Atlas Agares
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INSTITUTO TECNOLOGICO DE MAZATLAN
ING. BIOQUIMICA
SEXTO SEMESTRE
MICROBIOLOGIA
M.C. IRMA LORENA SANCHEZ HUMARAN
ATLAS DE AGARES BATERCIOLOGICOS
EQUIPO 5
Carnero Lerma Tania Ernestina
Carvajal Portillo Jocelyn Pamela
Figueroa Daz Carmen Liliana
Franco Torres Amayrani
Lizarraga Duarte Izamary
Zepeda Mediana Ana Karen
Mazatln Sin., 19 de Febrero del 2015
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1
CONTENIDO
INTRODUCCION .................................................................................................... 2
CULTIVO DE MICROORGANISMOS .................................................................. 2
MEDIOS DE CULTIVO ........................................................................................ 2
CULTIVO DE MICROORGANISMOS. ................................................................. 2
DESARROLLO ........................................................................................................ 4
AGAR DE BILIS Y ROJO VIOLETA. ............................................................. 4
AGAR DE BILIS VERDE BRILLANTE ........................................................... 6
AGAR DESOXICOLATO ............................................................................... 7
AGAR DEXTROSA ........................................................................................ 9
AGAR DE PAPA Y DEXTROSA (PDA) ....................................................... 11
AGAR ENDO ............................................................................................... 12
AGAR EOSINA AZUL DE METILENO ........................................................ 14
AGAR PARA ESTAFILOCOCOS (NO 110 S-110) ...................................... 16
AGAR PARA INFUSIN DE CEREBRO Y CORAZN (BHI) ..................... 17
AGAR LACTOSA ......................................................................................... 19
AGAR Mc CONKEY .................................................................................... 21
AGAR PARA MTODOS ESTNDAR ........................................................ 22
AGAR NUTRITIVO ...................................................................................... 24
AGAR SALMONELLA SHIGELLA (SS) ....................................................... 26
AGAR BISMUTO SULFITO ......................................................................... 28
AGAR TCBS (TIOSULFATO CITRATO SALES BILIARES SACAROSA) . 30
AGAR XILOSA LISINA DESOXICOLATO (XLD) ......................................... 32
AGAR BAIRD-PARKER .............................................................................. 34
CALDO TETRATIONATO ........................................................................... 36
CALDO ESCHERICHIA COLI ..................................................................... 38
BIBLIOGRAFAS ................................................................................................... 39
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2
INTRODUCCION
CULTIVO DE MICROORGANISMOS
El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones fsicas,
qumicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma
controlada. En general, podemos distinguir cultivos lquidos y slidos en funcin de
las caractersticas del medio y cultivos discontinuos y continuos en funcin de la
disponibilidad de nutrientes en el medio.
MEDIOS DE CULTIVO
Un microorganismo necesita para crecer nutrientes que le aporten energa y
elementos qumicos para la sntesis de sus constituyentes celulares. Dependiendo
de la fuente de carbono que utilizan, los microorganismos se pueden clasificar en
autotrofos si es el CO2 atmosfrico (microorganismos que fotosintetizan) y
heterotrofos si utilizan carbono orgnico.
La frmula elemental de un microorganismo es, aproximadamente,
C4H7O2N
Lo que supone que los componentes de las clulas son: carbono que representa
alrededor del 50% del peso seco, oxgeno (32%), nitrgeno (14%), fsforo (3%),
azufre (en torno al 1%) y otros elementos traza entre los que se encuentran Fe, K,
Mg, Mn, Co, Mb, Cu y Zn.
La elaboracin de medios de cultivo requiere proporcionar los elementos antes
citados en una forma asimilable. As, por ejemplo, el C debe estar en forma de
carbono orgnico para los heterotrofos y como CO2 para los autotrofos, el N en
forma de NH4, de NO3 - o de NO2 - o en forma de aminocidos a los que se
pueda tomar su grupo amino; el P debe estar en forma de PO4 3-, el S procede de
aminocidos sulfurados o de SO4.
CULTIVO DE MICROORGANISMOS.
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3
Los medios de cultivo se pueden clasificar en definidos cuando su composicin
qumica se conoce totalmente y complejos cuando no es el caso porque estn
compuestos por mezclas de extractos de materiales complejos (extracto de
levadura, extracto de carne, etc.).
Por otra parte, los medios de cultivo pueden ser lquidos o slidos si se aade
algn agente solidificante que no sea consumible por los microorganismos
(normalmente agar).
En funcin de los microorganismos que pueden crecer en ellos, los medios
pueden ser generales, selectivos cuando favorecen el crecimiento de ciertos
microorganismos
mientras suprimen el de otros (por ejemplo, el medio SPS para clostridios),
diferenciales cuando alguno de sus componentes permite identificar las colonias
de un tipo de microorganismos (por ejemplo medios con hemates para identificar
colonias de microorganismos hemolticos), selectivo-diferenciales cuando
combinan las dos caractersticas anteriores (por ejemplo, el agar de MacConkey
para identificar Escherichia coli), y medios de enriquecimiento que permiten aislar
un tipo determinado de microorganismo a partir de una mezcla una poblacin
mixta de gran tamao.
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4
DESARROLLO
AGAR DE BILIS Y ROJO VIOLETA.
Fundamento
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aporta los nutrientes
necesarios para el crecimiento bacteriano, las sales biliares y el cristal violeta
inhiben el desarrollo de la flora Gram positiva, la lactosa es el hidrato de carbono
fermentable, y el rojo neutro es el indicador de pH. El agar es el agente
solidificante. Los coliformes son bacterias que fermentan la lactosa, acidifican el
medio y producen un viraje del indicador de pH al color rojo intenso. Debido a
esto, se observan como colonias de color rojo prpura, de 1 a 2 mm de dimetro,
rodeadas, generalmente, de una zona rojiza de bilis precipitada.
Preparacin
Suspender 41,5 g en 1 l de agua destilada; calentar y agitar hasta ebullicin y
hervir durante 1 minuto. Dejar enfriar a 45C y emplear de inmediato.
Se puede esterilizar a 118C durante 15 minutos. No sobrecalentar ni refundir el
medio.
Color de las colonias
Color de las colonias que se desarrollan en el medio de cultivo:
Ingredientes (gr/L)
Extracto de levadura 3.0 gr
Peptona 7.0 gr
Sales biliares 1.5 gr
Lactosa 10.0 gr
Cloruro de sodio 5.0 gr
Rojo neutro 0.03 gr
Cristal violeta 0.002 gr
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5
Bacterias que fermentan la lactosa: colonias rojo prpura, rodeadas por un
halo de precipitacin rojizo.
Bacterias que no fermentan la lactosa: colonias del color del medio,
incoloras.
Las cepas de enterococcus: Se pueden desarrollar en este medio de cultivo como
colonias pequeas, puntiformes, rosadas.
Colonias que se desarrollan en el cultivo
Microorganismo Crecimiento
Escherichia coli ATCC
8739
Satisfactorio
Escherichia coli ATCC
25922
satisfactorio
Klebsiella pneumonias
ATCC 700603
Satisfactorio
Salmonella typhimurium
ATCC 14028
satisfactorio
Proteus mirabilis ATCC
43071
satisfactorio
Pseudomonas
aeruginosa ATCC 9027
satisfactorio
Enterococcus faecalis
ATCC 29212
Escaso
Staphylococcus aureus
ATCC 6538
Inhibido
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AGAR DE BILIS VERDE BRILLANTE
Fundamento
En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el
adecuado desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante son los agentes
selectivos que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram negativas
a excepcin de coliformes, y la lactosa es el hidrato de carbono fermentable. Es
una propiedad del grupo coliforme, la fermentacin de la lactosa con produccin
de cido y gas.
Ingredientes (gr/L)
Bilis de buey 0.00295 gr
Erioglucina 0.0649 gr
Hierro (III) cloruro 0.0295 gr
Peptona de gelatina 8.25 gr
Sodio sulfito 0.205 gr
Verde brillante 0.0000295 gr
Fuscina bsica 0.0776 gr
Lactosa 1.8 gr
Potasio di-hidrogeno fosfato 0.0153 gr
Preparacin
Suspender 20,6 g en 1 l de agua destilada; calentar y agitar hasta ebullicin y
hervir durante 1 minuto. Distribuir y esterilizar a 121C durante 15 minutos.
El medio preparado es fotosensible por lo que se recomienda almacenarlo al
abrigo de la luz, y prepararlo poco antes de su utilizacin. Incubar a 37C de 18 a
24 horas.
Color y colonias que se desarrollan en el cultivo
Escherichia coli ATCC 25922. Crecimiento entre nulo y moderado, colonias entre amarillas y amarillas verdosas, halo amarillo.
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7
Enterococcus faecalis ATCC 29212. Crecimiento entre nulo y ligero, colonias amarillas con o sin halo amarillo. Salmonella Abony DSM 4224 Entre 10 y 100 colonias, colonias blanquecinas, halo rojo. Salmonella Typhimurium ATCC 14028. Crecimiento entre bueno y excelente, colonias blanquecinas, halo rojo sin inocular coloracin entre marrn y aceituna.
AGAR DESOXICOLATO
Fundamento
Es un medio altamente selectivo para el aislamiento de patgenos entricos,
particularmente de los gneros Salmonella y Shigella. Como la cantidad de este
carbohidrato es limitada, una vez que estos microorganismos lo consumen,
comienzan a utilizar la lisina lo cual produce la alcalinizacin del medio; este
hecho se evidencia porque el rojo fenol nuevamente vira a un color rojo. En el
caso de los coliformes lisina positiva, para prevenir la alcalizacin del medio por la
utilizacin de la lisina, se incorpora en el medio un exceso de lactosa y sacarosa.
El medio tambin tiene la capacidad de detectar la produccin de H2S, a travs
del sistema indicador tiosufalto de sodio y citrato frrico amonio. Cuando el
microorganismo produce H2S se observan colonias con el centro negro. Los
microorganismos no patgenos productores de H2S no descarboxilan la lisina;
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8
cuando estn presentes estos microorganismos la reaccin cida producida por la
utilizacin de los carbohidratos previene en ennegrecimiento de las colonias. El
desoxicolato de sodio es utilizado como un inhibidor de los microorganismos Gram
positivos.
Ingredientes (gr/L)
Infusin de carne de porcino 330,0
Proteosa peptona 10,0
Lactosa 10,0
Citrato de sodio 20,0
Citrato amnico frrico 2,0
Desoxicolato de sodio 5,0
Agar 13,5
Rojo neutro 20,0 mg
Agua destilada 1.000 mL
PH final 7.5 +/- 0.2
Preparacin
Suspender los ingredientes en el agua destilada. Calentar hasta ebullicin con
agitacin suave y frecuente hasta disolver completamente los ingredientes. Enfriar
entre 45C y 50C, colocar 20 mL de medio por cada placa y dejar solidificar. El
medio en las placas debe utilizarse el mismo da de su preparacin.
Color y colonias que se desarrollan en el cultivo
Microorganismos Resultados del crecimiento
E. coli
Colonias grandes, planas, de color rosa o rojo
con una zona de precipitacin biliar.
Enterobacter/Klebsiella
Colonias grandes, mucoides, de color rosa.
Proteus Colonias incoloras o rojas dependiendo de la
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especie.
Salmonella/Shigella
Colonias incoloras o de color anaranjado plido.
Pseudomonas
Colonias desde incoloras hasta marrn o verde.
Vibrio cholerae
Colonias de incoloras a rojas.
Bacterias gram-positivas
Crecimiento nulo o escaso.
AGAR DEXTROSA
Fundamento
Este medio de cultivo es utilizado para cultivo de mohos y levaduras patgenas y
no patgenas. El bajo pH del medio resulta favorable para el crecimiento de los
hongos y ligeramente inhibitorio para las bacterias. En caso de requerirse un
incremento en la inhibicin del crecimiento de bacterias, se recomienda aadir
agentes antimicrobianos como la gentamicina que inhibe el crecimiento de los
microorganismos gram negativos o el cloramfenicol que tiene un amplio espectro
de accin.
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Preparacin
Suspender 65 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitacin
suave hasta su completa disolucin y hervir durante un minuto. Evitar el
sobrecalentamiento. Esterilizar en autoclave a 121C (15 libras de presin)
durante 15 minutos. Dejar enfriar a una temperatura entre 45-50C y vaciar en
placas de Petri estriles.
Color y colonias que se desarrollan en el cultivo
Microorganismos Color
T. mentagrophytes Blanco a blanco grisceo/marrn claro.
A. brasili Marrn a negro.
Candida albicans Blanco a blanco grisceo.
Ingredientes (gr/L)
Dextrosa 40 g
Peptona de Casena 5 g
Digerido Pancretico de Tejido
Animal
5 g
Agar Bacteriolgico 15 g
PH 5.6
0.2
PH 5.6
0.2
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AGAR DE PAPA Y DEXTROSA (PDA)
Fundamento
Medio de cultivo microbiolgico que se preparan a partir de infusin de papa y
dextrosa (PDA). El agar de papa y dextrosa es el medio ms utilizado para el
crecimiento de hongos y levaduras que atacan a las plantas vivas o materia
vegetal muerta en descomposicin. El agar de papa y dextrosa puede ser
suplementado con antibiticos o cidos para inhibir el crecimiento bacteriano. Este
medio es recomendado para realizar el recuento colonial. Tambin puede ser
utilizado para promover el crecimiento de hongos y levaduras de importancia
clnica. La base del medio es altamente nutritiva y permite la esporulacin y la
produccin de pigmentos en algunos dermatofitos. Algunos procedimientos
sealan bajar el pH del medio a 3.5 0.1 con cido tartrico al 10 %, para inhibir
el crecimiento bacteriano. La infusin de papa promueve un crecimiento
abundante de los hongos y levaduras y el agar es adicionado como agente
solidificante.
Preparacin
La infusin de patata se puede preparar hirviendo 200 g de patatas cortadas en
rodajas sin pelar en ~ 1 litro de agua destilada durante 30 minutos y luego
decantar o filtrar el caldo a travs de una gasa. Se aade agua destilada de
manera que el volumen total de la suspensin es 1 litro. Se aaden 20 g de
dextrosa y agar en polvo (20 g), el medio se esteriliza en una autoclave a 15 psi
(121C) durante 15 minutos.
Ingredientes (gr/L)
Agua Destilada 1 L.
Patatas (cortadas en rodajas sin
pelar)
200 g.
Dextrosa 20 g.
Agar en Polvo 20 g.
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12
Color y colonias que se desarrollan en el cultivo
Microorganismos Color
Saccharomyces cervisiae Crema, lisas.
Candida albicans Crema, lisas.
AGAR ENDO
Fundamento
La selectividad del agar Endo se debe a la combinacin de sulfito de sodio y
fucsina bsica que inhibe ligeramente el crecimiento de los microorganismos gram
positivos. Es un medio de cultivo microbiolgico de color rosa plido. Fue
originalmente desarrollado para el aislamiento de Salmonella typhi, pero ahora es
usado mayormente como un medio para coliformes. La mayora de los organismos
gram negativos crecen bien en este medio, mientras que otros organismos gram
positivos son inhibidos.
Ingredientes. (gr/L)
Agar 15.0 gr
Fucsina bsica. 0.5 gr
Fosfato dopotsico. 3.5 gr
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13
Lactosa 10.0 gr
Peptona de carne 10.0 gr
Sulfito de sodio 2.5 gr
Preparacin
Rehidratar 41.5 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 10 a 15
minutos. Calentar agitando frecuentemente hasta el punto de ebullicin durante 1
minuto para disolverlo por completo. Esterilizar a 121C (15 lbs de presin)
durante 15 minutos. Enfriar aproximadamente a 45C. Vaciar en cajas de Petri
estriles. Conservar en refrigeracin de 2 a 8C.
NOTA: Para una mejor solubilidad de la Fucsina bsica agregar 40 ml de etanol
absoluto por litro de medio y dejarlo reposar 15 durante minutos.
Color y colonias que se desarrollan en el cultivo
Microorganismo Resultado
Escherichia coli Colonias rojo intenso con brillo metlico de color
verde.
Enterobacter cloacae
Colonias rojo intenso con o sin brillo metlico.
Salmonella typhi Colonias translcidas, rosa plido o del color del
medio.
Shigella flexneri Colonias translcidas, rosa plido o del color del
medio.
Enterococcus faecalis
Inhibicin parcial o colonias puntiformes.
PH 7.4 0.2
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AGAR EOSINA AZUL DE METILENO
Fundamento
Agar eosina azul de metileno (EMB de Levine) es un medio selectivo diferencial
para bacterias gramnegativas no exigentes. Los colorantes contenidos en el medio
inhiben el crecimiento de las bacterias grampositivas, excepto el del enterococo.
Con ello, se permite la diferenciacin de las enteribacterias fermentadoras de la
lactosa (color violeta intenso) de las no fermentadoras (grisceas). Escherichia coli
aparece violeta, como lactosa positiva, pero con un brillo metlico caracterstico.
Permite el crecimiento de no cardia formando colonias tpicas.
pH = 7.2 0.2
Preparacin
Rehidratar 36 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 10 a 15 minutos.
Calentar agitando frecuentemente hasta el punto de ebullicin durante 1 minuto
para disolverlo por completo. Esterilizar a 121C (15 lbs de presin) durante 15
Ingredientes (gr/L)
Peptona especial. 10 gr
Lactosa 5 gr
Sacarosa 5 gr
Fosfato dipotsico 2 gr
Agar 13.5 gr
Eosina 0.4 gr
Azul de metileno 0.085 gr
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15
minutos. Enfriar aproximadamente a 45C. Vaciar en cajas de Petri estriles.
Conservar a temperatura ambiente.
Color y colonias que se desarrollan en el cultivo
Microorganismo Resultado
Escherichia coli Colonias grandes, color negro azulado, con
brillo metlico azul verdoso.
Enterococcus faecalis Inhibicin parcial
Salmonella typfhimurium Colonias transparentes, desde incoloras
hasta mbar.
Shigella flexneri Colonias transparentes, desde incoloras
hasta mbar.
Staphylococcus aureus Crecimiento parcialmente inhibido o colonias
puntiformes.
Candida albicans Colonias plumosas, rosa plido atpicas.
Enterobacter/ Kiebsiella Colonias grandes, mucoides, color negro
azulado.
Proteus Colonias incoloras.
Pseudomonas Colonias irregulares, incoloras
Bacterias gram-positivo Crecimiento escaso o nulo
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AGAR PARA ESTAFILOCOCOS (NO 110 S-110)
Fundamento
Staphylococcus aureus es un microorganismo que puede causar intoxicacin
alimentaria, y para su aislamiento, pueden usarse distintos medios slidos
selectivos. En el medio de cultivo, el extracto de levadura y la triptena aportan los
nutrientes para el desarrollo de microorganismos. La gelatina es el sustrato de la
enzima gelatinasa. La lactosa y el manitol son los hidratos de carbono
fermentables. El cloruro de sodio, se encuentra en alta concentracin, para inhibir
el desarrollo de la flora acompaante excepto Staphylococcus spp., logrndose as
un medio selectivo para el desarrollo de estos microorganismos.
Ingredientes (gr/L)
Extracto de levadura 2.5
Triptena 10.0
Gelatina 30.0
Lactosa 2.0
D-Manitol 10.0
Cloruro de sodio 75.0
Fosfato dipotsico 5.0
Agar Bactereologico 15.0
Preparacin
Suspender 149 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y
mezclar calentando a ebullicin durante 1 o 2 minutos. Esterilizar en autoclave
durante 15 minutos a 121C. Verter en placas y mezclar para dispersar el
precipitado.
Color de las colonias
Los estafilococos positivos a la coagulasa (por ejemplo, Staphylococcus aureus)
producen colonias de color amarillo y un medio circundante de color amarillo,
PH final: 7.0
0.2
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17
mientras que los estafilococos negativos a la coagulasa producen colonias de
color rojo y no producen cambio de color en el indicador de rojo fenol.
Colonias que se desarrollan en el cultivo
Microorganismo Pigmento Fermentacin
de manitol
Hidrlisis
de la
gelatina
Prueba de la
coagulasa
S. aureus ATCC
25923
+ + + +
S. aureus ATCC
6538
+ + + +
S. epidermidis ATCC
14990
- - + -
AGAR PARA INFUSIN DE CEREBRO Y CORAZN (BHI)
Fundamento
La infusin de cerebro y corazn ha resultado ser efectiva en el cultivo de una
amplia variedad de microorganismos, incluidos muchos tipos de patgenos. Se ha
utilizado como medio base para las nuevas frmulas de medios de cultivo cuando
se suplementa con sangre o agentes selectivos. Brain Heart Infusion (BHI) Agar
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18
sin suplemento se recomienda actualmente como medio universal para
bacteriologa aerobia y para la recuperacin primaria de hongos y Actinomycetales
a partir de muestras clnicas y no clnicas1-5. BD Brain Heart Infusion (BHI) Agar
obtiene los nutrientes de la infusin de cerebro y corazn, la peptona y la glucosa.
Las peptonas y la infusin son fuentes de nitrgeno orgnico, carbono, azufre,
vitaminas y sustancias de traza. La glucosa es la fuente de carbohidratos que los
microorganismos utilizan mediante fermentacin. Se utiliza fosfato disdico como
tampn en el medio.
Ingredientes (gr/L)
Infusin de cerebro de ternera
200.0
Infusin corazn vacuno 250.0
Peptona 10.0
Cloruro de sodio 5.0
Glucosa 2.0
Fosfato disdico 2.5
Agar 15.0
pH final: 7.4 0.2
Preparacin
Disolver 52 g de polvo en un litro de agua destilada. Calentar a ebullicin hasta su
disolucin total. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121C.
Extender la muestra tan pronto como sea posible despus de recibirla en el
laboratorio, mediante un asa de inoculacin estril para obtener colonias aisladas.
Para el aislamiento de hongos de muestras potencialmente contaminadas, se
debe inocular un medio selectivo junto con uno no selectivo. Incubar las placas a
25 30 C en posicin invertida con humedad aumentada.
Incubar las placas durante 24 48 para bacterias y Candida, y hasta un mximo
de 5 das para Trichophyton. Las bacterias y Candida deben incubarse a una
temperatura de 35 a 37 C, y Trichophyton, a 25 30 C.
Color de las colonias que desarrolla
Incoloro
-
19
Colonias que se desarrollan en el cultivo
Microorganismos Crecimiento
Aspergillus niger Bueno
Neisseria meningitidis Bueno
Streptococcus pyogenes Bueno
Streptococcus pneumoniae Bueno
AGAR LACTOSA
Fundamento
Es un medio rico en nutrientes y no contiene inhibidores del crecimiento
bacteriano. Permite recuperar clulas injuriadas, diluye sustancias txicas o
inhibitorias y favorece el desarrollo de Salmonella con respecto a otras bacterias.
El extracto de carne y la peptona son la fuente de carbono y nitrgeno mientras
que la lactosa es el hidrato de carbono fermentable. Por la fermentacin de la
lactosa se produce cido y gas (el cual se evidencia al utilizar las campanas
Durham).
En Agar Lactosa, la peptona, el extracto de carne y el extracto de levadura
proporcionan nutrientes. El desoxicolato de sodio, el cristal violeta y el tiosulfato
inhiben las bacterias gram positivas. La diferenciacin de microorganismos
entricos gram negativos en fermentadores de lactosa (color amarillo) y no
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20
fermentadores de lactosa (color azul) se logra gracias a la combinacin de lactosa
y el indicador azul de bromotimol.
Preparacin
Suspender 50 g del polvo en 1 litro de agua purificada. Reposar 5 minutos.
Calentar con agitacin frecuente y llevar a ebullicin 1 a 2 minutos hasta disolver
completamente. Distribuir en recipientes apropiados y esterilizar en autoclave a
121C durante 15 minutos.
Color y colonias que se desarrollan en el cultivo
Microorganismo Resultado
E. coli, Klebsiella, Enterobacter Colonias amarillas rodeadas de medio Amarillo.
Proteus, Providencia, Hafnia, Salmonella, Serratia,
Alcaligenes, Pseudomonas
Colonias azul grisceas a azul verdosas, medio de azul a azul verdoso.
Enterococci, staphylococci Inhibido
Ingredientes (gr/L)
Peptona 15
Extracto de carne 3
Extracto de levadura 3
Desoxicolato de sodio 1
Tiosulfato sdico 1
Lactosa 15
Cristal violeta 0.005
Azul de bromotimol 0.08
Agar 11
pH final: 7.4 0.2
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21
AGAR Mc CONKEY
Fundamento
En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el
desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla
de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el
desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva. El agar es el agente
solidificante.
Por fermentacin de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto
produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorcin en las
colonias, y la precipitacin de las sales biliares. Los microorganismos no
fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.
Ingredientes (gr/L)
Peptona de carne 1.5 1.5 g
Peptona de gelatina 17.0 17 g
Triptena 1.5 1.5 g
Lactosa 10.0 10 g
Mezcla de sales biliares 1.5
Cloruro de sodio 5.0 5 g
Rojo neutro 0.03 0.03 g
Cristal violeta 0.001 0.001 g
Agar 13.5
pH final: 7.1 0.2
13.5 g
Preparacin
Suspender 50 g del polvo en 1 litro de agua purificada. Reposar 5 minutos.
Calentar con agitacin frecuente y llevar a ebullicin 1 a 2 minutos hasta disolver
completamente. Distribuir en recipientes apropiados y esterilizar en autoclave a
121C durante 15 minutos. En superficie: inocular directamente la muestra por
estria. En profundidad: inocular una alcuota de la muestra directa o de su
-
22
disolucin. Verter un volumen del medio de cultivo fundido y enfriado a 40 45 C.
Homogeneizar mediante movimientos de vaivn y rotacin. Dejar solidificar.
Incubacin: En aerobiosis, a 35 37 C durante 18 48 horas.
Color y colonias que se desarrollan en el cultivo
Microorganismos Crecimiento y color
Escherichia coli
Colonias de color rosa
Proteus mirabilis
Colonias de incoloras a color beige,
agrupamiento dinmico inhibido.
Salmonella Typhimurium
Colonias de incoloras a color beige.
Salmonella Abony Colonias de incoloras a color beige.
Shigella flexneri Colonias incoloras.
Enterococcus faecalis Inhibicin de parcial a completa.
Staphylococcus aureus
Inhibicin de parcial a completa.
Sin inocular Rosa claro, ligeramente opalescente.
AGAR PARA MTODOS ESTNDAR
Fundamento
El Agar Mtodos Estandar fue desarrollado por Buchbinder Baris and Goldstein en
1953 como un requerimiento de la American Public Health Association. Este medio
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23
se formula con los ingredientes originales. El extracto de levadura y la peptona de
casena han sido utilizados en medios diseados para estudiar la presencia de
microorganismos termoflicos en productos lcteos desde 1928.
La peptona de gelatina y el extracto de levadura proporcionan la fuente de
carbono y nitrgeno. La dextrosa es el carbohidrato fermentable y el agar es
adicionado como agente solidificante.
Ingredientes (gr/L)
Peptona de Casena 5 gr
Extracto de levadura 2.5 gr
Dextrosa 1
Agar bacteriolgico 15
7.0 0.2
Preparacin
Rehidratar 23.5 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 10 a 15
minutos. Calentar agitando frecuentemente hasta el punto de ebullicin durante 1
minuto para disolverlo por completo. Esterilizar en autoclave a 121C (15 lbs de
presin) durante 15 minutos. Enfriar aproximadamente a 45C antes de usarlo.
Color y colonias que se desarrollan en el cultivo
Microorganismo Crecimiento
Escherichia coli Colonias medianas crema
Staphylococcus aureus Colonias mediana crema
Enterococcus faecalis Colonias pquelas blancas
Lactobacillis casei Colonias pequeas blanco a crema
Salmonella typhimurium Colonias grandes crema.
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24
AGAR NUTRITIVO
Fundamento
Medio de cultivo nutritivo no selectivo, en el cual la pluripeptona y el extracto de
carne constituyen la fuente de carbono, nitrgeno y aportan nutrientes para el
desarrollo bacteriano. El agregado de cloruro de sodio mantiene el balance
osmtico y el agar es el agente solidificante. Puede ser suplementado con sangre
ovina desfibrinada estril para favorecer el crecimiento de microorganismos
exigentes en sus requerimientos nutricionales y permite una clara visualizacin de
las reacciones de hemlisis.
Ingredientes (gr/l)
Extracto de carne. 3 gr
Peptona de geletina. 5 gr
Agar. 15 gr
Color de las colonias que se desarrollan
Medio de cultivo color mbar claro. En caso de ser suplementado con sangre
ovina: color rojo cereza.
Preparacin
-
25
Suspender 23 g en 1 l de agua destilada; calentar y agitar hasta ebullicin y
disolucin total y hervir durante 1 minuto. Esterilizar a 121C durante 15 minutos.
Incubar a 37C de 24 a 48 horas.
Colonias que se desarrollan en el cultivo
Microorganismos Desarrollo
Staphylococcus aureus ATCC 25923 bueno
Escherichia coli ATCC 25922 bueno
Salmonella typhimurium ATCC 14028 bueno
Streptococcus pyogenes ATCC 12344 bueno
Streptococcus pneumoniae ATCC
6301
bueno
Hemlisis alfa: lisis parcial de los glbulos rojos. Se observa un halo de color
verdoso alrededor de la colonia en estudio. Es debido a la oxidacin de la
hemoglobina a metahemoglobina (compuesto de color verdoso) por el perxido de
hidrgeno generado por los microorganismos.
Hemlisis beta: lisis total de los glbulos rojos. Se observa un halo claro, brillante
alrededor de la colonia en estudio.
Hemlisis gamma: ausencia de lisis de los glbulos rojos. El medio de cultivo no
presenta modificaciones de color y aspecto alrededor de la colonia en estudio.
-
26
AGAR SALMONELLA SHIGELLA (SS)
Fundamento
En el medio de cultivo la pluripeptona y el extracto de carne aportan los nutrientes
para el desarrollo microbiano. Las sales biliares y el verde brillante inhiben el
desarrollo de una amplia variedad de bacterias Gram positivas, de la mayora de
los coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp. La lactosa es el hidrato de
carbono fermentable. El rojo neutro es el indicador de pH y el agar es el agente
solidificante. Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de
desarrollar, acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH,
obtenindose colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo.
Ingredientes (gr/L)
Pluripeptona 5 g
Extracto de carne 5 g
Lactosa 10 g
Mezcla de sales biliares 8.5 g
Citrato de sodio 8.5 g
Tiosulfato de sodio 8.5 g
Citrato frrico 1 g
Verde brillante 0.00033 g
Rojo neutro 0.025 g
Agar 13.5 g
pH final: 7.0 0.2
Preparacin
Suspender 60 g del polvo en un litro de agua purificada. Reposar 5 minutos y
mezclar hasta homogeneizar. Calentar con agitacin frecuente y llevar a ebullicin
durante un minuto para disolucin total. NO esterilizar en autoclave.
Enfriar y distribuir en placas de Petri estriles.
-
27
Color y colonias que se desarrollan en el cultivo
Microorganismos Crecimiento Color de la colonia Produccin de
Salmonella enteritidis
Satisfactorio Incolora +
Salmonella
typhimurium Satisfactorio Incolora +
Shigella flexneri
Satisfactorio Incolora -
Shigella sonnei
Satisfactorio Incolora -
Proteus mirabilis
Satisfactorio Incolora +
Escherichia coli
Inhibicin parcial
o total Rojo-rosada -
Enterococcus faecalis Inhibicin parcial
o total Incolora -
-
28
AGAR BISMUTO SULFITO
Fundamento
Es una modificacin del Medio Wilson Blair, utilizado para la deteccin de
Salmonella, en particular Salmonella typhi de muestras clnicas. La Peptona y el
Extracto de carne aportan nitrgeno, vitaminas, minerales y amino cidos
esenciales para el crecimiento. La Dextrosa es el carbohidrato fermentable y
provee de carbono y energa. El indicador de Bismuto sulfito y el verde Brillante
son inhibidores de bacterias Gram positivas y de algunas bacterias del grupo
coliformes. El Agar bacteriolgico es el agente solidificante.
El sulfato ferroso se incluye para la produccin de H2S. Cuando el H2S est
presente, el hierro es precipitado dando colonias positivas caractersticas de color
marrn a negro con brillo metlico. Las placas deben ser uniformes, opacas, de
color crema-verde palo. Se recomienda guardar las placas en refrigeracin 4 das
antes de usar para reducir la inhibicin y as poder aislar salmonella de muestras
de heces dbilmente contaminadas.
Ingredientes (gr/L)
Agar 20 gr
Dextrosa 5 gr
Extracto de carne 5gr
Fosfato disdico 4 gr
Indicador de sulfito de bismuto 8 gr
Peptona de carne 5 gr
Peptona de casena 5 gr
Sulfato ferroso 03 gr
Verde brillante 0.025 gr
7.6 0.2 25
Preparacin
Rehidratar 52 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 10 a 15 minutos.
Calentar agitando frecuentemente hasta el punto de ebullicin durante 1 minuto
-
29
para disolverlo por completo. NO calentarse por tiempo prolongado y evitar as
que pierda su selectividad. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Enfriar
aproximadamente a 45C. El precipitado caracterstico del medio se debe
dispersar uniformemente durante el vaciado en las cajas de Petri estriles. Una
vez solidificado presenta un aspecto crema uniforme y gradualmente un color
verde plido. ES IMPORTANTE PROTEGERLO DE LA LUZ y conservarlo en
refrigeracin de 2 a 8C. De lo contrario, el medio de cultivo que est en forma
reducida se va oxidando hasta adquirir un color francamente verde, cuando esto
ocurre se descarta el medio.
Tras abrir el frasco por primera vez, el contenido se puede usar hasta la fecha de
caducidad si se almacena en un lugar seco y firmemente cerrado a una
temperatura de entre 15 y 25 C. Proteger de la luz.
Color y colonias que se desarrollan en el cultivo
Microorganismo Crecimiento y color
Salmonella typhi Colonias con centro negro, bordes claros, a las
48 horas con halo negro grisceo y brillo
metlico.
Salmonella typhimurium Colonias negras a verdes
Escherichia coli Crecimiento inhibido o colonias marrn-verdes
Proteus mirabilis Colonias pequeas verdes plido o marrones y
a veces mucoides.
Staphylococcus aureus Crecimiento inhibido.
Salmonella enteriditis Colonias de color negro con brillo metlico.
Shigella flexneri Crecimiento de inhibicin parcial o colonias de
color marrn.
Enterococcus faecalis Crecimiento nulo
-
30
AGAR TCBS (TIOSULFATO CITRATO SALES BILIARES
SACAROSA)
Fundamento
El contenido de peptonas y extracto de levadura proporcionan al medio la
fuente de nutrientes necesarios para el desarrollo de los microorganismos; el
contenido de sales biliares y el colato de sodio inhiben el desarrollo de Gram
positivos sobre todo a los enterococos. La alta concentracin de tiosulfato de
sodio y citrato, as como el elevado pH, inhiben notablemente a las
enterobacterias.
La sacarosa es el carbohidrato fermentable, utilizando como indicador de la
variacin de pH, el azul de bromotimol y el azul de timol, se presenta un vire
amarillo por la produccin de cido incluso en un medio altamente alcalino
como el Agar TCBS. Sembrar en la superficie del medio de cultivo por estra
cruzada con el material en estudio o a partir de un cultivo de enriquecimiento.
Incubar 24 h a 35C.
Ingredientes (gr/L)
Agar 14
Cloruro de sodio 10
Azul de bromotimol 0.04
Colato de sodio 3
Azul de timol 0.04
Extracto de levadura 5
Bilis de buey 5
Polipeptona 10
-
31
Citrato de hierro 1
Sacarosa 20
Citrato de sodio 10
Tiosulfato de sodio 10
pH 8.6 0.2
Preparacin
Rehidratar 88 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 10 a 15
minutos. Calentar agitando frecuentemente hasta el punto de ebullicin durante
1 minuto para disolverlo por completo. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE.
Enfriar aproximadamente a 45C. Vaciar en cajas de Petri estriles. Conservar
en refrigeracin de 2 a 8C.
Color y colonias que se desarrollan en el cultivo
Microorganismo Crecimiento y color
Vibrio parahaemolitycus
Bueno, colonias pequeas, centro verde azulado.
Vibrio cholerae
Bueno, colonias amarillas, convexas.
Escherichia coli Inhibicin completa o colonias pequeas transparentes.
Proteus mirabilis Inhibicin parcial, colonias pequeas azul claro.
-
32
AGAR XILOSA LISINA DESOXICOLATO (XLD)
Fundamento
El agar XLD (Xilosa, Lisina, Desoxicolato) es un medio selectivo diferencial,
utilizado para el aislamiento y diferenciacin de patgenos entricos Gram
negativos, especialmente del gnero Shigella.
La degradacin de los carbohidratos presentes en el medio (xilosa, lactosa y
sacarosa) genera la produccin de cido haciendo virar el indicador (rojo fenol)
de rojo a amarillo. En este medio se incorpora la xilosa porque es
prcticamente fermentada por todas las enterobacterias con excepcin de los
microorganismos pertenecientes al gnero Shigella. La lisina se incluye para
aumentar la diferenciacin de los microorganismos pertenecientes al gnero
Salmonella
El medio tambin tiene la capacidad de detectar la produccin de H2S, a travs
del sistema indicador tiosufalto de sodio y citrato frrico amonio.
Ingredientes (gr/L)
Extracto de levadura 3gr
L-lisina 5gr
Lactosa 7.5 gr
Sacarosa 7.5 gr
Xilosa 3.5 gr
Desoxicolato sdico 2.5 gr
Cloruro sdico 5 gr
Tiosulfato sdico 6.8 gr
Citrato de amonio frrico 0.8 gr
Rojo fenol 0.08 gr
Agar 13.5 gr
7.4 0.2
Preparacin
Homogenice el polvo contenido en el frasco.
Aada 55 gramos de medio deshidratado a un litro de agua destilada estril.
Caliente suavemente, agitando con frecuencia hasta que hierva. Evitar el
-
33
sobrecalentamiento ya que puede provocar la precipitacin del medio. Este
medio NO se puede esterilizar por autoclave. Transfiera inmediatamente a un
bao mara de 50C para su enfriamiento. Dispense en placas de Petri o
frascos en cuando el medio se haya enfriado suficientemente. NO SOMETER A
AUTOCLAVE.
Color y colonias que se desarrollan en el cultivo
.
Color MICROORGANISMOS
Colonias opacas amarillas
fermentacin de al menos uno de los
azcares y LDC(-)
Escherichia coli
Enterobacter
Klebsiella
Citrobacter
Proteus
Serratia
Colonias rojas LDC (+) Shigella
Providencia
Salmonella H2S(-)
Colonias rojas con un centro negro
Produccin de H2S
Salmonella
Edwardsiella
-
34
AGAR BAIRD-PARKER
Fundamento
Es un medio selectivo utilizado para el aislamiento de Staphylococcus Aureus
coagulasa positivo.
Medio altamente nutritivo, en el cual la peptona de casena y el extracto de
carne constituyen la fuente de carbono y nitrgeno, el extracto de levadura
aporta vitaminas del complejo B, la glicina y el piruvato estimulan el
crecimiento de los estafilococos. El agar es el agente solidificante. Permite el
crecimiento selectivo de estafilococos ya que el telurito de potasio y el cloruro
de litio inhiben el desarrollo de la flora acompaante presente en la muestra.
Ingredientes (gr/L)
Peptona de casena 10 g
Extracto de carne 5 g
Extracto de levadura 1 g
Cloruro de litio 5 g
Glicina 12 g
Piruvato de sodio 10 g
Agar 17 g 17 g
PH final : 6.8 0.2
Preparacin
Suspender 60 g del polvo en 940 ml de agua purificada. Dejar en reposo 5 a 10
minutos. Calentar agitando frecuentemente y hervir durante 1 minuto, hasta
disolucin total. Distribuir en recipientes apropiados y esterilizar en autoclave a
121C durante 15 minutos. Enfriar a 45-50C y agregar 50 ml de emulsin de
yema de huevo y 10 ml de la solucin de telurito (Emulsin Yema de Huevo
con Telurito). Homogeneizar y distribuir en placas de Petri estriles.
Color y colonias que se desarrollan en el medio de cultivo
Microorganismo
s
Crecimient
o
Actividad
Lecitinsic
Reducci
n de
Caracterstica
s de las
-
35
a Telurito
de Potasio
Colonias
Staphylococcus
aureus
Satisfactorio Positiva Positiva
Colonias
negras con
borde incoloro,
convexas,
rodeadas de
una zona
opaca, con una
zona clara
externa.
Staphylococcus
aureus
Satisfactorio Positiva Positiva
Colonias
negras con
borde incoloro,
convexas,
rodeadas de
una zona
opaca, con una
zona clara
externa.
Staphylococcus
epidermidis
Regular-
Satisfactorio Negativa Positiva
Colonias
negras, de
tamao
irregular. Zona
opaca
alrededor
de la colonia
(no hay zona
clara).
Escherichia coli
Total o
parcialmente
inhibido
Negativa Negativa ----
Proteus mirabilis Total o Negativa Positiva Colonias
-
36
parcialmente
inhibido
marrones sin
zona clara u
opaca
alrededor.
CALDO TETRATIONATO
Fundamento
El medio de cultivo contiene peptona que provee los nutrientes necesarios para
el desarrollo bacteriano, y carbonato de calcio que neutraliza y adsorbe
metabolitos txicos. La selectividad est dada por la presencia de sales biliares
y tetrationato (compuesto generado en el medio de cultivo al reaccionar el
tiosulfato de sodio con la solucin iodo-iodurada) que inhiben el desarrollo de
microorganismos Gram positivos y algunas enterobacterias. Salmonella spp.
contiene la enzima tetrationato reductasa y puede crecer satisfactoriamente en
el medio de cultivo debido a que no la afecta la toxicidad del tetrationato.
Para evitar la proliferacin de especies de Proteus spp., se recomienda agregar
40 mg/l de Novobiocina previo al agregado de la solucin iodo iodurada.
Ingredientes (gr/L)
Peptona 5.0
Sales biliares 1.0
Carbonato de calcio 10.0
-
37
Tiosulfato de sodio 30.0
pH final: 8.4 0.2
Solucin iodo iodurada
Iodo 6.0
Ioduro de potasio 5.0
Agua 20.0
Preparacin
Suspender 46 g en 1 l de agua destilada; calentar y agitar hasta ebullicin. NO
ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Si se va a utilizar el mismo da, aadir
aspticamente 20 ml de solucin yodo-yodurada por litro de medio, o
proporcionalmente a la cantidad usada. Eventualmente puede aadirse 10 ml/l
de una solucin al 0,1% de Verde Brillante, as como Novobiocina a razn de
0,04 g/l, ambos esterilizados por filtracin. Al distribuir el Caldo repartir
homogneamente el precipitado existente. No recalentar el medio.
Sembrar el medio con el inculo e incubar entre 352C de 18 a 24 horas.
Pasado este tiempo sembrar en medios selectivos.
Color y colonias que se desarrollan en el medio de cultivo
Microorganismo Crecimiento y color
Salmonella typhimurium Satisfactorio, incoloras.
Salmonella enteritidis Satisfactorio, incoloras.
Salmonella typhi Satisfactorio, incoloras
Escherichia coli Escaso-nulo, color rosada roja
-
38
CALDO ESCHERICHIA COLI
Fundamento
Medio recomendado por Hajna y Perry y por el Standard Methods for the
Examination of Water and Wastewater para el recuento de coliformes en
alimentos.
En el medio de cultivo la triptena es la fuente de pptidos, aminocidos y
nitrgeno. La lactosa es el hidrato de carbono fermentable y favorece el
desarrollo de bacterias coliformes, las sales biliares inhiben el crecimiento de la
flora acompaante Gram positiva, las sales fosfato constituyen un sistema
buffer que impide que los productos cidos originados por la fermentacin de
lactosa afecten el crecimiento microbiano y el cloruro de sodio mantiene el
balance osmtico.
Ingredientes (gr/L)
Triptena 20.0
Lactosa 5.0
Sales biliares N 3 1.9
Fosfato dipotsico 4.0
Fosfato monopotsico 1.5
Cloruro de sodio 5.0
pH final: 6.9 0.2
Preparacin
Suspender 37,4 g del medio en un litro de agua destilada. Calentar hasta su
total disolucin. Distribuir en tubos de ensayo que contengan campanitas de
Durham. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121C.
Colonias que se desarrollan en el medio de cultivo:
Microorganismos Crecimiento Produccin de gas
Enterobacter aerogenes Bueno a excelente
+
Escherichia coli ATCC 25922 Bueno a excelente
+
Salmonella typhimurium ATCC 14028
Bueno a excelente
-
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Inhibido Inhibido
-
39
Color de las colonias a desarrollar
Medio de cultivo deshidratado: color beige claro, homogneo, libre
deslizamiento.
Medio de cultivo preparado: color mbar claro.
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Microbiologa General, Tema 2.- Cultivo de microorganismos.