Universidad Central de Venezuela

Facultad de Ciencias Instituto de Zoología y Ecología Tropical

Postgrado en Ecología

Tesis Doctoral

““AAssppeeccttooss eeccoollóóggiiccooss ddee mmiiccrrooaallggaass

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Caracas – 2012

2

3

Las algas son vegetales que crecen en agua, tanto dulce como salada. En el

océano constituyen el principal componente del plancton marino. Tuvieron mucho que ver con el origen de la vida en el ámbito marino; fueron los

primeros organismos en realizar la fotosíntesis clorofílica. Van desde los microscópicos organismos unicelulares (como las espirulinas) hasta las

gigantescas kelp (el ser vivo más largo del planeta).

Fuente: Almacén Natural

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CONTENIDO

Índice de figuras ........................................................................................................... 7

Índice de tablas ........................................................................................................... 10

Resumen .................................................................................................................... 12

1. Introducción ............................................................................................................ 14

1.1 Una breve reseña histórica ............................................................................ 14

1.2 Evolución y ecología de las microalgas ......................................................... 14

1.3 Aspectos biogeográficos ............................................................................... 17

1.4 Importancia biotecnológica de las microalgas ............................................... 18

2. Antecedentes en Venezuela ................................................................................... 22

3. Justificación ............................................................................................................ 23

4. Hipótesis ................................................................................................................. 24

5. Objetivos ................................................................................................................. 25

6. Metodología ............................................................................................................ 26

6.1 Ecología de poblaciones de especies cultivadas ........................................... 26

6.2 Ecología de comunidades fitoplanctónicas .................................................... 39

7. Resultados .............................................................................................................. 57

7.1 Cultivos ......................................................................................................... 57

7.2 Ensayos con poblaciones cultivadas de Arthrospira platensis ....................... 65

7.3 Comunidades fitoplanctónicas ....................................................................... 86

8. Discusión .............................................................................................................. 116

8.1 Cultivos ....................................................................................................... 116

8.2 Ensayos con poblaciones de Arthrospira platensis ...................................... 117

8.3 Comunidades fitoplanctónicas ..................................................................... 123

9. Conclusiones ........................................................................................................ 127

10. Bibliografía .......................................................................................................... 128

11. Enlaces ............................................................................................................... 135

Apéndice 1 ................................................................................................................ 137

Apéndice 2 ................................................................................................................ 142

Apéndice 3 ................................................................................................................ 147

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7

Índice de figuras

Figura 1. Esquema ilustrado donde se muestra el escalamiento de microalgas de medio líquido a medio sólido con el empleo de la técnica del asa de estaño. ............. 29

Figura 2. Esquema donde se muestra el escalamiento de poblaciones de microalgas a fiolas de diferentes volúmenes hasta alcanzar los cultivadores a gran escala. ........... 30

Figura 3. Imágenes donde se muestran las diferentes etapas de escalamiento del cultivo en medio líquido en el sistema integrado LOA-Ficotrón: (a) cultivos a escala pequeña en condiciones controladas (Cámara de Crecimiento, LOA - IZET); (b), (c) y (d) cultivos a cielo abierto en el Ficotrón, IDEA, en botellones de 5 L, tanques circulares de 500 L y cultivadores tipo carrusel de 2000 L, respectivamente. ............. 31

Figura 4. Esquema para la preparación de cada medio (tratamiento) del diseño factorial fraccionado 26-1. ............................................................................................. 33

Figura 5. Esquema de la disposición espacial de los tanques cilíndricos en el Ficotrón para la ejecución del diseño de bloques completos aleatorizados. ............................. 34

Figura 6. Ubicación de los sitios de muestreo (el mapa se encuentra en www.guiageo-ameri cas.com/mapas/venezuela.htm). ....................................................................... 39

Figura 7. (a) Mapa de Venezuela donde se destaca a la península de Paria en un recuadro, (b) ubicación del área de estudio y (c) vista panorámica del humedal “Palmares III” desde una carretera que lo bordea al norte, la vegetación herbácea cubre la totalidad de su superficie y forma bandas monoespecíficas, evidenciadas por las tonalidades distintas del color verde, que cubren toda su superficie sin formar espejos de agua (tomado de Torres y Zoppi de Roa 2010)......................................... 41

Figura 8. Pluviodiagrama con precipitaciones medias de 47 años (1953-2000) del sur de la península de Paria (datos tomados de la Dirección de Meteorología del MARN 2000). ......................................................................................................................... 42

Figura 9. Vista satelital del área de estudio (humedal herbáceo de El Clavo). La línea blanca dibujada en el centro de la imagen señala el transecto levantado en la salida de campo (fuente: http://earth.google.com/). .................................................................... 43

Figura 10. Tomas fotográficas parciales de las dos zonas de vegetación emergente estudiadas: (a) vista de la amplia zona central de Hymenachne amplexicaulis, en primer plano la zona de Heliconia marginata que bordea todo el litoral sur; (b) zona de H. marginata (fotos: Carlos Lugo). .............................................................................. 44

Figura 11. Ubicación geográfica del área de estudio al sur de Monagas (Orinoco bajo), con detalle de la localización en el mapa y fotografía panorámica de Macapaima, uno de los cuerpos de agua visitados (foto: Rubén Torres). .............................................. 46

Figura 12. Imagen correspondiente a un sector de la orilla de la fosa El Caracol, (Municipio Aragua, Edo. Anzoátegui, 2009), donde se pueden apreciar los desechos petroleros que conforma parte del fondo de la misma (Foto: Olaf Ilzins). .................... 47

Figura 13. Ubicación de la laguna de Boca Chica (círculo azul) en la península de Macanao, isla de Margarita, estado Nueva Esparta (mapa: http://www.disfrutevenezuela.com/Municipio-Peninsula-de-Macanao-Mapa.html)....... 48

Figura 14. Marcha analítica simplificada para la determinación de nitrógeno en muestras de agua con el método Kjeldahl (1883) (continúa en la página siguiente). .. 52

Figura 15. Marcha analítica simplificada para la determinación del fósforo por el método colorimétrico de Murphy – Riley (1962). Las dos imágenes inferiores fueron tomadas de una presentación digital del curso de Ecología de Humedales, Postgrado en Ecología, IZET, 2009. ............................................................................................ 53

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Figura 16. Algunas imágenes tomadas bajo microscopio invertido de las poblaciones de las diferentes cepas de Arthrospira spp. en la Cámara de Crecimiento (LOA-IZET).

................................................................................................................................... 59

Figura 17. Algunos cultivos de microalgas de interés biotecnológico presentes en la Cámara de Crecimiento (LOA, IZET). ......................................................................... 62

Figura 18. Curvas de crecimiento poblacional de Arthrospira platensis en (a) fiolas y (b) cilindros. La densidad poblacional está expresada en términos de absorbancia a 680 nm. ............................................................................................................................. 66

Figura 19. Producción de biomasa seca en fiolas y cilindros de 2 L para cada medio mineral. La biomasa está expresada en gramos por dos litros. ................................... 67

Figura 20. Valores comparativos de pH mostrados por los diferentes medios de cultivo. En la figura se señala con un óvalo rojo el lapso de disminución de pH del medio – – y la contaminación del mismo por la cianobacteria Microcystis aeruginosa. .................. 67

Figura 21. Valores comparativos de conductividad (S/cm) mostrados por los diferentes medios de cultivo. ....................................................................................................... 68

Figura 22. Curva de calibración A680 vs. Peso seco (mg). Las variables tienen una relación lineal (R2 = 0,9935). ....................................................................................... 68

Figura 23. Crecimiento poblacional de Arthrospira platensis en cuatro medios de

cultivo. En la fase de crecimiento rápido A680 y el tiempo presentaron correlaciones lineales fuertes, como se evidencia en los valores del coeficiente de determinación (R2). ............................................................................................................................ 70

Figura 24. Crecimiento poblacional de Arthrospira platensis en cuatro medios de

cultivo (filamentos por litro) en la Cámara de Crecimiento. ......................................... 70

Figura 25. Curvas de crecimiento poblacional de Arthrospira platensis obtenidas en un

ensayo factorial fraccionado 26-1 con combinaciones aleatorias de niveles mínimos y centrales de cinco macronutrientes (tratamientos). La densidad poblacional fue medida indirectamente con la absorbancia a una longitud de onda de 680 nm, correspondiente al rojo dentro del espectro visible, pico de absorción de la clorofila a. ........................ 72

Figura 26. Diagrama de columnas mostrando en orden creciente los tiempos de duplicación (tg) de los diferentes tratamientos del ensayo multifactorial. ..................... 79

Figura 27. Biomasa seca (g/L) cosechada en los diferentes tratamientos del ensayo factorial 26-1. Los valores se ordenan en forma creciente. ........................................... 81

Figura 28. Diagramas circulares que muestran las variaciones porcentuales en grupos de filamentos de diferentes tallas en una población de Arthrospira platensis, a lo largo

de un periodo de incubación que duró 30 días. La cepa se cultivó en el medio optimizado en el ensayo factorial fraccionado 26-1 (tratamiento 36). ............................ 82

Figura 29. Dinámicas de crecimiento poblacional de los tres componentes de tallas de filamentos de Arthrospira platensis: (a) filamentos con 2 células, (b) filamentos con

cuatro células y (c) filamentos con más de cuatro células. La letra “Y” en la ordenada es la densidad (filamentos/L) y en la abscisa el tiempo está dividido en intervalos de tres días. Salida: PAST. .............................................................................................. 83

Figura 30. Dinámicas de crecimiento poblacional de Arthrospira platensis a partir de

tres extracciones de volúmenes en fase de saturación. De izquierda a derecha se muestran las curvas de crecimiento a partir de 25%, 50% y 75% de extracción. ........ 84

Figura 31. Absorbancias medias (λ = 680 nm) de los cultivos en fase de crecimiento rápido, para tres profundidades, izquierda a derecha: 15 cm (barras azules), 25 cm (barras rojas) y 35 cm (barras amarillas). .................................................................... 85

9

Figura 32. Biomasa seca total (g/L) en los tres bloques. ............................................. 85

Figura 33. Biplot de los dos primeros componentes principales del ACP para las variables (especies) y casos (parches de vegetación) escogidas para caracterizar el ecosistema del humedal Palmares III en noviembre de 2008. Los dos primeros componentes principales acumularon 89,965% de la inercia total del sistema. Salida: MVSP 3.0. .................................................................................................................. 91

Figura 34. Dendrograma del Análisis de Agrupamiento o “Cluster Analysis” derivado del conjunto de especies fitoplanctónicas y zooplanctónicas más importantes colectadas en el ACP. Salida: MVSP 3.0. ................................................................... 92

Figura 35. Algunas especies de microalgas representantes del fitoplancton del humedal de El Clavo, Barlovento, Edo. Miranda: (a) Lyngbya lutea (Cyanobacteria), 400x; (b) Pinnularia sp. (Bacillariophyta), 400x; (c) Asterococcus limneticus (Chlorophyta), (d) Micrasterias sol (Chlorophyta), 250x; (e) Closterium ehrenbergii (Chlorophyta); 250x; (f) Spirogyra ternata (Chlorophyta), 250x. Fotos: Rubén Torres,

cámara digital PAX-CAM acoplada a microscopio invertido y a computador (programa PAX-IT!). ..................................................................................................................... 98

Figura 36. Variaciones temporales de (a) conductividad eléctrica y (b) oxígeno disuelto a medida que la lámina de agua disminuyó en el parche de Heliconia marginata (enero

– febrero 2009). .......................................................................................................... 99

Figura 37. Concentraciones de nitrógeno (N) en las muestras de agua colectadas en la zona de Heliconia marginata en la primera salida de campo al humedal de El Clavo

(05/01/2009). ............................................................................................................ 100

Figura 38. Curva de calibración para la obtención de fósforo total en agua de las muestras tomadas en la zona de Heliconia marginata en la primera salida de campo al

humedal de El Clavo (05/01/2009). ........................................................................... 101

Figura 39. Biplot de los dos primeros componentes principales del ACP para los ambientes lagunares del Orinoco bajo, sur de Monagas. Los dos primeros componentes principales retuvieron 95,4% de la inercia total del sistema multidimensional original. Salida: MVSP 3.0. ............................................................ 107

Figura 40. Imágenes que muestran la composición de especies fitoplanctónicas de una charca fangosa, específicamente proveniente del borde exterior de un área de pozos petroleros en el norte del Edo. Bolívar, 2009. ........................................................... 109

Figura 41. Composiciones porcentuales de las divisiones de organismos procariotas y eucariotas integrantes de la comunidad del fitoplancton en las regiones estudiadas en el país a lo largo del estudio. .................................................................................... 115

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Índice de tablas

Tabla 1. Especies de microalgas con potencialidades para generación de biocombustibles. Contenido de aceites en base seca (tomada de Albarracín 2007). .. 20

Tabla 2. Composición química del medio Spirulina (Schlösser 1994). ........................ 26

Tabla 3. Diseño factorial 22 para ensayos de laboratorio. El experimento se simplificó a cuatro medios de cultivo sin replicación. .................................................................. 31

Tabla 4. Resumen del diseño factorial fraccionado 26-1 (salida del programa Design Expert)*. ...................................................................................................................... 32

Tabla 5. Medios de cultivos preparados en laboratorio para crecimiento de poblaciones de microalgas y modalidades de preparación y recipientes. ....................................... 57

Tabla 6. Concentraciones milimolares (mM) de los macronutrientes totales (representados como elementos, a excepción del carbono que se representa en las formas de los aniones carbonato y bicarbonato) y relaciones milimolares sodio/potasio en los cuatro medios minerales comparados en el diseño factorial 22. En rojo se destacan las concentraciones milimolares de Na+ y K+, y en azul las de Cl-, anión directamente involucrado con el Na+. .......................................................................... 65

Tabla 7. Concentraciones milimolares totales de los macronutrientes que integran cada uno de los medios de cultivo preparados. En rojo se destaca la relación 4:1 de K y Na en el medio 1. ............................................................................................................. 69

Tabla 8. Tasa de crecimiento per cápita de Arthrospira platensis en la fase de crecimiento rápido, biomasa seca producida en cada medio de cultivo y pH inicial y final. ............................................................................................................................ 71

Tabla 9. Tasas de crecimiento per cápita y capacidades de carga en cultivos de Arthrospira platensis para el ensayo factorial fraccionado 26-1. En rojo se destacan los

medios con valores mayores para uno o ambos parámetros poblacionales obtenidos de forma experimental. ............................................................................................... 77

Tabla 10. Análisis de varianza para el diseño factorial fraccionado 26-1 (salida del programa Design Expert). Los números destacados en rojo son valores de p<0,05. .. 80

Tabla 11. Resumen del Análisis de Varianza (salida de MICROSOFT EXCEL). ......... 86

Tabla 12. Composición de especies y abundancia (células/litro) de los taxa fitoplanctónicos presentes en las zonas de vegetación en noviembre de 2008. Bm (Brachiaria mutica), EcBmSe (ecotono B. mutica - Sesbania exasperata), Se (S. exasperata), EcSeCa (ecotono S. exasperata - Cyperus articulatus), Ca (C. articulatus), EcCaTd (ecotono C. articulatus-Typha dominguensis), Td (T. dominguensis) y EcTdSe (ecotono T. dominguensis - S. exasperata)......................... 87

Tabla 13. Algunos índices de diversidad empleados para caracterizar la comunidad fitoplanctónica de Palmares III en sus diferentes parches de vegetación monoespecífica y ecotonos (noviembre 2008). Salida: PAST. .................................... 89

Tabla 14. Distancias Jaccard entre los parches de vegetación acuática del humedal Palmares III, noviembre de 2008, definidas a partir a las abundancias de las especies fitoplanctónicas. Los valores están acotados entre 0 y 1, los destacados en rojo indican similitudes altas y en azul se señala a la pareja de vegetaciones con menor similitud. Salida: PAST. ............................................................................................................. 90

Tabla 15. Variables fisicoquímicas y concentraciones de cationes y aniones del agua, determinados en las zonas de vegetaciones monoespecíficas estudiadas en el humedal de Palmares en noviembre de 2008. ............................................................ 92

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Tabla 16. Composición de especies y abundancias (células/litro) de los taxa fitoplanctónicos presentes en las zonas de vegetación para agosto de 2009. EcBm1Ca y EcCaBm2 (ecotonos B. mutica - C. articulatus); EcBm2Td (ecotono B. mutica - T. dominguensis). ........................................................................................................... 93

Tabla 17. Algunos índices de diversidad empleados para caracterizar la comunidad fitoplanctónica de Palmares III en sus diferentes parches de vegetación monoespecífica y ecotonos (agosto 2009). Salida: PAST. .......................................... 94

Tabla 18. Distancias Jaccard entre los parches de vegetación acuática del humedal Palmares III, agosto de 2009, definidas a partir a las abundancias de las especies fitoplanctónicas. Los valores están acotados entre 0 y 1, los destacados en rojo indican similitudes altas y en azul se señala a la pareja de vegetaciones con menor similitud. Salida: PAST. ............................................................................................................. 94

Tabla 19. Variables ambientales medidas en agosto de 2009..................................... 95

Tabla 20. Grupos (Taxa) fitoplanctónicos identificados en los diferentes ambientes de vegetación en El Clavo, Barlovento, Edo. Miranda (enero de 2009). .......................... 95

Tabla 21. Algunos índices de diversidad empleados para caracterizar la comunidad fitoplanctónica del humedal de El Clavo (enero 2009). Salida: PAST.......................... 97

Tabla 22. Índice de similitud de Jaccard para las tres zonas estudiadas en el Clavo, Edo. Miranda (enero de 2009). El análisis se hizo en PAST. ...................................... 97

Tabla 23. Valores medios desviaciones estándares de las variables fisicoquímicas tomadas en la zona de Heliconia marginata del humedal herbáceo de El Clavo, Edo.

Miranda en enero - febrero de 2009. ........................................................................... 99

Tabla 24. Lista de especies y abundancia (cel./L) del fitoplancton en aguas libres de las lagunas estudiadas en el bajo Orinoco, sur de Monagas. .................................... 102

Tabla 25. Algunos índices de diversidad empleados para caracterizar la comunidad fitoplanctónica de lagunas de inundación del bajo Orinoco (sur de Edo. Monagas), para enero de 2010. Salida: PAST. ................................................................................... 105

Tabla 26. Índice de similitud de Jaccard para las lagunas estudiadas en el bajo Orinoco, sur del Edo. Monagas (enero de 2010). En rojo se resaltan los valores más altos. Salida: PAST. .................................................................................................. 106

Tabla 27. Composición y abundancia (células por litro) de la comunidad fitoplanctónica de tres ambientes de los módulos inundables de Mantecal (noviembre 2010). ......... 107

Tabla 28. Algunos índices de diversidad empleados para caracterizar la comunidad fitoplanctónica entres ambientes de los módulos inundables de Mantecal (Edo. Apure), en noviembre de 2010. Salida: PAST. ...................................................................... 108

Tabla 29. Índice de similitud de Jaccard para comparación de los tres ambientes estudiados en Mantecal (Edo. Apure). Salida: PAST. ............................................... 109

12

Resumen

Las poblaciones naturales suelen estar bajo presión ambiental constante, y sus

tamaños poblacionales están limitados por la disponibilidad de recursos. En el caso de

la ecuación logística, el parámetro que define la magnitud de la población en equilibrio

es la capacidad de carga (K), mientras que la dinámica de retorno al mismo, luego de

una perturbación, depende de la tasa de crecimiento per cápita (r). Las comunidades

están caracterizadas por atributos estructurales como diversidad y relaciones

interespecíficas. Las cianobacterias son los organismos fotosintéticos más antiguos

del planeta; se encuentran a mitad de camino entre las bacterias y las algas

eucariotas, pues su organización es procariótica pero su aparato fotosintético es

similar al de las algas. Arthrospira y Spirulina son dos géneros de cianobacterias

filamentosas que han colonizado diversos ambientes y algunas especies son

extremófilas y de distribución muy restringida. Estas especies son propias de

ambientes alcalinos (lagos de soda) y han experimentado pocas presiones

ambientales, entre ellas competencia y depredación escasas. Poseen un gran valor

alimenticio para animales y humanos, como lo demuestran numerosas

investigaciones. Del mismo modo, existen microalgas eucariotas que poseen gran

potencial para la biotecnología alimentaria y petrolera (bioenergética), esta última con

la finalidad de generar combustibles alternativos (biocombustibles), con valores

ecológicos y económicos para generar energía eléctrica y tracción para vehículos.

Esta investigación se enfocó en el estudio de las dinámicas poblacionales de A.

platensis (especie en revisión) y muestreos de comunidades fitoplanctónicas con

interés en especies autóctonas de gran valor biotecnológico. Se diseñaron

experimentos para optimizar medios de cultivos para A. platensis a escala pequeña en

sistemas controlados (Cámara de Crecimiento) y escalas mayores en sistemas no

controlados (Ficotrón). Se obtuvieron medios de cultivo idóneos para el crecimiento de

A. platensis en condiciones controladas (medio 1 = medio Parra (2005)) y naturales

(tratamiento 36: medio central), con miras a su aprovechamiento biotecnológico a gran

escala. La dinámica de crecimiento poblacional de A. platensis evidencia

densodependencia logística, con una estructura de tallas que varía a medida que la

población crece desde etapas tempranas hasta la capacidad de carga. Se encontraron

representantes de varios géneros y especies de cianobacterias (Arthrospira spp.,

Spirulina subsalsa, Lyngbya spp., Oscillatoria spp. y Anabaena spp.) y microalgas

eucarióticas (Scenedesmus spp., Isochrysis galbana, Chlorella sp., Chaetoceros sp.,

Navicula platalea, Dunaliella salina y D. viridis) de gran interés biotecnológico en

diferentes lugares de la geografía variada del país, lo que conduce a la idea de que

Venezuela cuenta con un gran potencial en su diversidad para la biotecnología de

microalgas.

13

14

1. Introducción

1.1 Una breve reseña histórica

Las referencias más antiguas del consumo de microalgas por el hombre datan del

Antiguo Testamento, puesto que el maná que permitió la supervivencia del pueblo de

Israel es un liquen del desierto (simbiosis de hongo y alga) (García-Blairsy 2008).

Spolaore y col. (2006) mencionan que el primer uso de las microalgas por los seres

humanos se remonta a 2000 años atrás en China; para entonces, los chinos utilizaban

Nostoc sp. para sobrevivir durante la hambruna. No obstante, no se conoce con

precisión cuándo el humano empezó a emplear las microalgas (Sánchez y col. 2003).

El uso corriente de estos recursos tiene tres precedentes: tradición, desarrollo

científico y tecnológico, y la denominada “tendencia verde” (Henrikson 1994). En la

América de la conquista europea, Bernal Díaz del Castillo, miembro de las tropas de

Hernán Cortés, reportó en 1521 que una pasta azulada (la hoy conocida Arthrospira

maxima) era cosechada del lago Texcoco, secada y vendida para consumo humano

en un mercado de Tenochtitlán (hoy Ciudad de México). Los aztecas dieron a este

alimento el nombre de tecuitlalt, el cual en su lengua literalmente significa

“excrementos de las piedras” e indiscutiblemente formó parte de su cultura alimentaria,

social, económica y política (Ciferri 1983, Sánchez y col. 2003).

Se sabe entonces que el empleo alimentario de microalgas por la humanidad no es

reciente. Hoy día, algunas culturas de la zona del lago Chad en África subsahariana,

como la etnia kanembu, conservan las mismas prácticas de cosecha artesanal de A.

platensis (identificación en revisión) legadas desde tiempo inmemorial. Esta

cianobacteria filamentosa constituye la base de la dieta diaria de esa tribu, la que

extraen del lago y secan al sol para preparar una galleta denominada dihé; este hábito

alimentario peculiar le ha brindado a los kanembu mejor estado de salud que tribus

vecinas que no consumen el dihé (Ciferri 1983). Cuando los científicos descubrieron la

rapidez con la que las poblaciones de estos microorganismos crecen, con un

rendimiento 20 veces mayor que la soja o soya (Glycine max) por unidad de superficie,

los describieron como el alimento del futuro (Henrikson 1994).

1.2 Evolución y ecología de las microalgas

Dentro del vasto grupo de seres vivos considerados bajo la denominación de

microalgas, éstas incluyen en su definición más amplia a las cianobacterias

(anteriormente cianofitas o cianofíceas y conocidas comúnmente como algas verde-

azules). Estos seres constituyen el grupo de organismos fotosintéticos más antiguos

15

del planeta y se puede decir que se encuentran a mitad de camino entre las bacterias

y las algas, porque su organización es procariótica pero su aparato fotosintético es

similar al de las algas (Prosperi 2000).

La Tierra tiene una edad aproximada de 4.600.000.000 de años y se ha podido

comprobar que 1.000.000.000 de años después de su formación ya había actividad

orgánica en la corteza terrestre. Los sedimentos no metamorfoseados más antiguos

de hace 3.500.000.000 de años muestran las primeras bacterias y los estromatolitos,

las más antiguas comunidades coloniales de las que se tenga conocimiento,

constituidas principalmente por algas verdes-azules filamentosas semejantes a las

Oscillatoriales (Orden al que pertenecen los géneros Oscillatoria, Lyngbya, Spirulina y

Arthrospira, entre otros), colonias que se asentaron en las costas de los mares

primitivos. Hoy sólo quedan estromatolitos vivos en la costa sur de Australia, las

Bahamas y algunas otras costas e islas remotas y prístinas (Woese 1987).

Hace unos 2.000.000.000 de años las cianobacterias produjeron suficiente oxígeno

para modificar sustancialmente la atmósfera terrestre. Muchos anaerobios obligados

(aquellos que no viven en presencia de oxígeno) fueron dañados por el oxígeno y

algunos desarrollaron modos de neutralizarlo, o se restringieron a vivir en áreas donde

este gas no penetra. Por selección natural algunos organismos aerobios se adaptaron

a vivir desarrollando una vía respiratoria que utilizaba el oxígeno para extraer más

energía de los alimentos y transformarla en ATP, prosperaron y radiaron en múltiples

formas de vida. La respiración aerobia se incorpora así al proceso anaerobio ya

existente de la glucólisis (Woese 1987, Mercado 1999).

Las cianobacterias y las microalgas eucarióticas al ser productoras que utilizan la luz

solar como fuente de energía contienen clorofila y otros pigmentos accesorios que les

otorgan una gran eficiencia fotosintética. Por el proceso de fotosíntesis que regula el

contenido de oxígeno y dióxido de carbono en la atmósfera, las microalgas contribuyen

notablemente a aliviar el efecto invernadero y se constituyen en protagonistas de la

producción inicial de materia viva en ecosistemas acuáticos (Mercado 1999).

La ecología de microalgas está determinada por un sinnúmero de factores ambientales

bióticos y abióticos que regulan sus poblaciones y determinan la amplitud de su

dispersión y la capacidad de invadir nuevos hábitats. Posiblemente el factor más

importante en la determinación de la abundancia del fitoplancton, comunidad acuática

errante constituida por microalgas, sea la disponibilidad de nutrientes. Las poblaciones

fitoplanctónicas aumentan sus números aceleradamente en la época de crecimiento

16

(surgencias, afloramientos, estación de mezcla en la zona limnética de los lagos, etc.),

por lo que ciertos nutrientes pueden hacerse limitados (Paulson 2005).

Otro factor primario a tomar en cuenta, principalmente en lo que respecta a la

distribución espacial del fitoplancton, es la luz, fenómeno físico que restringe a las

poblaciones de microalgas a parches en la zona iluminada (eufótica) de los cuerpos de

agua, único lugar donde pueden hacer la fotosíntesis. Si bien, las diferentes especies

de microalgas pueden entablar competencias intra e interespecíficas fuertes por la luz,

las comunidades fitoplanctónicas mantienen una riqueza elevada con tamaños

poblacionales moderados, fenómeno que ha sido denominado por Hutchinson (1961)

la paradoja del plancton.

De lo anterior se desprende la idea de que las poblaciones naturales suelen estar

siempre bajo presión ambiental constante, y sus tamaños poblacionales están

limitados por la disponibilidad de recursos. Aun cuando matemáticamente el

crecimiento poblacional es exponencial a densidades bajas, progresivamente se hace

densodependiente a medida que el tiempo avanza y la densidad crece. El modelo

logístico, el modelo densodependiente más conocido, explica el crecimiento de las

poblaciones durante lapsos más prolongados. Gráficamente se observa un periodo

inicial de latencia y adecuación (crecimiento lento), seguido de un incremento

exponencial (crecimiento rápido) para luego culminar en un plateau donde se alcanza

la capacidad de carga del ambiente, K (May 1976).

Las microalgas pueden ser organismos con un gran impacto negativo en la ecología

de los ambientes húmedos del planeta. Muchas especies de cianobacterias son

problemáticas en lagos y embalses usados para abastecimiento de agua para

consumo humano, donde crecen muy bien y frecuentemente producen florecimientos o

“blooms”, fenómenos en los que muchas especies se pueden acumular en las

espumas superficiales con densidades poblacionales sumamente altas. Estos

afloramientos son inducidos por enriquecimientos con macronutrientes como el fósforo

y el nitrógeno, principalmente derivados de actividades antrópicas (aguas ricas en

fertilizantes provenientes de zonas agropecuarias, vertidos industriales, aguas

domésticas, etc.); están acompañados de la producción de malos olores y sabores en

el agua, así como de neuro y hepatotoxinas mortales para animales domésticos y

seres humanos que la consumen (Carmichael 1994). En el mar ocurren las

denominadas mareas rojas, compuestas principalmente por dinoflagelados altamente

tóxicos, que producen una mortandad masiva de peces; también se dan las mareas

blancas o “blooms” en época de surgencia, congregaciones constituidas por diatomeas

17

que originan el efecto opuesto a las mareas rojas, pues desencadenan una gran

producción secundaria del zooplancton y de los siguientes peldaños de la cadena

alimentaria marina. Estas zonas de surgencia son de gran importancia en la economía

pesquera de muchas naciones del mundo.

1.3 Aspectos biogeográficos

En el contexto evolutivo y ecológico, Spirulina y Arthrospira son dos de los géneros de

cianobacterias más interesantes de este grupo antiguo, debido a la historia natural y

evolución singulares de algunas de sus especies en ambientes extremos y sumamente

restringidos, muchos de ellos agrestes e inhóspitos para casi cualquier otra forma de

vida, donde han tenido muy poca competencia y depredación. No obstante el carácter

extremófilo de ciertas especies de Spirulina y Arthrospira, estos géneros son ubicuos,

pues se encuentran representantes en ambientes marinos costeros, estuarinos,

humedales dulceacuícolas, lagos, etc., lo que también sugiere una idea del éxito

colonizador de estas cianobacterias filamentosas (Ciferri 1983).

Las microalgas extremófilas, como Arthrospira platensis, han evolucionado en sitios

que eran vastos en el precámbrico, y de los que ahora sólo quedan unos pocos sitios

aislados como relictos de esos mares antiguos por procesos continuos de evaporación

y desertificación. Estos procesos hoy día aún prosiguen y se intensifican con el

proceso de calentamiento global, como es el caso del lago Chad (África

Subsahariana), cuya superficie ha retrocedido en forma notable en el curso de menos

de un siglo. Dicho lago constituye uno de los últimos hábitats naturales de

microorganismos antiguos como A. platensis (Ciferri 1983).

De acuerdo al concepto de especie morfológica, la mayoría de las especies de algas

de agua dulce son cosmopolitas. Esto implica que las especies poseen mecanismos

muy eficientes para la dispersión o sus caracteres morfológicos han permanecido

“estáticos” en un tiempo evolutivo amplio. No obstante, hoy día muchos ficólogos

prestan atención a variaciones intraespecíficas en aspectos fisiológicos y bioquímicos.

Por otro lado, observaciones cuidadosas de poblaciones naturales pueden revelar

aislamiento reproductivo dentro de una morfoespecie o entre taxa intraespecíficos

(Ichimura 1996).

Se puede demostrar que los patrones de distribución de organismos sobre la

superficie del planeta no son aleatorios. Esta no aleatoriedad requiere explicaciones

en términos de procesos y reconstrucciones de eventos geológicos y biológicos en la

historia de la vida en la Tierra. Los procesos implican la formación de patrones

18

biogeográficos a partir de procesos abióticos muy lentos y a gran escala que incluyen

los movimientos tectónicos de placas, cambios en los niveles de los mares y océanos

y cambios climáticos, entre otros aspectos geológicos. Estos procesos han operado

casi en concierto, pues el clima puede ser afectado por los movimientos de los

continentes y los cambios en la circulación oceánica; los movimientos tectónicos

pueden alterar las corrientes oceánicas; el clima ha podido influir en la eustasia1 de la

periodicidad interglaciar. A un nivel más local, las erupciones volcánicas,

desertificaciones, cataclismos terrestres, huracanes, etc. también han contribuido a la

creación de patrones de distribución en diferentes hábitats (Myers y Giller 1991).

La determinación de patrones de distribución parte de un análisis biogeográfico. Tales

patrones son dóciles a análisis sin supuestos específicos de procesos subyacentes o

pueden ser usados para probar hipótesis sobre procesos. La biogeografía histórica y

ecológica indirectamente ha usado patrones observados de distribución de organismos

para probar hipótesis, con miras a explicar procesos tales como la vicariancia

(separación de grupos por barreras geográficas), dispersión, interacciones de especies

y eventos de perturbación (Myers y Giller 1991).

1.4 Importancia biotecnológica de las microalgas

Pocas personas, fuera del ámbito científico, conocen qué son las llamadas

cianobacterias, a pesar de que estos organismos son responsables tanto de beneficios

como de problemas en asuntos humanos (Prosperi 2000). Tampoco se conoce a la

mayor parte de las microalgas eucariotas, aún las bien sabidas propiedades abrasivas

de las tierras de diatomeas; o las especies que producen las perjudiciales mareas

rojas; o todavía sus “primas mayores”, las macroalgas, tan apreciadas en la

gastronomía japonesa y europea, así como en las industrias de geles como el agar y

carragenina, esta última para espesar jaleas y gelatinas. Son también invaluables los

aportes de las microalgas a la industria de los colorantes por la gran diversidad de

pigmentos que producen. Clorofitas del género Dunaliella acumulan elevados

contenidos de carotenoides, varias veces más que la zanahoria en base seca, por un

proceso denominado carotenogénesis, que las hacen fuente primaria de provitamina A

para humanos (Guevara y col. 2005).

1 El término eustasia se emplea para designar los hundimientos y posteriores ascensos de la corteza terrestre en aquellas zonas en que existieron grandes glaciares continentales durante el Pleistoceno. Con la formación de los grandes glaciares, el relieve se fue hundiendo por el peso del propio hielo y al finalizar el período glacial y desaparecer esos glaciares, el relieve previamente hundido tiende a "rebotar" hacia arriba debido a que se queda liberado de dicho peso (http://es.wikipedia.org/wiki/Eustasia).

19

A pesar del empleo milenario de las microalgas como alimento humano, la

biotecnología de estos microorganismos en realidad sólo comenzó a desarrollarse a

mediados del siglo pasado. Hoy en día, existen numerosas aplicaciones comerciales

de las microalgas. Por ejemplo, (i) las microalgas pueden ser utilizadas para mejorar el

valor nutritivo de los alimentos y la alimentación animal debido a su composición

química, (ii) desempeñan un papel crucial en la acuicultura y (iii) pueden ser

incorporadas a los cosméticos. Además, se cultivan como fuentes muy valiosas de

diversas moléculas. Respecto a esto último, por ejemplo, los ácidos grasos

poliinsaturados de los aceites se añaden a las fórmulas infantiles y complementos

nutricionales y los pigmentos son importantes como tintes naturales. Isótopos

bioquímicos estables ayudan en la determinación estructural y los estudios

metabólicos. La investigación futura deberá centrarse en la mejora de los sistemas de

producción y la modificación genética de las cepas. Las microalgas constituyen de

esta manera una alternativa económica cada vez más diversificada y competitiva

(Spolaore y col. 2006).

Entre los beneficios que la humanidad obtiene de las cianobacterias, por citar uno de

múltiples ejemplos, se encuentra su utilización como biofertilizantes en agricultura,

gracias a su capacidad de fijar nitrógeno atmosférico (N2) y producir compuestos

orgánicos ricos en nitrógeno que contribuyen a incrementar los rendimientos de las

cosechas de arroz (Prosperi 2000). El empleo de algunas especies de los géneros

Spirulina y Arthrospira para la alimentación humana está ampliamente comprobado

por un sin fin de investigaciones científicas, las que coinciden en su inocuidad (no son

tóxicas), gran palatabilidad (más de 90% comestible) y sus importantes cantidades de

proteínas (65-70% en base seca), vitaminas y otros nutrientes (Ciferri 1983, Henrikson

1994, Mani y col. 2000, Pervushkin y col. 2001, Sachdeva y col. 2004).

Está ampliamente comprobado el beneficio alimentario de Spirulina y Arthrospira en

animales de granjas pecuarias (aves de corral, porcinos, etc.) y acuícolas (peces,

camarones, etc.), y consumo humano (Martínez-Palacios y col. 1996, Soler y col.

2000, Nandeesh y col. 2001, Jaime-Ceballos y col. 2004). Las tecnologías empleadas

para cultivar masivamente microalgas y obtener productos alimenticios, farmacéuticos

y cosméticos de su biomasa son limpias en su totalidad; las granjas a cielo abierto

tienen un gran valor ecológico como trampas vivientes de gases de efecto invernadero

y purificación de biogás (Conde y col. 1993), así como recuperación de cuerpos de

agua contaminados (Ayala y Vargas 1987, Sim y Goh 1988, Cañizares y col. 1993).

20

Existen diversas especies de microalgas que metabolizan hidrocarburos, los

bioacumulan en sus vacuolas y producen aceites, a partir de los cuales se pueden

producir biocombustibles (biodiesel). La clorofita Botryococcus braunii se caracteriza

por su capacidad de producir hidrocarburos insaturados de cadena larga, llegando a

contenidos que van de 15 a 75% de su peso seco. Además, esta microalga produce

polisacáridos extracelulares que inducen la formación de colonias, el tamaño de las

mismas depende de la hidrodinámica de estrés en el biorreactor. Su gran potencial

como fuente renovable de combustibles de base o de productos químicos ha sido

demostrado por diferentes grupos de investigación (Casadevall y col. 1985, Banerjee y

col. 2003).

Otras especies de microalgas con gran potencial en biotecnología petrolera, debido a

sus gran contenido de lípidos, son Schizochytrium sp., Nannochloropsis sp., Nitzschia

sp., Isochrysis sp. y Tetraselmis suecica, entre otras (Tabla 1).

Tabla 1. Especies de microalgas con potencialidades para generación de biocombustibles. Contenido de aceites en base seca (tomada de Albarracín 2007).

Especie Contenido de aceite (% de peso seco)

Botryococcus braunii 25 – 75

Chlorella sp. 28 – 32

Crypthecodinium cohnii 20

Cylindrotheca sp. 16 – 37

Dunaliella primolecta 23

Isochrysis sp. 25 – 33

Monallanthus salina 20

Nannochloris sp. 20 – 35

Nannochloropsis sp. 31 – 68

Neochloris oleoabundans 35 – 54

Nitzschia sp. 45 – 47

Phaeodactylum tricornutum 20 – 30

Schizochytrium sp. 50 – 77

Tretraselmis suecica 15 – 23

21

Por su parte, la diatomea marina Chaetoceros muelleri puede tener potencial para su

explotación como un precursor renovable de los combustibles líquidos o como fuente

de lípidos, esto sobre la base de su alta tasa de crecimiento, la tolerancia a una amplia

gama de temperaturas y conductancias específicas, y una gran cantidad de lípidos

intracelulares (Mcginnis y col. 1997).

El fitoplancton ha sido ampliamente estudiado en sus dinámicas poblacionales y

comunitarias. Los estudios teóricos a partir de observaciones empíricas y de campo

han crecido notablemente debido a la importancia de muchas especies de microalgas

en la alimentación, farmacia, medicina, control de calidad de aguas, etc. Un aspecto

aún incipiente es el estudio biogeográfico de microalgas en sus ambientes nativos.

Este trabajo trata de dos temas: (1) estudio de las dinámicas poblacionales en

especies cultivadas y (2) muestreo y caracterización de hábitats y aspectos

comunitarios de especies autóctonas de gran valor en la biotecnología alimentaria y

petrolera.

22

2. Antecedentes en Venezuela

En Venezuela se han hecho numerosos trabajos taxonómicos y ecológicos de

microalgas. Diversas especies fitoplanctónicas de importancia biotecnológica son

nativas de Venezuela; las clorofitas Botryococcus braunii y Chlorella vulgaris y

cianobacterias del género Spirulina han sido reportadas para el embalse de Guri

(González de Infante y Riehl 1992). Anteriormente, B. braunii también se encontró en

la laguna de San Javier del Valle, Edo. Mérida (Yacubson 1974). En aguas salobres y

estuarinas, como el sistema del lago de Maracaibo (norte del lago) se ha reportado la

cianobacteria Spirulina subsalsa y otras cianobacterias eurihalinas (Rodríguez 2001).

En diversos sistemas marinos costeros y lagunas hipersalinas del país se han

colectado diferentes especies de clorofitas del género Dunaliella (Guevara y col.

2005), así como prasinofitas del género Tetraselmis (Romero y col. 2002), entre otras

especies.

Por otra parte, algunas investigaciones se han orientado a ensayos de cultivos de

microalgas en condiciones controladas con fines biotecnológicos. Algunos análisis han

permitido la determinación de las composiciones nutricionales y producciones de

metabolitos de diferentes especies de microalgas: Anabaena sp. (Morales y col. 2002),

Chlorella sp. (Mora y col. 2004) y Dunaliella salina (Guevara y col. 2005). Otros

ensayos han conducido a la cuantificación de efectos inmunomoduladores de Spirulina

subsalsa (Cheng-Ng y col. 2005). Parra (2005) aisló y purificó c-ficocianina y

aloficocianina de Arthrospira platensis, dos pigmentos de gran interés en la industria

de los colorantes y marcadores moleculares. Naranjo y col. (2010) hicieron una

revisión del uso de A. platensis como biofactoría de metabolitos secundarios de interés

farmacológico, con énfasis en el ácido pipecólico.

La Asociación Civil Gente de Ciencias (2007), organización científica y social

venezolana constituida por profesionales del área de las ciencias naturales, con

experiencia en el cultivo de microalgas (cultivos en laboratorio y campo; optimización

de medios de cultivo, fotobiorreactores y obtención de productos de microalgas), con

énfasis en Arthrospira platensis desde el año 2000. Las investigaciones se

concentraron en la aplicación de la biotecnología de microalgas en temas como la

nutrición animal y humana. Recientemente con Botryococcus braunii, Nannochloropsis

sp., Tetraselmis chuii e Isochrysis galbana, entre otras especies, se ha explorado la

factibilidad de producir biocombustibles a partir de aceites sintetizados o acumulados

en sus compartimentos intracelulares.

23

3. Justificación

Este trabajo está enmarcado en el estudio ecológico, taxonómico y biogeográfico de

especies de microalgas eucarióticas y cianobacterias autóctonas con potencialidades

para su cultivo masivo en Venezuela y empleo en la acuicultura, biotecnología

alimentaria, generación de biocombustibles (biodiesel), biorremediación, producción de

energías limpias y trampas de gases de efecto invernadero. También se incorporan

especies cultivadas en Venezuela desde hace varios años, como Arthrospira platensis

y A. maxima de conocido perfil nutricional, médico y biorremediador, por lo que tienen

gran demanda mundial; más de 70 países las cultivan comercialmente (Henrikson

1994).

Las especies de los géneros Spirulina y Arthrospira han sido incorporadas con éxito

notable en programas sociales y alimentarios dentro de países del cuarto mundo con

altas tasas de desnutrición, como el África Ecuatorial. Conviene entonces incorporar el

estudio ecológico de estas cianobacterias para conocer sus tasas de crecimiento

óptimas y otros parámetros poblacionales con miras a cultivarlas a gran escala en el

país y aprovechar su biomasa con la firme intención de establecer programas

nutricionales similares en Venezuela y Latinoamérica, a sabiendas de los niveles

preocupantes de desnutrición que imperan en los países de esta región.

El estudio de los organismos en su ambiente natural brinda la oportunidad de conocer

las especies con las que cuenta Venezuela y adquirir un conocimiento integral de sus

ambientes naturales. Esta propuesta lleva implícito un propósito productivo de emular

las condiciones naturales para lograr sus cultivos en sistemas controlados, y una

finalidad de conservación a partir del conocimiento de los ambientes para manejo

sustentable de ecosistemas o su protección como santuarios de vida. En síntesis, la

meta de esta investigación es brindar puntos de partida a partir de un estudio

ecológico integral a expectativas y necesidades creadas en el país por la búsqueda de

fuentes alternativas de alimentos, medicinas, pigmentos y energías limpias, así como

perspectivas para la recuperación de ecosistemas acuáticos contaminados. Esta

propuesta está enmarcada en el Plan Nacional Simón Bolívar como nuevo modelo

sociopolítico para el país.

24

4. Hipótesis

1. Las poblaciones de Arthrospira platensis cultivadas en el laboratorio presentan

densodependencia, y un crecimiento poblacional que puede ser descrito con

modelos matemáticos.

2. La geografía y ecología variadas del país permiten esperar una gran diversidad de

especies de microalgas distribuidas en forma discontinua y gradientes, algunas de

ellas con gran potencial biotecnológico.

25

5. Objetivos

1. Establecer la dinámica de crecimiento poblacional de Arthrospira platensis con

optimización de medios de cultivo para fines productivos.

2. Caracterizar hábitats y comunidades fitoplanctónicas con especies de interés

biotecnológico en el país.

Del objetivo 1 se desprenden los objetivos específicos:

a. Caracterizar el crecimiento poblacional de A. platensis en condiciones

controladas y naturales.

b. Determinar los parámetros poblacionales.

c. Realizar análisis de perturbación en el modelo dinámico.

Del objetivo 2 derivan los objetivos específicos:

a. Identificar especies de microalgas de muestras colectadas en el campo.

b. Determinar riqueza, abundancia e índices de diversidad.

c. Establecer relaciones entre ambientes, variables físicas y químicas y la

composición de especies encontradas.

26

6. Metodología

El plan general de trabajo se dividió en dos niveles de organización: poblacional y

comunitario.

6.1 Ecología de poblaciones de especies cultivadas

Los estudios poblacionales se condujeron por aproximaciones experimentales y con

base en la teoría ecológica. Los mismos se centraron en cultivos de la cianobacteria

Arthrospira platensis (cepa Lefevre 1963/M-132-1, República Checa). La especie se ha

cultivado en el Laboratorio de Optimización Agrícola (LOA-IZET) por más de ocho

años. Arthrospira maxima (cepa cubana), es una especie congénere obtenida para el

cepario del laboratorio en tiempo más reciente. El cepario también cuenta con otras

especies de valor biotecnológico provenientes de otros ceparios del país y del

extranjero, así como colecciones de campo: Chaetoceros sp. (Bacillariophyta),

Botryococcus braunii (Chlorophyta), Chlamydomonas sp. (Chlorophyta), Chlorella

vulgaris (Chlorophyta), Dunaliella salina (Chlorophyta), D. viridis (Chlorophyta), D.

primolecta (Chlorophyta), Haematococcus pluvialis (Chlorophyta), Scenedesmus sp.

(Chlorophyta), Spirulina subsalsa (Cyanobacteria), Isochrysis galbana (Haptophyta),

Nannochloropsis sp. (Ochrophyta), Tetraselmis sp. (Prasinophyta), Porphyridium

cruentum (Rhodophyta) y Rhodosorus marinus (Rhodophyta).

Medios de cultivo. Se procedió a la preparación de un medio de cultivo estándar para

cianobacterias filamentosas alcalófilas de los géneros Spirulina y Arthrospira

denominado medio Spirulina o SAG (Schlösser 1994), que es una modificación del

medio Aiba y Ogawa (1977). Parra (2005), incorporó algunos cambios a este medio

nutritivo. La composición del medio Spirulina se presenta en la Tabla 2.

Tabla 2. Composición química del medio Spirulina (Schlösser 1994).

Componentes Solución Stock

(mL) Masa (g)

Concentración

en el medio

final

pH

Solución I 500 (2X) – – Alcalino

(>9)

NaHCO3 – 13,61 1,62×10-4

M –

Na2CO3 – 4,03 3,80×10-5

M –

K2HPO4* – 0,50 2,87×10-4

M –

Solución II 500 (2X) – – Neutro

(7)

NaNO3* – 5,00 2,94×10-5

M –

K2SO4 – 2,00 5,74×10-6

M –

NaCl – 2,00 1,71×10-5

M –

27

Tabla 2. Continuación.

Componentes Solución Stock

(mL) Masa (g)

Concentración

en el medio

final (1X)

pH

MgSO4.7H2O – 0,40 8,11×10-7

M – CaCl2.2H2O – 0,02 2,72×10

-7M –

FeSO4.7H2O – 0,02 3,60×10-8

M – Na2EDTA.2H2O – 0,16 2,15×10

-7M –

Traza metálica 1000 (1000X) – – Neutro

(7)

Na2EDTA.2H2O – 0,80 2,15×10-6

M – FeSO4.7H2O – 0,70 2,52×10

-6M –

ZnSO4.7H2O – 0,001 3,48×10-9

M – MnSO4.7H2O – 0,002 8,97×10

-9M –

H3BO3 – 0,01 1,62×10-7

M – Co(NO3)2.6 H2O – 0,001 3,44×10

-9M –

Na2MoO4.2 H2O – 0,001 4,13×10-9

M – CuSO4.5H2O – 0,00005 2,00×10

-11M –

*Parra (2005) reemplazó el K2HPO4 por KH2PO4, debido a la mayor solubilidad de la primera

en agua. También sustituyó el NaNO3 por KNO3 para obtener una relación Na:K más próxima a la fisiológica (4:1).

Spirulina subsalsa fue cultivada en medio Spirulina combinado con agua de mar

(50:50), debido al origen estuarino de la cepa (Morales, com. pers.). El resto de las

especies de microalgas del cepario se cultivaron en diferentes medios probados y

estandarizados como óptimos para sus crecimientos poblacionales: medio F/2

(Guillard 1975), para microalgas marinas como Nannochloropsis sp., Tetraselmis sp. e

I. galbana; medio Algal (Fábregas y col. 1985), el cual fue empleado tanto para

microalgas de agua dulce como Chlamydomonas sp., C. vulgaris y Scenedesmus sp.,

como para diatomeas marinas (Chaetoceros sp.), con adición de silicatos, rodofitas (P.

cruentum y R. marinus) y Tetraselmis sp., con adición de agua de mar, y clorofitas de

ambientes hipersalinos (Dunaliella spp.), con la incorporación de solución saturada de

cloruro de sodio (NaCl); medio Chu-13 (Chu 1942) modificado por Dayananda (2007)

para B. braunii; Haematococcus pluvialis fue cultivada en medio Bristol (Bold 1949).

Para especies del género Dunaliella también se probó el medio de Serpa y Calderón

(2006). Las composiciones de estos medios se presentan en el Apéndice 1.

La preparación de los medios se efectuó conforme los siguientes pasos generales:

1. Se preparó una solución madre 1000X (solución concentrada) de micronutrientes

(oligoelementos o traza metálica), según lo establecido en cada medio de cultivo.

Para ello, las sustancias requeridas como sales inorgánicas cristalizadas grado

analítico se pesaron en una balanza analítica digital AND (d = 1 mg).

28

2. Las sustancias constituyentes de la solución de macronutrientes, sales inorgánicas

cristalizadas grado analítico (salvo bicarbonato y carbonato de sodio, sales que

debido a sus altos requerimientos para el medio Spirulina se obtuvieron de sacos

de 25 ó 50 kg de agroquímicos grado técnico), también se pesaron en una balanza

analítica digital AND (d = 1 mg). Las sales de bicarbonato y carbonato de sodio se

pesaron en una balanza digital de 10 kg (d = 1 g).

3. Cada sal se disolvió en forma independiente con agitación magnética y calor, luego

se mezclaron todos los componentes de la solución madre y se enrasó al volumen

final, generalmente de un (1) litro, en un balón aforado o en un cilindro graduado

de 1 L. Algunas sales, como el sulfato ferroso heptahidratado (sal utilizada

generalmente como fuente de hierro para todos los medios), tuvieron que ser

disueltas con un quelante (EDTA disódico o citrato trisódico dihidratado). No se

añadieron vitaminas ni carbohidratos a ninguna solución de medio nutritivo.

4. La solución madre de micronutrientes se esterilizó en un autoclave analógico

vertical KALSTEIN durante 45 min hasta una temperatura tope de 119ºC

(temperatura óptima = 121ºC), y una presión de 10 PSI (presión óptima = 15 PSI).

Antes de autoclavar cualquier solución y material (pipetas Pasteur, fiolas, botellas

vacías, etc.), una cinta de papel autoadhesivo indicador (o testigo) se colocó a

cada recipiente.

5. A la solución de macronutrientes se añadió la alícuota correspondiente de solución

madre de micronutrientes estéril, para de este modo obtener el medio de cultivo

íntegro. Para trasvasar soluciones se tomó la previsión de destapar el envase

frente a la llama azul de un mechero FISHER.

6. Finalmente, la solución de medio de cultivo se autoclavó para luego enfriar y

proteger con papel envolvente.

Inóculo. Se obtuvieron cultivos monoalgales y monoclonales (poblaciones surgidas de

un filamento) de A. platensis (cepa Lefevre), por la virtud de estas cianobacterias de

reproducirse asexualmente por particiones de filamentos o tricomas en sitios críticos

que necrosan y se escinden formando hormogonios (filamentos reproductivos), sitios

denominados necridia o necridios. Esto garantizó uniformidad genética en las

poblaciones de estos microorganismos.

Para la obtención de cultivos monoclonales se cumplió la pauta siguiente:

29

1. De una cepa se aisló un filamento en una cápsula de Petri con solución buffer

alcalina (bicarbonato-carbonato de sodio, 4:1) bajo un estereoscopio (lupa).

2. Cada filamento se colocó en un tubo de ensayo con medio Spirulina esterilizado y

se colocó en cámara de crecimiento (T = 27ºC) con iluminación permanente. El

periodo de incubación fue de 15 días, tiempo en el cual el filamento inicial pudo

clonarse en varios filamentos vía escisión en necridios.

3. Los cultivos monoclonales se escalaron a fiolas de 250 mL y se mantuvieron sin

agitación en la cámara de crecimiento. En estos recipientes se mantuvieron para

ser empleados en medios sólidos y completar proceso de purificación de la cepa.

Para la siguiente etapa de purificación del cultivo monoalgal y monoclonal, con la

finalidad de controlar contaminación de bacterias y hongos, se emplearon los

siguientes pasos:

1. Se prepararon medios sólidos con disolución en caliente de agar no purificado en

medio Spirulina (1,5 g de agar por cada 100 mL de medio), de esta manera se

elaboró un medio de agar alcalino.

2. Las soluciones con agar se autoclavaron en cápsulas de Petri, para hacer placas y

en tubos de ensayo inclinados para obtener cuñas. Una vez obtenidos los medios

sólidos estériles, se procedió a encender la llama azul en un mechero FISHER y

limpiar el mesón con etanol absoluto. Este procedimiento se hizo con el fin de

tener las mayores condiciones de asepsia posibles.

3. Bajo estas condiciones de asepsia y llama azul, una vez que las soluciones

esterilizadas se enfriaron, se procedió a la siembra de las cepas vivas. Los medios

solidificados en placas y tubos fueron sembrados por medio de un asa metálica

pasada por llama azul y enfriada en algún punto del medio sólido, teniendo

cuidado de no inocular posteriormente en esa zona (figura 1).

Figura 1. Esquema ilustrado donde se muestra el escalamiento de microalgas de medio líquido a medio sólido con el empleo de la técnica del asa de estaño.

30

4. Finalmente las cepas en las soluciones nutritivas solidificadas se ubicaron en el

cepario o cámara fría bajo luz fría (tubos fluorescentes day-light) a una

temperatura media de 23ºC.

Luego de la obtención de cepas limpias, monoclonales y monoalgales, se procedió al

escalamiento a fiolas de 250 mL, y de éstas a fiolas de mayores volúmenes en forma

sistemática hasta llegar a los cultivos en fiolas de 2 L con agitación y sin fotoperiodo

(luz por 24 h diarias). Para ello se procedió del modo siguiente:

1. Soluciones líquidas esterilizadas se trasvasaron a fiolas de 250 mL cubiertas con

tapones de algodón y gasa. Todo este material previamente se autoclavó. Los

medios líquidos nuevos se inocularon con pequeños volúmenes de cepas

provenientes de cuñas y placas del cepario en cámara fría.

2. Las cepas cultivadas en medio líquido se colocaron en la cámara de crecimiento

bajo luz fría y temperatura media de 27ºC, con agitación y luz continuas. La

agitación en la cámara de crecimiento la proveyó un blower KAWAKE (¼ HP; 220

V), y se condujo a través de un sistema de tubos y mangueras hasta culminar en

pipetas Pasteur esterilizadas sumergidas en las soluciones con inóculo.

3. Los dos pasos anteriores se repitieron para los escalamientos sucesivos hasta

culminar en cultivos a escala mayor (figuras 2 y 3).

Figura 2. Esquema donde se muestra el escalamiento de poblaciones de microalgas a fiolas de diferentes volúmenes hasta alcanzar los cultivadores a gran escala.

Diseño de experimento. Los experimentos en laboratorio bajo condiciones

controladas se ejecutaron a escala menor (fiolas de 2 L); estas pruebas se ejecutaron

en la cámara de crecimiento del cepario del Laboratorio de Optimización Agrícola

(LOA). Los ensayos en campo se llevaron a cabo a escala mayor y con monitoreo de

las condiciones ambientales en la Planta Experimental “Ficotrón” ubicada en el

Instituto de Estudios Avanzados (IDEA), Sartenejas, Edo. Miranda. Se ensayó en

31

botellones de 5 L, tanques cilíndricos de 500 L y cultivadores tipo carrusel (en inglés

“race-ways”) de 2000 L (figura 3).

Figura 3. Imágenes donde se muestran las diferentes etapas de escalamiento del cultivo en medio líquido en el sistema integrado LOA-Ficotrón: (a) cultivos a escala pequeña en condiciones controladas (Cámara de Crecimiento, LOA - IZET); (b), (c) y (d) cultivos a cielo abierto en el Ficotrón, IDEA, en botellones de 5 L, tanques circulares de 500 L y cultivadores tipo carrusel de 2000 L, respectivamente.

Cada diseño de experimento se definió por el número de factores o variables

independientes a fijar y su número de niveles (Montgomery 2001). En todos los

experimentos se consideraron variables dependientes: (1) la densidad poblacional

(filamentos/L), por el método directo de conteo de filamentos, y (2) la absorbancia a

longitud de onda (λ) = 680 nm, para el método indirecto.

Los ensayos de laboratorio se organizaron en diseños factoriales 22 (dos factores,

sodio (Na) y potasio (K), con dos niveles, alta y baja concentración), para comparar

cuatro medios de cultivo (modificaciones del medio Spirulina) empleados para A.

platensis. Los ensayos no se replicaron en número de fiolas, puesto que se supone la

existencia de repeticiones del experimento en cada una de las posibles combinaciones

de los niveles del factor correspondiente (Montgomery 2001). Se hicieron ajustes

matemáticos para modificar la relación Na+:K+, sin variar en forma notable las

concentraciones de los demás iones. Con estas pruebas se determinó el medio de

cultivo óptimo para el crecimiento poblacional en condiciones controladas, a partir de

los dos cationes más importantes en el equilibrio electroquímico entre los

compartimentos intra y extracelulares, y contraiones de las sales inorgánicas. Las

interacciones entre factores se evaluaron con un ANOVA de dos vías (α = 0,05). La

Tabla 3 muestra el resumen del ensayo factorial 22.

Tabla 3. Diseño factorial 22 para ensayos de laboratorio. El experimento se simplificó a cuatro

medios de cultivo sin replicación.

K+ alto K+ bajo

Na+ alto + + + –

Na+ bajo – + – –

(a) (b) (c) (d)

32

En campo se continuó la investigación con diseños factoriales de mayor complejidad, a

medida que se añadieron factores. El primer experimento de campo se llevó a cabo en

botellones plásticos de 5 L y el diseño correspondió a un factorial fraccionado 26-1 de

resolución VI, montado con el programa Design Expert versión 6, donde las variables

independientes o factores fueron seis sales grado alimenticio a dos niveles, con cinco

puntos centrales. El programa produjo 37 tratamientos, 5 centrales y el resto

combinaciones aleatorias de los factores (Tabla 4). Las sales forman parte del medio

Spirulina (Schlösser 1994), pero en lugar de la sustitución de Parra (2005) de KNO3

por NaNO3, se empleó NH4NO3, esto debido a razones de costos. A esta escala de

experimentación se emplearon sales grado alimenticio y no reactivo, el NH4NO3 resultó

la fuente de nitrógeno disponible y muy empleada en producción de fertilizantes.

Tabla 4. Resumen del diseño factorial fraccionado 26-1

(salida del programa Design Expert)*.

Study Type: Factorial Runs: 37

Initial Design:

2 Level Factorial Blocks: No Blocks

Center

Points:

5

Design Model:

Reduced 3FI

Factor Name Units Type Low Actual

High Actual

Low Coded

High Coded

Mean Std. Dev.

A NaHCO3 mg/L Numeric 6805 13610 -1 1 10207,5 3164,3

B Na2CO3 mg/L Numeric 2015 4030 -1 1 3022,5 937,0 C K2HPO4 mg/L Numeric 250 500 -1 1 375 116,2

D NaCl mg/L Numeric 500 1000 -1 1 750 232,5

E K2SO4 mg/L Numeric 500 1000 -1 1 750 232,5

F NH4NO3 mg/L Numeric 1176 2352 -1 1 1764 546,8

*Para más detalle sobre este ensayo, ver Apéndice 2.

Las variables respuestas o dependientes aleatorias fueron: absorbancia a 680 nm,

número de filamentos por litro, y biomasa final (g/L). El medio óptimo para este

experimento se escogió por una técnica matemática multivariada denominada

superficie de respuesta (ver Apéndice 2 con salida del análisis en Design Expert, y

Apéndice 3 que muestra un marco teórico breve que explica la técnica).

Para este ensayo de campo, los medios se prepararon según esquema de la figura 4.

Los pasos se enumeran a continuación:

1. Se prepararon soluciones stocks por triplicado con agua destilada y se preservaron

en envases limpios. Los primeros ocho tratamientos se prepararon en dos

soluciones de 500 ml cada una: Solución I (Stocks A, B y C) y Solución II (stocks I,

33

D, E, F y II). Las preparaciones se hicieron en grupos de ocho debido a la

capacidad limitada del autoclave (16 botellas de vidrio de 1 L c/u).

2. Se autoclavaron las soluciones I y II de cada tratamiento.

3. Cada tratamiento se aforó a 4 L con agua filtrada.

4. Se tomó una muestra de 50 mL de cada tratamiento y se realizaron medidas de pH

y conductividad como método de comprobación de calidad del medio.

Figura 4. Esquema para la preparación de cada medio (tratamiento) del diseño factorial fraccionado 2

6-1.

La siguiente escala de volumen en el estudio, la constituyeron tanques cilíndricos de

500 L. El diseño experimental empleado para evaluar el crecimiento poblacional de A.

platensis en este tipo de cultivadores fue un factorial 32 con bloques completos

aleatorizados. Se estableció un sistema de 9 tanques cilíndricos de 500 litros de

polietileno de alta densidad, con sistema de bombeo y aireación (blower KAWAKE ¼

HP; 220 V) bajo invernadero (Ficotrón). El sistema de bombeo está compuesto de dos

bombas de pecera (cada bomba aproximadamente suministra 2 L•min-1). Cada medio

en tanque se inoculó con 10% de los volúmenes totales, dando como resultado una

concentración promedio de 83 mg/L. Las pérdidas por evaporación se repusieron con

agua filtrada. Cada 72 h se midió la absorbancia o densidad óptica (DO) en un

espectrofotómetro SHIMADZU UV-160 a λ = 680 nm. Como medio de cultivo se

empleó el optimizado en el diseño factorial fraccionado 26-1. La variable independiente

aleatoria fue la profundidad (cm), debido a que este factor físico resulta determinante

Stock A

1/2L Sol. I

de Trat. X

1/2L Sol. II

de Trat. X

4L Trat. X

Autoclavar I y II

Stock B Stock C Stock I Stock D Stock E Stock F Stock II

34

en las tasas de crecimiento y mortalidad de filamentos por la generación de puntos

oscuros donde la fotosíntesis se anula. Las variables respuestas a evaluar fueron la

absorbancia a 680 nm (medida cada tres días) y biomasa total (g/L), ésta última

determinada una vez realizada la cosecha al final del periodo de incubación. La figura

5 muestra un esquema de este sistema de tanques y su disposición espacial para el

experimento.

Figura 5. Esquema de la disposición espacial de los tanques cilíndricos en el Ficotrón para la ejecución del diseño de bloques completos aleatorizados.

Un Análisis de Varianza (acrónimo en inglés ANOVA) de dos vías (α = 0,05) se realizó

para determinar efectos significativos de tratamientos y bloques. La corrida de la

prueba se ejecutó en EXCEL versión 2007.

Finalmente, para piletas o cultivadores tipo carrusel de 2000 L no se realizó un diseño

experimental formal, pues sólo se dispuso de un sistema con agitación por paletas de

los ocho construidos en la planta. De esta forma, no se dispuso de “réplicas” para

comparar medias poblacionales de A. platensis con diferentes tratamientos. Sólo se

pudo recurrir a un muestreo sin norma o puntual cada tres días para valorar la

absorbancia a 680 nm y biomasa final (g/L), una vez realizada la cosecha.

Biomasa. Para la obtención de biomasa seca, en laboratorio se procedió a colectar la

biomasa húmeda en una malla de poliéster con 27 μm de apertura de poro, mientras

que en el campo (Ficotrón) la cosecha se hizo con filtros metálicos con diámetro de

poro de 55 μm. El pH del medio de cultivo de A. platensis se caracteriza por su

60 cm 60 cm

60 c

m6

0 c

m

ABC

1

2

3

N

S

BLO

QU

ES

F I L A S

35 cm

35 cm

35 cm 25 cm

25 cm

25 cm 15 cm

15 cm

15 cm

A1-25A2 25

A3 15

B1 35

B2 15

B3 25C1 15C2 35

C3 35

10º24`12`` N 66º53`13`` O

35

alcalinidad elevada (9,5 a 10), por lo que la biomasa fue neutralizada con agua filtrada

o agua acidulada para fines de aprovechamiento alimenticio; un pH-metro digital

HANNA permitió monitorear la reducción del pH hasta 7. Finalmente, la biomasa

húmeda y neutralizada fue extendida sobre una superficie de papel parafinado y

colocada en rejas metálicas, para ser secada en un deshidratador a 60ºC por 24 h. La

biomasa total o final se estableció una vez alcanzado el plateau y sucedidos algunos

días para la estabilización de la curva (de 15 a 30 días de incubación).

Determinación de la densidad poblacional. Se determinó el crecimiento poblacional

de A. platensis por dos métodos: (1) directo, por conteo de filamentos en cámaras

cilíndricas desmontables Utermöhl (1958) bajo un microscopio invertido LEICA DMIL, y

(2) indirecto, por absorbancia o densidad óptica en un espectrofotómetro digital

SHIMADZU UV-160 a longitudes de onda (λ) de 680 y 700 nm, correspondientes al

rojo y rojo lejano, respectivamente, en las cuales la clorofila a teóricamente tiene

absorción óptima de luz visible y umbral visible-infrarrojo.

Para el conteo de filamentos, se empleó el método de conteo de bandas (Utermöhl

1958) en una cámara de 25 mL. Previamente, las muestras se dejaron sedimentar en

la cámara por 24 h. Una vez hecho el cómputo de filamentos por banda, se determinó

la densidad ( D ) o número de filamentos por litro a partir de la ecuación:

1000/Lfilamentos

NVTL

SD (1)

Donde:

S = superficie total de la cámara de sedimentación (2r )

N = número total de filamentos contados

L = longitud de la banda recorrida (2 r )

T = ancho de la banda recorrida (según aumento del objetivo)

V = volumen total de la cámara (25 mL)

Para determinar el ancho de la banda, se calibró el microscopio con una escala

grabada en un ocular (aumento 10x) dividida en 100 líneas, la cual se superpuso a

otra escala de 2 mm de longitud grabada en un portaobjetos ubicado sobre el carro.

Para el aumento de cada objetivo se obtuvieron los siguientes factores de conversión:

36

10x: 3 líneas = 0,05 mm

20x: 10 líneas = 0,08 mm

32x: 20 líneas = 0,1 mm

Previo a cada ensayo con el método indirecto, en el espectrofotómetro se hizo un

barrido (en inglés “scan”) de absorbancias, en un intervalo de longitudes de onda de

400 a 700 nm, con factibilidad de expandir hacia el espectro UV por el límite inferior o

el infrarrojo por el límite superior; de esta manera se verificaron los máximos u óptimos

de absorción de las cepas de A. platensis.

La densidad óptica ( λDO ) es la absorción de un elemento óptico por unidad de

distancia, para una longitud de onda dada:

I

Ilog

lTlog

ll

ADO λ

λ0

1010

11 (2)

Donde:

Aλ = Absorción a longitud de onda λ

l = Distancia que la luz viaja por una muestra (i.e., el grosor de la muestra, o dicho de

otro modo, anchura o abertura de la cubeta, con exclusión de las paredes) medida en

centímetros (cm). Si l = 1 cm, entonces λDO = λA

T = Transmitancia por unidad

I0 = Intensidad del rayo de luz incidente

I = intensidad del rayo de luz transmitido

(http://es.wikipedia.org/wiki/Densidad_óptica)

Mientras más alta es la densidad óptica, más corta es la transmitancia. Esta última

medida está acotada entre 0 y 1, si se transforma a porcentaje (como generalmente se

registra en espectrofotómetros), entonces la transmitancia se lee entre 0 y 100%. Para

calibrar el espectrofotómetro, se empleó una solución “blanco”, la cual teóricamente

tiene 100% T o Aλ = 0, y la misma se restó a las absorbancias de las muestras.

Modelos para crecimiento poblacional y cosecha de biomasa. Los estudios

teóricos tienen valor predictivo y se verifican en experimentos de laboratorio y campo.

Los supuestos generales de los modelos determinísticos son los siguientes (Begon y

col. 1996):

37

1. Las poblaciones son aisladas o cerradas (E = I = 0; donde E = tasa de emigración,

I = tasa de inmigración).

2. Las dinámicas son coetáneas (cohortes o individuos de la misma edad).

3. Los individuos son unitarios, excluyendo los modulares (Ej.: colonias de filamentos

o células).

4. Todos los individuos se consideran unidades reproductivas.

5. En modelos discretos, el tiempo entre generaciones Δt se iguala a la unidad.

El modelo de crecimiento densodependiente de partida es el logístico continuo de una

población simple sin estructura:

K

NrN

dt

dN1 (3)

Siendo N(t) la densidad al tiempo t; r la tasa per cápita de crecimiento poblacional

cuando N 0, y K la capacidad de carga o densidad de equilibrio.

La solución de la ecuación (3) es:

rteNKN

KNtN

)()(

00

0 (4)

Siendo N0 = N(0).

El modelo de crecimiento logístico, en su forma discreta, se puede expresar como:

tttt bNrNNN 11 (5)

O bien,

ttt rbNrNN 11 (6)

Donde tN y 1tN son densidades poblacionales a tiempos t y t+1, respectivamente, y

b es una constante definida como un término de retroalimentación densodependiente.

Este modelo es iterativo y el sistema de ecuaciones tiene un arreglo matricial que

representa la estructura de la población en el tiempo (Caswell 2001).

38

Como una aproximación experimental a la tasa de crecimiento instantánea (r), se

determinó la tasa de crecimiento per cápita o de recambio en intervalos de tiempo (t,

t+n) en la fase inicial de crecimiento exponencial, r = ΔN/[N(t)Δt], donde, las tasas

instantánea y media son comparables a densidades bajas (May 1976).

El punto de equilibrio estable (capacidad de carga, KN ˆ ) también se determinó en

forma experimental, a partir del conteo de filamentos en el plateau de la curva de

crecimiento.

El tiempo de duplicación, tg (Begon y col. 1996), es el intervalo temporal en el que la

población inicial ( 0N ) se duplica suponiendo crecimiento exponencial. Esto implica

que N(t) al tiempo tg es dos veces el tamaño inicial de la población (N(t) = 2 0N ). La

definición matemática de tg surge de un despeje e integración de la ecuación

diferencial de crecimiento exponencial:

rNdt

dN

gtN

N

dtrN

dN

0

2 0

0

grtN

N

0

02ln

grt2ln

rt g

2ln (7)

Como se puede observar en la ecuación (7), el tiempo de duplicación es independiente

del tamaño poblacional inicial ( 0N ).

Con el medio escogido como óptimo en el factorial fraccionado 26-1, se reprodujeron

algunos cultivos de A. platensis en botellones de 5 L, y se hicieron conteos de

filamentos clasificados en diferentes tallas (el criterio escogido fue el número de

células por filamento). Las categorías de tallas escogidas fueron: (1) filamentos con

dos células (hormogonios), (2) filamentos con cuatro células y (3) filamentos con más

de cuatro células.

Finalmente, con empleo del mismo medio optimizado, se hizo un análisis de

estabilidad posterior a perturbaciones sobre poblaciones de A. platensis. Dichas

perturbaciones consistieron en extracciones de volúmenes (25, 50 y 75%) en la fase

de saturación o capacidad de carga (K) y dilución con medio optimizado hasta el

enrase del recipiente. Se graficaron las dinámicas de crecimiento hasta el equilibrio.

39

6.2 Ecología de comunidades fitoplanctónicas

Los estudios de comunidades fitoplanctónicas se llevaron a cabo en diversas

localidades del país. Se ubicaron especies nativas de cianobacterias (entre ellas

representantes de los géneros Arthrospira y Spirulina) y eucariotas en ecosistemas

como humedales herbáceos de la península de Paria (Edo. Sucre) y El Clavo

(Barlovento, Edo. Miranda), lagunas de inundación del río Orinoco (Edo. Monagas),

sabanas inundadas todo el año (módulos de Mantecal, Edo. Apure), ambientes

marinos costeros (Bahía de Mochima, Edo. Sucre, y Puerto Cabello, Edo. Carabobo),

lagunas hipersalinas (Las Cumaraguas, Edo. Falcón), algunos sistemas contaminados

con crudos, producto de la explotación petrolera comercial, como la fosa “El Caracol”

(Edo. Anzoátegui), y manaderos naturales de hidrocarburos como la laguna de Boca

Chica en la isla de Margarita, estado Nueva Esparta (Mata García 2003). La figura 6

señala la ubicación geográfica de los sitios visitados.

Figura 6. Ubicación de los sitios de muestreo (el mapa se encuentra en www.guiageo-ameri cas.com/mapas/venezuela.htm).

Salinas de Las Cumaraguas,

Paraguaná Laguna de

Bocachica, Isla de Margarita

Lagunas de inundación, Bajo Orinoco

Humedales de la península de Paria

Humedales de Barlovento

Puerto Cabello

Bahía de Mochima Fosa El Caracol,

Edo. Anzoátegui Módulos de Mantecal

40

Humedales de la península de Paria. La península de Paria está localizada en el

extremo noreste de la región Nororiental de Venezuela, en el estado Sucre, y abarca

un área de 1.078 km² (figura 7a). Limita al norte con el Mar Caribe y al sur con el golfo

de Paria. La Boca Dragón la separa de la Isla de Trinidad en su extremo este.

Geográficamente está localizada entre las coordenadas 10°27’00” N – 10°42’32” N y

62°32’00” W – 63°11’00” W. La geomorfología de la península de Paria es muy

accidentada. Se trata de un sistema montañoso menos macizo que la serranía del

Interior, con relieves poco prominentes, pendientes de 30 a 45% y alturas

relativamente bajas (500 a 1000 m). El sustrato geológico está constituido por rocas

del Cretáceo metamórfico (cuarcitas, esquistos, filitas), y los rasgos más importantes

de la evolución geomorfológica cuaternaria de los depósitos continentales están

influenciados por fenómenos tectónicos. Los suelos son en general poco profundos, de

textura entre franco-arenosa y franco-arcillosa. El clima es tropical húmedo en el norte

caribeño (zona de barlovento) y semi-árido o tropical de sabana en el sur (zona de

sotavento). La precipitación anual media de la península de Paria está comprendida

entre 881,30 y 2348,6 mm, con una clara tendencia de las lluvias a incrementarse en

dirección sur-norte. La temperatura media anual para los primeros 500 m de altura,

gradualmente disminuye de 27,3 a 23,8°C (MARN 1992).

La vegetación natural de la región comprende una variedad importante de formaciones

que notablemente cambian de norte a sur. El norte está dominado por la selva húmeda

tropical y el sur tiene una vegetación de sabana con formas arbóreas características

como el chaparro y el manteco. En las desembocaduras de los ríos que vierten sus

aguas en el Golfo de Paria o el Mar Caribe, existen comunidades de manglares. Hay

diversas zonas húmedas interiores que contienen una vegetación palustrina. El

entorno del área de estudio, es de tipo bosque bajo y denso, con actividad

agropecuaria y levemente intervenido (MARN 1992).

“Palmares III” fue el sitio escogido para el muestreo en los años 2008 y 2009 (Proyecto

Fonacit 2001001850). Es un humedal palustrino, según el sistema de clasificación de

Tabilo-Valdivieso (1999). Sus aguas son someras y semipermanentes y está ubicado

en un terreno bajo o estero. Su localización geográfica precisa es la vertiente sur de la

península, cerca de la población de Los Palmares, con latitud 10°34’58” N, longitud

62°52’10” W y altitud de 30 m.s.n.m. (figura 7b). El área del humedal está cubierta de

vegetación emergente, predominantemente de hábito herbáceo, no siendo evidente la

formación de espejos de agua. Unas pocas especies de fanerógamas forman zonas o

bandas monoespecíficas, aunque también existen algunos sectores con vegetación

mixta, y al sur limita con un sembradío de cocoteros (figura 7c).

41

Figura 7. (a) Mapa de Venezuela donde se destaca a la península de Paria en un recuadro, (b)

ubicación del área de estudio y (c) vista panorámica del humedal “Palmares III” desde una

carretera que lo bordea al norte, la vegetación herbácea cubre la totalidad de su superficie y

forma bandas monoespecíficas, evidenciadas por las tonalidades distintas del color verde, que

cubren toda su superficie sin formar espejos de agua (tomado de Torres y Zoppi de Roa 2010).

42

“Palmares III” tiene un régimen hídrico estacional o semipermanente, producto de una

estacionalidad marcada. Valores medios mensuales que sintetizan 47 años (1953-

2000) de determinaciones del régimen anual de lluvias en las cercanías del humedal,

registradas por la Estación Meteorológica de Irapa, establecen un promedio anual de

precipitaciones de 930,8 mm (MARN 2000). Se define que la estación seca va de

diciembre a marzo, abril es una transición de sequía a lluvia, la estación lluviosa

corresponde al intervalo de mayo a octubre y finalmente noviembre es la transición de

lluvia a sequía (figura 8).

Figura 8. Pluviodiagrama con precipitaciones medias de 47 años (1953-2000) del sur de la península de Paria (datos tomados de la Dirección de Meteorología del MARN 2000).

Las comunidades de plantas que forman zonas monoespecíficas son: (1) gramínea

(Brachiaria mutica (Forssk) Stapt in Pain, Poaceae), (2) leguminosa (Sesbania

exasperata H.B.K., Fabaceae), (3) junco (Cyperus articulatus L., Cyperaceae) y (4)

enea (Typha dominguensis (Pers.) Poir. Ex Steud., Typhaceae).

Humedal de Barlovento. Al este de Caracas, donde finaliza la Cordillera de la Costa,

se inicia la llanura de Barlovento, la cual geopolíticamente es una región del centro de

Venezuela, ubicada en el estado Miranda, que abarca los municipios Acevedo, Andrés

Bello, Brión, Buroz, Páez y Pedro Gual. Esta región se encuentra inserta en la

depresión de Barlovento, siendo una de las regiones naturales que conforman la

denominada región Norte Costera. Se ubica entre los paralelos 10° y 11° latitud norte y

43

los meridianos 65° y 67° longitud oeste. Al norte limita con el mar Caribe; al sur lo hace

con la serranía del Interior y el estado Guárico; al este delimita con la serranía del

Litoral de la cordillera de la Costa, el estado Vargas y otros municipios del estado

Miranda; al oeste culmina en el río Uchire y estado Anzoátegui

(http://es.wikipedia.org/wiki/Barlovento_(Venezuela)).

El área donde se realizó la investigación en 2009 (Ecología de Humedales, materia

electiva del postgrado en Ecología IZET-UCV), se denomina El Clavo, ubicado a 10

msnm, 10°15’34’’ N y 66°7’28’’ O (figura 9). La precipitación total anual es 2484 mm,

con distribución bimodal, con máximos en julio-agosto y noviembre-diciembre y la

mínima entre febrero-marzo, por lo cual la estación seca es corta (MARN 1996). De

acuerdo al sistema de clasificación de Holdridge (Ewel y Madriz 1968, cit. Gordon y

Feo 2007), la zona de vida corresponde a un bosque húmedo tropical. El humedal

herbáceo es inundado por el río Colorado, afluente del río Tuy, y está dominado por

Hymenachne amplexicaulis (Poaceae). En algunos sitios del humedal se encuentran

otras especies como: Montrichardia arborescens (L.) Schott, Mimosa sp., Polygonum

acuminatum Kunth, Ludwigia octovalvis (Jacq.) Raven, Ipomoea sp., Ludwigia

helminthorrhiza (Mart.) Hara, Pistia stratiotes L., Eichhornia crassipes (Mart.) Solms.,

Lemna sp., Salvinia auriculata Aubl., Azolla filiculoides Lam. y Utricularia sp. La textura

de los suelos del humedal es arcillosa (72% arcilla, 22,4% limo y 5,6% arena); el

porcentaje medio de materia orgánica total del suelo es 2,7%, y su pH medio 6,4. La

conductividad del agua varía entre 116 y 294,7 mS/cm, y el pH del agua 6-8 (Feo

2002; cit. Gordon y Feo 2007).

Figura 9. Vista satelital del área de estudio (humedal herbáceo de El Clavo). La línea blanca dibujada en el centro de la imagen señala el transecto levantado en la salida de campo (fuente: http://earth.google.com/).

44

Se muestrearon dos zonas contiguas de vegetación emergente monoespecífica, en un

sentido suroeste–noreste en la parte más estrecha del humedal (ver en la figura 9 la

línea blanca que señala el transecto). Las especies dominantes en cada zona de

vegetación fueron: (1) la hierba arbórea Heliconia marginata (Heliconiaceae), y (2) la

gramínea Hymenachne amplexicaulis. Las figuras 10a y 10b muestran vistas parciales

de las dos zonas de vegetación estudiadas en el humedal herbáceo de El Clavo.

Figura 10. Tomas fotográficas parciales de las dos zonas de vegetación emergente estudiadas: (a) vista de la amplia zona central de Hymenachne amplexicaulis, en primer plano la zona de Heliconia marginata que bordea todo el litoral sur; (b) zona de H. marginata (fotos: Carlos Lugo).

(a)

(b)

45

Lagunas de inundación del Orinoco bajo. El Orinoco es uno de los ríos más

importantes del mundo, no tanto por su longitud y caudal (2.140 km y algo más de

30.000 m³/s), ni por la extensión de su cuenca (989.000 km²); ni siquiera por las

peculiaridades que encierra, sino por su importancia histórica y económica y la

significación que ha tenido para Venezuela, país en el que se extiende la mayor parte

de su cuenca, con casi las dos terceras partes de la misma. Es probablemente el río

más caudaloso del mundo con relación a su cuenca, similar en extensión a la del

Danubio, pero con un caudal que triplica al de este último. En toda la extensión de la

cuenca del Orinoco los climas son isotermos, es decir, climas con escasas variaciones

de temperatura a lo largo del año (la diferencia entre la temperatura media de los

meses más y menos cálidos es de apenas 3°C), como corresponde a la zona

intertropical. Se distinguen de manera bastante nítida cinco grandes tipos de clima en

las zonas bajas (hasta los 800 msnm aproximadamente, según las consideraciones de

Antonio W. Goldbrunner, fundador de los estudios de Meteorología en Venezuela), de

los que destacan el clima de selva (Af en la clasificación de Köppen) y el de sabana

(Aw en la misma clasificación) (http://es.wikipedia.org/wiki/Cuenca_del_Orinoco). El

clima de sabana es el característico de la zona del Orinoco bajo.

La temporada de sequía se extiende de noviembre a abril y la de lluvia se ubica entre

mayo y octubre (Instituto Nacional de Canalizaciones 1999, cit. Rodríguez y

Betancourt 1999). Como sistema de inundación, el río Orinoco presenta en su orilla

bosques sometidos a inundaciones periódicas. Estos bosques crecen cercanos a las

lagunas, y en las áreas de inundación se desarrollan las macrofitas acuáticas (Blanco-

Belmonte 1990). Entre las especies de plantas acuáticas dominantes en estas

lagunas, se encuentran las flotantes libres Eichhornia crassipes (bora) y Paspalum

repens (tapón volador).

La figura 11 muestra el área de estudio a orillas del río Orinoco en la ribera sur del

estado Monagas, en las proximidades del puente Orinokia. Se destacan la ubicación y

una fotografía de la laguna Macapaima, uno de los ambientes estudiados en el periodo

seco del año 2010 (Proyecto PDVSA-IZET Orinokia). Algunos tramos son inundados

en forma directa y constituyen lagunas muy alargadas, paralelas y muy próximas al

curso principal; también se forman brazos y canales que comunican a unas lagunas

con otras. La laguna Macapaima es un sistema que se inunda en forma secundaria por

medio de un canal; estas lagunas suelen tener formas redondeadas y no se ubican

contiguas al río Orinoco, sino que más bien algo apartadas tierra adentro. En época de

sequía, estas lagunas redondas suelen quedar aisladas porque bajan los niveles tanto

del curso principal como de los canales.

46

Figura 11. Ubicación geográfica del área de estudio al sur de Monagas (Orinoco bajo), con detalle de la localización en el mapa y fotografía panorámica de Macapaima, uno de los cuerpos de agua visitados (foto: Rubén Torres).

Módulos inundables de Mantecal. Los módulos de Mantecal son un caso especial de

manejo agroecológico. En ellos, la regulación del caudal de agua se efectúa mediante

la construcción de diques-carreteras en las sabanas inundables de los Llanos bajos de

Venezuela (Cressa y col. 1993). Estos diques tienen una extensión de 3.600 ha con

una capacidad de 40 x 106 m3 (Schargel y González 1973, cit. Cressa y col. 1993).

Los módulos se encuentran en el centro-norte del estado Apure, próximos a Mantecal

y al curso del río Apure. Mantecal es una población satélite de la pequeña ciudad de

Bruzual, capital del Municipio Muñoz, jurisdicción a la cual el pueblo pertenece

(http://es.wikipedia.org/wiki/Mantecal). El estudio en el ecosistema artificial de los

módulos se llevó a cabo en las postrimerías del periodo lluvioso, transición hacia la

sequía, en noviembre de 2010 (Proyecto Mantecal, IZET).

En casi todo el territorio apureño prevalece una vegetación de sabana, con amplio

dominio del componente herbáceo, entre este último se incluyen abundantes

pastizales que alimentan a numerosas reses de ganado vacuno y bufalino de la zona.

También existen matorrales y arbustos, frecuentemente acompañados de enormes

palmas que agrupadas forman los paisajes de morichales y palmares comunes a todo

47

el llano. Posee también secciones intercaladas de selvas, llamadas "de galería", y en

menor grado, zonas de bosque tropical lluvioso y húmedo montano en las

estribaciones de los Andes. En esteros y márgenes de ríos prolifera la vegetación

acuática (http://es.wikipedia.org/wiki/Apure).

Fosas petroleras. Dentro del marco de estudios de ambientes acuáticos

continentales, se determinó la realización de muestreos de plancton en fosas

petroleras, que son ambientes residuales altamente contaminados derivado de su

empleo como sumideros de desechos de la actividad petrolera comercial. Interesan

además estos ambientes contaminados, por el hallazgo de especies fitoplanctónicas

que suponen ser un gran potencial para la biotecnología petrolera, en procura de la

derivación de biocombustibles (biodiesel).

Muestras compuestas de suelo arenoso, materia vegetal, hidrocarburo y agua, fueron

colectadas de la macro-fosa Caracol en la región de Caico Seco, ubicada en el

municipio Aragua del estado Anzoátegui, en el año 2009. Esta fosa fue escogida por

representar un área de exposición histórica a hidrocarburos que operó durante muchos

años como una de las principales y más grandes recolectoras de desechos petrolíferos

de la zona. La figura 12 muestra un acercamiento a la zona de descarga.

Figura 12. Imagen correspondiente a un sector de la orilla de la fosa El Caracol, (Municipio Aragua, Edo. Anzoátegui, 2009), donde se pueden apreciar los desechos petroleros que conforma parte del fondo de la misma (Foto: Olaf Ilzins, IDEA).

48

Igualmente se colectaron muestras de un pozo (P57X) ubicado al norte del estado

Bolívar, 2009. Las muestras provienen en forma específica de una pequeña charca

fangosa en la parte exterior del pozo mencionado, enmarcada en un lugar donde se

encuentra petróleo, ripios y sedimentos de perforación.

Laguna de Boca Chica. Se trata de una laguna costera hipersalina ubicada en la

proximidad de Punta Arenas, en el extremo suroccidental de la península de Macanao,

isla de Margarita, Edo. Nueva Esparta (figura 13). Se trata de un ambiente extremo

donde se han reportado emanaciones naturales de crudos. El sitio fue visitado en julio

de 2009 para obtener algunas muestras fitoplanctónicas.

Figura 13. Ubicación de la laguna de Boca Chica (círculo azul) en la península de Macanao, isla de Margarita, estado Nueva Esparta (mapa: http://www.disfrutevenezuela.com/Municipio-Peninsula-de-Macanao-Mapa.html).

Mata García (2003) cita en forma textual: “En lo que respecta a Margarita, en un

artículo del año 1919, Charles Caracristi afirmó haber descubierto un mene en Punta

Arenas (Península de Macanao). Aguerrevere (1936), expresa en el mismo orden de

ideas: “... en la región occidental de Margarita, cerca de la Laguna de Bocachica, hay

unas pequeñas manifestaciones de petróleo (...), no quiere esto decir que se haya

comprobado definitivamente que no hay depósitos de valor comercial en ese lugar”.

Lorenz (1951, cit. Mata García 2003), ofreció una explicación de las potencialidades

petrolíferas de Margarita: “La isla de Margarita propiamente ofrece pocas condiciones

favorables para la existencia de yacimientos petrolíferos, en vista de que: 1) el

49

cretácico, por su carácter metamórfico, cabe descartarlo como roca madre; 2) los

sedimentos terciarios no poseen espesores halagadores; 3) estructuras favorables son

inestables o están parcialmente erosionadas”.

Bahía de Mochima. Esta bahía profunda y semi-cerrada, de gran belleza paisajística,

forma parte del Parque Nacional Mochima, Edo. Sucre, en los límites con el Edo.

Anzoátegui, a orillas del mar Caribe. El Parque Nacional Mochima se encuentra

altitudinalmente ubicado desde 0 hasta 600 msnm, al noreste de Venezuela, entre las

ciudades de Barcelona, Puerto la Cruz y Cumaná, y se extiende a lo largo de la costa

en un área de 94.935 ha (http://www.mochima.org/).

El clima del Parque Nacional Mochima es semiárido. En la costa las temperaturas

oscilan entre 22 y 28°C, y existen dos periodos contrastantes: (1) una época seca que

se extiende de enero a mayo, con una media de lluvias de 3,5 mm/mes y (2) una

época lluviosa entre junio y diciembre, con una media de lluvias de 60-70 mm/mes. En

el parque existe una variada vegetación en donde predominan cactus, arbustos,

helechos y orquídeas, encontrándose árboles de mayor tamaño en la zona más alta

del parque. Parte de la flora la conforman los mangles y la hierba de vidrio (Salicornia

fruticosa, Sesuvium portulacastrum y Batis marítima). Se pueden conseguir cactáceas

como el guamacho y leguminosas como el cují y el dividive (http://www.mochima.org/).

En la población de Mochima, ubicada al sur de la bahía, se encuentra la Estación

Biológica Mochima (Sucre), que es una dependencia de la Fundación Instituto de

Estudios Avanzados (IDEA). El proyecto de microalgas (Proyecto BID-Fonacit

2006000537), cuya acometida impulsó la Asociación Civil Gente de Ciencias, está

embebido en un megaproyecto (Hidrocarburos Verdes) de esta institución

gubernamental. Por tal motivo, se procedió a la toma de muestras fitoplanctónicas y

zooplanctónicas en esa localidad marina costera, en agosto de 2009, con el interés

especial de colectar especies de microalgas marinas de gran potencial para la

obtención de biocombustibles.

Salinas de Las Cumaraguas. Las Cumaraguas es un sitio natural de salinas,

ubicadas al noreste de la península de Paraguaná, específicamente en el Municipio

Falcón. Su acceso es por vía terrestre. Presentan un espectáculo digno de ver en

horas del atardecer, cuando el tanino que contienen las aguas que irrigan ese sector,

les torna el color a rojizo. El estado Falcón cuenta con grandes potencialidades para el

desarrollo de la industria salinera. Existen cinco (05) salinas naturales y unas 220.000

ha de superficie aptas para la construcción de salinas artificiales repartidas a lo largo

del territorio falconiano. De las salinas del estado, sólo Las Cumaraguas se encuentra

50

bajo explotación industrial y privada, siendo el resto de las salinas explotadas de

manera artesanal (http://www.tuplaya.com/paginasfalcon/salinas/lascumaraguas.htm).

Las coordenadas astronómicas de las salinas de Las Cumaraguas son 12°06’ N y

69°54’ W (Guevara y col. 2005).

Ambientes hipersalinos como Las Cumaraguas y Boca Chica, ambos con condiciones

semi-áridas y precipitaciones escasas, son propicios para el desarrollo de especies

extremófilas que toleran grandes concentraciones de NaCl, como especies del género

Dunaliella (Chlorophyta), las cuales constituyen las fuentes vivientes más ricas en

carotenoides, contando hasta 14% de su masa seca (Guevara y col. 2005), lo que se

traduce en grandes posibilidades para su empleo en biotecnología alimentaria,

farmacéutica y pigmentos. Es por esto que en octubre de 2010, en el marco del

proyecto de microalgas para la exploración de especies nativas de gran valor

biotecnológico, se visitaron las salinas de Las Cumaraguas para obtener muestras de

agua con grandes densidades poblacionales de Dunaliella spp., para apuntar al inicio

de su cultivo en condiciones controladas de laboratorio y optimizar el medio nutritivo.

Puerto Cabello. El muelle de Puerto Cabello está localizado en la ciudad del mismo

nombre, norte del estado Carabobo, región Central de Venezuela, a orillas del mar

Caribe. Se trata de un ambiente marino costero muy perturbado por actividades

antrópicas relacionadas con dinámicas de las faenas portuarias, refineras y el vertido

de efluentes domésticos. La ciudad de Puerto Cabello tiene una población aproximada

de 203.633 habitantes y su puerto es el segundo en importancia para el país, debido a

su gran actividad de importación de materias primas para el sector industrial

venezolano, que normalmente se trasladan hacia Valencia, la capital del estado

Carabobo, y otras regiones del país. El Palito está a la entrada de Puerto Cabello, una

de las refinerías de petróleo más importantes del país. La ciudad también posee

relevancia en el área comercial y turística, pero su actividad por tradición ha sido la

portuaria (http://www.ipapc.gov.ve/).

La temperatura oscila entre 23 y 30°C, con una media anual de 27°C. El clima es

semiárido en la franja litoral con una precipitación anual de 463 mm. En tierra

predomina la vegetación xerófila, y en ambientes estuarinos y marinos costeros se

extiende el bosque de manglar, con el mangle rojo (Rhizophora mangle) como la

especie dominante (http://es.wikipedia.org/wiki/Puerto_Cabello). Se muestrearon

diversos punto en el muelle, en enero de 2011, en procura de evaluar la composición

fitoplanctónica y zooplanctónica del lugar y caracterizar su estado ambiental.

51

El trabajo de campo se ejecutó como se describe a continuación:

Se hicieron muestreos en ambientes parcelados, como humedales herbáceos y

litorales con vegetación, por el modelo de muestreo estratificado sin afijación (número

homogéneo de muestras), que sirvió de muestreo piloto para trabajos posteriores en

los mismos sitios con muestreo por conglomerados con afijación óptima, es decir,

mayor número de muestras se tomaron en lugares con varianzas altas y menor

número en zonas con varianzas bajas (Azorín 1970, Scheaffer y col. 1987). En cada

estrato se tomaron al azar cinco muestras de fitoplancton, para ello se levantaron

parcelas de 2 × 2 m y se escogieron pares ordenados con una tabla de números

aleatorios. Las muestras se colectaron con una botella de captación LaMotte de 1 L,

en forma sistemática desde el borde hasta el centro de la parcela, de este modo sólo

se perturbaron los puntos muestreados, sin alterar el resto. Las muestras de

fitoplancton se fijaron in situ con solución de lugol.

En aguas abiertas (espejos de agua y ambientes marinos costeros), el fitoplancton se

colectó en forma diferente. Tres puntos a lo largo de un transecto, con aleatorización

del tiempo en minutos para la escogencia del primer punto, permitieron tomar dos

muestras puntuales de fitoplancton en cada sitio con una botella LaMotte de 1 L.

Posteriormente, en forma continua se tomaron muestras muy grandes por medio de

dos arrastres horizontales de 5 min con red (øporo = 105 μm) realizados desde una

pequeña embarcación con motor fuera de borda a una velocidad de 2 nudos2. El

sistema de captura por botella permitió la retención de fitoplancton pequeño

(nanoplancton), pues constituye un tipo de trampa hermética que captura la muestra

con el agua, mientras que la red tomó en forma selectiva microalgas de mayor tamaño.

Como complemento al estudio comunitario, en los mismos ambientes se tomaron

algunas muestras de zooplancton, para conocer la microbiota animal asociada al

fitoplancton. Se tomaron dos muestras con botella LaMotte de 1 L en humedales

herbáceos y ambientes litorales, y dos barridos con red (øporo = 105 μm) en ambientes

abiertos (lagunas de inundación y ambientes marinos costeros). Las muestras se

fijaron in situ con solución de formalina al 10% V/V.

Finalmente, se midieron in situ algunas variables ambientales (pH, conductividad,

salinidad, O2 disuelto y temperatura) con un medidor digital HORIBA U-10, bajo la

2 1 nudo = 1 milla náutica por hora = 0,5144 metros por segundo (SI). Esta definición se basa en el acuerdo internacional sobre la longitud de la milla náutica, adoptado por EE. UU. (que utilizaba previamente una longitud de 1.852,249 m) y el Reino Unido (que utilizaba previamente una longitud de 1.853,184 m), entre otros países (http://es.wikipedia.org/wiki/Nudo_(unidad)).

52

lámina de agua. La radiación solar se determinó como luminancia (densidad de

fotones) con un luxímetro LUTRON-LX y la profundidad con una vara graduada.

Laboratorio. Una vez trasladadas las muestras, éstas se limpiaron y procesaron para

identificar las especies y determinar sus abundancias (conteos en cámara Bogorov

bajo estereoscopio o en cámara Utermöhl bajo microscopio invertido). Las especies

fitoplanctónicas se identificaron con ayuda de claves e ilustraciones: Ortega (1984),

Varela y col. (1986) y Matto y Parra (1995). Para el zooplancton la taxonomía se hizo a

partir de los trabajos de Edmonson (1959), Elster y Ohle (1978), Infante (1980),

Dussart (1984), Reid (1984), Zoppi de Roa y Vásquez (1991), Zoppi de Roa (1993),

Velho y Lansac-Tôha (1996) y Velho y col. (1996).

Para algunas muestras de agua tomadas en un humedal de Barlovento, se hicieron

algunos análisis de nutrientes, principalmente nitrógeno (método de Kjeldahl (1883)) y

fósforo (método de Murphy-Riley (1962)). Las muestras de agua se fijaron en campo

con ácido sulfúrico. De seis puntos muestreados en la zona de H. marginata, las

muestras tomadas en los puntos 1, 2 y 3 estaban muy próximas, por lo que fueron

unidas y se obtuvo una muestra combinada, lo que permitió tener una muestra más

representativa. Los métodos químicos están representados en las figuras 14 y 15.

Para muestras de Paria, algunos nutrientes se determinaron por absorción atómica.

Figura 14. Marcha analítica simplificada para la determinación de nitrógeno en muestras de agua con el método Kjeldahl (1883) (continúa en la página siguiente).

Filtración de la muestra

Muestra de campo fijada con ácido sulfúrico

Destrucción de la materia orgánica con ácido sulfúrico concentrado

Equipo de destilación Kjeldahl

53

Figura 14. Continuación (Fotos de equipo Kjeldahl y sucedáneas tomadas de una presentación digital del curso de Ecología de Humedales, Postgrado en Ecología, IZET, 2009).

Figura 15. Marcha analítica simplificada para la determinación del fósforo por el método colorimétrico de Murphy – Riley (1962). Las dos imágenes inferiores fueron tomadas de una presentación digital del curso de Ecología de Humedales, Postgrado en Ecología, IZET, 2009.

Destrucción de la materia orgánica con ácido sulfúrico concentrado

Muestra de campo fijada con ácido sulfúrico

Filtración de la muestra

Medición y curva de calibración

54

Índices de diversidad. Para el análisis comunitario se cumplieron las pautas

siguientes:

1. Los cómputos del fitoplancton quedaron expresados según el nivel de organización

o forma de vida en células, colonias y filamentos por litro, para el caso de muestras

obtenidas con botella de captación, o en células, colonias y filamentos por metro

cúbico para el caso de muestras tomadas con red. En forma análoga para el

zooplancton, los organismos totales quedaron expresados en individuos por litro

(Ind./L) o individuos por metro cúbico (Ind./m3), según que el método de captura

haya sido por empleo de botella de captación o red, respectivamente. Para la

extrapolación al volumen de arrastre o barrido con red, V, se calculó la distancia, d,

recorrida en bote a partir del tiempo recorrido y la velocidad de la embarcación, la

cual fue aproximadamente constante, resultando un movimiento rectilíneo

uniforme. Esta distancia se multiplicó por el área de la boca de la red, A, que es

circular (A = πr2), obteniéndose el volumen, V, de un cilindro, V = dπr

2.

2. La riqueza (S) y la equidad ( 'J ) (Pielou 1975) son dos parámetros comunitarios de

relevancia para caracterizar la diversidad, por lo que fueron calculados. La riqueza

es la sumatoria de las especies presentes en la comunidad y es el índice de

diversidad más sencillo que se conoce. Por su parte, la ecuación que describe a la

equidad es la siguiente:

SHHHJ /ln'=/'=' max (8)

Donde 'H es el índice de diversidad de Shannon-Wiener (Shannon y Weaver 1949) y

SH ln=max es la diversidad máxima. El uso del índice de Shannon-Wiener se basa en

suponer que los individuos se muestrean al azar en una población infinita y que todas

las especies están representadas en la muestra. Este índice se define

matemáticamente como:

i

S

i

i ppH ln-='1=

∑ (9)

Siendo pi la fracción de abundancia de la especie i.

3. Se empleó el índice de Simpson, D (Simpson 1949), el cual es un índice de

dominancia y representa la probabilidad de que dos individuos obtenidos al azar de

55

una muestra pertenezcan a la misma especie. Por lo tanto, valores mayores

indican menor diversidad. Su representación matemática es:

S

i

ii

NN

nnD

1= 1

1= (10)

El cual normalmente es calculado como:

S

i

ipD1=

2= (11)

Cuando se utiliza el recíproco de este índice (1/D), los valores son interpretados como

el número de especies esperado de una muestra con una determinada distribución de

individuos en especies. El valor 1/D aumenta cuando la muestra es más equitativa, por

lo cual 1/D tiene un significado biológico más claro que el índice original.

Otro índice de dominancia empleado es el de Berger-Parker (1970):

N

Nd máx= (12)

Donde:

máxN = número total de individuos de la especie más abundante

N = número total de individuos en la comunidad

Se determinó el índice de similitud o distancia Jaccard (1901), el cual es definido como

la razón entre el tamaño de la intersección y el tamaño de la unión de dos conjuntos

de muestras, por lo que Del Pino y col. (2006) lo clasifican como un índice de

diversidad beta (β), donde se considera la tasa o grado de cambio en la composición

de especies entre diferentes comunidades en un paisaje.

El programa ejecutable libre PAST se utilizó para la determinación de los índices

anteriormente descritos.

Análisis de Datos. El manejo de la información obtenida se hizo con un Análisis de

Datos (Andrienko y Andrienko 2006), que describe el patrón de distribución espacial y

temporal de las especies asociadas a diferentes ambientes. El análisis de datos se

llevó a cabo en tres fases:

1. Descriptiva (análisis de homogeneidad, asimetría y curtosis de las variables,

evaluación de valores extremos). Se establecieron estadísticos robustos para

56

variables con notables asimetrías y valores extremos. Se eliminaron del análisis

especies zooplanctónicas con desviaciones estándares menores a 0,4 Ind./L (Peña

y Rodríguez 2003).

2. Análisis de Componentes Principales (ACP) iterativo para escoger las variables

estadísticamente importantes representadas en gráficos biplot tridimensionales

(Fluir 1988). En este análisis se utilizaron las densidades poblacionales de las

especies fitoplanctónicas (células, colonias y filamentos por litro) y zooplanctónicas

(Ind./L) como variables dependientes aleatorias. Con esta metodología se

seleccionaron las especies que se consideraron más importantes desde el punto

de vista estadístico y que posteriormente se emplearon en el Análisis de

Agrupamiento.

3. Análisis de Agrupamiento o “Cluster Analysis” (Anderberg 1973), con empleo de la

Distancia Euclídea como medida de disimilitud, el método de Ward’s como método

de agrupamiento y las variables dependientes aleatorias escogidas con el ACP:

densidades poblacionales de las especies zooplanctónicas (Ind./L). Se calcularon

los centroides para establecer las especies con mayor ponderación. Un Análisis

Multivariado de Varianza (acrónimo en inglés MANOVA) se utilizó para establecer

diferencias significativas entre grupos (α = 0,05).

Los análisis descriptivos multivariados se realizaron en el software MVSP 3.0. Los

programas JMP versión 3.2.1 (1997) y SPAD versión 3.0 (1999) sirvieron para hacer

Análisis de Datos en general, y MINITAB release 13.20 (2000) fue otra herramienta útil

para evaluar la fase descriptiva.

57

7. Resultados

7.1 Cultivos

Los medios de cultivo empleados para las especies del cepario y la cámara de

crecimiento están listados en la Tabla 5 con sus respectivas fuentes bibliográficas. Es

importante acotar que las temperaturas del cepario (cámara fría sin sistema de

agitación) y la cámara de crecimiento (cámara cálida con sistema de agitación

continua), 24 y 27°C, respectivamente, se mantuvieron constantes a lo largo del

periodo de incubación, pues se trata de un ambiente controlado. Como se puede

observar, el medio algal (Fábregas y col. 1985) fue el de más amplio uso en el

laboratorio, puesto que resultó adaptable a los requerimientos de una gran variedad de

especies de microalgas provenientes de distintos ambientes (dulceacuícola, marino y

salinas). El medio Spirulina (Schlösser 1994) con las modificaciones introducidas por

Parra (2005) funcionó muy bien para todas las cepas de Arthrospira spp. cultivadas en

la Cámara de Crecimiento, y se pudieron escalar en esa misma preparación de placas

y tubos con cuñas a medio líquido en tubos y posteriormente a fiolas.

Tabla 5. Medios de cultivos preparados en laboratorio para crecimiento de poblaciones de microalgas y modalidades de preparación y recipientes.

Medio de cultivo Especie Cepa

Placas/cuñas

(medio sólido

en cápsulas y

tubos)

Tubos

(medio

líquido)

Fiolas (medio

líquido)

Spirulina (Schlösser

1994, modificación

del Aiba y Ogawa

1971) + modificación de Parra (2005)

Arthrospira máxima Cubana X X X

Arthrospira platensis Cubana X X X

Arthrospira platensis Lefevre X X X

Spirulina + agua de

mar (50:50) (Morales, comunicación

personal) y F/2

(Guillard 1975)

Spirulina subsalsa C4 X X

Chu-13 (Dayananda y

col. 2007) Botryococcus braunii

UTEX-

572 X X X

F/2 (Guillard 1975)

Nannochloropsis sp. MAD1 X X X

Tetraselmis sp. TE X X X

Isochrysis galbana Nueva

Esparta X X

Medio Algal

(Fábregas y col. 1985) Chlamydomonas sp. – X X

58

Tabla 5. Continuación.

Medio de cultivo Especie Cepa

Placas/cuñas

(medio sólido

en cápsulas y

tubos)

Tubos

(medio

líquido)

Fiolas (medio

líquido)

Medio Algal

(Fábregas y col. 1985)

Chlorella vulgaris – X X

Scenedesmus sp. – X X X

Medio Algal con

adición de silicatos Chaetoceros sp. – X

Medio Algal con

adición de agua de

mar

Porphyridium

cruentum C1 X X

Rhodosorus marinus C2 X X

Tetraselmis sp. TE X X

Medio Algal con

adición de solución

saturada de NaCl

(grado alimenticio)

Dunaliella salina – X X

Dunaliella viridis – X

Dunaliella

primolecta DPN X

Serpa y Calderón

(2006)

Dunaliella salina – X X

Dunaliella viridis – X

Dunaliella

primolecta DPN X

Bristol (Bold 1949) Haematococcus

pluvialis HPOC8 X

Una evaluación microscópica de las diferentes cepas, cultivadas en la cámara fría sin

agitación y la cámara cálida o de crecimiento rápido con agitación, pudo comprobar

que los cultivos estaban en buen estado (monoalgales y poco detrito), donde las cepas

cubanas de A. platensis y A. maxima mostraron filamentos helicoidales, si bien en

poblaciones de la segunda se evidenciaron algunos filamentos lineales. Por su parte,

la cepa Lefevre de A. platensis se caracterizó por mostrar una población integrada en

forma absoluta por filamentos lineales en todas las “réplicas” ubicadas en la Cámara

de Crecimiento. La figura 16 muestra un conjunto de fotografías tomadas con una

cámara digital PAX-CAM acoplada al microscopio invertido y al computador, lo que

permitió visualizar los filamentos con alta resolución y detectar el estado de pureza de

los cultivos. Durante todo el periodo de mantenimiento, las observaciones al

microscopio no detectaron invasiones de otras especies de microalgas.

59

Figura 16. Algunas imágenes tomadas bajo microscopio invertido de las poblaciones de las diferentes cepas de Arthrospira spp. en la Cámara de Crecimiento (LOA-IZET).

60

Fig. 16. Continuación.

La cianobacteria Spirulina subsalsa se cultivó en medio Spirulina + agua de mar

(50:50), puesto que la cepa existente en la colección proviene de un ecosistema

estuarino. Los cultivos fueron viables y las poblaciones crecieron de modo rápido. Sin

embargo, una observación que se hizo recurrente en estos cultivos, es que una vez

que las poblaciones eran grandes, se iniciaba la formación de grandes colonias de

filamentos muy adosados entre sí (grandes flóculos), y que además segregaban una

sustancia mucilaginosa abundante y viscosa que envolvía a las colonias y, al cabo de

pocos días, dicha sustancia mezclada con sal precipitada del medio se endurecía y

conformaba una especie de cascarón. La consecuencia de esto es que las colonias de

filamentos se fijaban a las paredes del recipiente, y no podían ser desprendidas, aún

con la agitación constante del aire presurizado enviado del blower. Como fórmula

alternativa, S. subsalsa fue cultivada en medio F/2. Esta modificación de medio derivó

en un resultado positivo consistente en la no formación de las capas cementantes

evidenciadas en el medio Spirulina + agua de mar (50:50), pero en contraposición a

ello las poblaciones no incrementaron su tamaño en la forma que lo hacían en el

medio anterior, las mismas se mantuvieron en flóculos pequeños y dispersos con una

coloración verde menos intensa que el caso citado.

61

Otras especies de la colección. En términos generales, los medios funcionaron,

salvo el medio Algal para Dunaliella primolecta y el medio Serpa y Calderón (2006)

para todas las especies del género Dunaliella, puesto que las cepas no pudieron

adecuarse a los mismos bajo las condiciones de la Cámara de Crecimiento. Algunas

de las fiolas con cultivos de D. salina y D. viridis en medio Algal exhibieron

crecimientos poblacionales notables, dada la coloración verde que adquirieron y no

incolora como en D. primolecta. Algunas de las cepas que han crecido exitosamente

en fiolas de 250 mL se trasladaron a fiolas de 2000 mL, y han podido replicarse. No

obstante, dos cultivos en fiolas de 250 mL de D. viridis en buen estado de crecimiento

al ser unidas y llevadas a una fiola de 2000 mL con medio nuevo no pudieron

adecuarse y permanecieron en estado de latencia.

Una especie que ha crecido muy bien en fiolas pequeñas y se ha trasvasado a fiolas

grandes es la clorofita dulceacuícola Haematococcus pluvialis. Esta microalga ha

permanecido en una fase de crecimiento rápido con poblaciones sanas y libres de

contaminación por otras especies de microalgas. El color que siempre se ha

observado en los cultivos de esta especie es un verde oliva, el cual es típico de una

población con una estructura de células jóvenes, y no la coloración roja púrpura

predominante en una población de células maduras en condiciones de estrés.

Los cultivos de las especies Botryococcus braunii, Nannochloropsis sp. y Tetraselmis

sp., especies de particular interés en la producción de biocombustibles, se

mantuvieron en muy buen estado. La primera especie creció bien en medio Chu-13

(Dayananda y col. 2007) y las otras dos hicieron lo propio en el medio F/2 (Guillard

1975). Las tres especies pudieron ser escaladas a fiolas de 2000 mL en la cámara

cálida, y el crecimiento poblacional fue óptimo. Como observación curiosa, uno de los

cultivos de B. braunii en fiolas sedimentó, las células formaron grandes colonias y al

parecer produjeron una sustancia cementante que las adhirió al fondo y paredes del

recipiente de vidrio, a pesar de que el sistema de la cámara cálida contó con agitación

fuerte por medio de aireación presurizada. La figura 17 muestra una serie de

fotografías donde se evidencia la condición monoalgal de los cultivos de estas

especies, y sólo algunos animales (rotíferos) y protozoarios (ciliados) han sido

observados.

Finalmente, como se presentó en la Tabla 5, algunas especies cultivadas, como

Chlamydomonas sp., Chlorella vulgaris y Chaetoceros sp., no pudieron ser escaladas

a fiolas, bien sea porque sus tamaños poblacionales eran pequeños y permanecieron

en tubos de ensayo dentro de la cámara fría, o algunas fueron trasvasadas y no

pudieron crecer a mayores volúmenes (efecto de dilución).

62

Figura 17. Algunos cultivos de microalgas de interés biotecnológico presentes en la Cámara de Crecimiento (LOA, IZET).

63

Figura 17. Continuación.

64

Figura 17. Continuación.

65

7.2 Ensayos con poblaciones cultivadas de Arthrospira platensis

Los ensayos con poblaciones de Arthrospira platensis tuvieron como punto de partida

un ensayo factorial 22 preliminar en dos bloques (cilindros y fiolas). Se prepararon

cuatro medios combinados: medio Spirulina (Schlösser 1994) con modificaciones de

Parra (2005), renombrado en este ensayo como medio Parra (– +), medio estándar

original de Aiba y Ogawa (1977) (+ –), medio máximo (+ +) y medio mínimo (– –). La

Tabla 6 muestra las concentraciones milimolares de los macronutrientes en las cuatro

combinaciones resultantes, con atención en los niveles de dos cationes alcalinos (Na+

y K+), cuyas concentraciones fueron modificadas de tal manera que no se afectaran

las concentraciones del resto de los iones. El ion cloruro (Cl-) por estar estrechamente

relacionado con el ion sodio (Na+), incrementó su concentración milimolar con gran

notoriedad en los medios donde el nivel de sodio fue máximo (+). En este primer

ensayo la relación milimolar Na+:K+ no es 4:1 para el medio – + ó Parra.

Tabla 6. Concentraciones milimolares (mM) de los macronutrientes totales (representados como elementos, a excepción del carbono que se representa en las formas de los aniones carbonato y bicarbonato) y relaciones milimolares sodio/potasio en los cuatro medios minerales comparados en el diseño factorial 2

2. En rojo se destacan las concentraciones milimolares de

Na+ y K

+, y en azul las de Cl

-, anión directamente involucrado con el Na

+.

Macronutrientes

totales – + + – + + – –

N 4,63 4,85 4,72 4,63

P 0,77 0,51 0,77 0,77

K 2,31 3,86 9,19 2,31

Mg 0,08 0,08 0,08 0,08

Ca 0,04 0,07 0,07 0,04

S 0,11 1,17 0,20 0,11

Na 60,66 75,21 80,89 60,66

Cl 0,85 10,51 43,55 0,85 2

3CO 21,83 21,83 15,71 21,83

3HCO 110,23 117,67 103,97 110,23

Na+/K

+ 26,2 19,5 8,8 26,2

Las figuras 18a y 18b muestran las curvas de crecimiento poblacional de A. platensis

en los cuatro medios de cultivo y dos tipos de cultivadores, fiolas y cilindros,

respectivamente. Las curvas de crecimiento muestran que el medio Aiba y Ogawa

propició mayor incremento poblacional de A. platensis en cilindros a los 20 días de

incubación, tiempo en el cual se detuvo el experimento. En fiolas, las cinéticas en los

medios Aiba – Ogawa y Parra tuvieron gran similitud. Para ambos tipos de recipientes,

66

el medio + + sucedió a los anteriores. Puede observarse que el medio – – se

caracterizó por presentar un período de latencia y adecuación muy prolongado, hasta

que la población empezó a crecer abruptamente a partir del día 15. No obstante, entre

este tratamiento y los demás no hubo diferencias significativas (α = 0,05).

Figura 18. Curvas de crecimiento poblacional de Arthrospira platensis en (a) fiolas y (b) cilindros. La densidad poblacional está expresada en términos de absorbancia a 680 nm.

La figura 19 presenta una comparación gráfica de la producción de biomasa seca en

los cuatro medios propuestos para el ensayo factorial. Como se puede evidenciar el

medio Aiba y Ogawa una vez más resultó ser el más productivo en cilindros y fiolas. El

medio Parra tuvo en fiolas una producción de biomasa que casi iguala a la del Aiba y

Ogawa, pero comparativamente baja en cilindros. El medio + + tuvo una producción

similar en ambos tipos de recipientes, y la cosecha del medio – – tuvo una producción

muy baja en los dos envases, siendo ligeramente superior en cilindro. En este ensayo

se apreció que hubo diferencias significativas entre fiolas y cilindros para los

tratamientos – – y Parra, así como entre el medio – – y los medios restantes para

ambos recipientes. La dispersión de datos (desviaciones estándares) fue pequeña.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

T iempo (días )

A6

80

Aiba y Ogawa Máximo (+ +)Mínimo (– –) Parra

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920

A6

80

(a)

(b)

67

Figura 19. Producción de biomasa seca en fiolas y cilindros de 2 L para cada medio mineral. La biomasa está expresada en gramos por dos litros. Intervalos de confianza: media desviación estándar.

Los valores de pH de los cuatro medios ensayados caracterizaron el ambiente químico

donde crecieron los filamentos de A. platensis durante el periodo de incubación. Los

medios Aiba y Ogawa, Parra y + + exhibieron un gran paralelismo a lo largo de los

días del ensayo con una tendencia hacia el incremento. En contraste, el medio – –

mostró una tendencia inversa, al iniciar con un pH más alto que los otros tres medios y

después decrecer, hasta que en los últimos 5 días experimentó un nuevo aumento, el

cual coincidió con el comienzo del crecimiento rápido de A. platensis en ese medio,

luego de una latencia y adecuación prolongadas. Durante el lapso en el que el pH bajó

para el medio mínimo, aparentemente desfavorable para A. platensis, prosperó otra

especie de cianobacteria oportunista, Microcystis aeruginosa, la cual desapareció del

medio una vez el pH volvió a subir y A. platensis volvió a dominar (figura 20).

Figura 20. Valores comparativos de pH mostrados por los diferentes medios de cultivo. En la figura se señala con un óvalo rojo el lapso de disminución de pH del medio – – y la contaminación del mismo por la cianobacteria Microcystis aeruginosa.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

Mínimo (– –) Máximo (+ +) Parra Aiba y Ogawa

Bio

ma

sa (

g/2

L)

Fiola Cilindro

8,60

8,80

9,00

9,20

9,40

9,60

9,80

10,00

10,20

10,40

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Tiempo (días)

pH

Mínimo (– –) Máximo (+ +) Parra Aiba y Ogawa

Contaminación del medio por Microcystis aeruginosa

68

La conductividad eléctrica se mantuvo constante en todos los medios a lo largo del

periodo de incubación, y resultó similar para los medios Parra y Aiba - Ogawa,

mientras que para el medio máximo (+ +), los valores de conductividad resultaron

ligeramente mayores por su condición de medio enriquecido. Por su parte, el medio

mínimo (– –) tuvo valores muy inferiores y paralelos a los registrados para los medios

anteriores (figura 21).

Figura 21. Valores comparativos de conductividad (S/cm) mostrados por los diferentes medios de cultivo.

En la figura 22 se observa la relación entre la absorbancia de la masa celular y el peso

seco de la misma. La curva muestra una tendencia lineal que fue evaluada con una

regresión lineal simple, con un coeficiente de regresión R2 = 0,9935, que evidencia una

correlación fuerte. Se calculó el peso seco de la masa celular presente en 1000 ml de

cultivo, en base a la linealidad de la fase de crecimiento rápido, con la obtención del

valor medio de 586 mg (0,586 g/L) de masa seca de A. platensis en ese volumen.

Figura 22. Curva de calibración A680 vs. Peso seco (mg). Las variables tienen una relación lineal (R

2 = 0,9935).

y = 0,0011x + 0,0578 R² = 0,9935

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

0 200 400 600 800 1000 1200

Ab

so

rban

cia

(λ =

680 n

m)

Peso seco (mg)

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Tiempo (días)

Co

nd

. (S

/cm

)

Mínimo (– –) Máximo (+ +) Parra Aiba y Ogawa

69

El experimento factorial 22 se replicó en un nuevo conjunto de fiolas, donde hubo un

reajuste de las concentraciones de los medios nutritivos del ensayo anterior (Tabla 7).

En este nuevo ensayo, la nomenclatura de los medios varió, el medio 1 corresponde al

anteriormente mencionado medio Parra, el medio 2 es el Aiba y Ogawa, el medio 3

corresponde al medio máximo (+ +) y por último el medio 4 es el mínimo (– –). Se

logró un mejor arreglo de las combinaciones milimolares de los macronutrientes, para

obtener en el medio 1, con la modificación de Parra (2005), una relación Na+:K+ bien

aproximada a la relación fisiológica normal de estos dos cationes en células vivas, lo

que no se consiguió en el primer perfil nutricional.

Tabla 7. Concentraciones milimolares totales de los macronutrientes que integran cada uno de los medios de cultivo preparados. En rojo se destaca la relación 4:1 de K y Na en el medio 1.

Nutriente Medio 1 Medio 2 Medio 3 Medio 4

N 29,44 29,40 29,86 29,90

P 2,87 2,87 3,33 3,30

K+ 63,75 17,22 18,07 17,22

Mg2+

0,81 0,81 0,81 0,81

Ca2+

0,27 0,27 0,27 0,26

SO42-

6,60 6,60 1,34 0,86

Na+ 238,07 284,60 282,62 238,06

Cl- 17,65 17,65 75,83 1,40

CO32-

38,70 38,70 27,85 38,70

HCO3- 162,02 162,02 143,16 163,02

Na+/K

+ 3,73 4 16,5 15,6 13,8

La figura 23 muestra las curvas de crecimiento poblacional de A. platensis en los

cuatro medios de cultivo. Como en el ensayo anterior, los medios 1 y 2 presentaron

cinéticas similares, aunque la pendiente del segundo supera un poco a la del primero.

La curva del medio 3 tiene la tercera pendiente más alta, mientras que en la curva de

crecimiento correspondiente al medio 4 se aprecia que la fase de latencia es muy

prolongada y la población rápidamente crece los últimos 5 días del ensayo. La fase de

70

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Tiempo (días)

A6

80

Medio 1 Medio 2 Medio 3 Medio 4

crecimiento rápido de todas las curvas presentó una fuerte tendencia lineal. En

ninguno de los casos se alcanzó el plateau o capacidad de carga.

Figura 23. Crecimiento poblacional de Arthrospira platensis en cuatro medios de cultivo. En la fase de crecimiento rápido A680 y el tiempo presentaron correlaciones lineales fuertes, como se evidencia en los valores del coeficiente de determinación (R

2).

La figura 24 exhibe las curvas de crecimiento para el segundo ensayo, ahora con

densidades poblacionales. Se evidencian tendencias similares a las observadas con

valores de absorbancias, la pendiente del medio 2 supera en forma ligera a las de 1 y

3, y en el medio 4 hubo un crecimiento muy lento y desfasado de los otros, por la

prolongada fase de latencia y adecuación. Las capacidades de carga no fueron

alcanzadas y no se encontraron diferencias significativas (α = 0,05) entre los medios.

Figura 24. Crecimiento poblacional de Arthrospira platensis en cuatro medios de cultivo (filamentos por litro) en la Cámara de Crecimiento.

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Den

sid

ad (f

ilam

ento

s/L)

Tiempo (días)

Medio 1 Medio 2 Medio 3 Medio 4

A680 = 0,1471t + 0,0124 R2 = 0,9986

A680 = 0,1426t + 0,0404 R

2 = 0,9968

A680 = 0,1612t + 0,0136 R2 = 0,9969

A680 = 0,1619t + 0,0473 R2 = 0,9991

71

La Tabla 8 resume los principales resultados obtenidos en el ensayo. Las tasas de

crecimiento per cápita (r) se calcularon entre los días 7 y 10. Los mayores valores de

r, capacidad de carga (K) y producción de biomasa correspondieron al medio 1. La

población que creció en el medio 3 presenta una tasa per cápita ligeramente menor a

los medios 1 y 2. Los medios 1, 2 y 3 tuvieron valores de pH inicial y final muy

próximos con una tendencia al aumento, el medio 4 mostró valores similares.

Tabla 8. Tasa de crecimiento per cápita de Arthrospira platensis en la fase de crecimiento rápido, biomasa seca producida en cada medio de cultivo y pH inicial y final.

Medio Parámetros poblacionales Biomasa seca (g/L) pH

r (días-1

) K (filamentos/L) Inicial Final

1 0,50 412.900 0,840 9,12 10,15

2 0,48 390.300 0,797 9,17 10,16

3 0,30 321.800 0,717 9,19 10,04

4 0,01 – 0,243 9,70 9,86

En la siguiente etapa de escalamiento, se realizó el primer diseño multifactorial a cielo

abierto en botellones de 5 L. Los ensayos produjeron, en periodos de incubación

uniformes (28 días), curvas de crecimiento logísticas con amortiguaciones monótonas

y oscilaciones amortiguadas sostenidas y crecientes (figura 25).

La inmensa mayoría de los tratamientos siguieron la dinámica de una típica curva

sigmoidea, que gráficamente representa el modelo logístico de crecimiento

poblacional. Las curvas se caracterizaron por presentar una fase inicial de crecimiento

lento (latencia y adecuación), donde incluso en algunos cultivos se evidenciaron

decrecimientos entre los días 1 y 4. A esta fase de crecimiento lento o estacionario le

siguió otra de crecimiento rápido o exponencial, la cual duró tres (3) días en la mayoría

de los tratamientos. Finalmente, después del punto de inflexión de la curva el

crecimiento empezó a amortiguarse hasta alcanzar el estado de saturación (plateau),

donde la mayoría de las poblaciones se estabilizaron una vez fue alcanzada la

capacidad de carga del ambiente (medio de cultivo).

Varios tratamientos alcanzaron un equilibrio estable con atenuación monótona

(“monotonic damping”) en el valor de la capacidad de carga (K), mientras que algunas

poblaciones alcanzaron dicha capacidad de carga con oscilaciones, unas

amortiguadas y otras sostenidas, lo que puede atribuirse a algún retraso temporal en

el efecto de la densidad. Algunos tratamientos como el 6, 22, 26, 28 y 29 no

alcanzaron el plateau y los cultivos continuaron un crecimiento indefinido, en la

72

mayoría de los casos con marcadas oscilaciones. Por su parte, la curva del

tratamiento 19 alcanzó la capacidad de carga a una absorbancia muy inferior a los

medios más productivos, pero claramente muestra un patrón de oscilaciones

amortiguadas.

Figura 25. Curvas de crecimiento poblacional de Arthrospira platensis obtenidas en un ensayo

factorial fraccionado 26-1

con combinaciones aleatorias de niveles mínimos y centrales de cinco macronutrientes (tratamientos). La densidad poblacional fue medida indirectamente con la absorbancia a una longitud de onda de 680 nm, correspondiente al rojo dentro del espectro visible, pico de absorción de la clorofila a.

Tratamiento 1

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A6

80

nm

Tratamiento 2

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A6

80

nm

Tratamiento 3

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A6

80

nm

Tratamiento 4

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A6

80

nm

Tratamiento 5

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A6

80

nm

Tratamiento 6

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A680 n

m

73

Figura 25. Continuación.

Tratamiento 7

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A680 n

m

Tratamiento 8

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A680 n

m

Tratamiento 9

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A680 n

m

Tratamiento 10

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A680 n

m

Tratamiento 11

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A680 n

m

Tratamiento 12

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A680 n

m

Tratamiento 13

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A6

80

nm

Tratamiento 14

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A6

80

nm

74

Figura 25. Continuación.

Tratamiento 17

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A680 n

m

Tratamiento 18

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A680 n

m

Tratamiento 19

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A680 n

m

Tratamiento 20

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A680 n

m

Tratamiento 21

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A680 n

m

Tratamiento 22

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A6

80

nm

Tratamiento 15

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A680 n

m

Tratamiento 16

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A6

80

nm

75

Figura 25. Continuación.

Tratamiento 23

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A680 n

m

Tratamiento 24

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (día)

A680 n

m

Tratamiento 25

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A680 n

m

Tratamiento 26

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A680 n

m

Tratamiento 27

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A680 n

m

Tratamiento 28

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A680 n

m

Tratamiento 29

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A680 n

m

Tratamiento 30

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A680 n

m

76

Figura 25. Continuación.

Tratamiento 31

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A680 n

m

Tratamiento 32

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A680 n

m

Tratamiento 33

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A6

80

nm

Tratamiento 34

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A6

80

nm

Tratamiento 35

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A680 n

m

Tratamiento 36

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A680 n

m

Tratamiento 37

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28

Tiempo (días)

A680 n

m

77

La tasa per cápita de crecimiento, ΔN/[N(t)Δt], presenta un incremento notable en

algunas curvas para los primeros días. Casi todas las curvas coincidieron en el día 10

como tiempo tope del crecimiento aparentemente exponencial, donde es válido

aproximar la tasa per cápita de crecimiento al valor r. Posteriormente a este lapso de

tiempo, el crecimiento disminuye progresivamente hasta llegar al equilibrio en K. La

población decreció hasta cero (ΔN/Δt = 0), en todas los casos donde la capacidad de

carga, K, se alcanzó. Para algunos tratamientos se observaron decrecimientos en los

primeros tres días (ΔN/Δt < 0), antes del inicio del crecimiento rápido, principalmente

en las curvas correspondientes a los tratamientos 2, 3, 4, 12, 18, 25, 32 y 35, lo que

revela fases de latencia y adaptación marcadas por parte de las poblaciones de A.

platensis. La Tabla 9 resume las tasas de crecimiento per cápita (días-1) para tres

intervalos de tiempo en fase de crecimiento rápido, así como las capacidades de carga

(filamentos/L) para el método de conteo de filamentos.

Tabla 9. Tasas de crecimiento per cápita y capacidades de carga en cultivos de Arthrospira platensis para el ensayo factorial fraccionado 2

6-1. En rojo se destacan los medios con valores

mayores para uno o ambos parámetros poblacionales obtenidos de forma experimental.

Tratamiento Tasa de crecimiento per cápita (días-1

) Capacidad de carga, K

(filamentos/L)

Días 7 – 10 Días 10 – 13 Días 13 – 16

1 0,22 0,21 0,11 762.000

2 0,12 0,16 0,06 812.000

3 0,44 0,35 0,22 658.500

4 0,20 0,114 0,08 785.000

5 0,20 0,17 0,10 –

6 0,15 0,12 0,05 –

7 0,46 0,42 0,37 630.500

8 0,42 0,40 0,25 654.700

9 0,41 0,32 0,20 616.870

10 0,45 0,40 0,27 –

11 0,30 0,25 0,17 523.540

12 0,29 0,22 0,11 722.520

13 0,68 0,41 0,28 522.410

14 0,82 0,75 0,52 739.750

15 0,54 0,40 0,29 740.165

16 0,85 0,81 0,70 1.782.960

17 0,65 0,50 0,32 789.875

18 0,72 0,54 0,35 1.425.000

19 0,37 0,30 0,21 374.100

20 0,18 0,19 0,10 730.589

21 0,21 0,20 0,12 798.500

78

Tabla 9. Continuación.

Tratamiento Tasa de crecimiento per cápita (días-1

) Capacidad de carga,

K (filamentos/L)

Días 7 – 10 Días 10 – 13 Días 13 – 16

22 0,18 0,17 0,09 –

23 0,23 0,15 0,10 851.450

24 0,37 0,30 0,16 730.215

25 0,41 0,35 0,22 831.230

26 0,16 0,12 0,08 –

27 0,45 0,39 0,30 730.257

28 0,27 0,18 0,14 –

29 0,84 0,71 0,69 –

30 0,20 0,21 0,11 –

31 0,25 0,22 0,12 –

32 0,19 0,11 0,07 –

33 0,82 0,74 0,64 1.932.680

34 0,51 0,45 0,40 1.747.890

35 0,10 0,11 0,05 301500

36 0,75 0,65 0,51 2.520.000

37 0,70 0,51 0,32 2.050.000

La figura 26 describe en orden creciente los tiempos de duplicación (tg) para

poblaciones inoculadas en 37 botellones con los tratamientos preparados. Para la

obtención de estos valores se utilizó la tasa de recambio entre los días 7 y 10, en la

fase de crecimiento rápido, como valor de la tasa de crecimiento poblacional, dado que

al día 10 las poblaciones duplicaron sus tamaños. Algunos de los tratamientos con las

mejores dinámicas de crecimiento poblacional, como los tratamientos 14, 16, 18, 29,

33, 36 y 37 estuvieron entre los medios con tiempos generacionales más cortos (de

0,8 a 1 día), y algunos con dinámicas menos eficientes tuvieron tiempos

generacionales más prolongados, como 2, 6 y 32. El tratamiento 2 tuvo un tiempo de

duplicación muy prolongado (6,5 días), a pesar de ostentar una de las capacidades de

carga más elevadas, pero el gran retraso inicial producto de una latencia y adecuación

prolongadas, desplazó con mucho el inicio de la fase crecimiento rápido, alcanzando el

plateau aproximadamente a los 18 días, cuando poblaciones en otros medios lo

habían logrado de 10 a 15 días. Algo similar se puede decir del medio 35 que tuvo el

valor de tg más alto de todos los tratamientos. El medio 16 presentó el tiempo de

duplicación más corto (0,8 días), esto debido a una tasa de crecimiento per cápita muy

alta en la fase exponencial, lo que permitió a la población salir prontamente de una

breve fase de latencia y alcanzar el plateau un poco antes de los diez (10) días.

79

Figura 26. Diagrama de columnas mostrando en orden creciente los tiempos de duplicación (tg) de los diferentes tratamientos del ensayo multifactorial.

80

El medio más productivo en biomasa fue el tratamiento 36 (aprox. 2,3 g/L), mientras

que el tratamiento 29 resultó el menos rendidor. Varios de los medios (16, 18, 33 y 36)

que mostraron los tg más bajos, también se constituyeron en los más productivos en

biomasa seca (figura 27). Un tiempo de duplicación corto implica que la producción de

biomasa será elevada en un término de tiempo breve, a la vista están los resultados

que indican que los tratamientos con tiempos generacionales menores alcanzaron la

capacidad de carga en un número de días inferior, alrededor de 10 días, y entonces

los 20 días restantes del ensayo permitieron generar un rendimiento superior de

biomasa para fines de producción masiva a escala mayor.

El análisis de varianza para las diferentes combinaciones aleatorias y niveles centrales

de cinco macronutrientes, para la variable respuesta densidad óptica o absorbancia,

determinó diferencias significativas (α = 0,05) para las sales que constituyen la

solución I del medio Spirulina. Esto repercutió en forma determinante en las dinámicas

poblacionales tan variables que se observaron en cada uno de los medios nutritivos.

De este análisis estadístico se desprende que las fuentes de carbono (NaHCO3 y

Na2CO3) y fósforo (KH2PO4), así como el efecto del modelo o diseño empleado,

resultan concluyentes para evidenciar diferencias significativas en los crecimientos de

las poblaciones de A. platensis, donde hubo combinaciones aleatorias de esos

componentes químicos esenciales para el desarrollo y replicación de los filamentos. El

nitrógeno, otro nutriente relevante en la nutrición mineral de A. platensis, no tuvo

efecto significativo en las cinéticas evidenciadas (Tabla 10).

Tabla 10. Análisis de varianza para el diseño factorial fraccionado 26-1

(salida del programa Design Expert). Los números destacados en rojo son valores de p<0,05.

Fuente Suma de

Cuadrados

Grados de

libertad

Cuadrado

Medio F p

Modelo 4,18 16 0,26 4,88 0,0007

NaHCO3 1,19 1 1,19 22,32 0,0001

Na2CO3 0,43 1 0,43 8,12 0,0102

KH2PO4 0,25 1 0,25 4,76 0,0418

NaCl 8,32E+00 1 8,32E+00 0,16 0,6978

K2SO4 0,18 1 0,18 3,42 0,0799

KNO3 0,12 1 0,12 2,21 0,1532

A partir de estas determinaciones, se escogió el tratamiento 36 como el óptimo para

ser probado en ensayos a escala mayor. Esta decisión deriva del análisis de las

interacciones de la biomasa con las concentraciones milimolares de los nutrientes más

importantes en la ejecución del experimento, siendo el 36 uno de los tratamientos

centrales (ver Apéndice 2), con mejores valores de parámetros y biomasa.

81

Figura 27. Biomasa seca (g/L) cosechada en los diferentes tratamientos del ensayo factorial 2

6-1.

Los valores se ordenan en forma creciente.

Ord

en

cre

cie

nte

de

bio

ma

sa

se

ca

0,0

00

0,5

00

1,0

00

1,5

00

2,0

00

2,5

00

29

19

30

25

28

32

611

10

117

12

31

26

415

322

227

514

820

24

35

13

916

23

33

18

34

37

21

736

Tra

tam

ien

to

BS (g/L)

82

La figura 28 muestra el resultado de un ensayo para establecer en forma experimental

la estructura de tallas de la población de A. platensis. El resultado evidencia que las

proporciones de tallas efectivamente varían a lo largo del periodo de crecimiento de la

población. En un principio (días 0 a 6) predominan los filamentos pequeños (2 – 4

células). Una vez que las fases de latencia y adecuación ocurren y dan paso a la fase

de crecimiento rápido, los porcentajes de filamentos cortos o “jóvenes” disminuyen en

forma sistemática, y filamentos “maduros” rápidamente comienzan a aumentar sus

números hasta llegar a la fase de saturación (capacidad de carga) y porcentualmente

ser las tallas predominantes en la estructura de la población.

Figura 28. Diagramas circulares que muestran las variaciones porcentuales en grupos de filamentos de diferentes tallas en una población de Arthrospira platensis, a lo largo de un periodo de incubación que duró 30 días. La cepa se cultivó en el medio optimizado en el ensayo factorial fraccionado 2

6-1 (tratamiento 36).

A continuación se presentan tres gráficos de barras y cajas combinados (en inglés “bar

chart/box plot”) que brindan información de la dinámica de crecimiento de los tres

65%32%3%

Día 0

2 células

4 células

> 4 células

53%

42%

5%

Día 6

2 células

4 células

> 4 células

42%

41%

17%

Día 12

2 células

4 células

> 4 células

2%

45%53%

Día 18

2 células

4 células

> 4 células

1%32%67%

Día 24

2 células

4 células

> 4 células

1%15%

84%

Día 30

2 células

4 células

> 4 células

83

componentes poblacionales de filamentos discriminados por sus tallas y la dispersión

de los datos (desviaciones estándares), respectivamente. Se verifica que la cohorte de

filamentos con dos células tiene un crecimiento poblacional vigoroso y sostenido hasta

el día 12 cuando alcanza un máximo, y desde este punto crítico empieza a declinar de

forma rápida hasta valores ínfimos al final del periodo cuando la población se

estabiliza y es madura. Los filamentos con cuatro células tienen una dinámica similar

(patrón unimodal) a la exhibida en el perfil de los filamentos más cortos de dos células,

pero con un desfase, alcanzando el máximo el día 18 y luego, como en el caso

anterior, declina la población a niveles basales hacia postrimerías del tiempo de

crecimiento asintótico. El tercer conjunto de tallas, correspondiente a filamentos con

más de cuatro células, posee una dinámica tardía respecto a los dos primeros, puesto

que la población se incrementa luego de que se han formado muchos filamentos

cortos que empiezan a crecer radialmente y sumar células al filamento, de este modo

la población de filamentos grandes empieza a ser ampliamente dominante al final del

periodo de crecimiento y se estabiliza con ligeras fluctuaciones en el estado de

saturación. Los datos medios, que son los que se grafican, presentaron poca

dispersión, lo que puede mostrarse como una aproximación experimental a una

estructura de tallas de la población de A. platensis (figura 29).

Figura 29. Dinámicas de crecimiento poblacional de los tres componentes de tallas de filamentos de Arthrospira platensis: (a) filamentos con 2 células, (b) filamentos con cuatro células y (c) filamentos con más de cuatro células. La letra “Y” en la ordenada es la densidad (filamentos/L) y en la abscisa el tiempo está dividido en intervalos de tres días. Salida: PAST.

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30

0

3E05

6E05

9E05

1,2E06

1,5E06

1,8E06

2,1E06

2,4E06

2,7E06

Y

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30

0

8E04

1,6E05

2,4E05

3,2E05

4E05

4,8E05

5,6E05

6,4E05

7,2E05

Y

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30

0

2E05

4E05

6E05

8E05

1E06

1,2E06

1,4E06

1,6E06

1,8E06

Y

(a) (b)

(c)

84

Por último, para poner a prueba la idoneidad del modelo logístico como modelo

dinámico para A. platensis, se hizo una prueba sencilla de extracción de volúmenes a

partir de la saturación o capacidad de carga (K), y reemplazar el volumen retirado con

medio de cultivo optimizado (tratamiento 36). Esta aproximación experimental permitió

medir en cuanto tiempo la población retornó a K en las siguientes situaciones: (1)

retiro de un volumen por encima del punto de inflexión (N = K/2), correspondiente a

25% del volumen total del cultivo; (2) retirar la mitad de la población (50%), para llevar

a la población hasta el punto de inflexión; (3) extracción del 75% del volumen total, que

implica cosechar la mayor parte de la población en una concentración muy por debajo

del punto de inflexión. Se puede observar que en el primer caso, a pesar de tratarse

de una remoción cercana al punto de saturación, su pendiente es inferior a la obtenida

para una remoción de 50%, lo que evidencia que el segundo tratamiento reduce a la

población justo a la fase de crecimiento rápido, mientras que con un 25% de remoción

las condiciones son similares o próximas a la saturación. El tratamiento con una

reducción de 75% de la población total llevó a los filamentos remanentes a un tamaño

basal, y la recuperación evidentemente se hizo muy lenta y, al momento de que en los

otros tratamientos las poblaciones alcanzaron y se estabilizaron en la capacidad de

carga, en el tercer caso la población aún no salía de la fase de latencia. El tiempo en

el que la población en el primer tratamiento (25%) retornó a K fue de cinco días, y con

una remoción de 50% la población tardó igual número de días.

Figura 30. Dinámicas de crecimiento poblacional de Arthrospira platensis a partir de tres extracciones de volúmenes en fase de saturación. De izquierda a derecha se muestran las curvas de crecimiento a partir de 25%, 50% y 75% de extracción.

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

1 3 5 7 9 11 13 15 1 3 5 7 9 11 13 15 1 3 5 7 9 11 13 15

A6

80

Tiempo (días)

85

Para el cultivo de A. platensis en tanques circulares de 500 L en el Ficotrón, el

crecimiento poblacional de filamentos se intensificó, evidenciado en forma indirecta por

la medición de la absorbancia, una vez entraron en la fase de crecimiento rápido,

siendo superior en tanques con profundidades menores, seguido de los de

profundidad intermedia y finalmente por los de profundidad mayor (figura 31).

Figura 31. Absorbancias medias (λ = 680 nm) de los cultivos en fase de crecimiento rápido, para tres profundidades, izquierda a derecha: 15 cm (barras azules), 25 cm (barras rojas) y 35 cm (barras amarillas).

Cuando se observa la otra variable respuesta, biomasa total producida por tanque

(g/L), el patrón es similar, los tanques de mayor producción son los de menor

profundidad de medio líquido, mientras que los de profundidades mayores resultaron

los de menor producción (figura 32).

Figura 32. Biomasa seca total (g/L) en los tres bloques.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

A3 B2 C1 A1 A2 B3 B1 C2 C3

A680

Tanque

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

A3 B2 C1 A1 A2 B3 B1 C2 C3

Bio

mas

a se

ca (

g/L)

Tanque

86

Es indiscutible pensar que la profundidad de la lámina de agua en los tanques

circulares afecta de manera diferencial la tasa de crecimiento y producción de

biomasa. El análisis de varianza determinó que hay diferencias significativas (α = 0,05)

entre los tratamientos (profundidades). Por otro lado, el efecto de los bloques en el

experimento parece no ser relevante (Tabla 11).

Tabla 11. Resumen del Análisis de Varianza (salida de MICROSOFT EXCEL).

Fuente de Variación Suma de

Cuadrados

Grados de

libertad

Media de

cuadrados Fo

Tratamientos (profundidad) 4197,31 2 2098,66 11,82

Bloques (columnas) 556,03 2 278,01 1,57

Error 709,95 4 177,49

Total 5463,29 8

F0,05;2;4=6,94

Para cultivadores tipo carrusel (2500 L de capacidad) se tiene información limitada de

su dinámica y producción de biomasa. La tasa de crecimiento per cápita media del

cultivo en carrusel, como aproximación a la tasa instantánea, fue 0,25 días-1 y la

biomasa seca total 0,5 g/L, en la única cosecha realizada. Se puede advertir cómo

disminuyen la tasa de crecimiento per cápita media y la producción de biomasa desde

botellones hasta el carrusel en condiciones no controladas y con fotoperiodo (sólo el

intervalo de horas con luz natural).

7.3 Comunidades fitoplanctónicas

El estudio de comunidades fitoplanctónicas ofrece la oportunidad de explorar los

ambientes acuáticos variados del país, así como colectar numerosas especies de

cianobacterias y microalgas eucarióticas con gran potencial biotecnológico.

Ambientes dulceacuícolas. La Tabla 12 presenta la composición y abundancia de la

biota fitoplanctónica de un humedal herbáceo de la península de Paria (Palmares III).

El fitoplancton estuvo principalmente representado, en riqueza y abundancia, por

diatomeas (Bacillariophyta) y algas verde-azules (Cyanobacteria). La zona de

Brachiaria mutica (Poaceae) fue la comunidad vegetal con mayor número de especies

(24), mientras que el ecotono Cyperus articulatus (Cyperaceae) - Typha dominguensis

(Typhaceae) fue la vegetación con riqueza menor (8).

Las especies de diatomeas cuantitativamente importantes fueron: Gyrosigma

attenuatum, muy común en B. mutica y el ecotono T. dominguensis - Sesbania

87

exasperata (Fabaceae); tres especies del género Navicula con densidades

poblacionales grandes en zonas diversas, en especial N. platalea con una densidad

notable en el ecotono S. exasperata - C. articulatus; Nitzschia valens, abundante en B.

mutica, S. exasperata y C. articulatus. Otras diatomeas, como Pinnularia gibba y

Pleurosigma sp., fueron numerosas en B. mutica, pero se hicieron raras o ausentes en

las demás zonas de vegetación. Oscillatoria sp. fue la única cianobacteria abundante y

dominante, con densidades grandes en B. mutica, S. exasperata y los ecotonos B.

mutica - S. exasperata y T. dominguensis - S. exasperata. Otra cianobacteria,

Anabaena sp., fue muy importante en el parche de B. mutica. También se encontraron

ejemplares de Spirulina subsalsa, Arthrospira sp y Chlorella sp. Las algas verdes

(Chlorophyta) y euglenofitas (Euglenophyta) escasearon en todas las comunidades

vegetales. Se halló un género de dinoflagelado (Pyrrophyta) con algunos individuos de

la especie Protoperidinium sp. en el ecotono S. exasperata - C. articulatus.

Tabla 12. Composición de especies y abundancia (células/litro) de los taxa fitoplanctónicos presentes en las zonas de vegetación en noviembre de 2008. Bm (Brachiaria mutica), EcBmSe (ecotono B. mutica - Sesbania exasperata), Se (S. exasperata), EcSeCa (ecotono S. exasperata - Cyperus articulatus), Ca (C. articulatus), EcCaTd (ecotono C. articulatus-Typha dominguensis), Td (T. dominguensis) y EcTdSe (ecotono T. dominguensis - S. exasperata).

TAXA Bm EcBmSe Se EcSeCa Ca EcCaTd Td EcTdSe Se

Bacillariophyta (15 especies)

Cocconeis striata 0 0 0 0 4 0 0 0 0

Eunotia monodon 0 0 8 0 8 4 8 0 8

Fragilaria crotonensis 5 2 2 1 1 0 0 1 2

Frustulia sp. 8 4 4 2 1 4 2 0 0

Gyrosigma attenuatum 264 80 24 0 40 20 4 236 24

Gomphonema brasiliense 0 0 0 0 4 0 0 0 0

Navicula fulva 72 12 32 32 52 20 0 0 32

N. oblonga 48 14 40 20 12 4 0 4 40

N. platalea 40 8 64 336 64 2 0 0 64

Nitzschia valens 80 50 64 24 96 40 24 0 64

N. obtusa 0 0 0 0 8 4 0 0 0

Pinnularia gibba 68 8 4 0 8 0 0 0 4

Pleurosigma sp. 48 20 0 0 0 0 4 0 0

Surirella sp. 0 0 0 0 8 0 4 0 0

88

Tabla 12. Continuación.

TAXA Bm EcBmSe Se EcSeCa Ca EcCaTd Td EcTdSe Se

Synedra sp. 0 8 8 0 0 0 0 24 8

Cyanobacteria (10 especies)

Anabaena sp. 192 20 0 0 0 0 12 84 0

Arthrospira sp. 8 0 0 0 0 0 0 0 0

Chroococcus sp. 4 0 0 0 0 0 4 0 0

Lyngbya sp. 24 0 0 0 0 0 0 12 0

Merismopedia sp. 4 0 0 0 0 0 4 0 0

Microcystis aeruginosa 4 4 0 0 24 0 4 0 0

M. flos-aquae 16 8 0 0 48 0 0 0 0

Nostoc sp. 68 20 0 0 0 0 0 0 0

Oscillatoria sp. 236 488 192 12 0 0 0 180 192

Spirulina subsalsa 12 16 4 12 0 0 0 0 4

Chlorophyta (6 especies)

Chlorella sp. 0 8 0 0 24 0 0 0 0

Closterium sp. 12 0 0 0 0 0 4 8 0

Desmidium baylei 16 0 8 0 0 0 0 0 8

Hyalotheca sp. 12 0 0 0 0 0 0 0 0

Lambertia setosa 0 0 0 0 5 0 0 0 0

Scenedesmus sp. 0 0 0 0 0 0 0 4 0

Euglenophyta (4 especies)

Euglena sp. 0 0 0 0 0 0 4 12 0

Phacus undulatus 28 8 8 0 0 0 0 0 8

Trachelomonas hispida 0 0 0 0 4 0 0 0 0

T. superba 72 8 0 0 8 0 0 36 0

Pyrrophyta (1 especie)

Protoperidinium sp. 0 0 0 8 0 0 0 0 0

Riqueza (S) 24 19 14 9 19 8 12 10 13

89

Las comunidades fitoplanctónicas de Palmares III no sólo variaron en forma cualitativa

(composición de especies) en los diferentes parches de vegetación emergente, los

índices de diversidad revelan que también cambiaron en forma cuantitativa a lo largo

de los ambientes parcelados. Para 2008, la diversidad, expresada en el índice

Shannon-Wiener (H´), relativamente fue alta en los parches de B. mutica (Bm) y C.

articulatus (Ca) debido a que la riqueza y equidad, sus dos componentes, también

fueron elevadas; en el caso de T. dominguensis (Td), con el tercer valor más alto, el

ambiente mostró la equidad más prominente del humedal en esa época. Los ecotonos

de vegetación o ambientes de transición fueron menos diversos que los parches

monoespecíficos contiguos. En el ecotono S. exasperata – C. articulatus (EcSeCa) la

equidad se constituyó en la más baja, subsecuentemente los índices de dominancia de

Simpson y Berger-Parker tuvieron valores sobresalientes (Tabla 13).

Tabla 13. Algunos índices de diversidad empleados para caracterizar la comunidad

fitoplanctónica de Palmares III en sus diferentes parches de vegetación monoespecífica y ecotonos (noviembre 2008). Salida: PAST.

Índice Bm EcBmSe Se EcSeCa Ca EcCaTd Td EcTdSe

Riqueza (S) 24 19 14 9 19 8 12 11

Equidad (J´) 0,80 0,54 0,72 0,46 0,81 0,78 0,88 0,66

Shannon-Wiener (H´) 2,55 1,60 1,89 1,00 2,38 1,62 2,20 1,59

Dominancia de Simpson (D) 0,11 0,40 0,23 0,58 0,12 0,26 0,15 0,27

Berger-Parker (d) 0,20 0,62 0,42 0,75 0,23 0,41 0,31 0,39

La Tabla 14 muestra los valores del índice de distancia o similitud Jaccard, para el

conjunto de ambientes parcelados (asociaciones de plantas emergentes) del humedal

Palmares III en noviembre de 2008. En términos generales, se evidencian similitudes

notables entre algunos parches monoespecíficos con ecotonos vecinos,

principalmente en el gradiente B. mutica (Bm) ecotono B. mutica – S. exasperata

(EcBmSe) S. exasperata (Se). Es curioso que el ecotono S. exasperata – C.

articulatus (EcSeCa) sea tan diferente del parche monoespecífico de C. articulatus

(Ca), cuando la otra vegetación monoespecífica que converge en esa área del

humedal guarda una similitud notable con la misma zona ecotonal o mixta entre ambas

especies vegetales. Las formaciones de vegetación espacialmente más apartadas

entre sí en el humedal tuvieron similitudes moderadas a bajas. Los ambientes más

disímiles fueron el ecotono S. exasperata – C. articulatus y la zona monoespecífica de

T. dominguensis (Td).

90

Tabla 14. Distancias Jaccard entre los parches de vegetación acuática del humedal Palmares III, noviembre de 2008, definidas a partir a las abundancias de las especies fitoplanctónicas. Los valores están acotados entre 0 y 1, los destacados en rojo indican similitudes altas y en azul se señala a la pareja de vegetaciones con menor similitud. Salida: PAST.

Bm EcBmSe Se EcSeCa Ca EcCaTd Td EcTdSe

Bm 1 0,654 0,462 0,320 0,344 0,231 0,333 0,296

EcBmSe 0,654 1 0,571 0,400 0,462 0,286 0,240 0,304

Se 0,462 0,571 1 0,533 0,375 0,467 0,182 0,250

EcSeCa 0,320 0,400 0,533 1 0,273 0,417 0,105 0,176

Ca 0,344 0,462 0,375 0,273 1 0,421 0,240 0,154

EcCaTd 0,231 0,286 0,467 0,417 0,421 1 0,250 0,118

Td 0,333 0,240 0,182 0,105 0,240 0,250 1 0,211

EcTdSe 0,296 0,304 0,250 0,176 0,154 0,118 0,211 1

Un Análisis de Componentes Principales (ACP) permitió comparar las especies

fitoplanctónicas y zooplanctónicas más importantes del ecosistema estudiado en la

península de Paria. La diatomea Navicula platalea, las cianobacterias Oscillatoria sp. y

Anabaena sp., Platyas quadricornis (Rotifera: Monogononta), Diaphanosoma birgei

(Crustacea: Branchiopoda: Cladocera), Moina minuta (Crustacea: Branchiopoda:

Cladocera) y Prionodiaptomus colombiensis (Crustacea: Maxillopoda: Copepoda:

Calanoida), estadísticamente se constituyeron en las especies fitoplanctónicas y

zooplanctónicas más importantes en 2008, luego de análisis descriptivos y ACP

iterativos empleados para eliminar variables en forma sistemática.

La figura 33 muestra el biplot del ACP, con la representación de los dos primeros

componentes principales (CP), los cuales reúnen una inercia acumulada de 89,965%,

que indica una gran reducción del espacio multidimensional en los dos primeros ejes.

Oscillatoria sp. fue la especie más relacionada con el primer componente principal, y

también tuvo una relación estrecha con el ecotono B. mutica – S. exasperata

(EcBmSe), mientras que N. platalea se constituyó en la segunda especie más

importante y la más estrechamente relacionada a la segunda nube de puntos más

grande, resumida en el segundo componente principal (CP2), y con una relación

cercana con el ecotono S. exasperata – C. articulatus (EcSeCa). Estas dos especies

de microalgas no tuvieron correlación alguna, por lo que fueron independientes entre

sí, a juzgar por sus autovectores que conformaron un ángulo recto entre sí. Las

especies zooplanctónicas seleccionadas para el análisis tuvieron autovectores muy

cortos, debido a las diferencias de escalas, y se concentraron en el origen de

coordenadas, sin guardar relaciones claras con las especies fitoplanctónicas

mencionadas. Moina minuta tuvo una relación positiva con Navicula platalea. Las

zonas de vegetación muestran un patrón en herradura que puede indicar algún

gradiente ambiental.

91

Figura 33. Biplot de los dos primeros componentes principales del ACP para las variables (especies) y casos (parches de vegetación) escogidas para caracterizar el ecosistema del humedal Palmares III en noviembre de 2008. Los dos primeros componentes principales acumularon 89,965% de la inercia total del sistema. Salida: MVSP 3.0.

El dendrograma (figura 34) del análisis de agrupamiento derivado de las especies

fitoplanctónicas y zooplanctónicas que destacaron en el ACP, muestra que se

formaron tres (3) grupos: (1) ecotono B. mutica – S. exasperata discriminado por

Oscillatoria sp. con el valor de centroide más alto; (2) ecotono S. exasperata – C.

articulatus (EcSeCa) al cual está asociada N. platalea y (3) B. mutica, S. exasperata y

ecotono T. dominguensis – S. exasperata, C. articulatus, ecotono C. articulatus – T.

dominguensis y T. dominguensis, con asociación de M. minuta. La vegetación

monoespecífica de T. dominguensis ecológicamente es muy parecida al ecotono que

esta especie forma con C. articulatus. La mayor parte de los otros ambientes poseen

disimilitudes de mediana magnitud en la escala Euclidiana. Los dos ecotonos que

conforman el segundo y tercer grupo, respectivamente, son ambientes muy diferentes

entre sí y a cualquier otra comunidad de plantas acuáticas que existen en el humedal.

CP 2

CP 1

Bm

EcBmSe

Se

EcSeCa

Ca

EcCaTdTd

EcTdSe

-28

-56

-84

28

56

84

112

140

-33.21-66.41-99.62 33.21 66.41 99.62 132.82 166.03

Navicula platalea

Anabaena sp.

Oscillatoria sp.

Platyas quadricornis

Diaphanosoma birgei

Moina minuta

Prionodiaptomus colombiensis

Vector scaling: 146,94

92

Figura 34. Dendrograma del Análisis de Agrupamiento o “Cluster Analysis” derivado del conjunto de especies fitoplanctónicas y zooplanctónicas más importantes colectadas en el ACP. Salida: MVSP 3.0.

En cuanto al ambiente abiótico, las variables fisicoquímicas mostraron una cierta

uniformidad, sólo algunas oscilaciones en el oxígeno disuelto. Los valores de salinidad

resultaron importantes para establecer que el humedal es un ambiente con

característica salobre. Se adicionan datos de algunos iones importantes para la

caracterización química del agua del humedal, principalmente metales alcalinos con

concentraciones importantes de sodio y muy bajas de potasio, que robustecen la idea

del carácter salobre del ambiente, y alcalino-térreos (cantidades notables de calcio y

magnesio), y aniones como sulfatos y cloruros en concentraciones altas (Tabla 15).

Tabla 15. Variables fisicoquímicas y concentraciones de cationes y aniones del agua, determinados en las zonas de vegetaciones monoespecíficas estudiadas en el humedal de Palmares en noviembre de 2008.

Parámetro/ ion B. mutica S. exasperata C. articulatus T. dominguensis

pH 7,3 6,9 7,1 7,3 Conductividad (mS/cm) 2,3 2,3 2,7 3,5 O2 (mg/L) 1,4 2,3 3,2 4,5 T (˚C) 25,1 25,4 24,6 25,8 Salinidad (‰) 0,11 0,11 0,12 0,13 Profundidad (cm) 23,8 21,8 19,0 18,6 Ca2+ (mg/L) 93,0 94,0 118,0 112,0 Mg2+ (mg/L) 64,0 55,0 58,0 60,0 Na+ (mg/L) 255,0 285,0 258,0 325,0 K+ (mg/L) 7,8 7,1 9,8 4,6 Cl- (mg/L) 540,0 500,0 460,0 660,0 SO4

2- (mg/L) 237,0 257,0 343,0 298,0

93

En agosto de 2009, un segundo muestreo en el mismo humedal de Paria, presentó

características fisonómicas cambiantes en la vegetación, debido a un incendio en

sequía que diezmó buena parte de la cobertura herbácea original, la cual cubría 100%

de su superficie, sin formar espejos de agua. El fitoplancton estuvo representado casi

en su totalidad por cianobacterias y euglenofitas, con predominio de las primeras en el

ecotono B. mutica - C. articulatus y abundancia de las segundas en B. mutica y T.

dominguensis. En términos generales, la riqueza fue muy inferior a la observada en

noviembre. Hubo un dominio alternado de una especie de euglenofita (Trachelomonas

superba) y una cianobacteria (Oscillatoria sp.). En esta época nuevamente se

encontraron representantes del género Arthrospira. Las diatomeas, en general,

escasearon en todos los ambientes, la única especie resaltante de este grupo fue N.

fulva en la zona B. mutica y el ecotono B. mutica - C. articulatus. Se observaron muy

pocas clorofitas. No se encontró fitoplancton en la zona de C. articulatus (Tabla 16).

Tabla 16. Composición de especies y abundancias (células/litro) de los taxa fitoplanctónicos presentes en las zonas de vegetación para agosto de 2009. EcBm1Ca y EcCaBm2 (ecotonos B. mutica - C. articulatus); EcBm2Td (ecotono B. mutica - T. dominguensis).

TAXA Bm1 EcBm1Ca Ca EcCaBm2 Bm2 EcBm2Td Td

Bacillariophyta (4 especies) Gyrosigma attenuatum 0 0 0 0 0 0 40 Navicula fulva 100 100 0 100 100 23 20 Nitzschia valens 60 20 0 20 60 5 0 Pinnularia gibba 20 20 0 20 20 0 0 Cyanobacteria (5 especies) Arthrospira sp. 20 0 0 0 20 0 0 Chroococcus sp. 0 20 0 20 0 0 0 Lyngbya sp. 20 0 0 0 0 0 0 Microcystis aeruginosa 0 20 0 20 0 0 0 Oscillatoria sp. 0 7560 0 7560 0 0 0 Chlorophyta (1 especie) Closterium sp. 20 0 0 0 20 0 0 Euglenophyta (2 especies) Trachelomonas hispida 0 20 0 20 0 0 0 T. superba 10.000 300 0 300 10.000 450 7680

Riqueza (S) 7 8 0 7 8 3 3

La Tabla 17 muestra los índices de diversidad empleados para caracterizar la

estructura comunitaria fitoplanctónica de Palmares III en agosto de 2009. Las riquezas

fueron muy bajas en todos los ambientes, por lo que la equidad pasó a tener

preponderancia o peso mayor en el valor del índice Shannon-Wiener. Hubo zonas de

vegetación como los dos parches de B. mutica (Bm), observados en esa época, con

equidades muy altas que produjeron los índices de diversidad más altos para el

humedal. El resto de los ambientes exhibieron valores de equidad muy bajos con la

subsecuente disminución de la diversidad y aumento de los índices de dominancia de

Simpson y Berger-Parker.

94

Tabla 17. Algunos índices de diversidad empleados para caracterizar la comunidad fitoplanctónica de Palmares III en sus diferentes parches de vegetación monoespecífica y ecotonos (agosto 2009). Salida: PAST.

Índice Bm1 EcBm1Ca Ca Bm2 EcBm2Td Td

Riqueza (S) 7 8 0 6 3 3

Equidad (J´) 0,85 0,15 0 0,83 0,23 0,05

Shannon-Wiener (H´) 1,65 0,31 0 1,49 0,25 0,05

Dominancia de Simpson (D) 0,76 0,12 0 0,72 0,11 0,02

Berger-Parker (d) 0,40 0,94 0 0,43 0,94 0,99

El índice de similitud o distancia Jaccard señala que la mayor similitud entre bandas de

vegetación, diferentes a ellas mismas, se encontró entre los dos parches de B. mutica

(Bm1 y Bm2). La segunda pareja de ambientes parcelados con mayor similitud

ecológica es la establecida entre B. mutica (Bm2) y su ecotono con T. dominguensis

(EcBm2Td). Los demás ambientes difirieron en forma notable y en distintos grados

(Tabla 18).

Tabla 18. Distancias Jaccard entre los parches de vegetación acuática del humedal Palmares III, agosto de 2009, definidas a partir a las abundancias de las especies fitoplanctónicas. Los valores están acotados entre 0 y 1, los destacados en rojo indican similitudes altas y en azul se señala a la pareja de vegetaciones con menor similitud. Salida: PAST.

Bm1 EcBm1Ca Bm2 EcBm2Td Td

Bm1 1 0,364 0,857 0,429 0,250

EcBm1Ca 0,364 1 0,400 0,375 0,222

Bm2 0,857 0,400 1 0,500 0,286

EcBm2Td 0,429 0,375 0,500 1 0,500

Td 0,250 0,222 0,286 0,500 1

Las variables físicas y químicas exhibieron cierta uniformidad en agosto de 2002. Se

encontraron incrementos leves de la salinidad, conductividad, temperatura y

profundidad hacia la zona de T. dominguensis. La concentración de oxígeno en el

agua también mostró un aumento hacia esa vegetación, aunque más notable que los

otros factores abióticos. El pH se mostró más alto en el parche de C. articulatus, sin

embargo en todas las comunidades se mantuvo alrededor de la neutralidad. En cuanto

a la intensidad de luz, se obtuvieron diferencias grandes entre la cantidad de luz que

llegó al techo vegetal y la que las plantas dejaron filtrar hasta la lámina de agua. La

zona de C. articulatus generó la disminución mayor de densidad fotónica (luminancia),

al sólo permitir que se filtraran 2 lux hasta la superficie del agua, de los 70 lux que

llegaron al dosel (Tabla 19).

95

Tabla 19. Variables ambientales medidas en agosto de 2009.

ZONA pH Conductividad

(mS/cm)

Temperatura

(°C)

Salinidad

(‰)

Profundidad

(cm)

Oxígeno

(mg/L)

Luminancia (lux)

Sobre el

techo

Bajo el

techo

B. mutica 6,93 2,30 26,92 0,11 18,75 0,88 56 8

Ecotono B.

mutica-C.

articulatus

6,92 2,33 26,90 0,11 15,00 0,74 53 14

C. articulatus 7,50 2,39 25,55 0,11 17,50 0,44 70 2

Ecotono B.

mutica-T.

dominguensis

7,41 3,05 31,47 0,14 16,00 2,68 65 19

T.

dominguensis 7,31 3,10 30,78 0,15 29,00 3,02 60 38

En la depresión de Barlovento, Edo. Miranda, específicamente en un sector

denominado El Clavo, se muestrearon dos zonas contiguas de vegetación emergente

monoespecífica: Heliconia marginata (Heliconiaceae) e Hymenachne amplexicaulis

(Poaceae), en sentido suroeste – noreste en la parte más estrecha de un humedal

herbáceo que ocupa la parte más baja (estero) de una zona boscosa con pendientes

pronunciadas. Este estudio se realizó en enero de 2009 a comienzo de sequía, pero

aún con algunas lluvias copiosas. En una zona pequeña de espejo de agua, el

fitoplancton tuvo una abundancia importante, aunque con riqueza baja, y dominio

amplio de dos especies: la cianobacteria Lyngbya lutea (500 filamentos/L) y en

segundo término la clorofita Spirogyra ternata (100 filamentos/L). Asterococcus

limneticus fue común en la zona de H. amplexicaulis. En las dos zonas con vegetación

emergente, las densidades poblacionales de las dos primeras especies y de algunas

otras cianobacterias, clorofitas y diatomeas fueron muy inferiores al espejo (Tabla 20).

Tabla 20. Grupos (Taxa) fitoplanctónicos identificados en los diferentes ambientes de vegetación en El Clavo, Barlovento, Edo. Miranda (enero de 2009).

Zona de

muestreo Muestra División Especie

Nivel de

organización

Abundancia

(células/L;

colonias/L;

filamentos/L)

Heliconia

marginata

He1

Cyanobacteria Microcoleus

chthonoplastes Filamentoso 1

Chlorophyta Closterium

littorale Unicelular 1

He2

Cyanobacteria Microcoleus

chthonoplastes Filamentoso 1

Chlorophyta

Closterium

ehrenbergii Unicelular 1

Closterium lineatum

Unicelular 2

He3 Chlorophyta Asterococcus

limneticus Colonial 1

96

Tabla 20. Continuación.

Zona de

muestreo Muestra División Especie

Nivel de

organización

Abundancia

(células/L;

colonias/L;

filamentos/L)

Espejo de agua

(dominado por Lemna sp. y

algunas otras

flotantes libres)

E1

(muestra

única)

Cyanobacteria Lyngbya lutea Filamentoso 500

Bacillariophyta

(diatomeas) Pinnularia sp. Unicelular 1

Chlorophyta

Asterococcus limneticus

Colonial 19

Micrasterias

sol Unicelular 2

Closterium ehrenbergii

Unicelular 6

Closterium

lineatum Unicelular 1

Spirogyra ternata

Filamentoso 100

Hymenachne

amplexicaulis

Hy1

Cyanobacteria Lyngbya lutea Filamentoso 100

Chlorophyta

Asterococcus limneticus

Colonial 16

Closterium

cornu Unicelular 1

Closterium

lineatum Unicelular 6

Closterium parvulum

Unicelular 1

Spirogyra

ternata Filamentoso 10

Hy2

Cyanobacteria Lyngbya lutea Filamentoso 100

Chlorophyta

Asterococcus

limneticus Colonial 86

Micrasterias

sol Unicelular 1

Closterium

ehrenbergii Unicelular 3

Closterium

lineatum Unicelular 2

Spirogyra

ternata Filamentoso 11

97

Tabla 20. Continuación.

Zona de

muestreo Muestra División Especie

Nivel de

organización

Abundancia

(células/L;

colonias/L;

filamentos/L)

Hymenachne

amplexicaulis

Hy2 Chlorophyta Volvox aureus Colonial

(cenobio) 1

Hy3

Cyanobacteria Lyngbya lutea Filamentoso 100

Chlorophyta

Asterococcus

limneticus Colonial 47

Closterium

cornu Unicelular 1

Closterium

ehrenbergii Unicelular 5

Closterium lineatum

Unicelular 3

Closterium

parvulum Unicelular 1

Spirogyra

ternata Filamentoso 9

Los índices de diversidad establecen que el ambiente más diverso es el parche de H.

marginata, la cual estuvo soportada en una equidad máxima, pese a su menor riqueza.

Los índices de dominancia fueron elevados en espejo y H. amplexicaulis debido a las

grandes abundancias de unas pocas especies (Tabla 21).

Tabla 21. Algunos índices de diversidad empleados para caracterizar la comunidad fitoplanctónica del humedal de El Clavo (enero 2009). Salida: PAST.

Índice Heliconia marginata Espejo de agua Hymenachne amplexicaulis

Riqueza (S) 5 8 9

Equidad (J´) 1,000 0,338 0,502

Shannon-Wiener (H´) 1,609 0,702 1,103

Dominancia de Simpson (D) 0,200 0,650 0,424

Berger-Parker (d) 0,200 0,790 0,556

El índice de similitud de Jaccard suministró información probabilística de los ambientes

a partir de su composición en especies. Las dos zonas con vegetación emergente

fueron más parecidas entre sí que respecto al espejo de agua (Tabla 22).

Tabla 22. Índice de similitud de Jaccard para las tres zonas estudiadas en el Clavo, Edo. Miranda (enero de 2009). El análisis se hizo en PAST.

Heliconia hirsuta Espejo de agua Hymenachne

amplexicaulis

Heliconia marginata 1 0,54054 0,64706

Espejo 0,54054 1 0,51429

Hymenachne amplexicaulis 0,64706 0,51429 1

98

La figura 35 muestra una serie de fotos, donde se exhiben ejemplares de especies

representantes de la comunidad fitoplanctónica del humedal de El Clavo.

Figura 35. Algunas especies de microalgas representantes del fitoplancton del humedal de El Clavo, Barlovento, Edo. Miranda: (a) Lyngbya lutea (Cyanobacteria), 400x; (b) Pinnularia sp. (Bacillariophyta), 400x; (c) Asterococcus limneticus (Chlorophyta), (d) Micrasterias sol (Chlorophyta), 250x; (e) Closterium ehrenbergii (Chlorophyta); 250x; (f) Spirogyra ternata (Chlorophyta), 250x. Fotos: Rubén Torres, cámara digital PAX-CAM acoplada a microscopio invertido y a computador (programa PAX-IT!).

En términos generales, para cada una de las fechas en las que se visitó el humedal de

El Clavo, las mayoría de las variables fisicoquímicas tuvieron gran uniformidad en los

diferentes puntos muestreados dentro de la zona de H. marginata, único parche de

(a) (b)

(c) (d)

(e) (f)

99

vegetación donde se tomaron esas mediciones dentro del ámbito del estudio. La

profundidad de la lámina de agua disminuyó rápidamente de enero a febrero conforme

la estación seca se aproximó, señal de que la época fue una transición de lluvia a

sequía y los valores de oxígeno y conductividad variaron (Tabla 23).

Tabla 23. Valores medios desviaciones estándares de las variables fisicoquímicas tomadas en la zona de Heliconia marginata del humedal herbáceo de El Clavo, Edo. Miranda en enero - febrero de 2009.

Salida Profundidad

(cm)

Temperatura

(°C) pH %O2 [O2]mg/L CE (μS)

CE

específica

(μS/cm)

Salinidad

(‰)

05/01/2008 69,2 15,4 – 6,28 0,1 2,2 1,3 0,3 0,2 87,1 2,1 86,8 2,1 <<1

26/01/2008 13,7 7,0 24,7 0,6 5,92 0,2 8,7 6,4 0,7 0,5 108,36,1

107,25,8

0,1 0

30/01/2008 11,3 4,6 22,5 0,3 5,58 0,3 10,29,3

0,9 0,8 99,436,5

94,434,6

0,1 0

07/02/2008 12,7 6,4 24,7 0,9 6,41 0,1 6,5 1,9 0,5 0,1 104,08,4

102,86,9

0,1 0

14/02/2008 13,7 5,7 24,6 0,3 6,17 0,4 3,9 0,6 0,7 0,3 133,861,2

132,560,4

0,1 0

01/03/2008 11,3 4,6 23,1 0 5,73 0,2 10,83,2

1,0 0,4 154,461,5

149,457,9

0,1 0

Las mediciones de conductividad eléctrica (CE) y concentración de oxígeno (O2)

fluctuaron entre los puntos a lo largo del seguimiento. Dichas fluctuaciones

principalmente fueron notables en el oxígeno, pero ambas variables mostraron

tendencias al incremento de sus valores a lo largo del tiempo, conforme la profundidad

de la lámina de agua disminuyó (figura 36).

Figura 36. Variaciones temporales de (a) conductividad eléctrica y (b) oxígeno disuelto a medida que la lámina de agua disminuyó en el parche de Heliconia marginata (enero – febrero 2009).

(b)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1 2 3 4 5 6

Tiempo (días)

[O2] m

g/L

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

Pro

f. (

cm

)

[O2]mg/L Profundidad (cm)

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

140,0

160,0

180,0

1 2 3 4 5 6

Tiempo (días)

CE

(μ

S)

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

Pro

f. (

cm

)

CE (μS) Profundidad (cm)

(a)

100

0

1

2

3

4

5

6

7

1,2,3 4,5 6

Muestra

Co

nc.

N (

mg

/L)

Los nutrientes determinados para el estudio en El Clavo fueron dos de los elementos

más importantes y limitantes para las plantas y el fitoplancton: el nitrógeno (N) y el

fósforo (P). La determinación de N total por método Kjeldahl (1883) resultó en una

concentración de 2,94 g/L de N para una muestra combinada 1-2-3, 6,44 g/L para otra

muestra combinada 4-5 y finalmente una concentración de 2,31 g/L para la muestra 6.

Llama la atención que en la muestra combinada 4-5 la concentración de N duplica a la

determinada en la muestra combinada 1-2-3 y casi triplica al contenido de la muestra

6, siendo todas muestras provenientes de la misma zona de H. marginata y tomadas

en la misma fecha. El punto de quiebre en la determinación de N lo determinó la

cantidad de ácido clorhídrico (HCl) empleado para cada titulación, ya que se necesitó

verter un volumen doble de HCl en la bureta para hacer el viraje a la coloración final de

la muestra combinada 4-5; la relación del volumen de HCl con la concentración de N

total es lineal o directa (figura 37).

Figura 37. Concentraciones de nitrógeno (N) en las muestras de agua colectadas en la zona de Heliconia marginata en la primera salida de campo al humedal de El Clavo (05/01/2009).

Las concentraciones de fósforo total (P) en fracciones de las mismas muestras

anteriormente mencionadas, se determinaron a partir de la curva de calibración

resultante de la medición de patrones de distintas concentraciones a las que se midió

su absorbancia a λ = 640 nm. En la muestra combinada 1-2-3 la concentración de P

fue 0,01 mg/L; en la muestra combinada 4-5 la concentración de P arrojó un resultado

físicamente ilógico, pues se trata de una concentración negativa (-4,61 mg/L), producto

de una transmitancia de 100% que al aplicar el factor de conversión a absorbancia

101

y = 0,4401x + 0,0308

R2 = 0,9949

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6

Concetracion de fósforo (mg/L)

Ab

so

rban

cia

(λ =

640 n

m)

derivó en el valor negativo señalado, lo que se traduce en una interpretación dual: (1)

no había P en la muestra o (2) se produjo un error experimental en algún paso de la

marcha analítica; la muestra 6 produjo el valor más alto de contenido de P en agua

(0,19 mg/L). La figura 38 muestra la curva de calibración con la indicación de los

conjuntos de pares ordenados o interceptos de las absorbancias experimentalmente

determinadas, e introducidas en la ecuación de regresión lineal, así como sus

correspondientes valores en miligramos por litro, con la salvedad de la muestra

combinada 4-5, por lo ya reseñado.

Figura 38. Curva de calibración para la obtención de fósforo total en agua de las muestras tomadas en la zona de Heliconia marginata en la primera salida de campo al humedal de El Clavo (05/01/2009).

En enero de 2010 se muestrearon una serie de lagunas de inundación del bajo

Orinoco, al sur de Monagas, próximas al puente Orinokia. La composición del

fitoplancton consta de cuatro grandes grupos, en orden de importancia: Cyanobacteria,

Chlorophyta, Bacillariophyta y Euglenophyta. La Tabla 24 presenta los taxa del

fitoplancton de cada localidad, en total 77 especies de los cuatro grupos antes

mencionados. Entre los componentes más importantes destacan las cianobacterias

filamentosas (Lyngbya circumcreta, Anabaena flos-aqua y A. planctonica) dominantes

en las localidades de Los Pocitos y Macapaima, y Lyngbya circumcreta dominó en las

dos lagunas anteriores y en la laguna Ramonero. Entre las coloniales destacaron

Microcystis elastica y M. parasitica en Los Pocitos y Macapaima; Gloeocapsa

(0,11;0,19 mg/L)

(0,04;0,01 mg/L)

102

aeruginosa fue importante en Macapaima. La cianobacteria unicelular Chroococcus sp.

destacó por su abundancia en Bañador. En Macapaima y Palital se encontraron

individuos de Spirulina subsalsa. De los grupos restantes, resaltan la diatomea

Achnanthes sp. en La Redonda, y la euglenofita Trachelomonas sp. en Guarampo. A

pesar de que ninguna especie de clorofita resultó numéricamente dominante, el grupo

fue el primero en número de especies y tercero en abundancia.

Tabla 24. Lista de especies y abundancia (cel./L) del fitoplancton en aguas libres de las lagunas estudiadas en el bajo Orinoco, sur de Monagas.

Grupos/Estaciones

Los

Pocit

os

Maca

paim

a

Pali

tal

Bañ

ad

or

La R

ed

on

da

Gu

aram

po

Las

Palo

meta

s

Ram

on

ero

Cyanobacteria

Unicelulares

Chroococcus sp. 886044

Filamentosas

Anabaena planctonica 1272000 1172640 439880 128822 56538 515560

A. flos-aqua 1600968 1549560 12564 40846 34052

A. spiroides 400000 78000 37704

Lyngbya sp. 4282

L. circumcreta 3000656 1900830 515288 2698000

L. limnetica 905628 161238 153958 15710 180084

Oscillatoria sp. 282690 15710 18852 96324

Spirulina subsalsa 52350 4188

Total filamentosas 7179252 5197308 21034 1203386 147674 15710 332946 3247612

Coloniales

Aphanocapsa biformis 234528 288972

A. pulchra 213588 188460 345821

Gloeocapsa aeruginosa 196836 586320 18846 97402 105090

Microcystis inserta 169614 41880

M. minima 200541

M. elastica 586320 339228 2094 223082

M. parasitica 335040 586320

M. robusta 196836 83760 14658 116254 3142 2094 4084 40787

Aphanocapsa biformis 234528 288972

A. pulchra 213588 188460 345821

Gloeocapsa aeruginosa 196836 586320 18846 97402 105090

103

Tabla 24. Continuación.

Grupos/Estaciones

Los

Pocit

os

Maca

paim

a

Pali

tal

Bañ

ad

or

La R

ed

on

da

Gu

aram

po

Las

Palo

meta

s

Ram

on

ero

A. pulchra 213588 188460 345821

G. aeruginosa 196836 586320 18846 97402 105090

Microcystis inserta 169614 41880

M. minima 200541

M. elastica 586320 339228 2094 223082

M. parasitica 335040 586320

M. robusta 196836 83760 14658 116254 3142 2094 4084 40787

Merismopedia sp. 12564 12568

M. punctata 10470 282690 3142 3142 35598

Nostoc sp. 113076 2094

Total coloniales 2056308 2399724 48162 452448 6284 2094 39682 692239

Total Cianobacterias 9235560 7597032 69196 1655834 153958 17804 372628 3939851

Chlorophyta

Actinastrum

hantzschii

15710

Artrodesmus sp. 33504

Bambusina sp. 20940

Closterium sp. 10470 41880

C. acutum 3142

C. aplanatum 197946

C. cetaceum 20940

C. kützingii 15710

C. ehrenbergii 4188

C. macilentum 113076 9426

Coelastrum cambricum

37692 12564

Cosmarium sp. 4188

C. bioculatum 3142

C. denticulatum 6284

C. logiense 2094

C. margaritiferum 6284

Euastrum ansatum 2094

E. elegans 2094

E. pulchellum 16752

Gonatozygon sp. 12568

104

Tabla 24. Continuación.

Grupos/Estaciones

Los

Pocit

os

Maca

paim

a

Pali

tal

Bañ

ad

or

La R

ed

on

da

Gu

aram

po

Las

Palo

meta

s

Ram

on

ero

G. pilosum 23034

Kirchneriella lunaris 2094 37692

Pediastrum duplex 41880

P. tetras 2094 9426 6284 25128

Scenedesmus sp. 167520 12564 9426

S. armatus 2094 6284

S. bimorfus 6284

S. brasiliensis 41880 16752

S. intermedius

S. quadricauda 73290 50272

Selenastrum gracile 4188

Spirogyra sp. 12564 3142

S. gracile 18846 6284 3142

Staurastrum sp. 31410 12568

S. brasiliense 10470

S. leptocladum 3142

S. noticum 3142 3142

S. tetracerum 2094

Staurodesmus sp. 8376

Tetraedrum

arthrodesmiformis

14658

T. minimum 6284

Ulothrix zonata 4188

Xanthidium sp. 2094

Total Chlorophyta 0 544440 211494 122538 270212 50258 77478 0

Bacillariophyta

Achnanthes sp. 249186 97402 628400 297348

A. lanceolata 3142

A. heteromorpha 12568

Actinella guianensis 3142

Gomphonema sp. 4188 12568

G. tenellum 12564

Hydrosera sp. 4188

Melosira granulata 10470 226152 21994 6284 50272 108888 138943

Pinnularia sp. 8376 3142 9426

105

Tabla 24. Continuación.

Grupos/Estaciones

Los

Pocit

os

Maca

paim

a

Pali

tal

Bañ

ad

or

La R

ed

on

da

Gu

aram

po

Las

Palo

meta

s

Ram

on

ero

P. dactylus 4188

P. hemiptera 12564

P. pectinata 9426

P. singularis 33504 8376

Tryblionella rustica 2094 3142 230340

Total

Bacillariophyta

10470 226152 330852 122538 678672 59698 644952 138943

Euglenophyta

Trachelomonas sp. 2094 593838 60726

Total Euglenophyta 2094 593838 60726

Total Fitoplancton 9246030 1449048 1553748 4141156 3010036 4739076 3815268 4257734

Los índices de diversidad señalan que las lagunas con mayor variedad fueron

Macapaima y Palital, puesto que tuvieron las mayores riquezas y equidades, junto con

Los Pocitos, el tercer ambiente más diverso y que presentó la misma equidad que

Macapaima. En las lagunas donde la equidad disminuyó, los índices de dominancia

aumentaron, además las riquezas también resultaron bajas en los mismos, lo que trajo

como consecuencia valores de diversidad relativamente bajos (Tabla 25).

Tabla 25. Algunos índices de diversidad empleados para caracterizar la comunidad fitoplanctónica de lagunas de inundación del bajo Orinoco (sur de Edo. Monagas), para enero de 2010. Salida: PAST.

Índice Los

Pocitos Macapaima Palital Bañador

La

Redonda Guarampo

Las

Palometas Ramonero

Riqueza (S) 24 35 43 29 25 9 14 14

Equidad (J´) 0,82 0,82 0,75 0,73 0,48 0,34 0,80 0,68

Shannon y Wiener

(H´) 2,59 2,92 2,82 2,45 1,54 0,74 2,12 1,80

Dominancia de

Simpson (D) 0,12 0,08 0,15 0,13 0,37 0,68 0,15 0,29

Berger-Parker (d) 0,26 0,17 0,37 0,27 0,57 0,82 0,26 0,52

Por su parte, el índice de similitud de Jaccard revela que los ambientes de mayor

similitud en el número y abundancias de especies comunes fueron Macapaima y Los

Pocitos. Los otros ambientes mostraron pocas similitudes entre sí, por lo que cada una

de esas lagunas tuvo una composición de especies diferente (Tabla 26).

106

Tabla 26. Índice de similitud de Jaccard para las lagunas estudiadas en el bajo Orinoco, sur del Edo. Monagas (enero de 2010). En rojo se resaltan los valores más altos. Salida: PAST.

Los Pocitos Macapaima Palital Bañador La Redonda Guarampo Las Palometas Ramonero

Los Pocitos 1 0,69 0,14 0,36 0,11 0,14 0,19 0,46

Macapaima 0,69 1 0,18 0,39 0,13 0,10 0,17 0,32

Palital 0,14 0,18 1 0,24 0,13 0,13 0,14 0,12

Bañador 0,36 0,39 0,24 1 0,20 0,15 0,26 0,26

La Redonda 0,11 0,13 0,13 0,20 1 0,13 0,26 0,11

Guarampo 0,14 0,10 0,13 0,15 0,13 1 0,44 0,15

Las Palometas 0,19 0,17 0,14 0,26 0,26 0,44 1 0,17

Ramonero 0,46 0,32 0,12 0,26 0,11 0,15 0,17 1

Un análisis de componentes principales (ACP) permitió establecer relaciones entre las

especies fitoplanctónicas y zooplanctónicas más importantes en el análisis descriptivo

e iterativo, para la eliminación sistemática de especies con pocas varianzas y raras

que redundaron en información. Los dos primeros ejes retuvieron 95,4% de la varianza

del sistema multidimensional. Las cianobacterias Anabaena planctonica, Lyngbya

circumcreta y L. limnética, y los rotíferos Brachionus havanaensis, Keratella americana

y Lecane proiecta fueron las especies escogidas para este análisis puesto que

tuvieron las mayores varianzas y correlaciones con los primeros componentes

principales. La figura muestra el biplot, donde las tres especies de cianobacterias

estuvieron fuertemente relacionadas a los dos primeros componentes principales, y

los organismos L. circumcreta y L. limnética al primer componente principal, y A.

planctonica al segundo componente principal. Los rotíferos no aparecen en este biplot,

puesto que estuvieron relacionados con otros componentes, sus abundancias y

varianzas resultaron muy inferiores a las de las especies fitoplanctónicas, de las que

se contaron hasta millones de células por litro. Lyngbya circumcreta estuvo asociada a

la laguna Ramonero y totalmente superpuesta a L. limnetica (máxima correlación). Las

lagunas Guarampo, Palital, La Redonda y Las Palometas estuvieron muy asociadas

entre sí (figura 39).

En Mantecal se muestrearon algunos bajíos, esteros (pastizal) y espejos de agua, en

etapas finales de lluvias o inicio de la transición de lluvia a sequía (noviembre de

2010). Se hicieron muestreos puntuales en cada estrato a lo largo del gradiente

ambiental desde el bajío hasta el espejo.

107

Figura 39. Biplot de los dos primeros componentes principales del ACP para los ambientes lagunares del Orinoco bajo, sur de Monagas. Los dos primeros componentes principales retuvieron 95,4% de la inercia total del sistema multidimensional original. Salida: MVSP 3.0.

La Tabla 27 muestra la composición de especies fitoplanctónicas en tres ambientes de

los módulos inundables de Mantecal. Dominaron las clorofitas, seguidas de las

cianobacterias y en menores proporciones las euglenofitas y diatomeas. Las especies

más abundantes fueron las clorofitas Desmidium baylei y Scenedesmus brasiliensis en

bajío, Euastrum pectinatum en bajío y pastizal y Cosmarium subtumidum en pastizal.

La cianobacteria Microcystis aeruginosa fue el principal representante de este grupo

en las muestras, y también se hallaron filamentos de Arthrospira sp. El espejo de agua

fue el ambiente menos rico en especies y también exhibió las menores densidades

poblacionales.

Tabla 27. Composición y abundancia (células por litro) de la comunidad fitoplanctónica de tres ambientes de los módulos inundables de Mantecal (noviembre 2010).

Taxa Bajío Pastizal Espejo

Cyanobacteria

Anabaena planctonica 5416 745 45

Arthrospira sp. 1285 4545

Chroococcus sp. 2569 458 89

CP 2

CP 1

Los PocitosMacapaima

Palital

Bañador

La Redonda

GuarampoLas Palometas

Ramonero

-193789.5

-387578.9

193789.5

387578.9

581368.4

775157.9

968947.3

-193789.5-387578.9 193789.5 387578.9 581368.4 775157.9 968947.3

Anabaena planctonica

Lyngbya circumcretaLecane proiectaBrachionus havanaensisKeratella americanaLyngbya limnetica

Vector scaling: 807456,00

108

Tabla 27. Continuación.

Cylindrospermum muscicola 1526

Lyngbya circumcreta 1045

Merismopedia glauca 748 1256

Microcystis aeruginosa 14025 225

M. flos-aqua 4188

Nostoc sp. 458 236

Oscillatoria tenuis 4326 4589

Chlorophyta

Cosmarium sp. 457 2546

Cosmarium subtumidum 4458 14565

Closterium ehrenbergii 784 6821

Desmidium baylei 45126 4895

Euastrum crassum 1546 74

Euastrum pectinatum 12546 15878

Hyalotheca sp. 3012 485 152

Micrasterias sol 1458 5963 58

Scenedesmus brasiliensis 15689 856

Scenedesmus quadricauda 4589 589

Staurastrum paradoxum 2589

Staurastrum triangularis 451 5846

Euglenophyta

Trachelomonas superba 745 1265 2548

Phacus orbicularis 512

Bacillariophyta

Achnanthes lanceolata 452

Gomphonema sp. 74 859 412

Una observación de los índices de diversidad permite fácilmente advertir que en el

pastizal se conjugan una riqueza y equidad elevadas que se combinan para la

obtención de un valor de diversidad Shannon-Wiener relativamente alto, si se compara

con los otros ambientes contiguos. El bajío fue el segundo lugar más diverso, donde

riqueza y equidad disminuyeron un poco. El espejo fue menos rico y equitativo que los

otros dos ambientes, y los índices de dominancia, especialmente el de Berger-Parker,

subieron en forma notable (Tabla 28).

Tabla 28. Algunos índices de diversidad empleados para caracterizar la comunidad fitoplanctónica entres ambientes de los módulos inundables de Mantecal (Edo. Apure), en noviembre de 2010. Salida: PAST.

Índice Bajío Pastizal Espejo

Riqueza (S) 19 22 8

Equidad (J´) 0,744 0,803 0,611

Shannon y Wiener (H´) 2,189 2,483 1,271

Dominancia de Simpson (D) 0,181 0,114 0,387

Berger-Parker (d) 0,365 0,208 0,553

109

El índice de Jaccard muestra que el bajío y el pastizal tuvieron una gran similitud, y

que el espejo fue un ambiente totalmente diferente a ambos (Tabla 29).

Tabla 29. Índice de similitud de Jaccard para comparación de los tres ambientes estudiados en Mantecal (Edo. Apure). Salida: PAST.

Bajío Pastizal Espejo

Bajío 1 0,640 0,285

Pastizal 0,640 1 0,304

Espejo 0,286 0,304 1

Fosas petroleras y lagunas con emanaciones naturales de crudos. La figura 40

muestra un conjunto de fotos con observaciones de especies de microalgas de una

muestra de pozo (P57X) del Edo. Bolívar, 2009. La muestra proviene en forma

específica de una pequeña charca fangosa en la parte exterior del pozo mencionado,

enmarcada en un lugar donde se encuentra petróleo, ripios y sedimentos de

perforación. Se evidenciaron muchas cianobacterias filamentosas (principalmente

Oscillatoria tenuis); también hubo una cantidad de euglenofitas y diatomeas pennadas,

y algunas clorofitas (principalmente Scenedesmus spp.).

Figura 40. Imágenes que muestran la composición de especies fitoplanctónicas de una charca fangosa, específicamente proveniente del borde exterior de un área de pozos petroleros en el norte del Edo. Bolívar, 2009.

110

Figura 40. Continuación.

111

Figura 40. Continuación.

112

Figura 40. Continuación.

113

Figura 40. Continuación.

La Fosa El Caracol en la región de Caico Seco, ubicada en el municipio Aragua del

estado Anzoátegui, fue escogida para la búsqueda de especies de microalgas nativas

con gran potencialidad para la producción de biodiesel, por representar un área de

exposición histórica a hidrocarburos que operó durante muchos años como una de las

principales y más grandes recolectoras de desechos petrolíferos de la zona. Se

tomaron muestras de agua libre en tres puntos denominados: Zona I, Zona II y Zona

III.

En la Zona I se identificaron dos géneros de cianobacterias (Chroococcus y

Anabaena), un género de clorofita (Chlamydomonas) y una especie de diatomea

(Tabellaria flocculosa). Para la Zona II se reportaron dos géneros de clorofitas

(Chlamydomonas y Chlorella), un género de cianobacteria (Anabaena, aunque una

especie diferente a la encontrada en la Zona I) y uno de diatomea (Navicula).

Finalmente en la Zona III, a diferencia del resto de las zonas, en esta localidad de

estudio se identificaron cinco géneros de cianobacterias (Lyngbya, Merismopedia,

Aphanocapsa, Synechocystis y Chroococcus) además de una clorofita (Chlorella sp.).

Salinas y lagunas hipersalinas. La laguna de Boca Chica en la isla de Margarita,

Edo. Nueva Esparta, es un ambiente natural extremófilo, con una salinidad elevada (>

40 ppm), que se presenta como una laguna costera en la costa suroeste de la

114

península de Macanao, donde ocurren emanaciones naturales de crudo. Un análisis

de muestras tomadas en este lugar, mayo de 2009, refiere que en las mismas se

encontraron ejemplares de Dunaliella primolecta (Chlorophyta) y Chaetoceros sp.

(Bacillariophyta) en densidades muy bajas, 125 y 145 células por litro,

respectivamente.

La salina de Las Cumaraguas, norte de la península de Paraguaná, Edo. Falcón, es

otro ambiente extremófilo donde se ubica una de las poblaciones naturales de

Dunaliella salina más importantes del Caribe sur. Las muestras colectadas exhibieron

abundancias de 14.000 a 75.000 células por litro, en fase de crecimiento, y se inició el

cultivo de la especie en la Cámara de Crecimiento con la metodología expuesta y

resultados explicados en la sección de cultivos.

Ambientes marinos costeros. En Mochima y Puerto Cabello, entre los años 2009 y

2010, se colectaron muestras de fitoplancton marino donde las diatomeas centrales

(Bacillariophyta) y dinoflagelados dominaron en riqueza y abundancia los ambientes.

En la bahía de Mochima, se encontraron individuos de las diatomea Chaetoceros sp. y

Nitzschia valens, así como la haptofita Isochrysis galbana, en densidades bajas (100 a

250 células por litro). En el muelle de Puerto Cabello se hallaron blooms (o

afloramientos) de la diatomea Coscinodiscus sp. (>17.000.000 de células por litro), el

dinoflagelado colonial Alexandrium catenella (>15.000.000 de células por litro) y la

cianobacteria Anabaena sp. (>5.000.000 de células por litro).

Síntesis de los ambientes. La figura 41 muestra una síntesis gráfica de todas las

regiones muestreadas y las composiciones porcentuales del fitoplancton en cada

lugar. Se muestra que en los ambientes de aguas continentales las cianobacterias,

diatomeas y clorofitas fueron los grupos más representativos. Las euglenofitas

constituyeron otros representantes de agua dulce encontrados en porcentajes muy

inferiores, pero en la fosa petrolera de Bolívar se evidencia una gran importancia

numérica de este taxón, junto a cianobacterias, clorofitas y diatomeas en porcentajes

menores. Las clorofitas del género Dunaliella resultaron muy importantes en

ambientes hipersalinos, con una dominancia absoluta en las salinas de Las

Cumaraguas. En medios marítimos, las diatomeas, pirrofitas (o dinoflagelados) y las

haptofitas, éstas en Mochima representadas por Isochrysis galbana, resultaron los

taxones predominantes. Con esta representación gráfica de las divisiones de

cianobacterias y microalgas eucariotas, se comprueban las grandes variaciones

porcentuales de los taxones mayores del fitoplancton, como consecuencia de la

variedad de ambientes acuáticos representados en el país.

115

Figura 41. Composiciones porcentuales de las divisiones de organismos procariotas y eucariotas integrantes de la comunidad del fitoplancton en las regiones estudiadas en el país a lo largo del estudio.

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

Co

mp

osi

ció

n p

orc

en

tual

Haptofitas

Pirrofitas

Euglenofitas

Diatomeas

Clorofitas

Cianobacterias

116

8. Discusión

8.1 Cultivos

Los medios preparados para mantenimiento y experimentos se caracterizaron por sus

componentes exclusivamente minerales (medios minerales), es decir, sólo se

emplearon sales inorgánicas sin la incorporación de fuentes orgánicas para los

macronutrientes (Ej.: urea como fuente de nitrógeno) y micronutrientes. La única

incorporación orgánica a los medios minerales fue el EDTA disódico, el cual no

funcionó como nutriente, sino como agente quelante que “secuestró” iones Hierro II

(Fe2+) y calcio (Ca2+). Por este mecanismo ambos cationes permanecieron como

formas solubles en agua. En el caso específico del Fe2+, la acción del quelante evitó

que se oxidara a Hierro III (Fe3+) y reaccionar con el fósforo del medio, para formar un

precipitado de fosfato férrico, lo que trae como consecuencia la no disponibilidad de

este nutriente para las microalgas. De forma homóloga, la mediación del quelante

impidió que el ion calcio hiciese precipitar a los aniones fosfato y sulfato.

Por otro lado, no hubo necesidad de suplementar con vitaminas y carbohidratos

(cultivos mixotróficos) a ningún medio nutritivo, a pesar de formar parte de sus

formulaciones. Ciferri (1983) y Duerr y col. (1997) mencionan que cultivos mixotróficos

producen una cantidad de biomasa elevada en comparación con la autotrofía (medios

minerales para microalgas, incluidas fuentes inorgánicas de carbono, como los

empleados en esta investigación) y heterotrofía. Dicha aseveración se puede deber al

efecto energético de la incorporación de carbohidratos a los medios, así como la

actuación eficiente de las vitaminas como coenzimas en muchos procesos catabólicos.

Además, estos aditivos orgánicos aumentan el valor nutricional de la biomasa de

microalgas. No obstante, adiciones de carbohidratos simples como glucosa, sacarosa

o fructosa, también producen crecimientos rápidos y descontrolados de bacterias, las

cuales pueden ser patógenas y mortales para los cultivos. Otros microorganismos

favorecidos por la adición de carbohidratos y vitaminas son las microalgas invasoras,

las cuales suelen poseer tasas de crecimiento per cápita (r) superiores a las de

especies de valor biotecnológico, como Arthrospira spp. y Spirulina spp., las que

pueden ser desplazadas por competencia. El medio altamente básico (pH>9,5) donde

crece A. platensis es un escudo o primera línea de defensa para estas especies

primitivas, las cuales evolucionaron en esos ambientes agrestes e inhóspitos para casi

cualquier otra forma de vida (Ciferri 1983).

Para el medio Schlösser (1994, modificación del medio Aiba y Ogawa (1977)), un

aporte importante realizado por Parra (2005) fue la sustitución en algunas sales, del

117

catión sodio (Na+) por el catión potasio (K+), para generar una relación Na+ : K+ 4 a 1

(la proporción en el medio original es de 10 a 1). Este ajuste tuvo por finalidad una

mayor aproximación a las condiciones imperantes en los medios naturales de A.

platensis en los lagos carbonatados de África (L’évêque 1987).

La razón de la adaptabilidad de la cepa Lefevre de A. platensis a las condiciones

naturales del país puede derivar de las características del lugar de origen de esa

variedad, África tropical (específicamente borde sur del desierto del Sahara). Las

similitudes climáticas en temperatura y radiación solar altas durante la mayor parte del

año son adecuadas para esa cepa silvestre, más que para otras que sólo se han

cultivado en invernaderos y condiciones controladas de manera persistente. Los

ambientes naturales de A. platensis son lagos y lagunas carbonatados, cerrados,

altamente alcalinos con valores de temperatura y radiación solar elevados. Estos

cuerpos de agua están confinados a regiones desérticas tropicales y subtropicales en

el interior de los continentes y, en general, son ambientes naturales muy hostiles, por

lo que a menudo los centros urbanos están apartados de ellos (Jones y Grant 1999).

La composición de los medios de cultivo afecta la tasa de crecimiento y producción de

biomasa de los microorganismos, y define el costo de producción del mismo (Raoof y

col. 2006). Por esa razón, para esta investigación fue de gran importancia obtener

medios de cultivo óptimos que permitiesen maximizar la producción y minimizar los

costos. Por ejemplo, el empleo de sales grado técnico y alimenticio, en lugar de sales

grado reactivo o analítico de precios muy elevados debido a sus altos grados de

pureza, ha permitido la viabilidad económica de los experimentos. Por otro lado, en

numerosas oportunidades sales de alta pureza han demostrado ser menos nutritivas

que las de grado técnico o alimenticio. Estas impurezas constituyen valores nutritivos

agregados que aumentan la calidad nutricional de los medios preparados.

8.2 Ensayos con poblaciones de Arthrospira platensis

Los ensayos factoriales 22 permitieron llegar a una primera aproximación del proceso

de optimización de los medios de cultivos, con el propósito firme de conocer y procurar

tasas de crecimientos poblacionales y rendimientos de biomasa óptimos para la meta

de aprovechamiento biotecnológico de A. platensis. Los medios 1 y 2 presentaron una

dinámica similar, lo cual indica que el intervalo de variación de las concentraciones de

Na+ y K+ no afectaron la tasa de crecimiento poblacional, por lo que puede explorarse

la posibilidad de disminuir las concentraciones de estos iones hasta un mínimo que

permita mantener esta tasa de crecimiento. La tasa de crecimiento ligeramente menor

del medio 3 indica que un incremento del Cl- pudo afectar en forma desfavorable el

118

crecimiento de A. platensis. En el caso de la curva de crecimiento del medio 4, con

una fase de latencia y adecuación muy prolongada, la misma señala que una

disminución pronunciada del Cl- en conjunto con el SO42- incrementan de modo

apreciable dicha adaptación al medio. Sin embargo, la baja concentración de estos

iones no afecta la tasa de crecimiento una vez alcanzada la fase exponencial.

En los ensayos se lograron ajustes del pH del medio de cultivo a un valor de 10,5, una

unidad por encima de lo establecido por Melack (1979), lo que significó una mejor

aproximación al pH del medio natural de A. platensis. Los cambios incorporados por

Parra (2005), y reajustes posteriores en el segundo ensayo factorial 22, determinaron

que el pH del medio se mantuviera estable por un tiempo prolongado y con pocas

variaciones en la conductividad, de este modo siendo alcanzadas las condiciones

óptimas para el crecimiento de A. platensis. Estas condiciones de laboratorio se

corresponden con los trabajos de Wood y Talling (1988), Njuguna (1988), Melack

(1988) y Jones y Grant (1999), donde se reportan alcalinidades extremas y

osmolaridades elevadas de los ambientes originarios de esta cepa.

A un pH de 8,5, el medio de cultivo de A. platensis frecuentemente se contaminó con

otras especies de microalgas (principalmente de los géneros de cianobacterias

Anabaena, Microcystis y Oscillatoria), las cuales se encuentran comúnmente en el

agua potable, lo que visualmente originó matices de color verde diferentes al verde-

azul, característico de los medios observados cuando A. platensis es la única especie

existente. Sena y col. (2011) mencionan un tratamiento de alta alcalinidad (pH 12, con

empleo de KOH) de 72 h, como procedimiento inicial determinante para eliminar a

Microcystis spp. y otras cianobacterias, partiendo del hecho de que A. platensis

sobrevive a condiciones de dureza y alcalinidad extremas en lagos de soda (en inglés

“soda lake”). La toxicidad de un medio muy alcalino con contenido de sales potásicas

como KOH o K2CO3 para cianobacterias invasoras u oportunistas como Microcystis

aeruginosa, aparentemente viene del hecho de que esta especie y congéneres tienen

densidades bajas de canales de potasio, por lo que una entrada masiva de iones

potasio (K+) al compartimento intracelular no permite su salida rápida por los canales,

debido a su insuficiencia numérica, y ocurre un gran desequilibrio electroquímico con

inversión de la polaridad de la membrana plasmática. La consecuencia final es la

muerte de la célula por intoxicación con potasio.

Para la cuantificación del peso neto de la biomasa de A. platensis, resultó necesario

determinar una relación lineal entre la absorbancia y el peso seco de la biomasa, de tal

manera de conocer su peso neto en cualquier instante de tiempo de manera rápida,

precisa y no destructiva. Boussiba y Richmond (1979) fueron los únicos en cuantificar

119

biomasa seca de microalgas en cultivos controlados, pero no lo hicieron en sentido

estricto, ni mucho menos en una relación lineal para su determinación. Otros autores

como Chen y col. (1996), Chen y Zhang (1997) y Zhang y Chen (1999), no

desarrollaron una metodología cuantitativa para estimar la biomasa, ya que ésta fue

tomada húmeda, lo que puede conducir a errores importantes en la cuantificación de

su peso.

La tasa de crecimiento para un cultivo autotrófico de A. platensis en medio Zarrouk,

obtenida por Chen y Zhang (1997), fue de 0,0083 h-1, mientras que para un cultivo

mixotrófico (suplementado con glucosa) en medio Zarrouk, reportado por los mismos

autores, el valor fue de 0,026 h-1, ambos en condiciones de laboratorio. La tasa de

crecimiento per cápita o de recambio obtenida en este trabajo para el cultivo

autotrófico en medio 1, el más productivo de las cuatro combinaciones obtenidas para

condiciones controladas, fue de 0,50 días-1 = 0,021 h-1, similar a la obtenida por Chen

y Zhang (1997) para el cultivo mixotrófico, y más de dos veces superior a la

conseguida para su cultivo autotrófico. Entonces, para los fines de este trabajo resulta

significativo el rendimiento notablemente superior obtenido en cultivos con medios

minerales, y similar al mixotrófico sin suplir glucosa u otra fuente orgánica.

El ensayo factorial fraccionado 26-1 permitió evaluar el crecimiento diferencial de

poblaciones de A. platensis en un gran número de medios de cultivos simultáneos con

combinaciones aleatorias de macronutrientes. El crecimiento diferenciado para cada

tratamiento puede deberse a que estas cianobacterias crecen en condiciones

altamente selectivas, principalmente en concentraciones altas de sales (Borowitzka

1999). Es evidente que cultivos con tratamientos centrales y algunos con

concentraciones importantes de ciertas sales inorgánicas propiciaron crecimientos

vigorosos y relativamente saludables de las poblaciones de A. platensis, con poca o

nula contaminación de otras especies de microalgas. En contraste, otros tratamientos

fueron poco viables por carencias considerables de una buena parte de los

requerimientos nutricionales de la microalga, disminuyendo notablemente la capacidad

de carga del medio. No es descartable que debido al empleo de sales amónicas en los

tratamientos, sus concentraciones hayan sido suficientemente altas en algunos

recipientes, como para intoxicar o limitar el crecimiento de las poblaciones residentes

de A. platensis, conocido el efecto deletéreo que el amonio en concentraciones altas

tiene sobre esta especie (Boussiba 1989).

Como consecuencia de la selectividad de medios de cultivo de A. platensis, la especie

contó con dinámicas de crecimiento poblacional variables. Vonshak y Richmond

(1985) reportaron que tasas de crecimiento per cápita elevadas se observaron a

120

densidades poblacionales bajas, mientras que tasas de crecimiento bajas estuvieron

relacionadas con limitación por luz en cultivos densos bajo condiciones óptimas a cielo

abierto, lo que coincide con la mayoría de las curvas obtenidas para el ensayo

multifactorial a partir del punto de inflexión, cuyas dinámicas se maximizaron en

medios centrales, como el tratamiento 36, que contaron con las concentraciones

óptimas de los principales nutrientes, en especial las fuentes de carbono.

El tiempo de duplicación (tg) es un parámetro poblacional importante en la

caracterización de la dinámica de crecimiento poblacional de microorganismos, y tiene

gran aplicabilidad en biotecnología como medida de eficiencia de cultivos masivos de

microalgas para maximizar la velocidad y rendimiento de los mismos. Melack (1979)

obtuvo para A. platensis un tiempo de recambio (“turnover time”), comparable con el tg

obtenido en varios de medios del ensayo factorial fraccionado, de 8,9 a 18,9 h en

condiciones naturales en un lago de Kenia. Para especies congéneres de A. platensis

o próximas a ella, se tiene que Tomaselli y col. (1995) determinaron

experimentalmente valores de tg de 27 horas para Spirulina subsalsa en condiciones

de laboratorio; Garnier y col. (1994) obtuvieron un tg de 70 h para A. maxima en

condiciones de laboratorio.

Los cultivos a mayor escala (tanques circulares de 500 L y cultivadores tipo carrusel

de 2000 L) brindaron la oportunidad de probar el medio optimizado en botellones, para

iniciar el cultivo masivo de A. platensis. Es importante resaltar la disposición espacial

de los tanques para el experimento. Debido a que para el momento del ensayo en

tanques se aproximaba el solsticio de invierno, la proyección de la eclíptica solar sobre

el Ficotrón ocurrió a más de 30° al sur, más allá de los 10° respecto al Ecuador, lo cual

constituye una fuente de variación adicional “no deseada”. Para contrarrestar este

efecto, se escogió un “Diseño en Bloques Aleatorios” que permitió extraer la variación

“posible”, producto del fenómeno descrito. El análisis de varianza no produjo

diferencias significativas entre los bloques, lo que hace presumir que la inclinación u

oblicuidad de los rayos solares no tuvo una implicación directa en la dinámica de los

cultivos. En otros términos, la diferencia de minutos transcurridos entre los tanques

que se iluminaron primero en el eje cardinal Este, con los rayos iniciales del alba, y los

últimos tanques en el punto cardinal opuesto iluminados de último, no repercutió de

manera decisiva en el crecimiento de las poblaciones, a pesar de que los

microorganismos responden de manera rápida a cambios igualmente rápidos. La

profundidad de la lámina sí tuvo un efecto significativo, esto debido a que a mayor

profundidad los rayos solares penetran cada vez con menor intensidad y se forman

121

puntos oscuros donde las microalgas no pueden fotosintetizar y mueren, cayendo en

forma notable la productividad primaria.

También es destacable la disminución del rendimiento de la cosecha de biomasa en

cultivos a escalas mayores a las de botellones. En estos recipientes la producción de

biomasa fue alta en buena medida por el volumen de los mismos, pero también a su

disposición inclinada que aumentó en forma notable la superficie de exposición a los

rayos solares. La temperatura es otro factor decisivo en la producción primaria, la

misma en botellones fue 2 o 3ºC superior a los tanques, los cuales tuvieron en contra

su diseño, pues son recipientes muy altos que generan sombra abundante aún en

horas del mediodía y el material (polietileno) no es conductor de calor. En estanques

tipo carrusel el volumen empleado es de 2000 L, la capacidad calórica aumenta aún

más, no obstante sus temperaturas fueron ligeramente más altas que las de los

tanques, ya que este tipo de cultivadores tiene un diseño de superficie amplia con

poca profundidad (lámina delgada), lo que genera mayor exposición a los rayos

solares y generación de pocos puntos muertos o zonas no iluminadas. No obstante, la

producción de biomasa no fue elevada, quizá debido a algún factor físico como la

temperatura, para la cual hubo un seguimiento y se registraron valores moderados a

bajos (18 - 20°C en horas diurnas; 17 - 19°C durante las noches). La causa alternativa

puede obedecer a la preparación y suministro de medio nutritivo en cantidades

suficientes, así como sus solubilidades, tomando en cuenta los altos grados de

impurezas de las sales grado técnico o alimenticio aplicadas, en ocasiones

conformadas por conglomerados muy compactos.

La estructura de tallas en la población de filamentos de A. platensis permite explicar

mecanismos de autorregulación poblacional típicos de poblaciones con

densodependencia. A densidades poblacionales muy bajas, los recursos (luz y

nutrientes) son disponibles y predominan tricomas muy cortos y hormogonios

(filamentos reproductivos de las cianobacterias del Orden Oscillatoriales constituidos

por sólo dos células), lo que permite una adaptación rápida al medio y crecer en forma

exponencial, una vez se inicia la fase de crecimiento rápido. En el proceso de

maduración del cultivo, empiezan a dominar filamentos o tricomas de gran tamaño

(con muchas células) y en la fase de saturación la tasa de crecimiento instantánea se

reduce notablemente hasta llegar a cero en la capacidad de carga. En esta etapa no

hay producción de hormogonios y los filamentos maduros no reproductivos son el

componente de talla ampliamente predominante en el cultivo en fase de equilibrio.

Entonces, cuando la capacidad de carga es alcanzada, no hay incremento poblacional

122

y la población se atenúa u ocurren retrasos (oscilaciones amortiguadas y ciclos)

asociados a efectos de la densidad alrededor del punto de equilibrio estable (K).

La tasa de crecimiento per cápita explica la recuperación de una población luego de

una perturbación (May 1976). Una perturbación por extracción de una parte de la

población en estado de equilibrio puede ser respondida en función del tamaño de las

poblaciones remanentes en el medio y de su tasa intrínseca de crecimiento per cápita.

La tasa de crecimiento elevada de A. platensis, principalmente en condiciones

naturales, es debida a su forma de reproducción vegetativa por escisión de filamentos

y generación de hormogonios que se multiplican radialmente por fisión binaria en

pocos días. La perturbación no puede ser total o llegar a niveles basales, porque las

poblaciones remanentes en el cultivo son pequeñas y biológicamente inviables, lo que

puede conducir a la extinción. Una remoción de 75% y reemplazo con medio nutritivo

nuevo generó un efecto de dilución que no permitió que la población se adecuara en

forma rápida. Esto no es conveniente en términos biotecnológicos, puesto que se

busca maximizar el rendimiento de cosecha con una tasa de recuperación o resiliencia

elevada.

Como nota complementaria para el tema de poblaciones, llama la atención la

morfología rectilínea de los filamentos de A. platensis en condiciones de laboratorio

(Cámara de Crecimiento), cuyos filamentos originalmente tenían una estructura

helicoidal, típica del género. Una sucesión de varias generaciones desde el primer

inóculo en la Cámara de Crecimiento con exposición a luz artificial (400 lux) originó el

cambio a la forma rectilínea. Al respecto, se debe comentar que cuando la cepa fue

llevada al Ficotrón, y los cultivos se aclimataron a condiciones a cielo abierto, la misma

nuevamente empezó a adquirir la morfología helicoidal, luego de su exposición a la

radiación solar por tres generaciones sucesivas. La explicación a esta recuperación

está contenida en la calidad o composición de longitudes de onda de la luz solar,

específicamente a su componente de rayos ultravioletas, los que inducen a un

arrollamiento o arreglo de los tricomas en forma espiral, que generan en los filamentos

regiones alternas de mayor y menor exposición a las radiaciones más fuertes (Ciferri

1983).

En condiciones de laboratorio, la cianobacteria se adecuó a una fuente luz artificial

menos intensa (luz fría) y de menor calidad (a pesar del empleo de las denominadas

lámparas fluorescentes “day-light” que contienen la mayor parte de las longitudes de

onda del visible), y su disposición rectilínea permitió aumentar la superficie de

exposición de los filamentos para captar la luz con mayor eficiencia. En condiciones

naturales, las zonas oscuras o menos expuestas de los filamentos espirales o

123

helicoidales, como adaptación pertinente para hallar protección o menor exposición de

los filamentos a las radiaciones ultravioletas, suelen incrementar en forma notable las

concentraciones de ficocianinas, pigmentos antena exclusivos de las cianobacterias

que contribuyen a la captación de longitudes de onda adicionales a las captadas por la

clorofila a, y que contribuye al incremento de su eficiencia fotosintética. Resulta de

particular interés biotecnológico la producción de A. platensis (y A. máxima) en

condiciones naturales o semi-controladas a cielo abierto (estanques cerrados) para

obtener poblaciones con morfología helicoidal, por el gran atractivo que brindan las

ficocianinas a la industria de los colorantes y su empleo en salud y farmacéutica como

marcadores moleculares (Henrikson 1994).

8.3 Comunidades fitoplanctónicas

En aguas continentales, los humedales de Paria, Barlovento y Mantecal tienen como

característica común las presencias de grandes formaciones vegetales que ocupan la

mayor parte de su superficie, con predominio de plantas emergentes de hábito

herbáceo, de allí la denominación de humedales herbáceos (Mitsch y Gosselink 2007),

si bien las composiciones de especies, fisionomías y dominancias varían.

Asociaciones del fitoplancton y zooplancton a determinadas clases de vegetación

dentro de un mismo humedal se evidenciaron en análisis de componentes principales.

En el caso del humedal Palmares III, península de Paria, se encontró un patrón en

herradura de los parches de vegetación, lo que conlleva la presunción del

establecimiento de un gradiente espacial, con la composición de especies planctónicas

variando a lo largo de las zonas de vegetación monoespecífica y ecotonos. En este

mismo análisis multivariado se observaron relaciones bióticas entre especies

fitoplanctónicas, y de éstas con algunos organismos zooplanctónicos, como los

cladóceros, los cuales se alimentan del fitoplancton. La disposición parcelada de la

vegetación acuática genera asociaciones diferenciales de las comunidades del

fitoplancton y zooplancton en sus predios. Las intensidades variables de la radiación

solar bajo los techos de las asociaciones de plantas tienen causalidad inmediata en las

disposiciones espaciales o formas de crecimiento de las diferentes especies de

plantas emergentes. La consecuencia de esto es que la calidad de luz que se filtra

hasta la lámina de agua es escasa, por lo que la sombra generada va en detrimento

de la actividad fotosintética del fitoplancton, mientras que para el zooplancton

significan refugios eficaces de depredadores visuales.

La homogeneidad de buena parte de las variables abióticas en el agua robustece el

pensamiento de que la estructura aérea de la vegetación y ciertas condiciones

124

microclimáticas locales son las causas reales del establecimiento de patrones de

distribución espacial de las especies fitoplanctónicas y zooplanctónicas. En los

humedales ubicados en Paria, Barlovento y Mantecal contrastan en modo notable las

composiciones y abundancias de las especies entre los distintos parches de

vegetación. Por otra parte, las distintas zonas de vegetación generaron efectos locales

sobre algunas variables fisicoquímicas, como la concentración de oxígeno

(concomitante a cambios en la concentración de dióxido de carbono) y conductividad,

por tasas de descomposición diferenciales asociadas al tipo de material vegetal y

variaciones en las concentraciones de iones disueltos, respectivamente. En el caso del

humedal de Barlovento, tales cambios en la concentración de oxígeno y conductividad

se relacionaron con la disminución progresiva de la profundidad de la lámina de agua

por advenimiento de sequía, lo que produjo un efecto de concentración de iones. Las

asociaciones de plantas emergentes también establecen microclimas. Las

concentraciones de nutrientes, principalmente el fósforo y el nitrógeno, resultaron

bajas en ese humedal, lo que determina que el flujo de energía y materia para el

funcionamiento del ecosistema está determinado, en modo preponderante, por los

aportes de las plantas acuáticas en forma de hojarasca y materiales en distintos

estados de descomposición que constituye una fuente importante de nutrientes para la

comunidad del plancton (Mitsch y Gosselink 2007). Las cianobacterias pueden

contribuir al incremento de las fuentes de nitrógeno en el humedal mediante la fijación

de nitrógeno atmosférico.

El carácter salobre del humedal Palmares III, según sistema de clasificación de Tabilo-

Valdivieso (1999), se pone de manifiesto en la composición de especies

fitoplanctónicas descritas para este ambiente, en el cual se encontraron microalgas

típicas de agua dulce como clorofitas, euglenofitas y cianobacterias del género

Arthrospira, diatomeas con un espectro amplio de tolerancia a la salinidad (eurihalinas)

de los géneros Navicula y Nitzschia, así como pirrofitas (o dinoflagelados) del género

Protoperidinium y la cianobacteria Spirulina subsalsa, especies principalmente

relacionadas a ambientes estuarinos.

Para lagunas de inundación del bajo Orinoco, las grandes abundancias de

cianobacterias fijadoras de nitrógeno (en especial especies de los géneros Lyngbya y

Anabaena, éstas caracterizadas por sus grandes heterocistos), indican

concentraciones altas de este elemento en Los Pocitos, Macapaima y Ramonero. El

fitoplancton menos abundante en ambientes como Palital, Bañador y La Redonda, con

un número de especies muy alto en el Orden Desmidiales, sugiere que se trata de

ambientes limpios, oligotróficos y con aguas ligeramente ácidas (Comas 2008). Las

125

diatomeas resultaron muy abundantes en Las Palometas y La Redonda, este grupo es

muy importante para la alimentación del zooplancton encontrado en la zona,

principalmente rotíferos y cladóceros. La abundancia de diatomeas en esas lagunas

indica valores de pH ligeramente alcalinos, con presencia de silicatos (Wetzel 1975).

Por su parte, la laguna de Guarampo fue un ambiente diferente en cuanto a la

estructura de la comunidad fitoplanctónica, en este caso hubo abundancias menores

de la mayoría de sus componentes, con predominio notable de euglenofitas del género

Trachelomonas; este tipo de composición fitoplanctónica a menudo caracteriza a

ambientes ricos en materia orgánica y ligeramente eutrofizados (Comas 2008). La

relación estrecha de Guarampo con Palital, Las Palometas y La Redonda en el análisis

de componentes principales se debe a las densidades poblacionales menores

registradas en estos ambientes, mas no a las composiciones de especies, las cuales

son muy diferentes.

En general, para la mayoría de los ambientes de agua dulce estudiados la diversidad

fue alta donde las equidades, y en segundo término las riquezas, contribuyeron en

modo determinante a los valores del índice Shannon-Wiener. La reducción de los

valores de diversidad por equidades bajas incrementaron los índices de dominancia en

algunos sitios, donde se encontraron dominios amplios de algunas especies

fitoplanctónicas. Los estudios con índices de diversidad permiten caracterizar las

comunidades a un nivel simple, como sistemas independientes o aislados. Los índices

de distancia y similitud de Jaccard brindan comparaciones entre comunidades

distintas, donde se establece un segundo nivel de análisis de complejidad comunitaria

(diversidad beta) respecto al estudio de comunidades simples (diversidad alfa) (Del

Pino y col. 2006). En el humedal de Paria, las similitudes entre ambientes contiguos y

disimilitudes entre parches lejanos encontraron asidero en la propuesta de este índice

de complejidad al constatar, que efectivamente al haber pocas especies comunes a

ciertos ambientes, los clasifica como comunidades diferentes dentro de una gran

comunidad heterogénea dividida en ambientes parcelados.

Spirulina subsalsa, especie de gran valor biotecnológico, fue encontrada en Paria y

lagunas de inundación del Orinoco. Rodríguez (2001) la reporta en aguas salobres y

estuarinas, como el sistema del lago de Maracaibo (norte del lago). Esto evidencia que

S. subsalsa puede ser hallada en una gran variedad de ambientes, con una

distribución geográfica amplia en el país. En Barlovento y Mantecal se hallaron

algunas especies de cianobacterias de los géneros Lyngbya y Arthrospira, así como

clorofitas del género Scenedesmus, especies también referidas con potencialidades

importantes para la biotecnología. Las presencias de microalgas en ambientes

126

extremófilos, como salinas y lagunas hipersalinas, y altamente contaminados o

intervenidos, como las fosas petroleras y el muelle de Puerto Cabello, indican la

adaptabilidad de estos microorganismos a ambientes modificados por actividades

antrópicas. Sus potencialidades biotecnológicas se reflejan en sus capacidades para

vivir en tales ambientes, con capacidades para la absorción y resíntesis de

hidrocarburos a compuestos más simples, como Chlorella spp. y Scenedesmus spp.

(Albarracín 2007). Se conoce también la gran producción de pigmentos fotosintéticos

(carotenoides) de Dunaliella salina y D. viridis, especies de gran valor en la industria

de colorantes y en la producción de vitamina “A”, con poblaciones ubicadas en salinas

de Paraguaná y Laguna Boca Chica, isla de Margarita, respectivamente. Ambientes

marinos costeros no perturbados, como la bahía de Mochima, también ofrecen en su

diversidad algunas especies de gran valor biotecnológico para producción de

biocombustibles, Isochrysis galbana, Nitzschia valens y Chaetoceros spp.

Existe una gran variedad de ecosistemas terrestres y acuáticos en el país, producto de

su ubicación tropical y variedad de relieves, desde sistemas montañosos con alturas

importantes que modifican el clima, hasta llanuras continentales y costeras, vastos

territorios selváticos, depresiones, sistemas deltaicos y un gran frente marino. La

cuenca del río Orinoco sintetiza las tres grandes formas de relieve que existen en la

naturaleza: por un lado macizos antiguos y escudos, cordilleras de levantamiento

reciente (es decir, del Terciario) por el otro, y depresiones tectónicas y cuencas o

llanuras de acumulación, en tercer lugar. Para un país con estas características

geomorfológicas, y más si se encuentra en la zona intertropical, tal variedad ambiental

representa una gran ventaja ecológica y económica. Sólo Canadá y los Estados

Unidos, además de Venezuela y Colombia, que en su territorio tiene una parte

reducida del escudo guayanés, presentan una disposición geológica similar

(http://es.wikipedia.org/wiki/Río_Orinoco). Tal multiplicidad de ambientes produce una

gran complejidad de hábitats dulceacuícolas, salobres, marítimos y extremos, que

unida a la condición de país megadiverso, permite la exploración de comunidades

biológicas con un banco genético muy importante de especies promisorias para el

desarrollo de la biotecnología en campos como la alimentación, producción de

biocombustibles, biorremediación, farmacología, cosmética, colorantes, etc.

127

9. Conclusiones

1. Se obtuvieron dos medios de cultivo óptimos para el crecimiento de Arthrospira

platensis, uno en condiciones controladas (medio 1 = medio Parra (2005)) y otro en

condición natural (tratamiento 36, medio central), lo que inicia el aprovechamiento

biotecnológico de la especie a diferentes escalas.

2. La dinámica de crecimiento poblacional de Arthrospira platensis muestra

densodependencia logística, con evidencia de una estructura de tallas que varía

conforme la población crece y alcanza un equilibrio.

3. El crecimiento diferencial de poblaciones de Arthrospira platensis mostrado en

tratamientos con combinaciones aleatorias y centrales de nutrientes en un

experimento factorial fraccionado, señala que esta especie crece en condiciones

altamente selectivas.

4. La mayoría de los tratamientos con tiempos de duplicación, tg, más cortos (y por

ende tasas de crecimiento per cápita, r, más elevadas) se constituyeron en los

más productivos en biomasa.

5. La profundidad de la lámina de agua en sistemas de tanques circulares a cielo

abierto influye en la dinámica de crecimiento poblacional y producción de biomasa

de Arthrospira sp.

6. Se encontraron especies de cianobacterias (Arthrospira spp., Spirulina subsalsa,

Lyngbya spp., Oscillatoria spp. y Anabaena spp.) y microalgas eucarióticas

(Scenedesmus spp., Isochrysis galbana, Chlorella sp., Chaetoceros sp., Navicula

platalea, Dunaliella salina y D. viridis) de gran interés biotecnológico en diferentes

lugares de la geografía variada del país, lo que conduce a la idea de que

Venezuela cuenta con un potencial genético importante en su biodiversidad para la

biotecnología.

128

10. Bibliografía

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http://es.wikipedia.org/wiki/Nudo_(unidad)

136

137

Apéndice 1

Medios de cultivo para microalgas f/2 Medium (Guillard 1975) Fuente: http://www-cyanosite.bio.purdue.edu/media/table/f2.html

NaNO3 (75.0 g/L dH2O) 1.0 ml

NaH2PO4·H2O (5.0 g/L dH2O) 1.0 ml

Na2SiO3·9H2O (30.0 g/L dH2O) 1.0 ml

f/2 Trace Metal Solution 1.0 ml

f/2 Vitamin Solution 0.5 ml

Filtered seawater to 1.0 L

Autoclave after all additions.

Note: f/2 Medium contains extensive silica precipitate and should be used only when

growing diatoms. For other algal groups use f/2-Si Medium.

f/2 Trace Metal Solution:

FeCl3·6H2O 3.15 g

Na2EDTA·2H2O 4.36 g

CuSO4·5H2O (9.8 g/L dH2O) 1.0 ml

Na2MoO4·2H2O (6.3 g/L dH2O) 1.0 ml

ZnSO4·7H2O (22.0 g/L dH2O) 1.0 ml

CoCl2·6H2O (10.0 g/L dH2O) 1.0 ml

MnCl2·4H2O (180.0 g/L dH2O) 1.0 ml

Distilled water to 1.0 L

Autoclave.

f/2 Vitamin Solution:

Vitamin B12 (1.0 g/L dH2O) 1.0 ml

Biotin (0.1 g/L dH2O) 10.0 ml

Thiamine HCl 200.0 mg

Distilled water to 1.0 L

Filter sterilize into plastic vials and store in refrigerator.

Note: Vitamin B12 and Biotin are obtained in a crystalline form. When preparing the Vitamin B12 Stock Solution allow for approximately 11% water of crystallization (For each 1.0 mg of Vitamin B12 add 0.89

ml dH2O). When preparing the Biotin Stock Solution allow for approximately 4% water of crystallization

(For each 1.0 mg of Biotin add 9.6 ml dH2O).

138

Fuente:

Vera, A., M. Martínez, K. Morillo y S. Montes. 2011. Cultivo discontinuo de Chlorella sp. en medios enriquecidos con el exudado gomoso de Acacia macracantha. En:

http://revistas.luz.edu.ve/index.php/bcib/article/viewFile/90/3326.

139

Medio Chu-13 modificado por Dayananda (2007)

Modified CHU13 Medium, one liter [3]

Compound mg/L

KNO3 400

K2HPO4 80

CaCl2 dihydrate 107

MgSO4 heptahydrate 200

Ferric Citrate 20

Citric acid 100

CoCl2 0.02

H3BO3 5.72

MnCl2 tetrahydrate 3.62

ZnSO4 heptahydrate 0.44

CuSO4 pentahydrate 0.16

Na2MoO4 0.084

0.072 N H2SO4 1 drop

The remaining volume is pure, de-ionized water.

Fuente: http://en.wikipedia.org/wiki/Chu_13

140

Medio Bristol UTEX

Bristol Medium

Directions

H.C. Bold's modification of Bristol's recipe (Bold 1949). General purpose freshwater

medium and as bristol's solution, an essential component of other media--see Bold 1NV,

Bold 3N, Bristol-NaCl, LDM, Proteose, Soil extract, and Trebouxia.

For 1 L Total

1. To approximately 900 mL of dH2O add each of the components in the order specified

while stirring continuously.

2. Bring total volume to 1 L with dH2O.

*For 1.5% agar medium add 15 g of agar into the flask; do not mix.

3. Cover and autoclave medium.

4. Store at refrigerator temperature.

# Component Amount Stock Solution

Concentration

Final

Concentration

1 NaNO3 (Fisher

BP360-500) 10 mL/L 10 g/400mL dH2O 2.94 mM

2 CaCl2·2H2O (Sigma

C-3881) 10 mL/L 1 g/400mL dH2O 0.17 mM

3 MgSO4·7H2O

(Sigma 230391) 10 mL/L 3 g/400mL dH2O 0.3 mM

4 K2HPO4 (Sigma P

3786) 10 mL/L 3 g/400mL dH2O 0.43 mM

5 KH2PO4 (Sigma P

0662) 10 mL/L 7 g/400mL dH2O 1.29 mM

6 NaCl (Fisher S271-

500) 10 mL/L 1 g/400mL dH2O 0.43 mM

Fuente: http://web.biosci.utexas.edu/utex/mediaDetail.aspx?mediaID=29

141

Medio Serpa y Calderón (2005)

Fuente:

Serpa, R.F. y A. Calderón. 2006. Efecto de diferentes fuentes de nitrógeno en el contenido de carotenoides y clorofila de cuatro cepas de Dunaliella salina TEOD. Ecología Aplicada 5(2): 93 – 99.

142

Apéndice 2

ENSAYO Nro. 2: Optimización en botellones

Factorial 26-1

con 5 ptos. centrales Desing Expert

St. Id Run Block Type

NaHCO3 Na2CO3 K2HPO4 NaCl K2SO4 NH4NO3

mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L

33 0 1 Block 1 Center 10207,5 3022,5 375 750 750 1764

28 28 2 Block 1 Fact 13610 4030 250 1000 1000 1176

2 2 3 Block 1 Fact 13610 2015 250 500 500 2352

11 11 4 Block 1 Fact 6805 4030 250 1000 500 1176

14 14 5 Block 1 Fact 13610 2015 500 1000 500 2352

25 25 6 Block 1 Fact 6805 2015 250 1000 1000 1176

30 30 7 Block 1 Fact 13610 2015 500 1000 1000 1176

22 22 8 Block 1 Fact 13610 2015 500 500 1000 2352

6 6 9 Block 1 Fact 13610 2015 500 500 500 1176

7 7 10 Block 1 Fact 6805 4030 500 500 500 1176

27 27 11 Block 1 Fact 6805 4030 250 1000 1000 2352

3 3 12 Block 1 Fact 6805 4030 250 500 500 2352

34 0 13 Block 1 Center 10207,5 3022,5 375 750 750 1764

4 4 14 Block 1 Fact 13610 4030 250 500 500 1176

31 31 15 Block 1 Fact 6805 4030 500 1000 1000 1176

10 10 16 Block 1 Fact 13610 2015 250 1000 500 1176

12 12 17 Block 1 Fact 13610 4030 250 1000 500 2352

24 24 18 Block 1 Fact 13610 4030 500 500 1000 1176

5 5 19 Block 1 Fact 6805 2015 500 500 500 2352

18 18 20 Block 1 Fact 13610 2015 250 500 1000 1176

23 23 21 Block 1 Fact 6805 4030 500 500 1000 2352

29 29 22 Block 1 Fact 6805 2015 500 1000 1000 2352

35 0 23 Block 1 Center 10207,5 3022,5 375 750 750 1764

8 8 24 Block 1 Fact 13610 4030 500 500 500 2352

26 26 25 Block 1 Fact 13610 2015 250 1000 1000 2352

13 13 26 Block 1 Fact 6805 2015 500 1000 500 1176

20 20 27 Block 1 Fact 13610 4030 250 500 1000 2352

21 21 28 Block 1 Fact 6805 2015 500 500 1000 1176

1 1 29 Block 1 Fact 6805 2015 250 500 500 1176

9 9 30 Block 1 Fact 6805 2015 250 1000 500 2352

17 17 31 Block 1 Fact 6805 2015 250 500 1000 2352

15 15 32 Block 1 Fact 6805 4030 500 1000 500 2352

32 32 33 Block 1 Fact 13610 4030 500 1000 1000 2352

16 16 34 Block 1 Fact 13610 4030 500 1000 500 1176

19 19 35 Block 1 Fact 6805 4030 250 500 1000 1176

36 0 36 Block 1 Center 10207,5 3022,5 375 750 750 1764

37 0 37 Block 1 Center 10207,5 3022,5 375 750 750 1764

143

Design-Expert® Software

Biomasa

Design Points

E- 500.000

E+ 1000.000

X1 = A: NaHCO3

X2 = E: K2SO4

Actual Factors

B: Na2CO3 = 3022.50

C: K2HPO4 = 375.00

D: NaCl = 750.00

F: NH4NO3 = 1764.00

E: K2SO4

6805.00 8506.25 10207.50 11908.75 13610.00

Interaction

A: NaHCO3

Bio

ma

sa

0.8

1.2

1.6

2

2.4

Design-Expert® Software

Biomasa

Design Points

F- 1176.000

F+ 2352.000

X1 = D: NaCl

X2 = F: NH4NO3

Actual Factors

A: NaHCO3 = 10207.50

B: Na2CO3 = 3022.50

C: K2HPO4 = 375.00

E: K2SO4 = 750.00

F: NH4NO3

500.00 625.00 750.00 875.00 1000.00

Interaction

D: NaCl

Bio

ma

sa

0.8

1.2

1.6

2

2.4

144

Design-Expert® Software

Biomasa

Design Points

B- 2015.000

B+ 4030.000

X1 = A: NaHCO3

X2 = B: Na2CO3

Actual Factors

C: K2HPO4 = 375.00

D: NaCl = 750.00

E: K2SO4 = 750.00

F: NH4NO3 = 1764.00

B: Na2CO3

6805.00 8506.25 10207.50 11908.75 13610.00

Interaction

A: NaHCO3

Bio

ma

sa

0.8

1.2

1.6

2

2.4

Design-Expert® Software

Biomasa

Design Points

E- 500.000

E+ 1000.000

X1 = A: NaHCO3

X2 = E: K2SO4

Actual Factors

B: Na2CO3 = 3022.50

C: K2HPO4 = 375.00

D: NaCl = 750.00

F: NH4NO3 = 1764.00

E: K2SO4

6805.00 8506.25 10207.50 11908.75 13610.00

Interaction

A: NaHCO3

Bio

ma

sa

0.8

1.2

1.6

2

2.4

145

Design-Expert® Software

Biomasa

Design points above predicted value

Design points below predicted value

2.3555

0.838

X1 = A: NaHCO3

X2 = E: K2SO4

Actual Factors

B: Na2CO3 = 3022.50

C: K2HPO4 = 375.00

D: NaCl = 750.00

F: NH4NO3 = 1764.00

6805.00

8506.25

10207.50

11908.75

13610.00 500.00

625.00

750.00

875.00

1000.00

1.2

1.525

1.85

2.175

2.5

B

iom

asa

A: NaHCO3 E: K2SO4

Design-Expert® Software

Biomasa

Design points above predicted value

Design points below predicted value

2.3555

0.838

X1 = D: NaCl

X2 = F: NH4NO3

Actual Factors

A: NaHCO3 = 10207.50

B: Na2CO3 = 3022.50

C: K2HPO4 = 375.00

E: K2SO4 = 750.00

500.00

625.00

750.00

875.00

1000.00 1176.00

1470.00

1764.00

2058.00

2352.00

1.4

1.64

1.88

2.12

2.36

B

iom

asa

D: NaCl F: NH4NO3

146

Design-Expert® Software

Biomasa

Design points above predicted value

Design points below predicted value

2.3555

0.838

X1 = A: NaHCO3

X2 = B: Na2CO3

Actual Factors

C: K2HPO4 = 375.00

D: NaCl = 750.00

E: K2SO4 = 750.00

F: NH4NO3 = 1764.00

6805.00

8506.25

10207.50

11908.75

13610.00 2015.00

2518.75

3022.50

3526.25

4030.00

1.2

1.525

1.85

2.175

2.5

B

iom

asa

A: NaHCO3 B: Na2CO3

147

Apéndice 3 Fuente: http://bellman.ciencias.uniovi.es/d_experimentos/d_experimentos_archivos/sr.pdf

148

149

150