Arbeiten mit Membranproteinen

Rupert Abele

Überblick

• Solubilisierung• Reinigung• Liposomenpräparation• Rekonstitution

Selbstorganisation von Detergenzien und Lipiden

Detergenz → Bildung von Mizellen (a)

Phospholipiden → Bildung von Lipiddoppelschichten (b) und Liposomen (c)

Einteilung von Detergenzien

• Ionische Detergenzienhohe Solubilisationseffizienzstark denaturierend

• Nichtionische Detergenzienmilde Detergenzienkurze Kettenlängen (C7-C10) führen oft zurInaktivierung des Membranproteins

Einteilung von Detergenzien

• Gallensäuresalzeionische Detergenzien mit starrem steroidem Rückgrat bildet nierenförmige Aggregatweniger inaktivierend als ionische Detergenzien

• Zwitterionische DetergenzienEigenschaften zwischen ionischen und nicht ionischen Detergenzien

CHAPSO

Eigenschaften von Detergenzien

CMC (critical micellar concentration)verringert sich mit Länge der Alkylketteerhöht sich mit Anzahl der Doppelbindungen oder Verzweigungen erhöht sich mit der Konzentration von Gegenionen von ionischen Detergenzien

Eigenschaften von Detergenzien

N (aggregation number)Anzahl der monomeren Detergenzmoleküle in einer Mizelleerhöht sich mit der Konzentration von Gegenionen von ionischen Detergenzien

CMT (critical micellar temperature)Temperatur, bei der monomeres, kristallines und mizellenhaltiges Detergenz im Gleichgewicht sindDetergenzlösungen werden klar

Cloud point (Trübungspunkt)Temperatur über der CMT, bei der nichtionische Detergenzien trübe werden Phasentrennung in Detergenz reiche und –verarmte Phase (eg. Triton X-114, 22 °C)

Faustregel

Eigenschaften von Detergenzien

Phasen der Solubilisierung

Phasen der Solubilisierung

Kinetik der Solubilisierung

Arten der Solubilisierung

Kryo-Elektronenmikroskopie

Triton X-100 Decylmaltoside

5 mM; 0 h

5 mM; 144 h

Vesikel-Mizellen Übergang

Rsat Rsat

TX-100

DM [DM] < Rsat

[DM] = Rsat4 days

Arten der Solubilisierung

„Transbilayer Solubilisation“Schnell

„Micellar Solubulisation“Langsam

• schneller Flip-Flop• kooperative Bindung

• langsamer Flip-Flop, da große, sehr hydrophile Kopfgruppe

• Transfer von Phospholipiden und Detergenzienaus der äußeren Schicht in Mizellen

Der Packungsparameter bestimmt den Solubilisierungsmechanismus

laVP×

=

V = hydrophobes Volumena = Querschnittsfläche des

hydrophilen Kopfsl = Länge der hydrophoben Kette

Detergenz

Phospholipid

Phosphatidylethanolamin

transbilayer solubilisation

micellar solubilisation

Einflüsse auf den Solubilisierungsmechanismus

Änderung der Querschnittsfläche(Detergenz oder Lipid)

Octyl‐β‐D‐glucopyranosid

Octyl‐β‐D‐thioglucopyranosid

aOTG = 47,2 A2

aOG = 41,3 A2

POG > POTG

PDOPC > PDMPC

Einflüsse auf den Solubilisierungsmechanismus

Änderung der Querschnittsfläche(Ionenstärke)

P300 mM NaCl > P100 mM NaCl

Detergenz-Protein Interaktion

Was ist solubilisiert?

Alles im Überstand nach Zentrifugationfür 1 h bei 100,000 x g

Praktische Aspekte der Solubilisierung

• Detergenz (Detergenz-screen)• Einfache Screening Prozedur (Western blot; Achtung spezielles Laufverhalten

etc.)• Lipidkonzentration• Detergenz –Lipid Verhältnis (so gering wie möglich)

[detergent] - cmc[lipid]ρ =

• Solublisieringsdauer (so kurz wie möglich)• Temperatur• Ionenstärke• Puffer, pH• Chemische Chaperone (Glycerin,Sucrose)• Stabilität und Funktionalität des Proteins

Größenbestimmung von Membranproteinen

OmpF mit einem Detergenzring

Größenbestimmung von Membranproteinen

Problem:• Stokes-Radius setzt sich aus Protein und Detergenz zusammen• Detergenzanteil ist von der Art des Detergenz und Protein abhängig

Methoden der Molekulargewichtbestimmung:

• Analytische Ultrazentrifugation• Statische Lichtstreuung• STEM (scanning transmission electron microscopy)• Kleinwinkel Neutronen- oder Röntgenstrahlenbeugung

Der Umgang mit Lipiden

• Lagerung von organischen Lösungen von Phospholipiden in Glasflaschen überschichtet mit Argon bei -80°C

• Niemals Plastikpipetten benutzen, um organische Lösungsmittel zu pipettieren• Ungesättigte Phospholipide sind hygroskopisch (in getrockneten organischen

Lösungsmitteln lagern) • Phospholipide nicht länger in wässrigen Lösungen aufbewahren• Oxidation von Phospholipiden verhindern (benutze qualitativ hochwertige

Lipidextrakte, destilliertes und entgastes Wasser, vermeiden von Lichteinstrahlung und hohen Temperaturen, verwende Antioxidantien wie Vitamin C, DTT, EDTA)

• Arbeite über der Phasenübergangstemperatur

liquid crystaline crystaline

Liposomen

water

water

Amphiphilpolarer Kopf

unpolaren Schwanz

MLV0.5 -2 µm

SUV

50 nm

LUV

100 - 500 nm

Liposomen Herstellung

Amphiphile Lipide

Auflösen in Detergenzien

Kolloidale Lösung

Entfernung des Detergenz

Auflösen in organischer Phase

Trocknen des Lipidfilms

Hydratisieren (MLV)

Ultraschall

SUV LUV

SUV

LUV

Einfrieren/ Auftauen

LUV (homogene Größe)

Extrudieren

Zugabe von wässriger Phase

Ultraschallbehandlung

Entfernung des organischen Lsgmittels

Extrudieren

Liposomen Herstellung von getrockneten Lipiden

• Auflösen der Lipide (5 – 20 mg/ml) in organischem Lösungsmittel (Chloroform oder Chloroform:Methanol 2:1)

• Trocknen der Lipide in einem Rotationsverdampfer (Multilammelare Schichten) • Hydratisierung in einem Puffer oberhalb der Phasenübergangstemperatur

zwischen Gel und flüssig-kristalliner Phase (MLVs entstehen)• Ultraschallbehandlung (SUVs entstehen)• Einfrieren und auftauen 3x (LUVs mit inhomogener Größe entstehen)• Extrudieren (ungerade Anzahl, mindestens 11x) durch einen 200 – 400 nm

Polycarbonatfilter (homogene LUVs werden gebildet)

Hydratisierung

Flüssig-kristalline Phase

Kristalline Phase

Extrudieren

• oberhalb der Phasenübergangstemperatur• immer ungerade Anzahl von Durchläufen

Charakterisierung der Liposomen

• Phospholipidkonzentration (Barlett assay):Hydrolyse des Phosphats mittels Perchlorsäure; Bestimmung von anorganischem Pi in Komplex mit Ammoniummolybdat

• Bestimmung der Lipidzusammensetzung und Oxidation von Lipiden

• Dichtigkeit der Liposomen:Selbstquenchen von Fluorescein, enzymatische Assays, radioaktive Substanzen

• Bestimmung des eingeschlossenen Volumens

• Bestimmung der Anzahl der SchichtenDerivatisierng der äußeren Lipide; Elektronenmikroskopie

• Größenbestimmung der Liposomen:Elektronenmikroskopie, dynamische und statische Lichtstreuung

• Trennung verschiedener Liposomen:Zentrifugation, Gelfiltration, Field flow fractionation

Field Flow Fractionation

Proteininkooperation

Proteininkooperation

Natriumcholate Triton X-100 Octylglucoside

Entfernung von Detergenzien

Kritische Punkte der Rekonstitution

• Proteinaktivität

• Proteinausbeute in jedem Schritt

• Phospholipidzusammensetzung

• Lipid-zu-Protein Verhältnis

• Detergenz für Destabilisierung von Liposomen muß kompatibel mit Proteinaktivitätsein

• Orientierung des Proteins in der Membran

• Dichtigkeit der Proteoliposomen

• Inkoorporationseffizienz

• Trennung von Liposomen von Proteoliposomen