Aula de Clonagem e Vetores e bibliotecas de DNA
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CLONAGEM
• Originada da palavra grega Kólon, que designa forma de reprodução
assexuada, ou seja, geração de indivíduos idênticos ao doador do DNA;
• Ocorre naturalmente em organismos unicelulares e plantas;
• Atualmente o termo clonagem é utilizado mais para a produção de
organismos idênticos derivados de um ancestral comum.
TIPOS DE CLONAGEM
Reprodutiva- Técnica de transferência nuclear utilizada pela primeira vez
com sucesso em mamíferos na geração da ovelha Dolly em 1997.
- A célula de um indivíduo adulto é fundida com um óvulo sem núcleo, de forma que o "embrião" gerado possui o conteúdo genético da pessoa que doou a célula.
Tipos de Clonagem
Terapêutica
- Aprimoramento das técnicas hoje existentes para
culturas de tecidos, que são realizadas há décadas.
- É feita a transferência do núcleo de uma célula de
uma pessoa para um óvulo sem núcleo, que ao dividir-se
gera, em laboratório, células potencialmente capazes de
produzir qualquer tecido.
• Clonagem Molecular
- É o processo de construção de moléculas de DNA recombinante
e da sua propagação em hospedeiros apropriados que possibilitam a
seleção do DNA recombinante.
- Sinônimos: Engenharia Genética, Manipulação gênica,
Clonagem gênica, Tecnologia do DNA recombinante, Modificação
genética e Nova genética
Tipos de Clonagem
CLONAGEM MOLECULAR
Estudos genômicos
Estudos de expressão de mRNAs
Expressão de proteínas (Proteínas recombinantes)
Vacinas de DNA
Produção de organismo transgênicos
Terapia Gênica
Estudos de interação DNA-proteína ou Proteína-proteína
Estudos de mutação sítio-dirigida de proteínas
CLONAGEM MOLECULAR
OBJETIVO: Gerar grande número de cópias de um determinado DNA.
- Inserção de fragmentos de DNA em vetores;
- Replicação de vetores contendo o inserto dentro de células hospedeiras
- Recuperar (purificar) os fragmentos dos vetores.
CLONAGEM MOLECULAR
Vetores: veículos de clonagem que permitem que os fragmentos de
DNA a serem clonados, sejam introduzidos e propagados em uma
célula hospedeira adequada.
Célula hospedeira: células de fácil manipulação, crescimento rápido
e constituição genética bem conhecida (ex: bactérias, leveduras,
células de cultura de tecidos de mamíferos e insetos).
VETORES MOLECULARES
São moléculas de DNA dupla fita, circular , auto-replicativas e que são
passados de geração para geração;
Características
-Origem de replicação (Ori): multiplicar-se de maneira
independente
- Múltiplos Sítios de Clonagem (MSC): Sítios para várias enzimas de
restrição
- Gene marcador (AmpR)
VETORES MOLECULARES- TIPOS
• Dependendo do tamanho do inserto de DNA e da finalidade do
experimento, muitos tipos diferentes de vetores de clonagem
podem ser utilizados para geração de moléculas recombinantes.
-Plasmídeos – clonagem de até 15.000 pb
- Fagos - clonagem de até 23.000 pb
- Permite expressar uma
proteína
- Indução da expressão
- Proteína pode ser purificada
Vetores Moleculares
Clonagem Expressão
FORMAS DE COLOCAR DNA RECOMBINANTE DENTRO DAS CÉLULAS COMPETENTES (HOST CELLS)
• Transformação bacteriana
• Transfecção (transformação em células eucariontes)
• Eletroporação (choque)
• Microinjeção
• Infecção viral
CaCl2: íons Ca²+ neutraliza carga –dos fosfolípideos da membrana e do DNA recombinante
Choque térmico: mudança brusca de temperatura atraem a molécula de DNA recombinante para dentro da célula hospedeira
Transformação
Meio de cultura enriquecido eincubação a 37ºC parapromover recuperação dascélulas hospedeira
Seleção das bactériastransformadas por cultivo emmeio de cultura contendoampicilina.
Transformação
BIBLIOTECAS MOLECULARES
• Conjunto de todos os genes de uma
determinada espécie armazenados
na forma de moléculas de DNA
recombinante.
BIBLIOTECAS MOLECULARES
Bibliotecas Genômicas
- Formadas a partir de DNA genômico
- DNA genômico pode ser quebrado mecanicamente ou
enzimaticamente em pedaços menores
- Clonados em fagos e plasmídios.
Bibliotecas Moleculares
Bibliotecas cDNA (DNA complementar)
- Representa o conteúdo de mRNA de uma
célula/tecido- Transcriptoma
- Clonagem apenas das mensagens dos genes.
- É mais seletiva
- Isolamento de genes específicos
Bibliotecas de cDNA
• Dependente da síntese de um cDNA a partir de um mRNA
- Transcriptase reversa
Extração de RNA total