollte folglich geprüft werden, ob möglicherweise
ein weiteres Gen an der Ausbildung des ci2-Phänotypen beteiligt ist, oder ob es sich
hierbei um einen dominant-negativen Effekt einer Mutation in den bereits
identifizierten Kandidatengenen (Myo15, Kcnj12) handelt. Denkbar wäre auch die
Möglichkeit, dass beide Kandidatengene für den ci2-Phänotypen mutiert sind, wobei
eine Mutation sowohl für das Rotationsverhalten als auch für die neurosensorische
Degeneration des Innenohrs und die andere für die progressive Retinopathie
verantwortlich sein könnte. Neben den bereits oben erwähnten Expressions- und
Sequenz-Analysen sollte zur Prüfung dieser Möglichkeiten eine
Rückkreuzungspopulation angelegt werden, bei der - aufgrund des aller
Wahrscheinlichkeit nach dominanten Vererbungsmusters der progressiven
Retinopathie - die Individuen der Filialgeneration mit demjenigen Elternteil verpaart
werden, der keine Veränderungen der Netzhaut aufweist (z.B. BN). Anschliessend
sollten die N2-Individuen systematisch auf Retinitis pigmentosa untersucht werden.
(ERG-Messungen). Unter Zuhilfenahme einer so phänotypisierten N2-Population
könnte geprüft werden (Kopplungsanalyse) ob möglicherweise weitere Loci im
Genom der LEW-ci2 Ratte eine Assoziation mit der progressiven Retinopathie
zeigen.
Bei der Untersuchung zur Genetik der BH.7A/Ztm-ci3 Ratte sollte die in der
vorliegenden Arbeit in Form eines Übersichtsverfahrens (ein Marker pro
Chromosom) begonnene Kopplungsanalyse, nach Identifikation einer ausreichenden
Anzahl polymorpher Mikrosatelliten, fortgesetzt werden. Zum einen könnte so die
modulierende Beteiligung weiterer Loci (außerhalb von RNO11) im Genom der
BH.7A/Ztm-ci3 Ratte an der Entstehung des ci3-Phänotypen untersucht werden.
Zum anderen könnte durch eine Erhöhung der Mikrosatellitenmarkerdichte auf
RNO11 eine weitere Eingrenzung der zentralen Assoziationsregion auf einen nicht
rekombinanten Bereich erreicht werden, um so mögliche weitere Kandidatengene für
125
die BH.7A/Ztm-ci3 Mutante zu identifizieren, falls eine Mutation innerhalb des
Kandidatengens Drd3 nicht als ursächlich für die Entsehung des ci3-Phänotypen
belegt werden könnte. Durch eine Einbeziehung der im Verlauf dieser Arbeit
gezüchteten und phänotypisierten N2-Individuen in die Kopplungsanalyse, die eine
sehr genaue Identifikation von Rekombinationsereignissen zuließe, könnte dieser
nicht rekombinante Bereich sehr exakt bestimmt werden. Im Zusammenhang mit der
Identifikation neuer Kandidatengene für die BH.7A/Ztm-ci3 Mutante würde sich auch
die Generierung einer physikalischen Karte der nicht rekombinanten Region, wie es
in dieser Arbeit bereits für RNO10 durchgeführt wurde, anbieten. Sollte es weiterhin
nicht möglich sein eine ausreichende Anzahl polymorpher Mikrosatellitenmarker zu
identifizieren, um die genetischen Analysen fortzusetzen, bestünde als Alternative
die Möglichkeit einen Kreuzungspartner mit ausgeprägter genetischer Divergenz zum
BH.7A/Ztm-ci3 Stamm (z.B. PAR/Ztm) für die Zucht einer neuen Rückkreuzung
einzusetzen.
Die Untersuchung von modulierenden Einflüssen des genetischen Hintergrundes
sowohl des LEW/Ztm- als auch des BH.7A/Ztm-Stammes könnte durch die
Entwicklung congener Stämme, also einer Übertragung der ci2- bzw. ci3-Mutation
auf einen anderen Rattenstamm, vorgenommen werden.
Neben genetischen Analysen sollten auch weitere funktionelle Untersuchungen der
LEW-ci2 und BH.7A-ci3 Rattenmutanten folgen. Insbesondere bietet sich der Einsatz
moderner nicht invasiver bildgebender Vefahren an. Neben den bereits erwähnten
PET-Geräten kann mittlerweile auch die Magnetresonanztomograpie (MRT) bei
Ratten und Mäusen angewandt werden. Mit Hilfe der PET-Technologie könnten nicht
nur die Expressionsmuster der Kandidatengene (Myo15, Kcnj12, Drd3) sondern auch
Unterschiede zwischen den beiden Mutanten und den Hintergrundstämmen
(LEW/Ztm, BH.7A/Ztm) bezüglich der entsprechenden Produkte (Myosin XV, Kir2.2,
DRD3) untersucht werden.
MRT würde einen Vergleich der Funktionen bestimmter Gehirnareale (BH.7A-ci3,
LEW-ci2) sowie des visuellen und akustischen bzw. vestibulären Systems (LEW-ci2)
126
zwischen den beiden Mutanten und den entsprechenden Hintergrundstämmen
erlauben. Hierdurch könnte den bisherigen Erkenntnissen zum visuellen, akustischen
und vestibulären (ci2-Mutation) bzw. dopaminergen System (ci3-Mutation) weiter
nachgegangen werden. Bei der LEW/Ztm-ci2 Rattenmutante könnte geprüft werden,
ob z.B. jene Gehirnareale, welche die Impulse des visuellen Systems und des
Innenohres verarbeiten, Funktionsunterschiede im Vergleich zum LEW/Ztm
Hintergrundstamm aufweisen. Darüber hinaus könnten so bei der BH.7A-ci3
Rattenmutante weitere Gehirnregionen untersucht werden, um festzustellen, ob
neben dem dopaminergen System der Basalganglien auch andere Areale von der
ci3-Mutation betroffen sind.
Es sind auch weitere funktionelle Untersuchung zu der progressiven Retinopathie der
LEW/Ztm-ci2 Ratte notwendig. Insbesondere der Zeitpunkt der Manifestation der
Retinitis pigmentosa, der bisher grob bestimmt wurde (zwischen dem 4. und dem 6.
Lebensmonat), sollte anhand von Longitudinalstudien genau analysiert werden.
Ausserdem sollte die Phagozytosefunktion und Apoptoseaktivität der Zellen des RPE
geprüft werden.
Abschliessend sei nochmals darauf hingewiesen, dass in die weiteren
Untersuchungen der LEW/Ztm-ci2 Ratte die neue PAR/Ztm-ci4 Mutante
eingebunden werden sollte, die möglicherweise ein Tiermodell für USH3 darstellt.
127
6. Zusammenfassung
Wojciech Chwalisz
Genetische Charakterisierung der LEW/Ztm-ci2 (circling2) und der BH.7A/Ztm-ci3
(circling3) Ratte als Modelle für Taubblindheit des Menschen (USH1) bzw.
Lateralisierung von Hirnfunktionen und Hyperlokomotion
Die LEW/Ztm-ci2 und BH.7A/Ztm-ci3 Ratten repräsentieren zwei Mutanten, die sich
durch spontanes und lateralisiertes Rotationsverhalten sowie Hyperaktivität und, im
Falle der LEW/Ztm-ci2, durch Ataxie und einen Opisthotonus auszeichnen.
Durch langjährige Untersuchungen zu den Phänotypen beider Mutanten konnte eine
neurochemische Lateralität des dopaminergen Systems der Basalganglien
festgestellt werden, wobei BH.7A/Ztm-c i3 Ratten zusätzlich auch eine
morphologische Lateralität hinsichtlich dopaminerger Neurone in diesen Strukturen
des Gehirns aufweisen.
Analysen zur Funktion und Morphologie des Innenohres zeigten, dass bei der
LEW/Ztm-ci2 Ratte Degenerationen vom neurosensorischen Typ vorliegen, die
sowohl die Haarzellen der Cochlea, als auch des vestibulären Systems betreffen und
mit entsprechenden Funktionsausfällen verbunden sind.
Die beiden Rattenmutanten zu Grunde liegende Genetik wurde mit Hilfe klassischer
Kreuzungsmethoden untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass beide Mutationen
autosomal rezessiv vererbt werden und es sich um Mutationen handeln muss, die
unterschiedliche Gene betreffen (Komplementationsanalyse).
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Frage nachgegangen, in welchen
chromosomalen Bereichen beide Mutationen lokalisiert sind und welche Gene sie
betreffen könnten. Hierzu dienten zwei segregierende Rückkreuzungspopulationen
((LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2; (BN/Ztm x BH.7A/Ztm-ci3)F1 x
B H . 7 A / Z t m - c i 3 ), deren Individuen mit Hilfe neurophysiologischer
Verhaltensuntersuchungen phänotypisch charakterisiert wurden, um sie in
homozygote und heterozygote Merkmalsträger differenzieren zu können. Untersucht
128
wurde das Rotationsverhalten der Individuen beider Rückkreuzungen sowie die
Funktion des auditiven und vestibulären Systems der Individuen der (LEW/Ztm-ci2 x
BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2 Rückkreuzungspopulation. Aufgrund dieser Parameter
(Rotationsverhalten bzw. Rotationsverhalten und Ausfälle des akustischen und
vestibulären Systems) konnte für den ci2- und den ci3-Phänotypen eine Inzidenz von
nahezu 50 % in der jeweiligen N2-Populationen festgestellt werden.
Beide Populationen wurden einer Kopplungsanalyse unter Verwendung anonymer
Mikrosatellitenmarker unterzogen, um die Assoziation beider Phänotypen mit
bestimmten chromosomalen Bereichen zu ermitteln. Hierbei zeigte sich, dass
sämtliche untersuchte Marker auf Chromosom 10 der Ratte (RNO10) eine
signifikante Kopplung zur ci2-Mutation aufwiesen, während sämtliche untersuchten
RNO11-Marker eine signifikante Kopplung zur ci3-Mutation zeigten.
Mit Hilfe eines im Rahmen dieser Arbeit entwickelten, gengekoppelten
Mikrosatellitenmarkers konnte erstmalig die Position des Gens Myo15 im Genom der
Ratte innerhalb der nicht rekombinanten Suszeptibilitätsregion auf RNO10 bestimmt
werden. Myo15 , welches für ein unkonventionelles Myosin kodiert, wird als
mögliches Kandidatengen für die LEW-ci2 Mutante betrachtet. Dies ergibt sich
daraus, dass bereits Mutationen in diesem Gen beschrieben sind, die zum einen bei
betroffenen Menschen und zum anderen bei Mäusen zu neurosensorischen
Innenohrdegenerationen und entsprechenden Funktionsausfällen führen. Basierend
auf Befunden zu MYO7A (Myosin VIIa) bei Mensch und Maus (Myo7a) erfolgten
durch GOCKELN et al. (2003) Untersuchungen zur Funktion und Morphologie der
Netzhaut von LEW/Ztm-ci2 Ratten. Hierbei wurde festgestellt, dass bei den LEW-ci2
Ratten, wie beim „Usher Syndrom“ des Menschen, eine retinale Degeneration in
Form einer Retinitis pigmentosa vorliegt. Durch neurophysiologische
Verhaltensuntersuchungen konnten Hinweise erlangt werden, dass entsprechende
Rückkreuzungsindividuen auch eine Störung des visuellen Systems aufweisen.
Mit Hilfe einer physikalischen Karte der nicht rekombinanten RNO10-Region konnte
ebenfalls die Position des Kcnj12 Gens bestimmt werden. Dieses Gen kodiert für
einen Kaliumeinzelkanal. Es wird auch als Kandidatengen für den ci2-Phänotypen
129
betrachtet, da Kaliumeinzelkanäle sowohl für die Funktion der Netzhaut, als auch des
Innenohres essentiell sind.
Innerhalb der zentralen Assoziationsregion mit dem ci3-Phänotypen auf RNO11 ist
laut der Datenbank „UCSC Genome Bioinformatics“ das Gen Drd3 lokalisiert, das für
den Dopamin D3-Rezeptor kodiert. Somit ist Drd3 ein potentielles Kandidatengen für
den ci3-Phänotypen, dem nach bisherigen Erkenntnisstand eine morphologische und
neurochemische Lateralität des dopaminergen Systems zu Grunde liegt. Im Rahmen
der vorliegenden Arbeit wurden die sieben Exone dieses Gens unter Verwendung
genomischer DNA einer BH.7A/Ztm-ci3 Ratte sowie jeweils einer Ratte des
congenen Stamms BH.7A/Ztm-ci3 und des originären Hintergrundes BH/Ztm mittels
PCR amplifiziert. Hierbei wurden aber keine Längenunterschiede der PCR-Produkte
festgestellt, die auf mögliche größere Deletionen innerhalb dieses Gens hinweisen
würden. Allerdings konnten bisher Punktmutationen in Drd3, die für den ci3-Phänotyp
verantwortlich sind, nicht ausgeschlossen werden.
130
Summary
Wojciech Chwalisz
Genetical characterization of the LEW/Ztm-ci2 (circling2) and the BH.7A/Ztm-ci3
(circling3) rats as animal models for syndromic deafness (USH1) respectively
lateralization of brain function and hyperlocomotion
Both, the LEW/Ztm-ci2 and the BH.7A/Ztm-ci3 rat, carry spontaneous mutations,
which cause lateralized circling behavior and locomotor hyperactivity. The ci2
phenotype is also characterized by ataxia and opisthotonus.
Previous studies have shown a neurochemical lateralization within the dopaminergic
system of the basal ganglia in both rats and a morphological lateralization of
dopaminergic neurons in the BH.7A/Ztm-ci3 rat. In addition, functional and
histological analyses of the inner ear of the LEW/Ztm-ci2 rat revealed degenerations
concerning the hair cells of the cochlea and the vestibular apparatus leading to
profound deafness and vestibular dysfunction.
Using breeding experiments it was shown that both mutations are gentically
transmitted as autosomal recessive traits. Furthermore, a classical complementation
analysis (cis-trans test) clearly indicated that both circling mutations affect different
loci.
In this study genetic analyses were performed in order to identify the chromosomal
localization bearing the ci2 and the ci3 mutation and to present functional candidate
genes. Using anonymous microsatellite markers two backcross populations
((LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2; (BN/Ztm x BH.7A/Ztm-ci3)F1 x
BH.7A/Ztm-ci3)) were analyzed, which were previously phenotyped by behavioral
testing. The incidence of circling behavior in both populations was nearly 50 %,
indicating that the ci2 as well as the ci3 phenotype are caused by a defect in a single
locus. These linkage analyses mapped the ci2 mutation to rat chromosome 10
(RNO10) and the ci3 mutation to RNO11.
131
A gene-linked marker for Myo15 was designed and the position of this gene in the rat
genome described for the first time within the non-recombinant interval of the core
region of association on RNO10. Thus Myo15, which codes for an unconventional
myosin (Myosin XV) that is expressed in the hair cells of the inner ear, can be
regarded as a candidate gene for the ci2 phenotype. This is based on the fact, that
mutations in the homologue genes of human and mouse are known to cause
profound deafness and vestibular dysfunction due to sensorineural degenerations of
the inner ear. Further on, mutations in human MYO7A, a gene that encodes for a
myosin with significant structural similarities to Myosin XV, are known to cause
“Usher Syndrome” 1B, which is characterized by sensorineural hearing loss,
vestibular dysfunction and a progressive retinal degeneration.
Because of the hind, that a mutation in a gene encoding for an unconventional
myosin might be responsible for the ci2 phenotype, GOCKELN et al. (2003)
performed functional and histological analysis of the retina of LEW/Ztm-ci2 rats. This
analysis revealed that LEW-ci2 rats display a progressive retinopathy as described
for the “Usher Syndrome” in Human. In this study behavioral testing of the (LEW/Ztm-
ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2 backcross population indicated that affected
individuals of this backcross also display a loss of retinal function.
A physical map of the non-recombinant interval on RNO10 was generated, which
describes the position of Kcnj12 to this part of the rat genome. This gene, which
codes for an inwardly rectifying potassium channel, can also be regarded as a
candidate gene for the deafblind LEW/Ztm-ci2 rat as these types of channels are
known to play an important role for the physiology of both the retina and the inner
ear.
The „UCSC Genome Bioinformatics“ database describes the chromosomal position
of Drd3 within the core region of association with the ci3 phenotype on RNO11. This
gene codes for the dopamine D3 receptor and can be regarded as a functional
candidate for the phenotype of the BH.7A/Ztm-ci3 rat, which seems to be related to a
lateralization of the dopaminergic system of the basal ganglia. PCR-amplification of
the seven exons of Drd3 was performed in this study using genomic DNA of a
BH.7A/Ztm-ci3 rat and a rat from the backround strain. No differences in the length of
132
the PCR-products could be detected indicating that this gene is not affected by
deletions. This result does not exclude that a single point mutation within the
sequence of Drd3 might be responsible for the phenotype of the BH.7A/Ztm-ci3 rat.
133
7. Literaturverzeichnis
Accili, D., Fishburn, C. S., Drago, J., Steiner, H., Lachowicz, J. E., Park, B. H.,
Gauda, E. B., Lee, E. J., Cool, M. H., Sibley, D. R., Gerfen, C. R., Westphal, H.
und Fuchs, S. (1996):
A targeted mutation of the D3 dopamine receptor gene is associated with
hyperactivity in mice.
Proc Natl Acad Sci U S A 93, 1945-1949
Ahmed, Z. M., Riazuddin, S. und Wilcox, E. R. (2003):
The molecular genetics of Usher syndrome.
Clin Genet 63, 431-444
Alstrom, C. H., Hallgren, B., Nilsson, L. B. und Asander, H. (1959):
Retinal degeneration combined with obesity, diabetes mellitus and neurogenous
deafness: a specific syndrome (not hitherto described) distinct from Laurence-Moon-
Biedl syndrome. A clinical endocrinological and genetic examination based on a large
pedigree.
Acta Psychiat Neurol Scand 34, 1-35
Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W. und Lipman, D. J. (1990):
Basic local alignment search tool.
J Mol Biol 215, 403-410
Ammann, F. (1970):
Investigations cliniques et genetiques sur le syndrome de Bradet-Biedl en Suisse.
Hum 18, 1-310
134
Anderson, D. W., Probst, F. J., Belyantseva, I. A., Fridell, R. A., Beyer, L., Martin,
D. M., Wu, D., Kachar, B., Friedman, T. B., Raphael, Y. und Camper, S. A. (2000):
The motor and tail regions of myosin XV are critical for normal structure and function
of auditory and vestibular hair cells.
Hum Mol Genet 9, 1729-1738
Ando, M. und Takeuchi, S. (1999):
Immunological identification of an inward rectifier K+ channel (Kir4.1) in the
intermediate cell (melanocyte) of the cochlear stria vascularis of gerbils and rats.
Cell Tissue Res 298, 179-183
Anney, R. J., Rees, M. I., Bryan, E., Spurlock, G., Williams, N., Norton, N.,
Williams, H., Cardno, A., Zammit, S., Jones, S., Jones, G., Hoogendoorn, B.,
Smith, K., Hamshere, M. L., Coleman, S., Guy, C., O'Donovan, M. C., Owen, M. J.
und Buckland, P. R. (2002):
Characterisation, mutation detection, and association analysis of alternative
promoters and 5' UTRs of the human dopamine D3 receptor gene in schizophrenia.
Mol Psychiatry 7, 493-502
Ashenhurst, E. M., Millar, J. H. D. und Milliken, T. G. (1958):
Refsum´s syndrome affecting a brother and two sisters.
Brit Med J 2, 415-417
Asman, D. C., Takimoto, K., Pitot, H. C., Dunn, T. J. und Lindahl, R. (1993):
Organization and characterization of the rat class 3 aldehyde dehydrogenase gene.
J Biol Chem. 268, 12530-12536
135
Avraham, K. B., Hasson, T., Sobe, T., Balsara, B., Testa, J. R., Skvorak, A. B.,
Morton, C. C., Copeland, N. G. und Jenkins, N. A. (1997):
Characterization of unconventional MYO6, the human homologue of the gene
responsible for deafness in Snell's waltzer mice.
Hum Mol Genet 6, 1225-1231
Avraham, K. B., Hasson, T., Steel, K. P., Kingsley, D. M., Russell, L. B.,
Mooseker, M. S., Copeland, N. G. und Jenkins, N. A. (1995):
The mouse Snell's waltzer deafness gene encodes an unconventional myosin
required for structural integrity of inner ear hair cells.
Nat Genet 11, 369-375
Bahler, M., Kroschewski, R., Stoffler, H. E. und Behrmann, T. (1994):
Rat myr 4 defines a novel subclass of myosin I: identification, distribution,
localization, and mapping of calmodulin-binding sites with differential calcium
sensitivity.
J Cell Biol 126, 375-389
Beckmann, J. S. und Weber, J. L. (1992):
Survey of human and rat microsatellites.
Genomics 12, 627-631
Bok, D., Galbraith, G., Lopez, I., Woodruff, M., Nusinowitz, S., BeltrandelRio, H.,
Huang, W., Zhao, S., Geske, R., Montgomery, C., Van Sligtenhorst, I., Friddle,
C., Platt, K., Sparks, M. J., Pushkin, A., Abuladze, N., Ishiyama, A., Dukkipati, R.,
Liu, W. und Kurtz, I. (2003):
Blindness and auditory impairment caused by loss of the sodium bicarbonate NBC3
Nat Genet 34, 313-319
136
Boughman, J. A., Vernon, M. und Shaver, K. A. (1983):
Usher syndrome: definition and estimate of prevalence from two high-risk
populations.
J Chronic Dis 36, 595-603
Brock, J. W. und Ashby, C. R., Jr. (1996):
Evidence for genetically mediated dysfunction of the central dopaminergic system in
the stargazer rat.
Psychopharmacology (Berl) 123, 199-205
Call, L. M. und Morton, C. C. (2002):
Continuing to break the sound barrier: genes in hearing.
Curr Opin Genet Dev 12, 343-348
Carlisle, L., Steel, K. und Forge, A. (1990):
Endocochlear potential generation is associated with intercellular communication in
the stria vascularis: structural analysis in the viable dominant spotting mouse mutant.
Cell Tissue Res 262, 329-337
Chen, Z. Y., Hasson, T., Kelley, P. M., Schwender, B. J., Schwartz, M. F.,
Ramakrishnan, M., Kimberling, W. J., Mooseker, M. S. und Corey, D. P. (1996):
Molecular cloning and domain structure of human myosin-VIIa, the gene product
defective in Usher syndrome 1B.
Genomics 36, 440-448
137
Chishti, A. H., Kim, A. C., Marfatia, S. M., Lutchman, M., Hanspal, M., Jindal, H.,
Liu, S. C., Low, P. S., Rouleau, G. A., Mohandas, N., Chasis, J. A., Conboy, J. G.,
Gascard, P., Takakuwa, Y., Huang, S. C., Benz, E. J., Jr., Bretscher, A., Fehon,
R. G., Gusella, J. F., Ramesh, V., Solomon, F., Marchesi, V. T., Tsukita, S.,
Tsukita, S., Arpin, M., Louvard, D., Tonks, N. K., Anderson, J. M., Fanning, A.
S., Bryant, P. J., Woods, D. F. und Hoover, K. B. (1998):
The FERM domain: a unique module involved in the linkage of cytoplasmic proteins
to the membrane.
Trends Biochem Sci 23, 281-282
Chong, S. A., Tan, E. C., Tan, C. H., Mythily und Chan, Y. H. (2003):
Polymorphisms of dopamine receptors and tardive dyskinesia among Chinese
patients with schizophrenia.
Am J Med Genet 116B, 51-54
Clausing, P., Bloom, D., Newport, G. D., Holson, R. R., Slikker, W., Jr. und
Bowyer, J. F. (1996):
Individual differences in dopamine release but not rotational behavior correlate with
extracellular amphetamine levels in caudate putamen in unlesioned rats.
Psychopharmacology (Berl) 127, 187-194
Collin, G. B., Marshall, J. D., Cardon, L. R. und Nishina, P. M. (1997):
Homozygosity mapping at Alstrom syndrome to chromosome 2p.
Hum Mol Genet 6, 213-219
Collin, G. B., Marshall, J. D., Ikeda, A., So, W. V., Russell-Eggitt, I., Maffei, P.,
Beck, S., Boerkoel, C. F., Sicolo, N., Martin, M., Nishina, P. M. und Naggert, J. K.
(2002):
Mutations in ALMS1 cause obesity, type 2 diabetes and neurosensory degeneration
in Alstrom syndrome.
Nat Genet 31, 74-78
138
Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Gilbert, D. J., Eppig, J. T., Maltais, L. J., Miller,
J. C., Dietrich, W. F., Weaver, A., Lincoln, S. E., Steen, R. G., Stein, L. D.,
Nadeau, J. H. und Lander, S. H. (1993):
A genetic linkage map of the mouse: current applications and future prospects.
Science 262, 57-66
Cramer, L. P. (2000):
Myosin VI. Roles for a minus end-directed actin motor in cells.
J Cell Biol 150, 121-126
Crawley, J. N. (1985):
Exploratory behavior models of anxiety in mice.
Neurosci Biobehav Rev 9, 37-44
Crawley, J. N. (1999):
Behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice: experimental design and
evaluation of general health, sensory functions, motor abilities, and specific
behavioral tests.
Brain Res 835, 18-26
Crawley, J. N. und Paylor, R. (1997):
A proposed test battery and constellations of specific behavioral paradigms to
investigate the behavioral phenotypes of transgenic and knockout mice.
Horm Behav 31, 197-211
Crozet, F., el Amraoui, A., Blanchard, S., Lenoir, M., Ripoll, C., Vago, P., Hamel,
C., Fizames, C., Levi-Acobas, F., Depetris, D., Mattei, M. G., Weil, D., Pujol, R.
und Petit, C. (1997):
Cloning of the genes encoding two murine and human cochlear unconventional type I
myosins.
Genomics 40, 332-341
139
Davenport, S. und Omenn, G. (1977):
Heterogeneity of Usher Syndrome.
Int Conf Birth Defects; Vth, Montreal
Deol, M. S. (1954):
The anomalies of the labyrinth of the mutants varitint-waddler, shaker-2 and jerker in
the mouse.
J Genet 52, 562-588
Deol, M. S. und Green, M. C. (1966):
Snell's waltzer, a new mutation affecting behaviour and the inner ear in the mouse.
Genet Res 8, 339-345
DEERBERG, F., KASPAREIT, J., REETZ, I.C. (1989)
Circling (ci), a new neurological mutant in the rat.
Rat News Lett 21, 19
Dietrich, W. F., Miller, J. C., Steen, R. G., Merchant, M., Damron, D., Nahf, R.,
Gross, A., Joyce, D. C., Wessel, M., Dredge, R. D. und et al. (1994):
A genetic map of the mouse with 4,006 simple sequence length polymorphisms.
Nat Genet 7, 220-245
Dobrovolskaia-Zavadskaia, N. (1928):
L’irradiation des testicules et l’heredite chez la souris.
Arch Biol 38, 457-501
el-Amraoui, A., Sahly, I., Picaud, S., Sahel, J., Abitbol, M. und Petit, C. (1996):
Human Usher 1B/mouse shaker-1: the retinal phenotype discrepancy explained by
the presence/absence of myosin VIIA in the photoreceptor cells.
Hum Mol Genet 5, 1171-1178
140
Ettaiche, M., Heurteaux, C., Blondeau, N., Borsotto, M., Tinel, N. und Lazdunski,
M. (2001):
ATP-sensitive potassium channels (K(ATP)) in retina: a key role for delayed ischemic
tolerance.
Brain Res 890, 118-129
Fan, L., Jaquet, V., Dodd, P. R., Chen, W. und Wilce, P. A. (2001):
Molecular cloning and characterization of hNP22: a gene up-regulated in human
alcoholic brain.
J Neurochem 76, 1275-1281
Fedrowitz, M. (1999)
Untersuchungen zur Pathophysiologie der circling- (ci2) Ratte, einer neuen
Rattenmutante mit spontanem Drehverhalten.
Hannover, Tierärztliche Hochschule, Diss.
Fedrowitz, M., Potschka, H., Richter, A. und Löscher, W. (2000):
A microdialysis study of striatal dopamine release in the circling rat, a genetic animal
model with spontaneous lateralized rotational behavior.
Neuroscience 97, 69-77
Friedman, T. B., Sellers, J. R. und Avraham, K. B. (1999):
Unconventional myosins and the genetics of hearing loss.
Am J Med Genet 89, 147-157
Gastaut, H., Aguglia, U. und Tinuper, P. (1986):
Benign versive or circling epilepsy with bilateral 3-cps spike-and-wave discharges in
late childhood.
Ann Neurol 19, 301-303
141
Gibbs, D., Kitamoto, J. und Williams, D. S. (2003):
Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the
Usher syndrome 1B protein.
Proc Natl Acad Sci U S A 100, 6481-6486
Gibson, F., Walsh, J., Mburu, P., Varela, A., Brown, K. A., Antonio, M., Beisel, K.
W., Steel, K. P. und Brown, S. D. (1995):
A type VII myosin encoded by the mouse deafness gene shaker-1.
Nature 374, 62-64
Glage, S., Karl, T., Hedrich, H. J. und Wedekind, D. (2003):
PAR-ci4: Eine neue Rattenmutante mit spontanem Drehverhalten.
41. GV-Solas Tagung, Göttingen; Abstract
Glick, S. D. und Cox, R. (1976):
Differential sensitivity to apomorphine and clonidine following frontal cortical damage
in rats.
Eur J Pharmacol 36, 241-245
Gockeln, R., Lindemann, S., Kamino, K., Winter, R., Hedrich, H. J. und Löscher,
W. (2003):
Retinitis Pigmentosa in Spontaneous Rat Mutants With Sensorineural Deafness and
Vestibular Dysfunction – A Rodent Model for Usher Syndrome Phenotype 1.
Invest Ophthalmol Vis Sci 2003; 44: E-Abstract 1861
Graybiel, A. M. (1990):
The basal ganglia and the initiation of movement.
Rev Neurol (Paris) 146, 570-574
142
Grondahl, J. (1987):
Estimation of prognosis and prevalence of retinitis pigmentosa and Usher syndrome
in Norway.
Clin Genet 31, 255-264
Hall, C. S. (1934):
Emotional behavior in the rat: defecation and urination as a measure of individual
differences in emotionality.
J Comp Psychol 18, 385-403
Hansen, C. T., Judge, F. J. Und Whitney, R. A. (1973):
Catalogue of NIH Rodents.
U.S. Department of Health, Education, and Welfare. Washington, D.C.
DHEW Publ. No. 74-606
Hashitani, T., Mizukawa, K., Kumazaki, M. und Nishino, H. (1998):
Dopamine metabolism in the striatum of hemiparkinsonian model rats with
dopaminergic grafts.
Neurosci Res 30, 43-52
Hasson, T. (1999):
Molecular motors: sensing a function for myosin-VIIa.
Curr Biol 9, R838-841
Hasson, T., Gillespie, P. G., Garcia, J. A., MacDonald, R. B., Zhao, Y., Yee, A. G.,
Mooseker, M. S. und Corey, D. P. (1997):
Unconventional myosins in inner-ear sensory epithelia.
J Cell Biol 137, 1287-1307
143
Hasson, T., Heintzelman, M. B., Santos-Sacchi, J., Corey, D. P. und Mooseker,
M. S. (1995):
Expression in cochlea and retina of myosin VIIa, the gene product defective in Usher
syndrome type 1B.
Proc Natl Acad Sci U S A 92, 9815-9819
Hasson, T. und Mooseker, M. S. (1997):
The growing family of myosin motors and their role in neurons and sensory cells.
Curr Opin Neurobiol 7, 615-623
Hasson, T., Walsh, J., Cable, J., Mooseker, M. S., Brown, S. D. und Steel, K. P.
(1997):
Effects of shaker-1 mutations on myosin-VIIa protein and mRNA expression.
Cell Motil Cytoskeleton 37, 127-138
Hedrich, H.-J. (1990):
Genetic monitoring of inbred strains of rats.
Gustav Fischer Verlag, Stuttgart
Hibino, H., Horio, Y., Inanobe, A., Doi, K., Ito, M., Yamada, M., Gotow, T.,
Uchiyama, Y., Kawamura, M., Kubo, T. und Kurachi, Y. (1997):
An ATP-dependent inwardly rectifying potassium channel, KAB-2 (Kir4. 1), in
cochlear stria vascularis of inner ear: its specific subcellular localization and
correlation with the formation of endocochlear potential.
J Neurosci 17, 4711-4721
Hmani, M., Ghorbel, A., Boulila-Elgaied, A., Ben Zina, Z., Kammoun, W., Drira,
M., Chaabouni, M., Petit, C. und Ayadi, H. (1999):
A novel locus for Usher syndrome type II, USH2B, maps to chromosome 3 at p23-
24.2.
Eur J Hum Genet 7, 363-367
144
Hope, C. I., Bundey, S., Proops, D. und Fielder, A. R. (1997):
Usher syndrome in the city of Birmingham--prevalence and clinical classification.
Br J Ophthalmol 81, 46-53
Hudson, J. L., van Horne, C. G., Stromberg, I., Brock, S., Clayton, J.,
Masserano, J., Hoffer, B. J. und Gerhardt, G. A. (1993):
Correlation of apomorphine- and amphetamine-induced turning with nigrostriatal
dopamine content in unilateral 6-hydroxydopamine lesioned rats.
Brain Res 626, 167-174
Hunt, H. F. und Otis, L. S. (1953):
Conditioned and unconditioned emotional defecation in the rat.
J Comp Physiol Psychol 46, 378-382
Hunt, M. A., Miller, S. W., Nielson, H. C. und Horn, K. M. (1987):
Intratympanic injection of sodium arsanilate (atoxyl) solution results in postural
changes consistent with changes described for labyrinthectomized rats.
Behav Neurosci 101, 427-428
Inoue, S., Orimo, A., Saito, T., Ikeda, K., Sakata, K., Hosoi, T., Orimo, H., Ouchi,
Y. und Muramatsu, M. (1997):
A novel RING finger protein, BFP, predominantly expressed in the brain.
Biochem Biophys Res Commun 240, 8-14
Isomoto, S., Kondo, C. und Kurachi, Y. (1997):
Inwardly rectifying potassium channels: their molecular heterogeneity and function.
Jpn J Physiol 47, 11-39
Jaber, M., Robinson, S. W., Missale, C. und Caron, M. G. (1996):
Dopamine receptors and brain function.
Neuropharmacology 35, 1503-1519
145
Jahnke, K. (1975):
The fine structure of freeze-fractured intercellular junctions in the guinea pig inner
ear.
Acta Otolaryngol Suppl 336, 1-40
Jansen, G. A., Ofman, R., Ferdinandusse, S., Ijlst, L., Muijsers, A. O., Skjeldal,
O. H., Stokke, O., Jakobs, C., Besley, G. T., Wraith, J. E. und Wanders, R. J.
(1997):
Refsum disease is caused by mutations in the phytanoyl-CoA hydroxylase gene.
Nat Genet 17, 190-193
Jones, D. E., Jr., Brennan, M. D., Hempel, J. und Lindahl, R. (1988):
Cloning and complete nucleotide sequence of a full-length cDNA encoding a
catalytically functional tumor-associated aldehyde dehydrogenase.
Proc Natl Acad Sci U S A 85, 1782-1786
Kaiser, A., Fedrowitz, M., Ebert, U., Zimmermann, E., Hedrich, H. J., Wedekind,
D. und Löscher, W. (2001):
Auditory and vestibular defects in the circling (ci2) rat mutant.
Eur J Neurosci 14, 1129-1142
Karjalainen, S., Pakarinen, L., Terasvirta, M., Kaariainen, H. und Vartiainen, E.
(1989):
Progressive hearing loss in Usher's syndrome.
Ann Otol Rhinol Laryngol 98, 863-866
Karl, T., Pabst, R. und von Horsten, S. (2003):
Behavioral phenotyping of mice in pharmacological and toxicological research.
Exp Toxicol Pathol 55, 69-83
146
Karwoski, C., Lu, H. und Newman, E. (1989):
Spatial buffering of light-evoked potassium increases by retinal Muller (glial) cells.
Science 244, 578-580
Katsanis, N., Lupski, J. R. und Beales, P. L. (2001):
Exploring the molecular basis of Bardet-Biedl syndrome.
Hum Mol Genet 10, 2293-2299
Kearns, T. P. (1965):
Neuro-ophthalmology.
Arch Ophthalmol 74, 707-738
Kikuchi, K. und Hilding, D. (1965):
The development of the organ of Corti in the mouse.
Acta Otolaryngol 60, 207-222
King, H. D. (1936):
A waltzing mutation in the white rat.
J Mammal 17, 157-163
Kofuji, P., Ceelen, P., Zahs, K. R., Surbeck, L. W., Lester, H. A. und Newman, E.
A. (2000):
Genetic inactivation of an inwardly rectifying potassium channel (Kir4.1 subunit) in
mice: phenotypic impact in retina.
J Neurosci 20, 5733-5740
Koshikawa, N. (1994):
Role of the nucleus accumbens and the striatum in the production of turning
behaviour in intact rats.
Rev Neurosci 5, 331-346
147
Koyama, H., Morishige, K., Takahashi, N., Zanelli, J. S., Fass, D. N. und Kurachi,
Y. (1994):
Molecular cloning, functional expression and localization of a novel inward rectifier
potassium channel in the rat brain.
FEBS Lett 341, 303-307
Kuramoto, T., Serikawa, T., Hayasaka, N., Mori, M. und Yamada, J. (1993):
Regional mapping of the Rowett nude gene (RONU) to rat chromosome 10q24-->q32
by localizing linked SYB2 and GH loci.
Cytogenet Cell Genet 63, 107-110
Kusaka, S., Horio, Y., Fujita, A., Matsushita, K., Inanobe, A., Gotow, T.,
Uchiyama, Y., Tano, Y. und Kurachi, Y. (1999):
Expression and polarized distribution of an inwardly rectifying K+ channel, Kir4.1, in
rat retinal pigment epithelium.
J Physiol 520 Pt 2, 373-381
Kusaka, S., Inanobe, A., Fujita, A., Makino, Y., Tanemoto, M., Matsushita, K.,
Tano, Y. und Kurachi, Y. (2001):
Functional Kir7.1 channels localized at the root of apical processes in rat retinal
pigment epithelium.
J Physiol 531, 27-36
Lagrutta, A. A., Bond, C. T., Xia, X. M., Pessia, M., Tucker, S. und Adelman, J. P.
(1996):
Inward rectifier potassium channels. Cloning, expression and structure-function
studies.
Jpn Heart J 37, 651-660
148
Lalwani, A. K., Goldstein, J. A., Kelley, M. J., Luxford, W., Castelein, C. M. und
Mhatre, A. N. (2000):
Human nonsyndromic hereditary deafness DFNA17 is due to a mutation in
nonmuscle myosin MYH9.
Am J Hum Genet 67, 1121-1128
Lee, M. S. und Ryu, S. H. (2002):
No association between the dopamine D3 receptor gene and Korean alcohol
dependence.
Psychiatr Genet 12, 173-176
Lerer, B., Segman, R. H., Fangerau, H., Daly, A. K., Basile, V. S., Cavallaro, R.,
Aschauer, H. N., McCreadie, R. G., Ohlraun, S., Ferrier, N., Masellis, M., Verga,
M., Scharfetter, J., Rietschel, M., Lovlie, R., Levy, U. H., Meltzer, H. Y., Kennedy,
J. L., Steen, V. M. und Macciardi, F. (2002):
Pharmacogenetics of tardive dyskinesia: combined analysis of 780 patients supports
association with dopamine D3 receptor gene Ser9Gly polymorphism.
Neuropsychopharmacology 27, 105-119
Lessenich, A., Lindemann, S., Richter, A., Hedrich, H. J., Wedekind, D., Kaiser,
A. und Löscher, W. (2001):
A novel black-hooded mutant rat (ci3) with spontaneous circling behavior but normal
auditory and vestibular functions.
Neuroscience 107, 615-628
Lessenich, A. (2002):
Charakterisierung zweier Rattenmutanten mitspontanem Drehverhalten
Hannover, Tierärztliche Hochschule, Ph. D. These
149
Lestienne, P. und Ponsot, G. (1988):
Kearns-Sayre syndrome with muscle mitochondrial DNA deletion.
Lancet 1, 885
Letts, V. A., Gervais, J. L. M. und Frankel, W. N. (1994):
Remutation at the shaker-1 locus.
Mouse Genome 92, 116
Liang, Y., Wang, A., Belyantseva, I. A., Anderson, D. W., Probst, F. J., Barber, T.
D., Miller, W., Touchman, J. W., Jin, L., Sullivan, S. L., Sellers, J. R., Camper, S.
A., Lloyd, R. V., Kachar, B., Friedman, T. B. und Fridell, R. A. (1999):
Characterization of the human and mouse unconventional myosin XV genes
responsible for hereditary deafness DFNB3 and shaker 2.
Genomics 61, 243-258
Libby, R. T. und Steel, K. P. (2001):
Electroretinographic anomalies in mice with mutations in Myo7a, the gene involved in
human Usher syndrome type 1B.
Invest Ophthalmol Vis Sci 42, 770-778
Lindemann, S., Lessenich, A., Ebert, U. und Löscher, W. (2001):
Spontaneous paroxysmal circling behavior in the ci2 rat mutant: epilepsy with
rotational seizures or hyperkinetic movement disorder?
Exp Neurol 172, 437-445
Liu, B. H. (1998):
Statistical Genomics – Linkage, Mapping, and QTL Analysis.
CRC Press, New York
150
Liu, X., Ondek, B. und Williams, D. S. (1998):
Mutant myosin VIIa causes defective melanosome distribution in the RPE of shaker-1
mice.
Nat Genet 19, 117-118
Liu, X., Udovichenko, I. P., Brown, S. D., Steel, K. P. und Williams, D. S. (1999):
Myosin VIIa participates in opsin transport through the photoreceptor cilium.
J Neurosci 19, 6267-6274
Liu, X., Vansant, G., Udovichenko, I. P., Wolfrum, U. und Williams, D. S. (1997):
Myosin VIIa, the product of the Usher 1B syndrome gene, is concentrated in the
connecting cilia of photoreceptor cells.
Cell Motil Cytoskeleton 37, 240-252
Lord, E. M. und Gates, W. H. (1929):
Shaker, a new mutation of the house mouse.
Am Nat 63, 435-442
Löscher, W., Richter, A., Nikkhah, G., Rosenthal, C., Ebert, U. und Hedrich, H. J.
(1996):
Behavioral and neurochemical dysfunction in the circling (ci) rat: a novel genetic
animal model of a movement disorder.
Neuroscience 74, 1135-1142
Marcus, D. C., Rokugo, M. und Thalmann, R. (1985):
Effects of barium and ion substitutions in artificial blood on endocochlear potential.
Hear Res 17, 79-86
Marcus, D. C., Wu, T., Wangemann, P. und Kofuji, P. (2002):
KCNJ10 (Kir4.1) potassium channel knockout abolishes endocochlear potential.
Am J Physiol Cell Physiol 282, C403-407
151
Matsuda, Y., Inoue, S., Seki, N., Hosoi, T., Orimo, A., Muramatsu, M. und Hori, T.
(1996):
Chromosome mapping of human (ZNF179), mouse, and rat genes for brain finger
protein (bfp), a member of the RING finger family.
Genomics 33, 325-327
Mburu, P., Liu, X. Z., Walsh, J., Saw, D., Jr., Cope, M. J., Gibson, F., Kendrick-
Jones, J., Steel, K. P. und Brown, S. D. (1997):
Mutation analysis of the mouse myosin VIIA deafness gene.
Genes Funct 1, 191-203
Melchionda, S., Ahituv, N., Bisceglia, L., Sobe, T., Glaser, F., Rabionet, R.,
Arbones, M. L., Notarangelo, A., Di Iorio, E., Carella, M., Zelante, L., Estivill, X.,
Avraham, K. B. und Gasparini, P. (2001):
MYO6, the human homologue of the gene responsible for deafness in Snell's waltzer
mice, is mutated in autosomal dominant nonsyndromic hearing loss.
Am J Hum Genet 69, 635-640
Mermall, V., Post, P. L. und Mooseker, M. S. (1998):
Unconventional myosins in cell movement, membrane traffic, and signal
transduction.
Science 279, 527-533
Mihalik, S. J., Morrell, J. C., Kim, D., Sacksteder, K. A., Watkins, P. A. und
Gould, S. J. (1997):
Identification of PAHX, a Refsum disease gene.
Nat Genet 17, 185-189
152
Miyauchi, K., Masaki, R., Taketani, S., Yamamoto, A., Akayama, M. und Tashiro,
Y. (1991):
Molecular cloning, sequencing, and expression of cDNA for rat liver microsomal
aldehyde dehydrogenase.
J Biol Chem 266, 19536-19542
Moller, C. G., Kimberling, W. J., Davenport, S. L., Priluck, I., White, V., Biscone-
Halterman, K., Odkvist, L. M., Brookhouser, P. E., Lund, G. und Grissom, T. J.
(1989):
Usher syndrome: an otoneurologic study.
Laryngoscope 99, 73-79
Mooseker, M. S. und Cheney, R. E. (1995):
Unconventional myosins.
Annu Rev Cell Dev Biol 11, 633-675
Muglia, P., Jain, U. und Kennedy, J. L. (2002):
A transmission disequilibrium test of the Ser9/Gly dopamine D3 receptor gene
polymorphism in adult attention-deficit hyperactivity disorder.
Behav Brain Res 130, 91-95
Nadal, N., Rolland, M. O., Tranchant, C., Reutenauer, L., Gyapay, G., Warter, J.
M., Mandel, J. L. und Koenig, M. (1995):
Localization of Refsum disease with increased pipecolic acidaemia to chromosome
10p by homozygosity mapping and carrier testing in a single nuclear family.
Hum Mol Genet 4, 1963-1966
Nuutila, A. (1970):
Dystrophia retinae pigmentosa - dysacusis syndrome (DRD): a study of the Usher- or
Hallgren syndrome.
J Genet Hum 18, 57-88
153
Oakley, B., 2nd und Green, D. G. (1976):
Correlation of light-induced changes in retinal extracellular potassium concentration
with c-wave of the electroretinogram.
J Neurophysiol 39, 1117-1133
Ossenkopp, K. P., Prkacin, A. und Hargreaves, E. L. (1990):
Sodium arsanilate-induced vestibular dysfunction in rats: effects on open-field
behavior and spontaneous activity in the automated digiscan monitoring system.
Pharmacol Biochem Behav 36, 875-881
Petit, C. (2001):
Usher syndrome: from genetics to pathogenesis.
Annu Rev Genomics Hum Genet 2, 271-297
Porsolt, R. D., Anton, G., Blavet, N. und Jalfre, M. (1978):
Behavioural despair in rats: a new model sensitive to antidepressant treatments.
Eur J Pharmacol 47, 379-391
Probst, F. J., Fridell, R. A., Raphael, Y., Saunders, T. L., Wang, A., Liang, Y.,
Morell, R. J., Touchman, J. W., Lyons, R. H., Noben-Trauth, K., Friedman, T. B.
und Camper, S. A. (1998):
Correction of deafness in shaker-2 mice by an unconventional myosin in a BAC
transgene.
Science 280, 1444-1447
Prokop, C. M., Lorcher, K. und Hedrich, H. J. (1993):
Leukocyte common antigen RT7 is characterized by more than two microsatellite
alleles.
Transplant Proc 25, 2795-2796
154
Pycock, C. J. (1980):
Turning behaviour in animals.
Neuroscience 5, 461-514
Rabbath, G., Necchi, D., de Waele, C., Gasc, J. P., Josset, P. und Vidal, P. P.
(2001):
Abnormal vestibular control of gaze and posture in a strain of a waltzing rat.
Exp Brain Res 136, 211-223
Redowicz, M. J. (1999):
Myosins and deafness.
J Muscle Res Cell Motil 20, 241-248
Reimann, F. und Ashcroft, F. M. (1999):
Inwardly rectifying potassium channels.
Curr Opin Cell Biol 11, 503-508
Ren, W. Z., Ng, G. Y., Wang, R. X., Wu, P. H., O'Dowd, B. F., Osmond, D. H.,
George, S. R. und Liew, C. C. (1994):
The identification of NP25: a novel protein that is differentially expressed by neuronal
subpopulations.
Brain Res Mol Brain Res 22, 173-185
Richardson, G. P., Forge, A., Kros, C. J., Fleming, J., Brown, S. D. und Steel, K.
P. (1997):
Myosin VIIA is required for aminoglycoside accumulation in cochlear hair cells.
J Neurosci 17, 9506-9519
155
Richardson, G. P., Forge, A., Kros, C. J., Marcotti, W., Becker, D., Williams, D.
S., Thorpe, J., Fleming, J., Brown, S. D. und Steel, K. P. (1999):
A missense mutation in myosin VIIA prevents aminoglycoside accumulation in early
postnatal cochlear hair cells.
Ann N Y Acad Sci 884, 110-124
Richter, A., Ebert, U., Nobrega, J. N., Vallbacka, J. J., Fedrowitz, M. und
Löscher, W. (1999):
Immunohistochemical and neurochemical studies on nigral and striatal functions in
the circling (ci) rat, a genetic animal model with spontaneous rotational behavior.
Neuroscience 89, 461-471
Rinchik, E. M., Carpenter, D. A. und Selby, P. B. (1990):
A strategy for fine-structure functional analysis of a 6- to 11-centimorgan region of
mouse chromosome 7 by high-efficiency mutagenesis.
Proc Natl Acad Sci U S A 87, 896-900
Rosenberg, T., Haim, M., Hauch, A. M. und Parving, A. (1997):
The prevalence of Usher syndrome and other retinal dystrophy-hearing impairment
associations.
Clin Genet 51, 314-321
Rozengurt, N., Lopez, I., Chiu, C. S., Kofuji, P., Lester, H. A. und Neusch, C.
(2003):
Time course of inner ear degeneration and deafness in mice lacking the Kir4.1
potassium channel subunit.
Hear Res 177, 71-80
156
Self, T., Mahony, M., Fleming, J., Walsh, J., Brown, S. D. und Steel, K. P. (1998):
Shaker-1 mutations reveal roles for myosin VIIA in both development and function of
cochlear hair cells.
Development 125, 557-566
Self, T., Sobe, T., Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Avraham, K. B. und Steel, K.
P. (1999):
Role of myosin VI in the differentiation of cochlear hair cells.
Dev Biol 214, 331-341
Serikawa, T., Kuramoto, T., Hilbert, P., Mori, M., Yamada, J., Dubay, C. J.,
Lindpainter, K., Ganten, D., Guenet, J. L., Lathrop, G. M. und et al. (1992):
Rat gene mapping using PCR-analyzed microsatellites.
Genetics 131, 701-721
Serikawa, T., Montagutelli, X., Simon-Chazottes, D. und Guenet, J. L. (1992):
Polymorphisms revealed by PCR with single, short-sized, arbitrary primers are
reliable markers for mouse and rat gene mapping.
Mamm Genome 3, 65-72
Shepherd, A. G., Lea, R. A., Hutchins, C., Jordan, K. L., Brimage, P. J. und
Griffiths, L. R. (2002):
Dopamine receptor genes and migraine with and without aura: an association study.
Headache 42, 346-351
Shimura, M., Yuan, Y., Chang, J. T., Zhang, S., Campochiaro, P. A., Zack, D. J.
und Hughes, B. A. (2001):
Expression and permeation properties of the K(+) channel Kir7.1 in the retinal
pigment epithelium.
J Physiol 531, 329-346
157
Smith, R. J., Berlin, C. I., Hejtmancik, J. F., Keats, B. J., Kimberling, W. J.,
Lewis, R. A., Moller, C. G., Pelias, M. Z. und Tranebjaerg, L. (1994):
Clinical diagnosis of the Usher syndromes. Usher Syndrome Consortium.
Am J Med Genet 50, 32-38
Snyder, L. A., Roberts, J. L. und Sealfon, S. C. (1991):
Alternative transcripts of the rat and human dopamine D3 receptor.
Biochem Biophys Res Commun 180, 1031-1035
Sokoloff, P. und Schwartz, J. C. (1995):
Novel dopamine receptors half a decade later.
Trends Pharmacol Sci 16, 270-275
Steel, K. P. und Bock, G. R. (1983):
Cochlear dysfunction in the jerker mouse.
Behav Neurosci 97, 381-391
Steinberg, R. H., Oakley, B., 2nd und Niemeyer, G. (1980):
Light-evoked changes in [K+]0 in retina of intact cat eye.
J Neurophysiol 44, 897-921
Strange, P. G. (1996):
Dopamine receptors: studies on their structure and function.
Adv Drug Res 28, 315
Strickberger, M. W. (1988):
Genetik
Carl Hanser Verlag, München, Wien
158
Takeuchi, S., Ando, M. und Kakigi, A. (2000):
Mechanism generating endocochlear potential: role played by intermediate cells in
stria vascularis.
Biophys J 79, 2572-2582
Tamayo, M. L., Bernal, J. E., Tamayo, G. E., Frias, J. L., Alvira, G., Vergara, O.,
Rodriguez, V., Uribe, J. I. und Silva, J. C. (1991):
Usher syndrome: results of a screening program in Colombia.
Clin Genet 40, 304-311
Tian, M., Chen, L., Xie, J. X., Yang, X. L. und Zhao, J. W. (2003):
Expression patterns of inwardly rectifying potassium channel subunits in rat retina.
Neurosci Lett 345, 9-12
Titus, M. (1999):
A class VII unconventional myosin is required for phagocytosis.
Curr Biol 9,1297–1303.
Truett, G. E., Brock, J. W., Lidl, G. M. und Kloster, C. A. (1994):
Stargazer (stg), new deafness mutant in the Zucker rat.
Lab Anim Sci 44, 595-599
Truett, G. E., Walker, J. A. und Brock, J. W. (1996):
A rat homolog of the mouse deafness mutant jerker (je).
Mamm Genome 7, 356-358
Ungerstedt, U. (1968):
6-Hydroxy-dopamine induced degeneration of central monoamine neurons.
Eur J Pharmacol 5, 107-110
159
Van Camp, G., Coucke, P. J., Akita, J., Fransen, E., Abe, S., De Leenheer, E. M.,
Huygen, P. L., Cremers, C. W. und Usami, S. (2002):
A mutational hot spot in the KCNQ4 gene responsible for autosomal dominant
hearing impairment.
Hum Mutat 20, 15-19
Vernon, M. (1969):
Usher's syndrome - a premium on prevention.
Sight Sav Rev 39, 152
Von Hörsten, S., Dimitrijevic, M., Markovic, B. M., Jankovic, B. D. (1993):
Effect of early experience on behavior and immune response in the rat.
Physiol Behav 54, 931-940
Wang, A., Liang, Y., Fridell, R. A., Probst, F. J., Wilcox, E. R., Touchman, J. W.,
Morton, C. C., Morell, R. J., Noben-Trauth, K., Camper, S. A. und Friedman, T. B.
(1998):
Association of unconventional myosin MYO15 mutations with human nonsyndromic
deafness DFNB3.
Science 280, 1447-1451
Weber, J. L. und May, P. E. (1989):
Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the
polymerase chain reaction.
Am J Hum Genet 44, 388-396
Weil, D., Blanchard, S., Kaplan, J., Guilford, P., Gibson, F., Walsh, J., Mburu, P.,
Varela, A., Levilliers, J., Weston, M. D. und et al. (1995):
Defective myosin VIIA gene responsible for Usher syndrome type 1B.
Nature 374, 60-61
160
Wu, X., Jung, G. und Hammer, J. A. (2000)
Functions of unconventional myosins.
Curr Opin Cell Biol 12, 42-51
Yeung, R. S., Hino, O., Vilensky, M., Buetow, K., Szpirer, C., Szpirer, J., Klinga-
Levan, K., Levan, G. und Knudson, A. G. (1993):
Assignment of 22 loci in the rat by somatic hybrid and linkage analysis.
Mamm Genome 4, 585-588
Yonemura, S., Hirao, M., Doi, Y., Takahashi, N., Kondo, T. und Tsukita, S.
(1998):
Ezrin/radixin/moesin (ERM) proteins bind to a positively charged amino acid cluster
in the juxta-membrane cytoplasmic domain of CD44, CD43, and ICAM-2.
J Cell Biol 140, 885-895
Yuan, Y., Shimura, M. und Hughes, B. A. (2003):
Regulation of inwardly rectifying K+ channels in retinal pigment epithelial cells by
intracellular pH.
J Physiol 549, 429-438
Zaritsky, J. J., Eckman, D. M., Wellman, G. C., Nelson, M. T. und Schwarz, T. L.
(2000):
Targeted disruption of Kir2.1 and Kir2.2 genes reveals the essential role of the
inwardly rectifying K(+) current in K(+)-mediated vasodilation.
Circ Res 87, 160-166
Zuo, J. (2002):
Transgenic and gene targeting studies of hair cell function in mouse inner ear.
J Neurobiol 53, 286-305
161
8. Anhang
Tabelle 9: Ergebnisse der neurophysiologischen Verhaltensuntersuchungen zur
Prüfung des Rotationsverhaltens und der Funktion des Innenohrs der
(LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2) Individuen
Tiernummer Rotations-VerhaltenAkustischer
Stimulus "Air-Rightning"-Test "Balance"-Test Schwimmtest
1 + - - - s.E.
2 - + + + 5 Min.
3 + - - - s.E.
4 - + + + 5 Min.
5 - + + + 5 Min.
6 + - - - s.E.
7 + - - - s.E.
8 - + + + 5 Min.
9 - + + + 5 Min.
10 - + + + 5 Min.
11 + - - - s.E.
12 - + + + 5 Min.
13 - + + + 5 Min.
14 - + + + 5 Min.
15 - + + + 5 Min.
16 + - - - s.E.
17 - + + + 5 Min.
18 - + + + 5 Min.
19 - + + + 5 Min.
20 + - - - s.E.
21 - + + + 5 Min.
22 + - - - s.E.
23 + - - - 30 Sek.
24 + - - - s.E.
25 + - - - 30 Sek.
26 - + + + 5 Min.
27 - + + + 5 Min.
28 + - - - s.E.
29 - + + + 5 Min.
30 + - - - s.E.
31 + - - - s.E.
162
Fortsetzung von Tabelle 9:
Tiernummer Rotations-VerhaltenAkustischer
Stimulus "Air-Rightning"-Test "Balance"-Test Schwimmtest
32 - + + + 5 Min.
33 + - - - s.E.
34 + - - - s.E.
35 - + + + 5 Min.
36 + - - - 30 Sek.
37 - + + + 5 Min.
38 + - - - s.E.
39 + - - - s.E.
40 + - - - s.E.
41 + - - - s.E.
42 - + + + 5 Min.
43 + - - - s.E.
44 - + + + 5 Min.
45 - + + + 5 Min.
46 + - - - 30 Sek.
47 - + + + 5 Min.
48 - + + + 5 Min.
49 - + + + 5 Min.
50 - + + + 5 Min.
51 - + + + 5 Min.
52 + - - - 30 Sek.
53 + - - - s.E.
54 - + + + 5 Min.
55 + - - - 30 Sek.
Legende zu Tabelle 9:
Die mit dem Symbol „+“ ausgezeichneten N2 Individuen zeigten ein positives
Ergebnis gemäß den in Kapitel 3.2.1 und 3.2.2 beschriebenen Bedingungen.
Die mit dem Symbol „-“ ausgezeichneten N2 Individuen zeigten ein negatives
Ergebnis gemäß den in Kapitel 3.2.1 und 3.2.2 beschriebenen Bedingungen.
Bei den Tieren, die mit der Bezeichnung „s.E.“ in der Rubrik „Schwimmtest“
ausgewiesenen sind erfolgte unmittelbar nach ihrer Verbringung in das
Schwimmbecken eine sofortige Entnahme, da sie nicht in der Lage waren zu
schwimmen.
163
Tabelle 10: Ergebnisse der neurophysiologischen Verhaltensuntersuchungen zur
Prüfung des Rotationsverhaltens der (BN/Ztm x BH.7A/Ztm-ci3)F1 x
BH.7A/Ztm-ci3 Individuen
Tiernummer Rotationsverhalten Tiernummer Rotationsverhalten1 - 35 +2 - 36 -3 - 37 -4 + 38 -5 + 39 -6 + 40 -7 - 41 -8 - 42 +9 + 43 +
10 + 44 +11 - 45 +12 - 46 +13 - 47 -14 - 48 -15 + 49 +16 + 50 -17 - 51 +18 + 52 +19 - 53 -20 - 54 +21 + 55 -22 + 56 +23 + 57 -24 - 58 -25 - 59 +26 + 60 +27 - 61 +28 + 62 +29 + 63 -30 - 64 -31 - 65 -32 - 66 -33 + 67 -34 + 68 +
164
Fortsetzung von Tabelle 10:
Tiernummer Rotationsverhalten Tiernummer Rotationsverhalten69 + 107 +70 - 108 -71 - 109 +72 + 110 +73 - 111 -74 + 112 +75 - 113 -76 - 114 -77 + 115 +78 + 116 -79 - 117 -80 - 118 -81 + 119 -82 - 120 -83 + 121 -84 + 122 +85 - 123 -86 - 124 -87 + 125 -88 + 126 +89 - 127 -90 + 128 +91 + 129 -92 + 130 +93 - 131 -94 + 132 +95 - 133 -96 + 134 +97 - 135 +98 + 136 -99 - 137 +
100 - 138 +101 + 139 -102 - 140 -103 + 141 -104 + 142 -105 + 143 -106 + 144 -
165
Fortsetzung von Tabelle 10:
Tiernummer Rotationsverhalten145 -146 +147 -148 +149 +150 -151 +152 +153 +154 -
Legende zu Tabelle 10:
Die mit dem Symbol „+“ ausgezeichneten N2 Individuen zeigten ein positives
Ergebnis gemäß den in Kapitel 3.2.1 beschriebenen Bedingungen.
Die mit dem Symbol „-“ ausgezeichneten N2 Individuen zeigten ein negatives
Ergebnis gemäß den in Kapitel 3.2.1 beschriebenen Bedingungen.
166
Tabelle 11: Untersuchte Mikrosatellitenmarker auf den Rattenchromosomen 1 bis 9
und 11 bis 20 ((LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x LEW/Ztm-ci2)
SSLP-Marker c2-Wert p-Wert ChromosomLokalisation in
cM
D1Mgh12 2,413 0,1203 RNO1 17,3D1Mit4 3,005 0,083 RNO1 63,7D1Mit2 3,864 0,0493 RNO1 76,9D1Mit1 0,708 0,4 RNO1 121,5
D2Wox36 1,408 0,2353 RNO2 47,7D2Mgh9 0,158 0,6909 RNO2 77D2Mit17 1,322 0,2502 RNO2 99,2
D3Mgh1 0,313 0,5757 RNO3 10,2D3Mit4 3,26 0,71 RNO3 45,9
D3Mit12 1,845 0,1744 RNO3 58,4D3Mgh8 3,173 0,749 RNO3 145,4
D4Wox32 0,223 0,6368 RNO4 20D4Mgh3 4,579 0,0324 RNO4 39,4D4Mit17 0,244 0,6215 RNO4 88,2
D4Mgh11 3,232 0,0722 RNO4 114,8D4Wox12 2,188 0,139 RNO4 134
D5Mgh1 2,714 0,2575 RNO5 0D5Mit10 2,114 0,146 RNO5 33,7D5Mit4 1,178 0,2778 RNO5 51,2
D5MCW 0,262 0,6089 RNO5 74,9
D6Mit10 0,357 0,5503 RNO6 9,4D6Mit8 0,666 0,4145 RNO6 30,1D6Pas1 0,407 0,5236 RNO6 78,5
D7Rat157 1,033 0,3096 RNO7 0D7Mgh9 2,637 0,1044 RNO7 22,9D7Wox1 0,947 0,3304 RNO7 29,2D7Mit7 0,488 0,4846 RNO7 44,9
D7Mit16 0,066 0,7969 RNO7 75,6D7Mgh1 0,024 0,8759 RNO7 90,2D7Arb7 0,003 0,9547 RNO7 98,8
167
Fortsetzung von Tabelle 11:
SSLP-Marker c2-Wert p-Wert ChromosomLokalisation in
cM
D8Mgh11 0,213 0,6444 RNO8 42,8D8Mit7 5,158 0,0231 RNO8 55,9
D8Mgh4 0,738 0,3903 RNO8 65,1D8Mgh1 0,009 0,9231 RNO8 93,8
D9Mit2 0,011 0,915 RNO9 38,5D9Mit6 0,807 0,369 RNO9 78,4
D9Mgh5 0,756 0,3845 RNO9 85,1
D11Mgh3 0,878 0,3487 RNO11 20,9D11Arb10 1,28 0,2579 RNO11 29,8D11Mit1 0,652 0,4194 RNO11 60,9
D12Wox8 0,007 0,9337 RNO12 5,7D12Wox5 0,026 0,8729 RNO12 44,7D12Wox6 0,207 0,649 RNO12 54,8
D13Mgh1 0,035 0,8523 RNO13 8,9
D14Mit4 3,192 0,074 RNO14 46,7D14Mit8 1,107 0,2927 RNO14 49,6
D14Mit2 0,148 0,7008 RNO14 71,7D14Mit1 0,047 0,8278 RNO14 77,6
D15Mgh7 0,261 0,6096 RNO15 22,4D15Mgh2 2,954 0,9863 RNO15 47,9D15Mgh6 1,13 0,2879 RNO15 92,8
D16Mgh4 0,117 0,7321 RNO16 6,8D16Mit2 0,15 0,6984 RNO16 45,8
D17Mit5 2,196 0,1384 RNO17 45,8D17Mgh5 0,744 0,3883 RNO17 68D17Mgh2 1,568 0,2105 RNO17 86,1D18Rat32 0,8 0,3711 RNO18 0,06D18Mit8 0,436 0,8041 RNO18 23,5D18Mit3 0,654 0,4186 RNO18 46
D19Rat17 6,353 0,0117 RNO19 6,75D19Mgh2 5,991 0,0144 RNO19 18D19Rat5 0,293 0,5881 RNO19 46,35
168
Fortsetzung von Tabelle 11:
SSLP-Marker c2-Wert p-Wert ChromosomLokalisation in
cM
D20Arb2 1,214 0,2705 RNO20 0D20Rat21 0,294 0,5784 RNO20 0D20Rat66 1,548 0,2135 RNO20 2,43D20Rat48 0,329 0,5662 RNO20 5,39D20Rat67 0,158 0,6909 RNO20 154,8D20Rat32 3,733 0,0534 RNO20 82,1 (cR)D20Mgh1 1,236 0,5318 RNO20 636 (cR)
169
Tabelle 12: Untersuchte Mikrosatellitenmarker auf den Rattenchromosomen 1 bis
10 und 12 bis 20 ((BN/Ztm x BH.7A/Ztm-ci3)F1 x BH.7A/Ztm-ci3)
SSLP-Marker c2-Wert p-Wert ChromosomLokalisation in
cM
D1Wox6 2,4 0,1213 RNO1 70,1
D2Mit17 1,222 0,269 RNO2 37,4
D3Mgh11 0,133 0,715 RNO3 46,8
D4Rat153 0,6 0,4386 RNO4 32,5
D5Mgh6 0,144 0,7048 RNO5 47,1
D6Mit1 2,4 0,1213 RNO6 54,4
D7Mit4 0,536 0,4642 RNO7 31,7
D8Rat43 2,783 0,0953 RNO8 39
D9Mgh1 0,144 0,7048 RNO9 967(cR)
D10Mgh10 0,285 0,5936 RNO10 39,5
D12Rat107 1,222 0,269 RNO12 42,5
D13Rat30 1,222 0,269 RNO13 23,8
D14Mit4 5 0,253 RNO14 31,8
D15Rat126 0,136 0,7125 RNO15 49
D16Mit3 0,133 0,715 RNO16 16,4
D17Rat79 0,333 0,5637 RNO17 30,2
D18Mgh1 0,144 0,7048 RNO18 17,5
D19Rat58 0,136 0,7125 RNO19 44,9
D20Wox1 2,222 0,136 RNO20 47
Legende zu Tabelle 11 und 12:
Die in Tabelle 11 und Tabelle 12 beschriebenen Lokalisationen der
Mikrosatellitenmarker sind den genetischen Kopplungskarten der Datenbanken „Rat
Genome Database“ und „Genetic Linkage Maps of the Rat Genome (1997)”
entnommen. Die Position der Marker D20Rat32 und D20Mgh1 (Tabelle 11) sowie
D9Mgh1 (Tabelle 12) entstammen „Radiation Hybrid“-Karten der Datenbank „Rat
Genome Database“ und sind in centiRay (cR) angegeben.
170
Tabelle 13: PCR- und Gelelektrophoresedaten der untersuchten nicht polymorphen
Drd3-gekoppelten Mikrosatelliten sowie die Ratten-BAC-Klone auf
denen sie lokalisiert sind
Ratten- Primer sequenzen Errechnete OptimaleKlon (5/ fi 3/) Produkt- Anlagerungs-
größe temperatur
CH230-8A22 f: CCT CCA AAT TCT 307 bp 56 °CAAG AAA AGC AAC CCr: GTA AGC TTT CTCTCA AGC CTC CAA GG
CH230-8A22 f: CAG AGA GAG GGT 574 bp 56 °CGTG TAA GAA GCr: TCA GGG AGA ACTGTG AGA GTC TC
CH230-8A22 f: CAT TCA AAC CGC 287 bp 60 °CCAC CAC CAC CCr: TTT CCT CTG TGCCTG CGG AAG GG
CH230-43P17 f: GGG CCA GGC ATG 298 bp 62 °CGTG CCT CAC ACC TTr: GCC CAG ACG AGGGTG AGG GGT CCC TG
CH230-43P17 f: CCC AGG ACC CAC 260 bp 56 °CATG GTA GTT CTCr: GGG CTG CTT TGCCTT TTC CCA TTA T
CH230-43P17 f: GTG ATA ACC ACC 374 bp 57 °CCCT TCC AAT AGG Ar: CCA ATG TAA TAACCA GGT AGG CGT G
171
Fortsetzung von Tabelle 13:
Ratten- Primer sequenzen Errechnete OptimaleKlon (5/ fi 3/) Produkt- Anlagerungs-
größe temperatur
CH230-7P17 f: AGA CAT GGG AGG 265 bp 56 °CAAT GGG ATG Cr: TTT GTG TAA TTCCTC CTT TCC TCC C
CH230-7P17 f: AAC TGC TGG GCC 343 bp 59 °CATC TCT CCA GCCr: CCA GCA GCT CACAGC TGC CTG TGA
CH230-7P17 f: CAA AAT TCC AGG 219 bp 58 °CAGG AAC GGC TGGr: CTC TGC CTC CCAAGT GCT GGG ATT
CH230-6K21 f: GCT AAG CAA CTA 473 bp 53 °CCTC TAC CAC TGG GCr: GGG AAG GAG CAGTGA GAC AGA CTT GG
CH230-6K21 f: GGA GGG TCC GTA 237 bp 54 °CGGA ACA AAA AGG AAr: GTT AGT AAA GGAGAC CAT TAT GGC CC
CH230-147H10 f: GGT CTA CTG TCT 453 bp 58 °CAGG ACA ATG AGG GCr: TTC TTG CCT AGCCAC TTG GGA C
CH230-147H10 f: ATT ATT TAG GAA 744 bp 54 °CGCT AAA TGA TAr: CTA TTT ACT TACTTA ATT TCA TTT C
172
Tabelle 14: Mit Hi l fe der RNO10-Mikrosatel l i tenmarker erhobene
Genotypisierungsdaten der Individuen der (LEW/Ztm-ci2 x BN/Ztm)F1 x
LEW/Ztm-ci2 Rückkreuzung
+ = ci2-Phänotyp L = LEW/Ztm-ci2-Genotyp
o = nicht betroffene Ratten B = BN/Ztm-Genotyp
Tiernummer PhänotypD10Ztm1(Myo15)
D10Ztm2(Znf179)
D10Ztm3(Myo1c)
D10Ztm4(Aldh3a1)
1 + L L L L2 + L L L L3 o L/B L/B L/B L/B4 o L/B L/B L/B L/B5 o L L L/B L6 o L/B L/B L/B L/B7 + L L L/B L8 o L/B L/B L/B L/B9 o L L L/B L10 + L L L L11 o L/B L/B L/B L/B12 o L/B L/B L/B L/B13 o L L L L14 o L/B L/B L/B L/B15 o L L L L16 o L/B L/B L L/B17 + L L L L18 o L/B L/B L/B L/B19 o L/B L/B L L/B20 o L L L L21 o L/B L/B L/B L/B22 + L L L L23 o L/B L/B L/B L/B24 o L/B L/B L/B L/B25 o L/B L/B L/B L/B26 o L/B L/B L/B L/B27 + L L L L28 o L/B L/B L/B L/B29 o L/B L/B L/B L/B30 o L/B L/B L/B L/B31 o L/B L/B L/B L/B32 + L L L L33 + L L L/B L34 o L/B L/B L/B L/B35 o L/B L/B L/B L/B
173
Fortsetzung von Tabelle 14:
Tiernummer PhänotypD10Ztm1(Myo15)
D10Ztm2(Znf179)
D10Ztm3(Myo1c)
D10Ztm4(Aldh3a1)
36 o L/B L/B L L/B37 + L L L L38 o L/B L/B L/B L/B39 o L L L L40 o L L L L41 + L L L L42 + L L L L43 o L/B L/B L/B L/B44 o L L L/B L45 o L L L/B L46 + L L L L47 o L/B L/B L/B L/B48 o L L L L49 + L L L L50 o L/B L/B L/B L/B51 o L L L/B L52 o L/B L/B L/B L/B53 + L L L L54 o L/B L/B L/B L/B55 + L L L L56 o L/B L/B L/B L/B57 + L L L L58 + L L L L59 + L L L L60 + L L L L61 + L L L L62 o L/B L/B L/B L/B63 + L L L L64 + L L L L65 + L L L/B L66 + L L L/B L67 + L L L L68 o L/B L/B L/B L/B69 o L/B L/B L/B L/B70 + L L L L71 o L/B L/B L/B L/B72 + L L L L73 o L L/B L/B L/B74 o L L L L75 + L L L L76 o L/B L/B L/B L/B77 o L/B L/B L/B L/B78 o L/B L/B L/B L/B79 o L/B L/B L L/B80 o L/B L/B L/B L/B
174
Fortsetzung von Tabelle 14:
Tiernummer PhänotypD10Ztm1(Myo15)
D10Ztm2(Znf179)
D10Ztm3(Myo1c)
D10Ztm4(Aldh3a1)
81 + L L L L82 + L L L L83 o L/B L/B L/B L/B84 o L/B L/B L/B L/B85 + L L L L86 + L L L L87 o L/B L/B L/B L/B88 o L/B L/B L/B L/B89 o L/B L/B L/B L/B90 o L/B L/B L/B L/B91 o L/B L/B L L/B92 o L/B L/B L L/B93 + L L L L94 o L/B L/B L/B L/B95 o L L L L96 o L L L L97 + L L L L98 + L L L L99 + L L L L100 + L L L L101 o L/B L/B L/B L/B102 o L/B L/B L/B L/B103 o L/B L/B L/B L/B104 o L/B L/B L/B L/B105 o L/B L/B L/B L/B106 + L L L L107 o L L L L108 o L/B L/B L/B L/B109 + L L L L110 + L L L L111 o L/B L/B L/B L/B112 o L L L L113 o L/B L/B L/B L/B114 + L L L/B L115 + L L L L116 + L L L L117 + L L L/B L118 o L/B L/B L L/B119 + L L L/B L120 o L/B L/B L/B L/B121 o L/B L/B L/B L/B122 o L/B L/B L/B L/B123 o L/B L/B L/B L/B124 o L/B L/B L/B L/B125 + L L L L
175
Fortsetzung von Tabelle 14:
Tiernummer PhänotypD10Ztm1(Myo15)
D10Ztm2(Znf179)
D10Ztm3(Myo1c)
D10Ztm4(Aldh3a1)
126 + L L L/B L127 o L L L/B L128 o L/B L/B L/B L/B129 o L L L L130 o L L L L131 o L L L/B L132 + L L L L133 o L/B L/B L/B L/B134 o L/B L/B L/B L/B135 o L/B L/B L/B L/B136 o L/B L/B L/B L/B137 + L L L L138 o L/B L/B L/B L/B139 o L/B L/B L/B L/B140 + L L L L141 o L/B L/B L/B L/B142 o L L L L143 o L/B L/B L/B L/B144 o L/B L/B L/B L/B145 + L L L L146 + L L L L147 + L L L L148 o L/B L/B L/B L/B149 o L/B L/B L/B L/B150 o L/B L/B L/B L/B151 o L/B L/B L/B L/B152 + L L L L153 o L/B L/B L L/B154 + L L L L155 o L/B L/B L L/B156 + L L L L157 + L L L L158 o L/B L/B L L/B159 o L/B L/B L/B L/B160 o L/B L/B L/B L/B161 + L L L/B L162 + L L L/B L163 + L L L L164 o L/B L/B L L/B165 o L L L L166 + L L L L167 + L L L L168 o L/B L/B L/B L/B169 o L/B L/B L/B L/B170 + L L L L
176
Fortsetzung von Tabelle 14:
Tiernummer PhänotypD10Ztm1(Myo15)
D10Ztm2(Znf179)
D10Ztm3(Myo1c)
D10Ztm4(Aldh3a1)
171 + L L L L172 + L L L/B L173 + L L L L174 + L L L/B L175 + L L L L176 o L/B L/B L L/B177 o L/B L/B L/B L/B178 + L L L L179 o L/B L/B L/B L/B180 o L/B L/B L L/B181 + L L L L182 o L/B L/B L/B L/B183 + L L L/B L184 + L L L/B L185 + L L L L186 + L L L L187 o L/B L/B L/B L/B188 o L/B L/B L/B L/B189 + L L L L190 + L L L L191 + L L L/B L192 o L L L L193 + L L L L194 + L L L L195 + L L L L196 + L L L L197 + L L L L198 + L L L L199 + L L L L200 + L L L L201 + L L L L202 + L L L L203 + L L L L204 + L L L L205 + L L L L206 + L L L L207 + L L L L208 + L L L L
177
Fortsetzung von Tabelle 14:
Tiernummer Phänotyp D10Ppy D10Mgh6 D10Mgh10 D10Rat47 D10Rat45 D10Rat164
1 + L L L L L L2 + L L L L/B L L3 o L/B L/B L/B L L/B L/B4 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B5 o L/B L/B L L L L6 o L/B L/B L/B L L L/B7 + L/B L/B L L/B L L8 o L L/B L/B L/B L/B L/B9 o L L L L/B L/B L10 + L L L L/B L L11 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B12 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B13 o L/B L L L L L14 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B15 o L L L L/B L L16 o L L L/B L/B L/B L/B17 + L L L L L L18 o L/B L/B L L L L/B19 o L L/B L/B L L L/B20 o L L L L L L21 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B22 + L L L L L L23 o L L/B L/B L/B L/B L/B24 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B25 o L/B L/B L/B L L/B L/B26 o L/B L/B L/B - L L/B27 + L - - - L/B L28 o L/B L/B L L/B L/B L/B29 o L L/B L/B L L L/B30 o L L/B L/B L L/B L/B31 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B32 + L L L L L L33 + L L L L L L34 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B35 o L/B L/B L/B - L/B L/B36 o L L L/B L/B L/B L/B37 + L/B L L L/B L/B L38 o L/B L/B L/B L L L/B39 o L L L L/B L/B L/B40 o L L L L/B L L41 + L L L L L L/B42 + L L L L/B L/B L43 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B44 o L/B L/B L/B L L L/B
178
Fortsetzung von Tabelle 14:
Tiernummer Phänotyp D10Ppy D10Mgh6 D10Mgh10 D10Rat47 D10Rat45 D10Rat164
45 o L/B L/B L L L L46 + L L L L L L47 o L L/B L/B L L L/B48 o L L L L L L49 + L L L L/B L/B L50 o L/B L/B L/B L L L/B51 o L/B L/B L L L L52 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B53 + L L L L/B L/B L54 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B55 + L/B L L L/B L/B L56 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B57 + L L L L L L58 + L L L L L L59 + L/B L L L L L60 + L L L L L L61 + L L L L L L62 o L/B L/B L/B - L L/B63 + L L L - L L64 + L L L L L/B L65 + L/B L/B L L L L66 + L/B L/B L L L L67 + L L L L L L68 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B69 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B70 + L L L L L/B L71 o L L/B L/B L/B L/B L/B72 + L L L L L L73 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B74 o L L L L/B L L75 + L L L L L L76 o L L/B L L L L77 o L/B L/B L/B - L/B L/B78 o L/B L/B L/B - L/B L/B79 o L L L/B L/B L/B L/B80 o L L/B L/B L L L/B81 + L L L/B L/B L/B L82 + L/B L L L L L83 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B84 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B85 + L L L L L L86 + L L L/B L/B L/B L87 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B88 o L L/B L/B L/B L/B L/B
179
Fortsetzung von Tabelle 14:
Tiernummer Phänotyp D10Ppy D10Mgh6 D10Mgh10 D10Rat47 D10Rat45 D10Rat164
89 o L/B L/B L L L L/B90 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B91 o L/B L L/B L/B L/B L/B92 o L/B L/B - L/B L/B L/B93 + L L - L L L94 o L/B L/B L L/B - L/B95 o L/B L L/B L/B L/B L96 o L L L L L L97 + L L L L/B L L98 + L/B L L L/B L/B L99 + L L L L L L100 + L L L L/B L/B L101 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B102 o L L/B L/B L/B L/B L/B103 o L L/B L/B L/B L/B L/B104 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B105 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B106 + L L L L L L107 o L L L L L L108 o L L/B L/B L/B L/B L/B109 + L L L/B L/B L/B L/B110 + L/B L L L/B L/B L/B111 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B112 o L L L L L L113 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B114 + L/B L/B L L L L115 + L L L L L L116 + L L L L L L117 + L L L L L L118 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B119 + L L L L L L120 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B121 o L/B L/B L/B - L/B L/B122 o L/B L/B L/B L L/B L/B123 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B124 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B125 + L L L L/B L/B L126 + L L/B L L L L127 o L/B L/B L L L L128 o L/B L/B L/B L L L/B129 o L/B L L L L L130 o L/B L L L L L131 o L/B L/B L L L L132 + L/B L L L L L133 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B134 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B
180
Fortsetzung von Tabelle 14:
Tiernummer Phänotyp D10Ppy D10Mgh6 D10Mgh10 D10Rat47 D10Rat45 D10Rat164
135 o L/B L/B L/B L L L/B136 o L L/B L/B L L L/B137 + L L L L L L138 o L L/B L/B L/B L/B L/B139 o L/B L/B L/B L L L/B140 + L L L L/B L/B L141 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B142 o L L L/B L/B L/B L143 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B144 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B145 + L L L L L L146 + L L L L/B L L147 + L L L L/B L/B L148 o L L/B L/B L L/B L/B149 o L/B L/B L/B L/B L L/B150 o L/B L/B L L - L/B151 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B152 + L L L L L L153 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B154 + L/B L L L L L155 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B156 + L L L L L L157 + L L L L L L158 o L/B L/B L/B L L/B L/B159 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B160 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B161 + L L L L L L162 + L L L L L L163 + L L L L L L164 o L L/B L/B L/B L/B L/B165 o L L L/B L/B L L166 + L L L L L L167 + L/B L/B L L L L168 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B169 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B170 + L/B L/B L L L L171 + L L L L L L172 + L L L/B L/B L/B L173 + L/B L L L L L174 + L L L L L L175 + L L L L L L176 o L L/B L/B L L L/B177 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B178 + L L L L/B L/B L179 o L L/B L/B L L L/B180 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B
181
Fortsetzung von Tabelle 14:
Tiernummer Phänotyp D10Ppy D10Mgh6 D10Mgh10 D10Rat47 D10Rat45 D10Rat164
181 + L L L/B L/B L/B L182 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B183 + L L L L/B L L184 + L L L L/B L/B L185 + L L L L/B L L186 + L L L L L L187 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B188 o L L/B L/B - L L/B189 + L L L/B L/B L/B L/B190 + L L L L L L191 + L/B L/B L L L L192 o L/B L/B L/B - L L193 + L/B L L/B L/B L/B L194 + L/B L L L L L195 + L L L L/B L/B L196 + L L L/B L L/B L197 + L L L L/B L/B L198 + L L L L L L199 + L L L L L L200 + L L L L/B L/B L201 + L L L L L L202 + L L L L/B L/B L203 + L/B L L L L L204 + L L L L L L205 + L L L L L L206 + L/B L L L L L207 + L L L L L L208 + L L L/B L/B L/B L
182
Fortsetzung von Tabelle 14:
Tiernummer Phänotyp D10Rat218 D10Rat26 D10Mgh4 D10Mit2 D10Rat126 D10Rat166
1 + L L L L L L2 + L/B L L L L L3 o L L/B L/B L/B L/B L/B4 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B5 o L L/B L/B L/B L L6 o L L/B L L/B L/B L/B7 + L L/B L/B L/B L L8 o L/B L/B L L/B L/B L/B9 o L/B L L L L L
10 + L/B L L L L L11 o - L/B - L/B L/B L/B12 o - L/B L/B L/B L/B L/B13 o L L L/B L L L14 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B15 o - L L L L L16 o L/B L L L L/B L/B17 + L L L L L L18 o L L/B L/B L/B L/B L/B19 o L L/B L L/B L/B L/B20 o L L L L L L21 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B22 + L L L L L L23 o L/B L/B L L/B L/B L/B24 o L/B L/B L L/B L/B L/B25 o L L/B L/B L L/B L/B26 o L L/B L/B L/B L/B L/B27 + - L L L L L28 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B29 o L L L L L/B L/B30 o L/B L L L L/B L/B31 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B32 + L L/B L/B L L L33 + - L/B L/B L L L34 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B35 o L L/B L/B L/B L/B L/B36 o L/B L L L L/B L/B37 + L/B L L/B L L L38 o L L/B L/B L/B L/B L/B39 o L/B L L L/B L L40 o L/B L L L L L41 + - L L L/B L L42 + L/B L L L L L43 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B44 o L L/B L/B L L L45 o L L/B L/B L/B L L
183
Fortsetzung von Tabelle 14:
Tiernummer Phänotyp D10Rat218 D10Rat26 D10Mgh4 D10Mit2 D10Rat126 D10Rat166
46 + L L L L L L47 o L L/B L L/B L/B L/B48 o L L L L L L49 + L/B L L/B L L L50 o L L/B L/B L/B L/B L/B51 o L L/B L/B L/B L L52 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B53 + L/B L L L L L54 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B55 + L/B L L/B L L L56 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B57 + L L L/B L L L58 + L L L L L L59 + L L/B L/B L L L60 + L L L L L L61 + L L L L L L62 o L L/B L/B L/B L/B L/B63 + L/B L L L L L64 + L/B L L L L L65 + L L/B L/B L/B L L66 + L L/B L/B L/B L L67 + L L L L L L68 o L L/B L/B L/B L/B L/B69 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B70 + L/B L L L L/B L71 o L/B L/B L L/B L/B L/B72 + L L L L L L73 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B74 o L L L/B L L L75 + L L L L L L76 o - L/B L L/B L L77 o L L/B L/B L/B L/B L/B78 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B79 o L/B L L L L/B L/B80 o L L/B L L/B L/B L/B81 + L/B L L L L L82 + L L L/B L L L83 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B84 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B85 + L L/B L L L L86 + L/B L L L L L87 o L/B L L/B L/B L/B L/B88 o L L/B L L/B L/B L/B89 o L L/B L/B L/B L/B L/B90 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B91 o L/B L L/B L/B L/B L/B
184
Fortsetzung von Tabelle 14:
Tiernummer Phänotyp D10Rat218 D10Rat26 D10Mgh4 D10Mit2 D10Rat126 D10Rat166
92 o L/B L L/B L L/B L/B93 + L L L L L L94 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B95 o L/B L/B L/B L L L96 o L L L L L L97 + L/B L L L L L98 + L/B L L/B L L L/B99 + L L L L L L100 + L/B L L L L L/B101 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B102 o L/B L/B L L/B L/B L/B103 o L/B L/B L L/B L/B L/B104 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B105 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B106 + L L L L L L107 o L L L L L L108 o L/B L L L/B L/B L/B109 + L/B L L L/B L/B L110 + L/B L L/B L L L111 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B112 o L L - L L L113 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B114 + L L/B - L/B L L115 + L L L L L L116 + L L L L L L117 + L L L L L L118 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B119 + L L L L L L120 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B121 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B122 o L L/B L/B L/B L/B L/B123 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B124 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B125 + L/B L L L L L126 + L L/B L/B L/B L L127 o L L/B L/B L/B L L128 o L L/B L/B L/B L/B L/B129 o L L L/B L L L130 o L L L L L L131 o L L/B L L/B L L132 + L L L L/B L L133 o L/B L/B L L/B L/B L/B134 o L/B L/B L L/B L/B L/B135 o L L/B L/B L/B L/B L/B136 o L L/B L/B L/B L/B L/B137 + L L L L L L/B
185
Fortsetzung von Tabelle 14:
Tiernummer Phänotyp D10Rat218 D10Rat26 D10Mgh4 D10Mit2 D10Rat126 D10Rat166
138 o L/B L/B L L/B L/B L/B139 o L L/B L L/B L/B L/B140 + L/B L L L L L141 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B142 o L L L L L L143 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B144 o L/B L/B L L/B L/B L/B145 + L L L L L L146 + L/B L L L L L147 + L/B L L L L L148 o L/B L/B L L/B L/B L/B149 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B150 o L L/B L/B L/B L/B L/B151 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B152 + L L L L L L153 o L/B L/B L L/B L/B L/B154 + L L L/B L L L155 o L/B L/B L L/B L/B L/B156 + L/B L L L L L157 + L L L L L L158 o L L/B L/B L/B L/B L/B159 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B160 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B161 + L L L L L L162 + L L L L L L163 + L L L/B L L L164 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B165 o L L L L L L166 + L L L L L L167 + L L/B L/B L/B L L168 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B169 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B170 + L L/B L/B L/B L L171 + L L L L L L172 + L/B L L L L L173 + L/B L L/B L L L174 + L L L/B L L L175 + L L L L L L176 o L L/B L L/B L/B L/B177 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B178 + L/B L L L L L179 o L L/B L L/B L/B L/B180 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B181 + L/B L L L L L182 o L/B L/B L L/B L/B L/B183 + L/B L L L L L
186
Fortsetzung von Tabelle 14:
Tiernummer Phänotyp D10Rat218 D10Rat26 D10Mgh4 D10Mit2 D10Rat126 D10Rat166
184 + L/B L L L L L185 + L/B L L L L L186 + L L L L L L187 o L/B L/B L/B L/B L/B L/B188 o L L/B L L/B L/B L/B189 + L/B L - L L/B L/B190 + L L L L L L191 + L L/B L/B L/B L L192 o L L L/B L L L193 + L/B L L/B L L L194 + L L L/B L L L195 + L/B L L L L L196 + L/B L L L L L197 + L/B L L L L L198 + L L L L L L199 + L/B L L L L L200 + L/B L L L L L201 + L L L L L L202 + L/B L L L L L203 + L L/B L/B L L L204 + L L L/B L L L205 + L L L L L L206 + L L L/B L L L207 + L L L L L L208 + L/B L L L L L
187
Fortsetzung von Tabelle 14:
Tiernummer Phänotyp D10Rat171 D10Rat 32 D10Rat31 D10Rat168 D10Rat116
1 + L L L L L2 + L L L L L3 o L/B L/B L/B L/B L/B4 o L/B L/B L/B L/B L/B5 o L L L L L6 o L/B L/B L/B L/B L/B7 + L L L L L8 o L/B L/B L/B L/B L/B9 o L L L L L
10 + L L L L L11 o L/B L/B L/B L/B L/B12 o L/B L/B L/B L/B L/B13 o L L/B L L L14 o L/B L L/B L/B L/B15 o L/B L/B L L L/B16 o L L/B L L L/B17 + L L L L L18 o L/B L/B L/B L L/B19 o L/B L/B L/B L/B L/B20 o L L L L L21 o L L/B L/B L/B L/B22 + L L L L L23 o L/B L/B L/B L/B L/B24 o L/B L/B L L/B L/B25 o L/B L/B L/B L/B L/B26 o L/B L/B L/B L/B L/B27 + L L L L/B L28 o L/B L/B L/B L/B L/B29 o L/B L/B L/B L/B L/B30 o L/B L/B L/B L/B L/B31 o L/B L/B L/B L/B L/B32 + L L L L L33 + L L L L L34 o L/B L/B L/B L/B L/B35 o L/B L/B L/B L/B L/B36 o L/B L/B L/B L/B L/B37 + L L L L L38 o L/B L/B L/B L/B L/B39 o L L L L L40 o L L L L L/B41 + L L L L L42 + L L L L L43 o L/B L/B L/B L/B L/B44 o L L/B L L L45 o L L L L L
188
Fortsetzung von Tabelle 14:
Tiernummer Phänotyp D10Rat171 D10Rat 32 D10Rat31 D10Rat168 D10Rat116
46 + L L L L L47 o L/B L/B L/B L/B L/B48 o L L L L L49 + L L L L L50 o L L/B L/B L/B L/B51 o L L/B L/B L L/B52 o L/B L/B L/B L/B L/B53 + L L L L L54 o L/B L/B L/B L/B L/B55 + L L L L L56 o L/B L/B L/B L/B L/B57 + L L L L L58 + L L L L L59 + L L L L L60 + L L L L L61 + L L/B L L L62 o L/B L/B L/B L/B L/B63 + L L L L L64 + L L L L L65 + L L/B L/B L L/B66 + L L/B L/B L L/B67 + L L L L L68 o L/B L/B L/B L/B L/B69 o L/B L/B L/B L/B L/B70 + L L L L L71 o L L/B L/B L/B L/B72 + L L/B L L L73 o L/B L/B L/B L/B L/B74 o L L L L L75 + L L L L L76 o L L/B L/B L L/B77 o L L/B L/B L/B L/B78 o L/B L/B L/B L/B L/B79 o L/B L/B L/B L/B L/B80 o L/B L/B L/B L/B L/B81 + L L L L/B L82 + L L L L L83 o L L/B L/B L/B L/B84 o L/B L/B L/B L/B L/B85 + L L L L L86 + L L L L L87 o L/B L/B L/B L/B L/B88 o L/B L/B L/B L/B L/B89 o L/B L/B L/B L/B L/B90 o L/B L/B L/B L/B L/B91 o L/B L/B L/B L/B L
189
Fortsetzung von Tabelle 14:
Tiernummer Phänotyp D10Rat171 D10Rat 32 D10Rat31 D10Rat168 D10Rat116
92 o L/B L/B L/B L/B L93 + L L L L L94 o L L/B L/B L/B L/B95 o L L L L L96 o L L L/B L L97 + L L L L L98 + L L L L L99 + L L L L L100 + L L L L L101 o L/B L/B L/B L/B L/B102 o L L/B L/B L/B L/B103 o L/B L/B L/B L/B L/B104 o L/B L/B L/B L/B L/B105 o L/B L/B L/B L/B L/B106 + L L L L L107 o L L L L/B L108 o L/B L/B L/B L/B L/B109 + L/B L L/B L/B L110 + L L L L -111 o L/B L/B L/B L/B L/B112 o L L L L L113 o L/B L/B L/B L/B L/B114 + L L L L L115 + L L L L L116 + L L L L L117 + L L L L L118 o L/B L/B L/B L/B L/B119 + L L L L L120 o L/B L/B L/B L/B L/B121 o L/B L/B L/B L/B L/B122 o L/B L/B L/B L/B L/B123 o L/B L/B L/B L/B L/B124 o L/B L/B L L/B L/B125 + L L L L L126 + L L/B L/B L L/B127 o L L L L L128 o L/B L/B L/B L/B L/B129 o L L L L L130 o L L L L L131 o L L/B L/B L L/B132 + L L L L L133 o L/B L/B L/B L/B L/B134 o L/B L L/B L/B L/B135 o L/B L/B L/B L/B L/B136 o L/B L/B L/B L/B L/B137 + L L L L L
190
Fortsetzung von Tabelle 14:
Tiernummer Phänotyp D10Rat171 D10Rat 32 D10Rat31 D10Rat168 D10Rat116
138 o L/B L/B L/B L/B L/B139 o L/B L/B L/B L/B L/B140 + L L L L/B L141 o L/B L/B L L/B L/B142 o L L L L L143 o L/B L/B L/B L/B L/B144 o L/B L/B L/B L/B L/B145 + L L L L L146 + L L L L L147 + L L L L L148 o L/B L/B L/B L/B L/B149 o L/B L/B L L/B L/B150 o L/B L/B L/B L/B L/B151 o L/B L/B L/B L/B L/B152 + L L L L L153 o L/B L/B L/B L/B L/B154 + L L L L L155 o L/B L/B L/B L/B L156 + L L L L L/B157 + L L L L L158 o L/B L/B L/B L/B L/B159 o L/B L/B L/B L/B L/B160 o L/B L/B L/B L L/B161 + L L L L L162 + L L L L L163 + L L L L L164 o L/B L/B L/B L/B L/B165 o L L L L L166 + L L L L L167 + L L/B L/B L L/B168 o L/B L/B L/B L/B L/B169 o L/B L/B L/B L/B L/B170 + L L L L L171 + L L L L L172 + L L L L/B L173 + L L L L L174 + L L L L L175 + L L L L/B L176 o L/B L/B L/B L/B L/B177 o L/B L/B L/B L/B L/B178 + L L L L L179 o L/B L/B L L/B L/B180 o L/B L/B L/B L/B L/B181 + L L L L/B L182 o L/B L/B L/B L/B L/B183 + L L L L L
191
Fortsetzung von Tabelle 14:
Tiernummer Phänotyp D10Rat171 D10Rat 32 D10Rat31 D10Rat168 D10Rat116
184 + L L L L L185 + L L L L L186 + L L L L L187 o L/B L/B L/B L/B L/B188 o L/B L/B L/B L/B L/B189 + L/B L L L/B L190 + L L L L L191 + L L/B L/B L L/B192 o L L L L/B L193 + L L L L/B L194 + L L L L L195 + L L L L L196 + L L L L/B L197 + L L L L L198 + L L L L L199 + L L L L L200 + L L L L L201 + L L L L L202 + L L L L L203 + L L L L L204 + L L L L L205 + L L L L L206 + L L L L L207 + L L L L L208 + L L L L/B L
192
Tabelle 15: Mit Hi l fe der RNO11-Mikrosatel l i tenmarker erhobene
Genotypisierungsdaten der Individuen der (BN/Ztm x BH.7A/Ztm-ci3)F1
x BH.7A/Ztm-ci3 Rückkreuzung
+ = ci3-Phänotyp BH = BH.7A/Ztm-ci3-Genotyp
o = nicht betroffene Ratten BN = BN/Ztm-Genotyp
Tiernummer Phänotyp D11Rat10 D11Rat24 D11Rat27 D11Rat28 D11Rat65
1 + BH BH BH/BN BH/BN BH2 + BH BH BH BH BH3 o BH/BN BH/BN BH BH BH/BN4 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN5 + BH BH BH BH BH6 + BH BH BH BH BH7 o BH BH BH/BN BH/BN BH8 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN9 + BH BH BH BH BH10 + BH BH BH/BN BH/BN BH11 + BH BH BH BH BH12 + BH BH BH/BN BH/BN BH13 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN14 + BH BH BH BH BH/BN15 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN16 o BH BH BH BH BH/BN17 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN18 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH19 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN20 + BH BH BH BH BH21 o BH BH/BN BH/BN BH/BN BH22 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN23 o BH/BN BH/BN BH/BN BH BH/BN24 + BH BH BH BH BH25 + BH BH BH BH BH26 + BH BH BH BH BH/BN27 + BH BH BH BH BH28 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN29 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN30 + BH BH BH/BN BH/BN BH/BN31 + BH BH BH BH BH32 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN33 o BH/BN BH/BN BH BH BH/BN34 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN35 + BH BH/BN BH/BN BH/BN BH
193
Fortsetzung von Tabelle 15:
Tiernummer Phänotyp D11Rat10 D11Rat24 D11Rat27 D11Rat28 D11Rat65
36 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN37 + BH BH BH BH BH38 + BH BH BH BH BH39 + BH BH BH BH BH40 o BH BH BH BH BH/BN41 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN42 + BH BH BH BH BH43 + BH BH BH BH BH/BN44 + BH BH BH BH BH45 o BH BH BH BH BH46 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN47 + BH/BN BH BH BH/BN BH48 + BH BH BH BH BH49 + BH BH BH BH BH50 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN51 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN52 + BH BH BH BH BH53 + BH BH BH BH BH54 + BH BH BH BH BH55 o BH BH BH BH BH56 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH57 + BH BH BH BH BH 58 o BH BH BH BH BH59 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN60 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN61 o BH BH BH/BN BH/BN BH62 + BH BH BH BH BH63 + BH BH BH BH BH64 + BH BH BH/BN BH/BN BH65 o BH BH BH BH BH66 o BH BH BH BH BH67 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN68 o BH BH BH BH/BN BH69 + BH BH BH BH BH70 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN71 + BH BH BH/BN BH/BN BH72 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN73 + BH BH BH BH BH/BN74 o BH BH BH BH BH75 + BH BH BH BH BH76 o BH BH BH BH BH77 o BH/BN BH BH BH BH/BN78 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN79 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN80 + BH BH BH BH BH81 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN
194
Fortsetzung von Tabelle 15:
Tiernummer Phänotyp D11Rat10 D11Rat24 D11Rat27 D11Rat28 D11Rat65
82 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH83 + BH BH BH BH BH84 + BH BH BH BH BH85 + BH BH BH BH -86 + BH BH BH BH BH/BN87 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN - 88 + BH BH BH BH -89 o BH/BN BH BH BH BH/BN90 + BH BH BH BH BH91 o BH/BN BH BH/BN BH/BN BH/BN92 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN93 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH94 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN95 + BH BH/BN BH/BN BH/BN BH96 + BH BH BH/BN BH/BN BH97 + BH BH BH BH BH98 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN99 + BH BH BH BH BH100 + BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH101 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN102 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN103 + BH BH BH BH BH104 o BH BH BH/BN BH/BN BH105 + BH/BN BH/BN BH BH BH/BN106 o BH BH BH/BN BH/BN BH107 + BH BH BH BH BH108 + BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN109 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN110 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN111 + BH BH BH BH BH112 + BH BH BH BH BH113 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN114 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN115 + BH BH BH BH BH116 + BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN117 o BH BH BH BH BH118 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN119 + BH BH BH BH BH120 o BH BH BH BH BH121 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN122 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN123 + BH BH BH BH BH124 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN125 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN
195
Fortsetzung von Tabelle 15:
Tiernummer Phänotyp D11Rat67 D11Rat93 D11Arb7D11Ztm1
(Morc)D11Ztm2(Tagln3)
1 + BH BH BH BH BH2 + BH BH BH BH BH3 o BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN4 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN5 + BH BH BH/BN BH BH6 + BH BH BH BH BH7 o BH BH BH/BN BH BH8 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN9 + BH BH BH BH BH10 + BH BH BH BH BH11 + BH BH/BN BH/BN BH BH12 + BH BH BH/BN BH BH13 o BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN14 + BH BH BH/BN BH BH15 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN16 o BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN17 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN18 o BH/BN BH BH BH/BN BH19 o BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN20 + BH BH BH/BN BH BH21 o BH BH BH/BN BH BH22 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN23 o BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN24 + BH BH/BN BH/BN BH BH25 + BH BH BH/BN BH BH26 + BH BH/BN BH/BN BH BH/BN27 + BH BH BH/BN BH BH28 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN29 o BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN30 + BH BH BH/BN BH BH31 + BH BH BH BH BH32 o BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN33 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN34 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN35 + BH - BH/BN BH BH36 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN37 + BH BH BH BH BH38 + BH - BH/BN BH BH39 + BH BH BH BH BH40 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN41 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN42 + BH BH BH/BN BH BH43 + BH BH BH/BN BH BH44 + BH BH BH BH BH
196
Fortsetzung von Tabelle 15:
Tiernummer Phänotyp D11Rat67 D11Rat93 D11Arb7D11Ztm1
(Morc)D11Ztm2(Tagln3)
45 o BH BH BH/BN BH BH46 o BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN47 + BH BH BH BH BH48 + BH BH BH BH BH49 + BH BH BH/BN BH BH50 o BH BH/BN BH BH/BN BH/BN51 o BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN52 + BH/BN BH BH/BN BH BH53 + BH BH BH BH BH54 + BH BH BH/BN BH BH55 o BH BH BH/BN BH BH56 o BH BH BH/BN BH BH57 + BH BH BH/BN BH BH58 o BH/BN BH BH BH BH59 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN60 o BH BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN61 o BH BH BH BH BH62 + BH BH BH BH BH63 + BH BH BH/BN BH BH64 + BH/BN BH BH BH BH65 o BH BH BH/BN BH BH66 o BH BH BH BH BH67 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN68 o BH BH BH BH BH69 + BH BH BH/BN BH BH70 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN71 + BH BH BH/BN BH/BN BH72 o BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN73 + BH BH BH BH BH74 o BH BH BH BH BH75 + BH BH BH BH BH76 o BH BH BH BH BH77 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN78 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN79 o BH/BN BH BH BH/BN BH/BN80 + BH BH BH BH BH81 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN82 o BH/BN BH BH BH/BN BH83 + BH BH BH BH BH84 + BH BH/BN BH BH BH85 + BH BH BH/BN BH BH86 + BH BH/BN BH BH/BN BH/BN87 o BH/BN BH BH BH/BN BH/BN88 + BH BH BH/BN BH BH89 o BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN
197
Fortsetzung von Tabelle 15:
Tiernummer Phänotyp D11Rat67 D11Rat93 D11Arb7D11Ztm1
(Morc)D11Ztm2(Tagln3)
90 + BH BH BH BH BH91 o BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN92 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN93 o BH/BN BH BH BH BH94 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN95 + BH BH BH/BN BH BH96 + BH BH BH/BN BH BH97 + BH BH BH/BN BH BH98 o BH/BN BH BH BH/BN BH/BN99 + BH BH BH BH BH100 + BH BH BH/BN BH BH101 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN102 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN103 + BH BH BH BH BH104 o BH BH BH/BN BH BH105 + BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN106 o BH BH BH/BN BH BH107 + BH BH BH BH BH108 + BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN109 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN110 o BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN111 + BH BH BH BH BH112 + BH BH BH BH BH113 o BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN114 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN115 + BH BH BH/BN BH BH116 + BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN117 o BH/BN BH BH BH BH118 o BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN119 + BH BH BH BH BH120 o BH BH BH BH BH121 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN122 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN123 + BH BH BH/BN BH BH124 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN125 o BH/BN BH/BN BH BH/BN BH/BN
198
Fortsetzung von Tabelle 15:
Tiernummer Phänotyp D11Mgh4 D11Wox6 D11Rat56 D11Mgh3 D11Mit4
1 + BH BH/BN BH BH BH2 + BH BH BH BH BH3 o BH/BN BH BH/BN BH/BN BH4 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN5 + BH BH BH BH BH6 + BH BH/BN BH BH BH7 o BH BH BH BH BH/BN8 o BH/BN BH BH/BN BH/BN BH/BN9 + BH BH BH/BN BH BH10 + BH BH BH BH BH/BN11 + BH BH/BN BH/BN BH/BN BH12 + BH BH BH BH BH13 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN14 + BH BH BH BH BH15 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN16 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH17 o BH/BN BH BH BH/BN BH/BN18 o BH BH BH BH BH/BN19 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN20 + BH BH BH BH BH21 o BH BH BH BH BH/BN22 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN23 o BH/BN BH/BN BH/BN - BH/BN24 + BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH25 + BH BH BH BH BH26 + BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH27 + BH BH BH BH BH28 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN29 o BH/BN BH/BN BH/BN - BH/BN30 + BH BH BH - BH31 + BH BH/BN BH/BN BH BH32 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN33 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN34 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN35 + BH BH BH BH BH/BN36 o BH/BN BH BH/BN BH/BN BH/BN37 + BH BH BH BH BH38 + BH BH BH BH BH39 + BH BH/BN BH BH BH40 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH41 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN42 + BH BH BH BH BH43 + BH BH BH BH BH44 + BH BH BH BH BH45 o BH BH BH BH BH
199
Fortsetzung von Tabelle 15:
Tiernummer Phänotyp D11Mgh4 D11Wox6 D11Rat56 D11Mgh3 D11Mit4
46 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN47 + BH BH BH BH BH48 + BH BH BH BH BH49 + BH BH/BN BH BH BH50 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN51 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN52 + BH BH BH BH BH53 + BH BH/BN BH/BN BH BH54 + BH BH/BN BH BH BH55 o BH BH BH BH BH56 o BH BH/BN BH BH BH/BN57 + - - - BH BH58 o BH BH BH BH BH59 o BH/BN BH BH BH/BN BH/BN60 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN61 o BH BH BH BH BH/BN62 + BH BH BH BH BH63 + BH BH BH BH BH64 + BH BH BH BH BH65 o BH BH/BN BH/BN BH BH66 o BH BH BH BH BH67 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN68 o BH BH BH BH BH69 + BH BH BH BH BH70 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN71 + BH BH BH BH BH72 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN73 + BH BH BH BH BH74 o BH BH BH BH BH75 + BH BH BH BH BH76 o BH BH BH BH BH77 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH78 o BH/BN BH BH/BN BH/BN BH/BN79 o BH/BN BH BH BH BH/BN80 + BH BH BH BH BH81 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN82 o BH BH BH BH BH/BN83 + BH BH BH BH BH84 + BH BH/BN BH/BN BH/BN BH85 + BH BH BH BH BH86 + BH/BN BH/BN - BH/BN BH87 o BH BH BH BH BH/BN88 + BH BH BH BH/BN BH89 o BH/BN BH BH BH/BN - 90 + BH BH BH BH BH91 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN
200
Fortsetzung von Tabelle 15:
Tiernummer Phänotyp D11Mgh4 D11Wox6 D11Rat56 D11Mgh3 D11Mit4
92 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN93 o BH BH/BN BH BH BH/BN94 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN95 + BH BH BH BH BH/BN96 + BH BH BH BH BH97 + BH BH/BN BH BH BH98 o BH/BN BH BH BH BH/BN99 + BH BH/BN BH/BN BH BH100 + BH BH BH BH BH/BN101 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN102 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN103 + BH BH/BN BH/BN BH BH104 o BH BH/BN BH BH BH/BN105 + BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN106 o BH BH BH BH BH107 + BH BH BH BH BH108 + BH/BN BH/BN - BH/BN BH/BN109 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN110 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN111 + BH BH BH BH BH112 + BH BH/BN BH/BN BH BH113 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN114 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN115 + BH BH BH BH BH116 + BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN117 o BH BH BH BH BH118 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN119 + BH BH BH BH BH120 o BH BH BH - BH121 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN122 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN123 + BH BH - BH BH124 o BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN BH/BN125 o BH/BN BH BH BH/BN BH/BN
201
Abb. 12: Elektroretinogramm (ERG) - Sequenzen von nicht affektierten LEW/Ztm
Ratten (Hintergrundstamm: wt) und affektierten homozygoten (ci2-/-)
und heterozygoten (ci2+/-) LEW/Ztm-ci2 Rattenmutanten (1) (GOCKELN
et al., 2003).
202
Legende zu Abb. 12:
Dargestellt sind ERG-Aufzeichnungen von 40 Wochen (PW40) alten Ratten unter
dunkeladaptierten (skotopischen) und helladaptierten (photopischen) Bedingungen.
In Anlehnung an den ISCEF-Standard (International Society for Clinical
Electrophysiology of Vision) wurde mit verschiedenen Stimulusintensitäten gereizt,
wobei als Standardblitz eine Stimulusintensität von 3.0 Candelasekunden pro
Quadratmeter (cds/m2) diente. Mit eingetragen ist die jeweilige Stimulusapplikation
(T). Als Hintergrundbeleuchtung für das photopische ERG diente eine
„Ganzfeldausleuchtung“ von 30 cd/m2.
Im Vergleich zu den LEW/Ztm-ci2 Rattenmutanten, welche im ERG lediglich
Restantworten aufwiesen, liess sich beim Hintergrundstamm (LEW/Ztm) ein im
Vergleich zu bekannten, nicht affektierten Ratten reguläres skotopisches und
photopisches ERG aufzeichnen. ERG-Aufzeichnungen von jungen LEW/Ztm-ci2
Rattenmutanten waren im Vergleich zum ERG des alterkorrelierten
Hintergrundstammes nicht verändert.
Dieser generalisierte Funktionsverlust der neurosensorischen Retina korrelierte gut
mit dem histopathologisch nachweisbaren Verlust der Photorezeptorzellen der
Mutantennetzhaut. Unter Berücksichtigung der funktionellen und strukturellen
Befundsituation liegt bei den homozygoten und heterozygoten LEW/Ztm-ci2
Rattenmutanten eine progressive Atrophie der Retina vor (GOCKELN et al., 2003).
203
Abb. 13: Shuttle-Box „Passive Avoidence System“ der Firma TSE-Systems, die
für den Hell-Dunkel-Transmissionstest benutzt wurde (Abb. ähnlich)
204
Danksagung
Herrn Prof. Dr. H.-J. Hedrich danke ich sehr für die Überlassung des Themas, die
Bereitstellung eines Arbeitsplatzes, sämtlicher untersuchten Tiere und aller
notwendigen Materialien sowie für die wissenschaftliche Anleitung bei der
Durchführung der Versuche und der Abfassung dieser Dissertation und insbesondere
für die stets gewährte und immer freundliche Unterstützung.
Weiterhin bedanke ich mich bei
Herrn Prof. Dr. W. Löscher, Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover, für die Hilfe bei der Kontaktaufnahme zu
Herrn Prof. Dr. H.-J. Hedrich und die wissenschaftliche Mitbetreuung;
Herrn Dr. D. Wedekind für die geduldige Beantwortung zahlreicher Fragen sowie
freundliche Anleitung bei der praktischen Durchführung der Versuche und Gestaltung
dieser Arbeit;
Frau PD Dr. M.-L. Enß für die hervorragende organisatorische Betreuung des
Graduiertenkollegs GK 705 in dessen Rahmen diese Arbeit angefertigt wurde;
Herrn Prof. Dr. S. von Hörsten und Herrn T. Karl, Abteilung Funktionelle und
Angewandte Anatomie der Medizinischen Hochschule Hannover, für die
wissenschaftliche Anleitung bei der Durchführung der Verhaltensuntersuchungen
und ihrer Auswertung;
Frau PD. Dr. A. Kindler-Röhrborn und Herrn Dr. B. Kölsch, Institut für
Neuropathologie der Universität Bonn, für die wissenschaftliche Anleitung bei der
Durchführung der computergestützten genetischen Analysen;
205
Herrn Dr. R. Gockeln, Augenklinik der Medizinischen Hochschule Hannover, für die
freundliche Zusammenarbeit und die Bereitstellung der Ergebnisse seiner ERG-
Untersuchungen zur Netzhautfunktion der LEW/Ztm-ci2 Ratte für den Anhang dieser
Arbeit;
Frau U. Gänger, Frau S. Przyklenk und Frau I. Trotz für ihr hilfreiches Mitwirken bei
der Durchführung der genomweiten Kopplungsanalyse;
Herrn M. Meyer für sein tatkräftiges und immer freundliches Mitwirken bei der
Durchführung der Verhaltensuntersuchungen;
den Tierpflegern des Zentralen Tierlaboratoriums der Medizinischen Hochschule
Hannover für die sorgsame Betreuung der Tiere sowie allen weiteren Mitarbeitern
des Instituts für die freundliche Aufnahme, die erwiesene Hilfsbereitschaft und das
sehr gute Arbeitsklima;
Mein Dank gilt insbesondere meinen Eltern für die liebevolle moralische
Unterstützung bei der Abfassung dieser Arbeit.
206
Erklärung
Zur Anfertigung der Dissertation wurden die folgenden Hilfen und Hilfsmittel,
insbesondere die folgenden Hilfen Dritter, in Anspruch genommen:
Frau U. Gänger führte zu Beginn der genomweiten Kopplungsanalysen einen Teil
der molekularbiologischen Arbeiten durch, während Frau S. Przyklenk und Frau I.
Trotz einen Teil dieser Arbeiten zum Ende der Kopplungsanalyse vornahmen.
Herr M. Meyer war an den Verhaltensuntersuchungen zur Rotation und Funktion des
Innenohres der Rückkreuzungsindividuen beteiligt und nahm auch zusammen mit
Frau S. Przyklenk einen Teil der Organentnahmen vor.
207