VIROLOGIA - Micro (Aula 1)

Iremos ver: estrutura, classificao e replicao viral; mecanismo de patogenia viral: as armas que os vrus usam para causar leso de clulas e diagnstico laboratorial nas doenas virais (exames complementares para confirmar uma infeco viral) Observamos diferentes estruturas dos vrus (envelopados e no envelopados, com ou sem capsdeos), diferentes mtodos de replicao e o conhecimento desses dois facilita o diagnostico laboratorial, o tratamento (novos antivirais podem ser aplicados e aprovados, de acordo com o modo de replicao ou da estrutura do vrus); e a preveno (conhecer como esse vrus infecta, por exemplo) Mtodos de controle: -conhecimento de reservatrios: conhecer de cada vrus, como o da dengue, febre amarela, permite fazer o controle dessa doena -modo de transmisso: como esse vrus se transmite, como fecal-oral; -mtodos para inativar vrus de interesse: destruir a causa para fazer vacinas (pode fazer vacina por meio de vrus mortos ou uma vacina atenuada); -vacinas -drogas anti-virais: importante, pois os vrus podem desenvolver resistncia aos anti-virais, como ocorre em coquetel de HIV (como tambm h nas bactrias) Consequncia das infeces: -sofrimento seguido de recuperao: doena aguda e resoluo dessa sem deixar problemas, como na influenza -doena persistente: como hepatite B, apresentando uma cronicidade -doena fatal: quando chega no rgo alvo (alguns vrus so considerados benignos, mas isso tambm depende do estado do paciente, sade, idade, sistema imune e outras doenas associadas), como no vrus da raiva, que ao chegar no SNC fatal (internao , pode entrar em coma e levar a morte) -doena congnita: como na rubola no adulto benigno, mas no primeiro trimestre pode gerar sequelas irreversveis (transmisso vertical) -fator contribuinte no cncer: muitos vrus so oncognicos capazes de induzir transformao e imortalizao da clula e desenvolve o tumor, como no vrus da hepatite B -fator contribuinte em outras doenas: se o individuo j possui outra doena associada e adquire outro determinado vrus, isso aumenta o grau de complicao Os vrus podem ser uteis no desenvolvimento de vacinas. H uma protena, por exemplo, muito importante para a proteo contra a doena de chagas, s que eu no consigo fazer uma imunizao com essa protena, ento eu posso pegar o gene dessa protena e transfectar em um vrus atenuado (mas vivo), levar o gene a produzir grande quantidade de protena e induzir uma resposta imune contra essa protena do T. cruzi; (carreador de qualquer gene para produzir um antgeno que no possua relao com o vrus) Terapia genica: quando o individuo nasce com algum defeito no gene, ento eu posso carrear genes com a utilizao do vrus como um vetor (pego um gene de uma pessoa normal, fao transfeco para um vrus, infecto o individuo com esse vrus vai ser uma infeco que no causa doenas, pois vrus atenuado, mas vai repor esse erro gentico hereditrio, por produo de protenas ou vai corrigir um gene defeituoso) Ferramentas para investigar clulas hospedeiras: auxilia no conhecimento sobre fisiologia da clula hospedeira, que usada como fabrica na replicao.

Transcrio de Brbara Almeida,

Karen Figueiredo e Thas Gonalves

MEDUERJ 2016

Vrus possuem genoma de acido nucleico DNA ou RNA protegido por uma cobertura proteica chamada de capsdeo , que protege do ambiente, mas tambm importante porque possui ligantes para receptores especficos nas clulas alvo protenas para proteo e entrada (VAP PROTEINA DE ADESO OU FIXAO VIRAL), pois possuem algumas terminaes que so ligante nos receptores das clulas permissveis que oferecem todo o maquinrio necessrio para replicao. O primeiro encontro do vrus com a clula-alvo feita por essa protenas virais que possuem receptores especficos, ex: EBV que possui receptor somente nas clulas B humanas, mas h outros tipos de vrus que tambm podem infectar animais, insetos etc. Envelopes lipdicos: Alguns vrus so chamados de vrus envelopados, possuindo o genoma dentro de capsdeo proteico e em torno desse h um envelope lipdico com algumas protenas e glicoprotenas (esse envelope adquirido da clula hospedeira). Sendo de natureza lipdica, ele menos resistente. Quando o vrus perde a sua proteo proteica, ele fica incapaz de infectar qualquer clula. O vrus de maior resistncia ambiental o no-envelopado (?). O tamanho dos vrus pode variar de 18-380 nm. So parasitas intracelulares obrigatrios, sendo a resposta imune eficaz a celular, a melhor que destruiria seria a CD8/CTL. Slide mostrando comparao com a bactria Escherichia coli e vrus RNA,DNA, vrus da varola (grandes) -pico (pequeno com RNA) Propriedades dos vrus: -agentes filtrveis: existem filtros , em que se pega liquido como um soro, urina, passa no filtro e esteriliza bactrias retidas e como os vrus so muito pequenos, eles passam, sendo agentes filtrveis; -parasitas intracelulares obrigatrios -incapazes de produzir energia ou protenas independentemente da clula hospedeira: vrus no faz nada, ele leva no seu genoma o que precisa, mas toda a sua protena, sntese porteira, duplicao do genoma, tudo a clula hospedeira que fornece. Se a clula alvo permissa no possui determinada enzima que o vrus precisa para fabricar componentes estruturais ou no estruturais, ele precisa levar no genoma o gene para codificar o restante para a clula produzir o que ele precisa utilizar (ao contrario desaparece). A mquina do vrus a clula alvo. -os genomas virais consistem em RNA ou DNA, mas no ambos; -vrus apresentam morfologia com capsdeo desnudo ou com envoltrio -componentes virais so organizados e no sofrem replicao por diviso (eles replicam dentro das clulas, montam as suas partculas, e saem das clulas por lise celular ou por brotamento, sendo essa ultima de melhor vantagem, pois a clula permanece viva e fechada e a maquinaria celular continua; se h lise celular, ele destri a fabrica dele). H vrus que mantm no mximo a clula vrus para aumentar a carga viral (ocorrem muitas replicaes); Consequncias das propriedades dos vrus: -os vrus no so vivos -os vrus devem ser infecciosos para sobreviver na natureza, infectando planta, inseto, humano; -os vrus devem ser capazes de utilizar os processos das clulas hospedeiras para produzir seus componentes (RNAm, protenas e copias idnticas dos genomas virais); -os vrus devem codificar quaisquer processos necessrios no oferecidos pelas clulas hospedeiras (como uma enzima ou protena importante para a sua replicao viral, ele ento deve levar essas protenas de forma inativa, sendo ativadas dentro das clulas, pois a clula no tem essa enzima);

-necessrio a ocorrncia de auto-organizao dos componentes virais : montagem dos vrus para deixar as clulas por lise ou brotamento COMPARAO ENTRE BACTERIAS E VIRUS (SLIDE) Fatores que afetam a faixa de hospedeiro: -receptores da superfcie celular: hospedeiro ideal aquele que possui clulas que possui receptores que reconhecem as VAP virais, ao contrario no ocorre infeco. As clulas hepticas, por exemplo, possuem receptores ideais ao vrus da hepatite. -disponibilidade da maquinaria de replicao: ela deve oferecer toda a maquinaria -habilidade de sair das clulas e disseminar-se: por lise, ou outra forma de morte celula ou brotamento; -resposta anti-viral do hospedeiro: importante, pois principalmente os vrus com efeitos citopticos causam leses; mas a grande maioria das doenas virais, a leso, inflamao leva a hemorragia , como febre amarela, no o vrus que causa, mas sim a resposta imune (imunepatognica). Ento a imunologia uma faca de 2 gumes, pois se o individuo muito comprometido, ele tem virose grave ou mesmo benigna. O sistema imune tanto na fase inata quando na adquirida importante por bloquear ou terminar infeco viral, mas muitas das leses so causadas pelas respostas imunes, principalmente nos vrus que no fazem efeito citopatico. Dependendo da resposta imune do hospedeiro, ele tem menos ou mais sucesso. Estrutura viral: -a partcula viral : virion -protena que recobre o genoma: capsdeo. Esses so usualmente simtricos, mas pode ser helicoidal ou icosadrico. -capsideo + genoma = nucleocapsideo (? Ver no slide) -pode haver ou no o envelope -simetria icosadrica (20 faces, 12 vrtices , 5 pentmeros) ou helicoidal (comprimento controlado pelo genoma viral e a hlice pode ser firme ou flexvel ; como no vrus do Tobaco, que possui um capsdeo com um genoma em hlice circular) -pentons com 5 lados e hexons com 6 lados - o envelope uma membrana com bicamada lipdica da clula hospedeira, so que protena na superfcie do envelope so protenas virais. Essas glicoprotenas externas so as VAP , atravs dessas h reconhecimento de receptores nas clulas-alvo. Ex: na influenza h uma hemaglutinina que liga a hemcia ou outra clula que contenha esse receptor. importante, pois uma protena de ligao com as clulas permissvel (ao contrario no h adeso ou infeco eficaz) Envelope: adquire o envelope por brotamento a partir da membrana celular. Ento quando h uma infeco, j estando dentro das clulas, j possui componentes prontos, protenas prontas, o vrus insere essas protenas virais na superfcie da membrana da clula hospedeira e naquele local ele sai por brotamento. Assim, ele no mata a clula, sai por brotamento, a clula recupera a membrana. Ento o brotamento possibilita a liberao do vrus sem causar morte clula. O envelope possui protenas virais e no da clula hospedeira (codificadas pelo vrus). A perda do envelope resulta na perda da infectividade (somente nos vrus envelopados), pois perde o ligante para a clula hospedeira. A mesma coisa ocorre com o vrus no envelopado e o capsdeo. Se h perda desse ultimo, ele no infecta mais nenhuma clula, pois no pode reconhecer clula-alvo (no possui VAP). O envelope tambm pode ser adquirido por lise celular. O mais comum por brotamento, mas quando a fabrica esta muito cheia, ento ocorre por lise (por alterao da membrana, fazendo com que ocorra lise). Muitos vrus prolongam a vida das clulas para usar e abusar da fabrica , enquanto outros imortalizam as clulas, sendo denominados de vrus oncognicos. No no envelopado, s ocorre por lise.

Revisando.... -icosadrico -icosadrico envelopado -helicoidal -helicoidal envelopado -morfologia complexa Agentes no convencionais -so mais simples que os vrus, chamados de virides; -composto somente por RNA, no codifica para protena (no possui nada para codificar protenas, o RNA chega na clula e transcrito) e ate o momento, os virides conhecidos possuem interesse na botnica; -virus humano da hepatite D : agente delta > esta entre um viride e um vrus (no nenhum dos dois completo), sendo o mais simples que mais infecta o homem. um vrus parasita de outro vrus vrus da hepatite D somente cresce na presena do vrus da hepatite B ( o tipo D oferece ferramentas para o tipo B) Classificao dos vrus: Pode ser por: tamanho, morfologia, tipo do acido nucleico, caractersticas bioqumicas, doena (vrus da encefalite, da hepatite) , modo de transmisso (como os arbovrus que so vrus transmitidos por artrpodes), clula hospedeira, tecido/rgo trpico. Classificao do acido nucleico: -RNA ou DNA -segmentado (genoma continuo) ou no segmentado -linear ou circular -filamento nico ou filamento duplo Se o filamento nico, pode ser + ou - . Se genoma RNAm sentido (+) significa que possui o mesmo sentido do RNAm e o que o torna mais fcil de codificar suas protenas (replicao mais rpida. Se (-), se compara com filme negativo ( esse negativo tem que virar RNAm para comear a sntese proteica(?) SLIDE : DIFERENA DE RESISTNCIA ENTRE VRUS ENVELOPADO E NO ENVELOPADO Enquanto que em consequncia disso podem ser facilmente disseminados (em fomites, das

mos para as mos, na poeira, em pequenas gotculas). Podem secar e manter a infectividade.

Podem sobreviver s condies adversas do intestino. Quais so as condies adversas do

intestino? O estmago produz o que? cido, acidez gstrica. O fgado produz o que? Bile, que

um detergente. O vrus no envelopado resiste aos cidos graxos e ao da bile. Podem ser

resistentes a detergentes e ao tratamento inadequado do esgoto. Os anticorpos podem ser

suficientes para imunoproteo, ou seja, um anticorpo formado contra a protena de adeso

viral vai ligar a ela e impedir a infeco pelo vrus, impedindo a interao dele com a clula-

alvo. A ao dos anticorpos importante para evitar a infeco. Depois da infeco j

instalada, sendo o vrus intracelular, os anticorpos so pouco eficazes.

Agora os vrus com envoltrio, com envelope. Componentes: membrana com bicamada

lipdica, lipdios, protenas e glicoprotenas virais. Propriedades: lbil, sofre ruptura nas

seguintes condies ambientais: no resiste ao meio cido, detergentes, ressecamento, calor.

Ento o vrus influenza, da gripe tem que estar num ambiente mido, seno ele no resiste.

liberado por brotamento ou lise celular. Consequncias: deve permanecer mido; no pode

sobreviver no trato gastrointestinal, ento vrus de transmisso fecal-oral, como o da

poliomielite tem que ser NO ENVELOPADO, para que sobreviva no trato gastrointestinal, caso

contrrio o envelope ser degradado pelo cidos graxos, pela bile (como o capsdeo proteico,

consegue resistir s aes dos cidos graxos e da bile, estando o stio de ligao no capsdeo,

este ficar intacto, entretanto, se o stio de ligao estiver no envelope e este for degradado, o

vrus perde a infectividade; por isso, os vrus no envelopados podem ser de transmisso fecal-

oral e os envelopados no podem); dissemina-se atravs de grandes gotculas, secreo,

transplante de rgos e transfuses sanguneas; no precisa matar a clula para sofrer

disseminao; pode necessitar de resposta imune mediada por anticorpos e clulas para

proteo e controle, mas como ele se reproduz por brotamento da clula, a resposta celular

muito importante para destruir a clula infectada; provoca hipersensibilidade (geralmente

tardia, mas tambm pode ser tipo III ou II) e inflamao (causa leso, mas se no tivesse

inflamao seria bem pior, porque a infeco se disseminaria livremente) para causar

imunopatognese.

Existe alguma vantagem do vrus ter envelope? Ele no destri a clula hospedeira, ele sai por

brotamento. Aquele vrus que se multiplica muito rpido, mata a clula.

Ento vamos ver rapidamente as etapas da replicao viral. 1 passo o reconhecimento da

clula-alvo, atravs de adeso especfica, o vrus vai ento encontrar a clula com a

maquinaria que ele precisa. Fixao superfcie da clula. Penetrao: alguns vrus penetram

diretamente, os que dependem do pH precisam entrar no fagossomo. Desnudamento, que a

liberao da membrana, envelope e capsdeo. Sntese macromolecular, que a sntese de

protenas no-estruturais, protenas que participam da replicao, mas no compem a

estrutura do vrus: sntese inicial de mRNA e protenas no estruturais: genes para enzimas e

protenas de ligao do cido nuclico; replicao do genoma; sntese tardia de mRNA e

protenas estruturais (j tem genoma, ento vai formar agora as protenas do capsdeo) (alguns

vrus formam o capsdeo separado do genoma e depois inserem o genoma no capsdeo, j

outros formam o capsdeo em torno do genoma); modificao ps-traduo da protena

(algumas protenas virais so glicosiladas, fosfatadas). Organizao do vrus. Brotamento dos

vrus com envoltrio. E liberao dos vrus. Normalmente, uma clula produz cerca de 100 mil

vrus. Destes, 10 a 20% so infectantes, os outros sofreram muitas mutaes e no so mais

infectantes.

Os vrus envelopados tm outra vantagem: escapam da resposta humoral; uma clula

infectada pode se ligar a uma vizinha no infectada e transferir os vrus para esta. Para destruir

essas clulas, s a ao dos CTL. Ns vamos ver que muitos vrus escapam da ao dos CTL por

impedir a sntese de MHC I, que um mecanismo importante, porque a ao dos CTL a

principal defesa contra vrus. As clulas sem MHC I dependem da ao das clulas NK para

serem mortas.

Aqui um desenho mostrando a temperatura independente da adsoro, requer protenas de

ligao viral (VAP) e receptores celulares.

A penetrao dos vrus envelopados se d atravs de fuso com a membrana plasmtica ou via

endossomas, atravs de fuso com a membrana do endossoma cido.

A captao de vrus via endossomas pode se dar por viropexia, endocitose ou pinocitose.

Os vrus no envelopados entram diretamente atravs da membrana plasmtica.

O desnudamento necessrio para a produo de novos genomas. Aps o desnudamento,

tem incio a fase de eclipse, na qual o vrus est sem o capsdeo e sem o envelope, estando

apenas o genoma. Nesse momento o vrus no infeccioso. A fase de eclipse termina quando

as primeiras novas partculas virais so formadas.

Sntese de cido nucleico e protenas virais: muitas estratgias (cada vrus tem seus meios de

sintetizar seu genoma e suas protenas); o cido nucleico pode ser produzido no ncleo ou no

citoplasma (regra geral: a multiplicao dos vrus de DNA se d intranuclear e a dos vrus de

RNA se d no citoplasma, mas h excees, como o HIV, que um retrovrus, de RNA, mas a

multiplicao se d intranuclear, o vrus da varola de DNA, mas a replicao

intracitoplasmtica); a sntese proteica sempre no citoplasma.

Organizao e maturao: no ncleo, no citoplasma, na membrana.

Liberao: por lise, mais comum nos vrus no envelopados; brotamento atravs da membrana

plasmtica que o mais comum nos vrus envelopados; nem todo vrion liberado infeccioso

(foi o que eu falei para vocs, so liberados cerca de 100 mil, mas apenas 10 a 20 mil so

infectantes).

Protenas virais: protenas estruturais (todas as protenas em um vrion maduro); protenas no

estruturais (protenas codificadas pelo vrus, mas no acondicionadas no vrion).

Efeitos no hospedeiro: pode inibir a sntese de DNA, RNA ou protena do hospedeiro (os vrus

penetram a fbrica, a clula-alvo e utilizam todas as estruturas para sua prpria replicao).

Efeito citoptico justamente causado por aqueles vrus que causam leso na clula, podendo

causar morte celular. Uma grande importncia do efeito citoptico no diagnstico

histopatolgico. Tem vrus que causam efeitos citopticos caractersticos, podendo ser

identificados pelo patologista. Ento, o efeito citoptico qualquer alterao detectvel na

clula hospedeira: alteraes morfolgicas, morte, apoptose, crescimento indefinido. A

apoptose interessante para o vrus? No. Ento, ns vamos ver que alguns vrus bloqueiam a

apoptose.

Bom, como cultivar vrus? Vrus so cultivados normalmente em monocamadas, utilizando-se

clulas contnuas. Pode-se utilizar no s para diagnstico, como tambm para quantificar a

carga viral (na urina, no lquor, na saliva).

Aqui h clulas em monocamada e podemos observar como elas mudam a sua morfologia

quando infectadas (slide 51). importante mandar o material para ser avaliado pelo

laboratrio junto histria do paciente: sintomas, viagens recentes, dados de exames. Isso

facilita o diagnstico histopatolgico.

Isso aqui o que eu falei, a unidade formadora de placa. Voc pode produzir para saber a

carga viral. Ento, eu tenho a minha monocamada de clulas. A eu adiciono uma espcie de

lquido (lquor, urina), um material. Uma partcula viral penetrou a clula e vai comear a

replicar. Novas partculas nas clulas. H contaminao de clulas vizinhas. Eu ento diluo para

poder quantificar. Aqui, por exemplo, eu posso contar 5 na diluio de 1000. Ento, h 5 para

cada 1000ml da amostra.

Patognese da infeco viral: fase de penetrao pele (tem que haver uma soluo de

continuidade, uma leso um corte, no penetram a pele ntegra), aparelho respiratrio,

aparelho digestivo, aparelho gnito-urinrio, conjuntiva (as mucosas ele penetra diretamente,

no precisam estar lesadas); fase de disseminao sangue, linfa, clula nervosa viremia;

perodo de incubao (pode variar muito, at chegar ao rgo-alvo o vrus vai causar dor de

cabea, mal-estar, os chamados sintomas gripais que muitos vrus provocam, at que atingem

o rgo-alvo e causam a doena especfica); fase de manifestao dos sintomas (a a infeco

j est estabelecida). Infeco aguda: sistmica (sarampo), localizada (influenza = gripe).

Infeco persistente: crnica (hepatite B, C a infeco persiste, sem sintomas e continua

liberando vrus), latente (herpes, catapora por exemplo, o indivduo tem catapora na infncia

e de repente os sintomas desaparecem, mas o vrus fica ali, ainda que no se replique,

podendo recidivar; no caso do vrus da catapora pode causar herpes zoster), lenta (HTLV

retrovrus em geral, podem ficar at 30/40 anos sem apresentar a doena).

Aqui est todo o mecanismo

de infeco viral:

1. O microorganismo

penetra o corpo seguinte para

a corrente sangunea

denominado Viremia Primria

(que baixa);

2. Segue para outros

rgos, onde sua replicao

maior sendo denominado

Viremia Secundria (que

bem alta);

3. Seguem para rgo

alvo, onde tero diferentes

representaes clnicas:

- Na pele: Varicela, Varola.

- Nas glndulas salivares: CMV

(citomegalovrus), caxumba e

EBV (Vrus Epstein-Barr causa

comum de mononucleose).

- Nos rins: Vrus lassa (causa

febre lassa), Hantavrus e CMV

- No crebro: Polio e Sarampo.

Relao entre stio inicial da infeco viral e produo da doena

Local da infeco Infeco Local Infeco Sistmica

OROFARNGE Citomegalovrus (CMV) Epstein-Barr (EBV) Herpes Simples 1

TRATO RESPIRATRIO Vrus influenza Vrus sincicial respiratrio Rinovrus

Sarampo Caxumba Rubola Varicela Vrus Lassa

TRATO INTESTINAL Norwalk Rotavrus

Hepatite A Polio

TRATO GENITAL Papilomavrus Hepatite B Hepatite C HIV

Transmisso Viral

Modo de transmisso Exemplo Comentrio

Disseminao respiratria ou salivar

Vrus influenza EBV Sarampo Cachumba

Transmisso de difcil controle

Disseminao fecal-oral Polio Rotavrus Hepatite A

Controle atravs de medidas pblicas de sade

Disseminao Venrea HSV HIV HPV

Controle por precaues apropriadas

Zoonoses Inseto-Humano Animal-Humano

Dengue Raiva Lassa Hantavrus

Infeco humana pode ser contolada atravs do controle de vetores(insetos) e/ou controlando a infeco de animais. No h ou raro a infeco entre humanos.

Animal-Inseto-Humano Febre amarela

Padres de infeco viral

II. Infeco Viral Aguda seguida por perodo de

latncia e reativao viral Padro caracterstico de

Herpes Vrus, Varicela, Herpes Simples 1, Herpes

simples

III. Infeco aguda seguida por diminuio da carga

viral. Paciente pode estar assintomtico, contudo,

continua capaz de transmitir vrus pois ainda est

infectado.

Padro caracterstico de Hepatite B e Hepatite C.

Padro de resposta durante uma

infeco primria aguda

I. Na resposta imune inata, os

interferons so importantes inibidores da

replicao viral. Algumas citocinas e as clulas

NK tambm so importantes neste tipo de

resposta imune.

II. Alguns vrus so capazes de

vencer a barreira formada pela imunidade inata.

Neste perodo, ocorre uma resposta mediada

por clulas T.

Clulas Th1-Cd4+, clulas Th2-Cd8+ e CTLs.

III. As citocinas produzidas pelas

clulas T sero extremamente importantes para

a ativao de clulas B.

IV. As clulas B uma vez ativadas

produzem anticorpos especficos contra os

patgenos.

- Os corpsculos de incluso so facilitadores do

diagnstico direto.

- Todas essas estruturas so facilitadoras do

diagnstico laboratorial. Principalmente a

histopatologia.

Diagnstico laboratorial das infeces virais

- Espcime clnico: natureza, coleta, transporte,manuteno. A coleta pode, dependendo da virose, ser o lquor, o sangue, fezes, urina. O importante o transporte. Se for um vrus envelopado, o transporte deve ser o mais rpido possvel, j que uma coleta contaminada com bactrias e fungos pode determinar a morte do vrus. Esse transporte dever ser feito em temperatura ideal, nem congelado, nem com temperatura elevada. Normalmente o transporte feito em reservatrio com gelo (provoca a morte de bactrias e fungos). - Processos laboratoriais: Exame citopatolgico ECP Pode determinar imediatamente o diagnstico atravs da histopatologia. Microscopia eletrnica e imunoeletrnica Restrita a determinadas instituies. Utiliza anticorpo especfico para determinado vrus. Este anticorpo facilita a agregao viral e posterior identificao. Logo, a imunoeletrnica um facilitador para a deteco rpida de um vrus. Isolamento e crescimento viral em animal, ovo embrionado, cultura de tecido primrio e imortalizado A maioria dos vrus cresce em tecido imortalizado. Efeitos citopatolgicos: a. Morte celular: arredondamento da clula, degenerao, agregao, perda da fixao ao substrato b. Alteraes histolgicas: corpsculos de incluso no ncleo ou citoplasma, marginao da cromatina c. Sinccios: clulas gigantes multinucleadas (fuso celular) d. Alteraes da superfcie celular: expresso de Ag viral, hemadsoro (expresso de hemaglutinina) Em cultivo, o vrus infecta a clula, que passa a expressar em sua superfcie a hemaglutinina. Se forem adicionadas hemcias este cultivo, estas aglutinaro.

Interao Vrus-Clulas: Corpsculos de incluso

Diagnstico laboratorial das infeces virais Pode ser feito atravs de trs mtodos diferentes: Deteco de protenas virais a. Perfis proticos (eletroforese) Certos vrus possuem perfis eletroforticos diferenciados, permitindo o diagnstico de imediato. b. Atividades enzimticas (transcriptase reversa) c. Hemaglutinao e hemadsoro d. Deteco do Ag (fluorescncia indireta, ELISA, Western blot) Deteco de material gentico viral a. Perfis de clivagem da endonuclease de restrio especfica b. Mobilidades eletroforticas do RNA para vrus de RNA segmentado (eletroforese) c. Hibridao do genoma de DNA in situ (citoqumica) d. Southern blot (1 tcnica para detectar DNA) e Northern blot e. Reao da polimerase em cadeia PCR (DNA) Importante para detectar carga viral em pacientes com HIV. f. Reao da polimerase em cadeia com transcriptase reversa RT-PCR (RNA)

Sorologia (converso sorolgica) Converso sorolgica importante na confirmao de infeces recentes. Sendo o tlulo normal para determinada infeco 1:32, um paciente que possui titulao 1:120 est infectado. Contudo, no possvel afirmar se essa infeco recente ou prvia. Por isso, pede-se ao paciente que retorne 3 semanas depois para que outro teste seja feito. Para que a infeco seja determinada recente necessrio que o novo ttulo esteja 4 vezes maior que o ttulo inicial. Ex: Mulher grvida com titulao positiva para rubola. Testes sorolgicos: neutralizao, inibio da hemaglutinao, hemaglutinao passiva, aglutinao ltex, Imunofluorescncia direta e indireta, ELISA, RIA, Western blot. Neutralizao: Teste baseado na especificidade entre partculas virais ou antgenos e anticorpos monoclonais especficos. Quando ocorre a neutralizao, h confirmao diagnstica para a infeco pesquisada. Hemaglutinao passiva: Pega-se o soro do paciente que suspeita-se possuir o anticorpo contra determinado antgeno viral. Caso haja aglutinao das hemcias, a suspeita confirmada. Se no existem anticorpos no meio as hemcias vo sedimentar naturalmente no fundo da placa, caracterizando o aspecto negativo de teste em boto. Pode ser utilizada tanto para a pesquisa de antgenos quanto de anticorpos. Aglutinao do ltex: As partculas do ltex so sensibilizados com anticorpo ou antgeno viral. Fazem o mesmo papel da hemcia na Hemiaglutinao passiva, a diferena que o ltex um material inerte. Imunofluorescncia: definida como uma tcnica que possibilita a visualizao de antgenos nos tecidos ou em suspenses celulares, por meio da utilizao de anticorpos especficos, marcados com fluorocromo, capazes de absorverem a luz ultra-violeta (UV), emitindo-a num determinado comprimento de onda, permitindo sua observao ao microscpio de fluorescncia (com luz UV).

Dentre os fluorocromos mais comumente utilizados esto:

Flurescena (FITC); Rodamina (TRICT).

Aps os fluorforos serem excitados por um determinado comprimento de onda, emitem ftons de luz fluorescentes a um comprimento de onda superior.

Imunofluorescncia Direta

Utiliza-se esta tcnica, tambm conhecida como tcnica de camada simples, para deteco de antgenos em amostras clnicas utilizando-se anticorpos marcados com fluorocromos.

As etapas deste procedimento compreendem:

Fixao do esfregao da lmina; Tratamento com anticorpo marcado; Incubao; Lavagem para remover excesso de anticorpos marcados no ligados; Visualizao no microscpio fluorescente.

As indicaes desta tcnica so: deteco de vrus, parasitas, antgenos de tumor de amostras ou monocamadas de clulas do paciente. utilizado tambm na identificao da distribuio de um antgeno no interior de um tecido ou compartimento de uma clula.

Imunofluorescncia Indireta

Utiliza-se este tipo de imunofluorescncia, tambm conhecida como tcnica de dupla camada, na deteco de anticorpos no soro do paciente por meio de antgenos fixados em uma lmina, na qual se aplica primeiramente um anticorpo especfico no fluorescente. Por fim, coloca-se um anticorpo fluorescente com especificidade marcada contra determinados antgenos do primeiro anticorpo usado para reagir com o antgeno.

Esta tcnica tem como vantagem possibilitar uma fluorescncia mais evidente, uma vez que os anticorpos fluorescentes associam-se somente aos anticorpos primrios, alm de permite trabalhar com diversos anticorpos primrios especficos para distintos tipos de antgenos, sendo capaz de identificar qual a classe a qual o anticorpo pertence.

Habitualmente, a imunofluorescncia indireta utilizada na deteco de auto-anticorpos, e tambm, na deteco de anticorpos anti-nucleares encontrados no soro de pacientes com lpus eritematoso sistmico.

ELISA: Mesma tcnica utilizada na imunofluorescncia. Possui tambm 2 tipos: ELISA indireto (deteco de anticorpos) e ELISA sanduche (deteco de antgenos). A diferena bsica consiste no fato de a imunofluorescncia usar fluorforos e o ELISA usar cromgenos.

Western-Blot: O teste de Western Blot o teste que confere maior segurana. O Western Blot conjuga a ligao do anticorpo especfico, em stios tambm especficos, uma vez que o anticorpo vai se ligar a protenas que so separadas por diferentes pesos moleculares . Em um laboratrio de pesquisa faz-se um gel que capaz de separar protenas. Coloca-se um pente que vai fazer os poinhos para o gel. No primeiro poinho que eu escolher, eu vou pipetar um marcador de peso molecular, que um conjunto de protenas ou fragmento proteicos com pesos moleculares conhecidos. Esse marcador de peso molecular serve para eu saber qual a posio da protena a hora da corrida. A eu aplico uma corrente eltrica que vai fazer as protenas migrarem, separando-se no gel pelo peso molecular (e eu vou saber o peso molecular por causa do marcador). At a no vi nada.Nesta etapa, transfere-se o gel para uma membrana e aplicada nova corrente eltrica, que vai fazer com que essas protenas migrem do gel para membrana. Todas as protenas esto imobilizadas na membrana. nessa membrana aonde eu vou colocar a amostra para ver se eu tenho alguma reao positiva. Se esse anticorpo conseguir se ligar ao antgeno que est imobilizado, ele vai ficar fixo ali. A eu lavo, coloco um segundo anticorpo, que pode ser conjugado a uma enzima que produz alterao de cor ou que produz luminescncia. Esse segundo anticorpo s vai se ligar se tiver anticorpo em amostra e a vai imprimir naquela posio do antgeno, no peso molecular que eu quero, vai se precipitar o substrato. A eu lavo de novo, coloco a membrana dentro de um cassete de filme, coloco um filme de raio-X e exponho. A eu tenho uma banda que corresponde ao tamanho da banda que eu espero, porque aqui do lado eu tenho um marcador e na hora que eu junto com o filme, eu vejo qual o tamanho da banda.