Augu molekulārā ģenētika
description
Transcript of Augu molekulārā ģenētika
1
Nils Rostoks LU Bioloģijas fakultāte
AUGU MOLEKULĀRĀ ĢENĒTIKA
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
2
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
2 kredītpunkti 11 lekcijas 2 semināri Patstāvīgais darbs – sagatavot prezentāciju semināram Nobeigumā – eksāmens
Prasības KP ieguvei: Lekciju apmeklējums, uzstāšanās ar referātu seminārā un aktīva dalība referātu apspriešanā (50% atzīmes), sekmīgi nokārtots rakstiskais eksāmens (50%)
KURSA APJOMS
MĀCĪBU PLĀNS UN LEKCIJU SARAKSTS
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
3
Datums Lekcijas temats08.02.2013 Iepazīšanās, ievadlekcija15.02.2013 Augu ģenētikas vēsture. Augi kā ģenētikas modeļorganismi. 22.02.2013 Augu genomu struktūra un pētīšanas metodes 01.03.2013 Augu genomu struktūra un evolūcija. Genomu polimorfisms, poliploīdija
08.03.2013 Molekulāro marķieri un to genotipēšanas tehnoloģijas un to pielietojums genoma kartēšanā
15.03.2013 Kartēšana augos izmantojot eksperimentālas un dabiskas populācijas 22.03.2013 Lekcija nenotiek 29.03.2013 Lieldienu brīvdienas05.04.2013 Molekulārie marķieri augu selekcijā 12.04.2013 Seminārs. Augu genoma struktūra un molekulārie marķieri 19.04.2013 Augu - augu patogēnu molekulārā ģenētika un bioloģija
26.04.2013 Augu abiotiskā stresa izturības un hormonālās regulācijas molekulārā ģenētika
03.05.2013Transgēno augu iegūšanas vēsture, metodes un pielietojums fundamentālos pētījumos. Latvijas un ES likumdošana ĢMO kultūraugu līdzāspastāvēšanas un ierobežotas izmantošanas jomās Transgēno augu pielietojums biotehnoloģijā. Ģenētiski modificēti kultūraugi.
10.05.2013 Seminārs. Augu abiotiskais un biotiskais stress un ĢMO 17.05.2013 Lekcija nenotiek 24.05.2013 Eksāmens
4MĀCĪBU MATERIĀLI
I
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
Lekcijas
5MĀCĪBU MATERIĀLI
II
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
Lekcijas
6AUGI KĀ ĢENĒTIKAS MODEĻORGANISMI
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
Augi kā ģenētikas modeļorganisms (Mendelis un zirņi)
Wilhelm Ludwig Johannsen, tīro līniju teorija (pupiņas un mieži)
Jack R. Harlan, Robert W. Allard, evolūcija un populāciju ģenētika (mieži)
Barbara McClintock, krusmijas citoģenētiskie pētījumi, gēnu novietojums hromosomā, transponējamie ģenētiskie elementi (kukurūza)
7MENDEĻA
EKSPERIMENTI
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
1865. gada raksts “Versuche über Pflanzen-Hybriden" (tulkojums angļu valodā atrodams http://www.mendelweb.org/)
Prasības eksperimentā izmantotajiem augiem:
1. augiem jāpiemīt nemainīgām, tos atšķirošām īpašībām;
2. šo augu hibrīdiem ziedēšanas laikā jābūt pasargātiem no apputeksnēšanas ar svešiem putekšņiem;
3. hibrīdiem un to pēctečiem nedrīkst piemist būtiskas atšķirības auglībā.
8MENDEĻA EKSPERIMENTU GĒNS – KROKOTA SĒKLA
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
Gēns, kas nosaka gludu/krokotu sēklu fenotipu
Bhattacharyya et al. (1990) The wrinkled-seed character of pea described by Mendel is caused by a transposon-like insertion in a gene encoding starch-branching enzyme. Cell, 60:115-122.
Šo pazīmi nosaka r (rugosus) lokuss. RR un Rr genotipi nosaka gludas sēklas, bet rr genotips nosaka krokotas sēklas. rr sēklās trūkst cietes zarošanās enzīms I (starch-branching enzyme –SBEI). r lokusā ir Ac/Ds transposona insercija, kas noved pie nefunkcionālas mRNS sintēzes un cietes, lipīdu un proteīnu biosintēzes traucējumiem.
9 TĪRĀS LĪNIJAS
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
10KVANTITATĪVO PAZĪMJU
SADALĪJUMS
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
11KVANTITATĪVĀS PAZĪMES
ĢENĒTIKĀ
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
Merlin Kompakt PR-3005 1268799-2 PR-3534 Ansis 754277-27 Ballistu Priekuļu 60 Imula L-2630 L-302 Ilga HB378 718676-190
20
40
60
80
100
120
Plant height (cm)
50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 10505
101520253035404550
Plant height categories (cm)
Size bins (cm)
Freq
uenc
cy
12DISKRĒTĀS UN KVANTITATĪVĀS
PAZĪMES ĢENĒTIKĀ
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
Mendelis strādāja ar diskrētām pazīmēm «dzeltens» – «zaļš», «rievots» – «gluds», pie tam katru pazīmi noteica viena gēna dažādas alēles
Johansens strādāja ar kvantitatīvu pazīmi «pupiņu garums, cm», kuru nosaka gan gēni (tāpēc iespējamas tīrās līnijas), gan vides faktori (tāpēc variācija tīrās līnijas ietvaros)
Vairums pazīmju dabā ir kvantitatīvas – tās nosaka vairāki gēni, kā arī vides faktori (fenotips = gēni + vide)
Vēsturiski uzskatīja, ka Mendeļa un kvantitatīvā ģenētika ir dažādas lietas, bet tagad ir zināms, ka kvantitatīvā ģenētika arī balstās uz Mendeļa likumiem
13 EVOLŪCIJAS PĒTĪJUMI
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
Alllard RW (1988) The Wilhelmine E. Key 1987 invitational lecture. Genetic changes associated with the evolution of adaptedness in cultivated plants and their wild progenitors. J Hered, 79: 225 – 238
Composite cross II – izveido 1928. gadā J. Harlan. Krusto 28 miežu šķirnes, no iegūtajiem 378 krustojumiem izsēj vienādu daudzumu F1 sēklu. Ievākto ražu apkopo un no tās izsēj nejaušu paraugu. To atkārto līdz F60.
14MIKROEVOLŪCIJA MIEŽU
POPULĀCIJĀ
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
Evolūcija – iedzimstošas izmaiņas organismos vai populācijās vairāku paaudžu laikā, īpašību nodošana nākamajām paaudzēm ar izmaiņām
Mikroevolūcija – evolūcija sugas iekšienē, ģenētiskās izmaiņas populācijās un ģenētiskā diferenciācija starp populācijām
Pielāgotība (adaptedness) – organisma spēja dzīvot un vairoties noteiktā vidē
Pielāgošanās (adaptation) – organisma vai populācijas pielāgošanās noteiktai videi
Fitness – genotipa vidējais ieguldījums populācijā salīdzinot ar citiem genotipiem
15EVOLŪCIJA CCII
POPULĀCIJĀ
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
CCII paaudžu gaitā bija novērojamas būtiskas kvalitatīvo pazīmju (morfoloģiskās pazīmes, slimību izturība, izoenzīmi, rDNS restrikcijas fragmenti) alēļu frekvenču izmaiņas
CCII kopumā turpināja pieaugt pielāgotība noteiktiem vides apstākļiem
Visiem marķieru lokusiem bija būtiska ietekme uz vairākām kvantitatīvām pazīmēm
Jau agrīnās paaudzēs izveidojās būtiskas asociācijas starp alēlēm dažādos lokusos
16ALĒĻU FREKVENČU IZMAIŅAS
ESTERĀZES LOKUSĀ
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
17TRANSPONĒJAMI
ĢENĒTISKIE ELEMENTI
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
Nobela prēmija medicībā 1983. gadā "for her discovery of mobile genetic elements“
Mutable Loci in Maize (1948)
http://profiles.nlm.nih.gov/LL/
18AC/DS TRANSPOZONU
SISTĒMA
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
http://www.mun.ca/biology/scarr/Ac-Ds_system_genetics2.html
19AC/DS SISTĒMAS PIELIETOJUMS
FUNKCIONĀLAJĀ GENOMIKĀ
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
Lazarow and Lutticke (2009) An Ac/Ds-mediated gene trap system for functional genomics in barley. BMC Genomics, 10: 55
Izveido transgēnu miežu līniju, kura satur Ac transpozāzi, kā arī vairākas līnijas, kas satur uz Ds elementa bāzes veidotu konstrukciju, kas ekspresē GUS marķieri. Krusto Ac līniju ar Ds līnijām, F1 un F2 augos novēro GUS marķiera aktivitāti. Sekvences analīze liecina, ka Ds elements ar GUS marķieri insertējas gēnu tuvumā miežu genomā
20POLIPLOĪDIJA, HROMOSOMU
SEGREGĀCIJA, MEJOTISKĀ KRUSTMIJA
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
Polyploidy in Zea Mays L (1926)
A Correlation of Cytological and Genetical Crossing-Over in Zea Mays (1931)
The Order of the Genes C, Sh, and Wx in Zea Mays with Reference to a Cytologically Known Point in the Chromosome (1931)
The Correlation of Cytological and Genetical Crossing-Over in Zea Mays. A Corroboration (1935)
21NORMANS BORLAUGS UN
“ZAĻĀ REVOLŪCIJA”
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
Normans Borlaugs (1914. – 2009.), Nobela miera prēmijas laureāts 1970. gadā
Augu patologs, ģenētiķis un selekcionārs
Pazīstams ar savu darbu CIMMYT (Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo, International Maize and Wheat Improvement Center, Mexico) pie jaunu kviešu šķirņu veidošanas un popularizēšanas Meksikā, Indijā, Pakistānā
“Zaļā revolūcija” notika pateicoties jaunām šķirnēm, pesticīdu pielietojumam un agrotehniskajiem pasākumiem
22NORMANS BORLAUGS UN
“ZAĻĀ REVOLŪCIJA”
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
23NORMANS BORLAUGS UN
“ZAĻĀ REVOLŪCIJA”
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
The green revolution in India and Pakistan ... is neither a stroke of luck nor an accident of nature. Its success is based on sound research, the importance of which is not self-evident at first glance. For, behind the scenes, halfway around the world in Mexico, were two decades of aggressive research on wheat that not only enabled Mexico to become self-sufficient with respect to wheat production but also paved the way to rapid increase in its production in other countries. It was in Mexico that the high-yielding Mexican dwarf varieties were designed, bred, and developed. There, also, was developed the new production technology which permits these varieties, when properly cultivated, to express their high genetic grain-yield potential - in general, double or triple that of the best yielders among older, tall-strawed varieties.
http://nobelprize.org/nobel_prizes/peace/laureates/1970/borlaug-lecture.html
24NORMANS BORLAUGS UN
“ZAĻĀ REVOLŪCIJA”
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
Equally as important as the transfer of the new seed and new technology from Mexico to India and Pakistan was the introduction from Mexico of a crop-production campaign strategy. This strategy harnessed the high grain-yield potential of the new seed and new technology to sound governmental economic policy which would assure the farmer a fair price for his grain, the availability of the necessary inputs - seed, fertilizers, insecticides, weed killers, and machinery - and the credit with which to buy them. Collectively these inputs and strategy became the base from which the green revolution evolved.
http://nobelprize.org/nobel_prizes/peace/laureates/1970/borlaug-lecture.html
25AUGU FILOĢENĒZE UN
TAKSONOMIJA
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
Sauszemes augu sporas pirmoreiz parādījās 476 miljonus gadu vecos iežos
Pirmās vaskulāro augu fosīlijas datētas no Silūra (415 – 440 miljoni g.)
Pirmie ziedaugi parādās pirms apm. 130 miljoniem gadu
26 AUGU SISTEMĀTIKA
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
Sistemātika (nozare) un taksonomija (apakšnozare)
Taksonomijā izmantojamās pazīmes :
Morfoloģiskās pazīmes – lapas forma un anatomija, reproduktīvo orgānu morfoloģija, ziedu forma un anatomija, embriju un dīgstu forma, vasas un sakņu forma
Bioķīmiskās pazīmes – fotosintēzes ceļi, izoenzīmi, hloroplastu un kodola genoms, metabolīti
27MIKROSKOPIJA AUGU
TAKSONOMIJĀ
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
Orhidejas Lycaste c.f. tricolor putekšņlapasLahaye et al. (2008) PNAS, 105: 2923
28AUGU
TAKSONOMIJA
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
Taksonomija – sadala dzīvos organismus grupās (taksonos) un sakārto tos hierarhiskā secībā balstoties uz to līdzības pakāpi
Filoģenētiskā taksonomija – atspoguļo taksonomisko vienību evolucionāro vēsturi
29MOLEKULĀRIE MARĶIERI
TAKSONOMIJĀ
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
Molekulārie dati sniedz nepastarpinātu informāciju par organismu genomu, tos iespējams interpretēt izmantojot precīzi definējamus evolūcijas modeļus
Molekulārās metodes ļauj analizēt tādus organismus, kuri nav pieejami standarta metodēm, piemēram, nekultivējami mikroorganismi, vai herbārija paraugi
Molekulāro marķieru informācija ir daudz plašāka nekā fenotipiskā informācija
Molekulārie marķieri palīdz atšķirt homoloģiju un analoģiju
Molekulārie dati ļauj tieši salīdzināt ģenētiskās diferenciācijas pakāpi dažādās taksonomiskās grupās, piemēram, zivīs un putnos
30MORFOLOĢISKĀS PAZĪMES
UN MOLEKULĀRIE MARĶIERI
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
31GRAUDZĀĻU (POACEAE)
SISTEMĀTIKA
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
Filoģenēze rekonstruēta balstoties uz morfoloģijas un anatomijas datiem, hloroplastu genoma datiem (cpDNA restrikcijas analīze, rbcL, ndhF, rpoC2 un rps4 sekvences) un kodola genoma datiem (rDNS, GBSSI (waxy) un fitohroma B sekvences) Kellog E (1998) PNAS, 95: 2005
32FENOTIPS UN GENOTIPS
SISTEMĀTIKĀ
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
O’Leary et al. (2013) The placental mammal ancestor and the post-K-Pg radiation of placentals. Science, 339:662
33DNS SVĪTRKODS UN
GENOMU SEKVENCES
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
Kress and Erickson (2008) PNAS, 105: 2761
34 DNS SVĪTRKODS
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
DNS svītrkods – īsa (400 – 800 bp) DNS sekvence dažādu taksonu identifikācijai un klasifikācijai
Pirmā starptautiskā konference “Barcoding of Life”, Londonas Dabas vēstures muzejā, Londonā, 2005. gada februārī
http://barcoding.si.edu/history.html
Priekšnoteikumi DNS svītrkodu pielietojumam:
Sekvences pietiekami polimorfas, lai atšķirtu radniecīgas sugas
Polimorfo rajonu flankējošie rajoni ir konservatīvi un ļauj veidot universālus PCR praimerus
Sekvencēm jābūt pietiekami īsām, lai atbilstu mūsdienu tehnoloģiju iespējām
35CBOL – CONSORTIUM FOR
THE BARCODE OF LIFE
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
http:// http://www.barcodeoflife.org/; http://www.boldsystems.org/
Dzīvniekiem visplašāk pielieto mitohondriju genomā kodētās citohroma c oksidāzes 1. subvienības 5’ rajonu (COI)
Augiem COI rajons nav pielietojams. Izmantoti tiek vairāki citi gēni, galvenokārt no hloroplastu genoma
36DNS SVĪTRKODA GĒNU
DAUDZVEIDĪBA
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
Lahaye et al. (2008) DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots. PNAS, 105: 2923
37PLANT GENETICS AND
ENVIRONMENT
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
Science Matters: Plant Genetics and the Environment (Dr. Julian Schroeder, UCSD)
http://www.youtube.com/watch?v=fghFaDlgc-E
41 2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
AUGU GENOMU STRUKTŪRA
42 AUGU GENOMI
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
Kodola genoms
Mitohondriju genoms
Hloroplastu genoms
Papildus informācija par augu genomiem:
http://www.ndsu.nodak.edu/instruct/mcclean/plsc731/genome/genome1.htm
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/PLANTS/PlantList.html
http://www.arabidopsis.org/portals/genAnnotation/other_genomes/index.jsp
43GENOMISKĀS DNS
RENATURĀCIJAS KINĒTIKA
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
Denaturēta DNS renaturēsies balstoties uz DNS bāzu pāru komplementaritātes principu
Renaturācijas kinētika ļauj raksturot genoma sekvences, jo renaturācija balstās uz nejaušu komplementāru DNS fragmentu sadursmi
C0 x t1/2 raksturo noteikta DNS sekvences veida renaturāciju, kur
C0 = DNS molārā koncentrācija
t1/2 = laiks, kas nepieciešams, lai puse DNS
molekulu renaturētu
Jo lielāks C0t1/2, jo lēnāka reakcija
44
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
http://plantgenome.agtec.uga.edu/CBCS/hub/webpages/cot.htm
45 C0T1/2
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
46C0T1/2 VĒRTĪBA ATKARĪGA NO
GENOMA KOMPLEKSITĀTES
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
47GENOMA
KOMPLEKSITĀTE
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
Genoma kompleksitāti definē kā kopīgo unikālo (savstarpēji atšķirīgo) sekvenču garumu
E. coli genoma kompleksitāte ir 4.2 x 106, kas atbilst tā genoma izmēriem, jo šajā genomā visas sekvences ir unikālas
C0t1/2 tieši saistīts ar DNS daudzumu genomā - jo genoms kompleksāks, jo mazāks katras unikālās sekvences kopiju skaits
Piemēram, 12 pg E. coli genomiskās DNS satur 3000 kopijas no katra gēna, bet tas pats daudzums cilvēka genomiskās DNS tikai 4 kopijas katra gēna
48EIKARIOTU GENOMU C0T1/2
ANALĪZE
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
Eikariotu genoma C0t1/2 analīzes līkne atšķiras no baktēriju līknes
Eikariotu genoms satur vairākus komponentus, katru ar savu C0t1/2 vērtību
Lēnais (augstas C0t1/2 vērtības) komponents satur gēnus, kurus veido unikālas DNS sekvences
Piemēram, sorgo genomā lēnais komponents atbilst 700 mb (24%) no genoma (Peterson et al. (2002) Genome Res, 12: 795
GENOMU IZMĒRU SALĪDZINĀJUMS
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
49
0.00
0.01
0.10
1.00
10.00
100.00
1000.00
10000.00
100000.00
50 AUGU GENOMU SEKVENCES
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
2000. g. 2002. g.2002. g. 2005. g.
2006. g.
51
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
52
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
AUGU GENOMU SEKVENĒŠANA
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
53
Brachypodium distachyon genoms nosekvenēts http://www.brachypodium.org/
Kukurūzas (Zea mays) genoms nosekvenēts- http://www.maizegdb.org/
Kviešu (Triticum aestivum) (http://www.wheatgenome.org/) un miežu (Hordeum vulgare) (http://www.etgi.org) genoma sekvenēšana
54AUGU GENOMU
SEKVENĒŠANAS STRATĒĢIJAS
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
Sekvenēt visu genomu, ieskaitot gēnus un atkārtojumus
Sekvenēt tikai to genoma daļu, kas ir unikāla (gēni, regulācijas elementi, nedaudz atkārtojumu)
Whitelaw et al. (2003) Enrichment of Gene-Coding Sequences in Maize by Genome Filtration. Science, 302: 2118 (http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/302/5653/2118?ck=nck)
55AUGSTĀ C0T1/2 GENOMA
SEKVENĒŠANA
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
Sekvenēt tikai to genoma daļu, kas ir unikāla (gēni, regulācijas elementi, nedaudz atkārtojumu)
Veic genomiskās DNS renaturāciju un izdala frakciju ar augstu C0t1/2 vērtību. Veido genomiskās DNS bibliotēkas no šīs DNS un veic tradicionālo sekvenēšanu
http://www.mgel.msstate.edu/press/gt.pdf
56
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
57METILFILTRĒŠANAS
METODE
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
Sekvenēt tikai to genoma daļu, kas ir unikāla (gēni, regulācijas elementi, nedaudz atkārtojumu)
Genomā atrodamie atkārtojumi (transpozoni, retrotranspozoni) parasti ir metilēti (citozīna metilācija, CpG vai CpNpG)
Genomiskā DNS tiek klonēta baktēriju celmā, kas sašķeļ metilētu DNS
Pāri palikušie kloni pārsvarā satur gēnus un to regulācijas elementus
58
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
59
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS http://www.vialactia.com/_attachments/Dallas2003_Ryegrass_GeneThresher_Poster.pdf
60GENOMA
SEKVENĒŠANA
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
Fiziskā karte un ģenētiskā karte; lielu, vidēju un mazu genomiskās DNS klonu bibliotēkas; sekvenē klonu pēc klona, savāc genoma sekvenci no savstarpēji pārklājošamies kloniem
Shotgun sekvenēšana; mazu un vidēju klonu bibliotēkas; savāc genoma sekvenci visu uzreiz
Abas pieejas balstās uz Sangera didezoksiterminatoru sekvenēšanu, par kuru viņš 70-tajos gados saņēma Nobela prēmiju
61
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
GENOMA SEKVENĒŠANA
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
62
Green (2001) Strategies for the systematic sequencing of complex genomes. Nat Rev Genetics, 2: 573
63GENOMA
SEKVENĒŠANA
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
DOE JGI Whole Genome Shotgun Sequencing, part 1
http://www.youtube.com/watch?v=RLsb0pMx_oU
DOE JGI Whole Genome Shotgun Sequencing, part 2
http://www.youtube.com/watch?v=eJ3WvQsPLUk
DOE JGI Whole Genome Shotgun Sequencing, part 3
http://www.youtube.com/watch?v=VhH-SJKGAPo
64NEXT GENERATION
SEQUENCING
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
Līdz šim genomu sekvenēšanai izmantoja Sangera sekvenēšanu – sekvenēšana ar sintēzi izmantojot fluorescenti iezīmētus didezoksinukleotīdu terminatorus
Next generation sequencing balstās uz citiem principiem
NGS ir apkopojošs nosaukums vairākiem atšķirīgiem sekvenēšanas protokoliem
454 (Roche), ABI Solid, Illumina Solexa, Helicos HeliScope Schendure and Hanlee (2008) Next-generation DNA sequencing. Nat Biotech 26:1135
65GENOMU SEKVENĒŠANA – NEXT
GENERATION SEQUENCING
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
NGS video apskats
http://www.youtube.com/watch?v=g0vGrNjpyA8&feature=channel
Bioinformātika nākamās paaudzes sekvenēšanas datiem
http://www.oxfordjournals.org/our_journals/bioinformatics/nextgenerationsequencing.html
NGS posteris
http://www.nature.com/nrg/posters/sequencing/Sequencing_technologies.pdf
454 (ROCHE) GS FLX TITANIUM
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
66
ILLUMINA (SOLEXA) GENOME ANALYZER
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
67
INDIVĪDA GENOMA SEKVENCE
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
68
Cilvēka genoma projekts (1990. – 2003.) noteica pilnu cilvēka genoma sekvenci, taču tā ir dažādu indivīdu genomu hibrīds
Levy et al. (2007) The diploid genome sequence of an individual human. PLoS Biol 5: e254
69AUGU GENOMA STRUKTŪRA
– GĒNI
2013. GADA 15. FEBRUĀRIS
Proteīnus kodējošie gēni, rRNS gēni, tRNS gēni, citi RNS gēni, genoma atkārtojumos esošie gēni
Gēnu izmēri
Gēnu izvietojums genomā
Intronu – eksonu struktūra
70GENOMA STRUKTŪRAS
SALĪDZINĀJUMS
Gēnu skaits
Cilvēks – 20 000 – 25 000
Arabidopsis – 25 498
Rīsi – 32 000 – 55 000
Gēnu blīvums un gēnu struktūra
Vidējais introna garums cilvēkam – 5.5 kbp, Arabidopsis – 152 bp, rīsiem – 387 bp
Vidējais kopējais intronu izmērs cilvēkam – 42 kbp, Arabidopsis – 0.74 kbp, rīsiem – 1.8 kbp
Vidējais kopējais eksonu garums cilvēkam – 1.49 kbp (8.7), Arabidopsis – 1.35 kbp (5.7), rīsiem – 1.34 (5.7)
Ren et al. (2006) In plants, highly expressed genes are the least compact. TIG, 22:5282013. GADA 15. FEBRUĀRIS