1 CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA

RESOLUCIN

Objetivos

Proporcionar los fundamentos de la separacin por cromatografa lquida

Realizar una descripcin de los instrumentos utilizados en la cromatografa lquida

Bibliografa

A. Braithwaite y F.J. Smith, Chromatographic Methods, Blackie Academic & Professional, 5a Ed.,Glasgow, 1996

High Performace Liquid Chromatography, Analytical Chemistry by Open Learning, John Wiley& Sons, Chichester, 1998

Ll. R. Snyder, J.J. Kirkland y J.L. Glajch, Practical HPLC Method Development, John Wiley &Sons., New York, 1997

1.1. Condiciones para el desarrollo de mtodos de HPLC

La HPLC1 es una tcnica de separacin de analitos basada en la transferencia de masa entre la

fase estacionaria y la fase mvil. Tras disolver la muestra los analitos son arrastrados a lo largo

de la columna por medio de la alta presin de la fase mvil. Dado que los analitos tienen distintas

interacciones con la fase mvil y estacionaria la mezcla aparece separada en sus componentes a

la salida de la columna.

La cromatografa de lquidos abarca un grupo muy amplio entre los mtodos cromatogrficos

puesto que el sistema ternario fase estacionaria/fase mvil/analito ofrece muchas y muy distintas

1High Performance Liquid Chromatography

1

1.1. CONDICIONES PARA EL DESARROLLO DE MTODOS DE HPLC

posibilidades para separar compuestos qumicos muy diferentes. La descripcin de la HPLC no

se puede basar solo en la instrumentacin si no que tambin hay que ofrecer una aproximacin

sistemtica para lograr separaciones adecuadas.

Por tanto, la ruta fundamental para el desarrollo de mtodos de HPLC se puede resumir en los

siguientes pasos:

1. Caractersticas de la muestra y objetivos de la separacin.

2. Tratamiento de la muestra y deteccin de analitos.

3. Condiciones iniciales de la separacin.

4. Validacin del mtodo HPLC.

El desarrollo de cualquier mtodo se debe de basar forzosamente en el conocimiento de la cro-

matografa de separacin puesto que el grado de conocimiento que hoy en da se tiene acerca

de los mtodos de separacin en funcin de la muestra y condiciones experimentales est bien

cimentado.

1.1.1. Caractersticas de la muestra y objetivos de la separacin.

Antes de hacer nada hay que tener en cuenta este anlisis que parece tan fundamental, puesto que

tanto las caractersticas de la muestra como los objetivos de la separacin pueden proporcionar

recursos que ayuden a llevar a cabo la separacin por HPLC.

Las caractersticas referidas a la muestra aparecen recogidas en la Tabla 1.1 en la pgina siguien-

te. En un principio, esas caractersticas se pueden dar para cualquier muestra. Por ejemplo, en

un medicamento antihistamnico se puede hacer un anlisis del componente activo teniendo en

cuenta que tambin habr otros componentes que aparezcan disueltos. Otra cosa ser si se trata

de sub-productos originados en la sntesis del componente activo o si este est contaminado.

En cuanto a los objetivos de la separacin, hay que aclarar los siguientes puntos:

El objetivo fundamental del mtodo HPLC es un anlisis cuantitativo, la deteccin de un

compuesto, caracterizar algn componente desconocido o la purificacin del compuesto?

Segn cual sea la respuesta el camino puede ser muy diferente.

Hay que conseguir la resolucin de todos los componentes? Por ejemplo, en el ejemplo

antes expuesto acerca del medicamento es preciso saber si hay que llevar a cabo tambin

la separacin de los productos de degradacin o impurezas.

2

1.1. CONDICIONES PARA EL DESARROLLO DE MTODOS DE HPLC

Cuadro 1.1: Informacin fundamental acerca de la composicin y caractersticas de la muestra.

Nmero de compuestosEstructura qumica de los compuestos (grupos fun-cionales)Peso molecular de los compuestosCtes. de sus equilibrios cido/Base (pKa)Espectros UV-V y MSIntervalo de concentracin de los analitosSolubilidad de la muestra

En el caso de necesitarse un anlisis cuantitativo hay que saber con que grado de exacti-

tud y precisin se quiere hacer. Si el anlisis de la muestra necesita un tratamiento largo

entonces la obtencin de datos exactos y precisos necesita de un gran trabajo.

De cuantas matrices hay que analizar el analito? No es lo mismo determinar un antihis-

tamnico en distintos medicamentos que en la orina de un enfermo.

Cuantas muestras se van a analizar a la vez? En funcin de ello puede ser ms razonable

usar cromatogramas de 10 minutos que de 20 minutos.

Cuales son los requisitos de la instrumentacin? En algunos hay que termostatizar la

columna y en otros el sistema de deteccin puede no ser el mas habitual.

1.1.2. Tratamiento y deteccin de la muestra

La muestra puede llegar de distintas formas al laboratorio:

Como para ser analizada enseguida por HPLC.

Puede necesitar un proceso de dilucin o que se le aada una disolucin amortiguadora o

un estndar interno.

Puede ser necesario extraer compuestos de una matriz slida.

Las muestras pueden necesitar pretratamientos largos para extraer los analitos y separarlos

de otras especies interferentes antes de introducirlas en el HPLC.2

2Ms detalles sobre esto se pueden encontrar en el Captulo 10.

3

1.1. CONDICIONES PARA EL DESARROLLO DE MTODOS DE HPLC

Entre las condiciones para el desarrollo de mtodos hay que tener en cuenta el sistema de de-

teccin. El detector utilizado tiene que ver los analitos de la mejor forma posible (sensibilidad

y selectividad). Puesto que como detector ms general se suele emplear el espectrofotmetro

UV-V, los espectros de los compuestos de inters de la muestra pueden encontrarse en la biblio-

grafa en la medida en la que los compuestos puros sean accesibles. Cuando este detector no es

adecuado hay que considerar la utilizacin de otros. Si se trata de compuestos fluorescentes o

activos electroqumicamente existen detectores especficos y en ausencia de stos sera preciso

utilizar el espectrmetro de masas.

1.1.3. Condiciones iniciales de separacin

La separacin por medio de HPLC es una posibilidad ms entre muchos procedimientos. Es cier-

to que a travs de esta tcnica se puede llevar a cabo la separacin y determinacin de muchos

compuestos pero hay que tener en cuenta tambin la viabilidad de otros mtodos. Como con-

secuencia de ello, es necesario considerar otras posibilidades como la cromatografa de gases,

electroforesis, cromatografa de lquidos supercrticos o cromatografa de capa fina.

Si la tcnica elegida es la HPLC, entonces hay que especificar si la muestra a analizar es nor-

mal o especial. La definicin de muestra normal es bastante amplia, esto es, una mezcla de

molculas pequeas (1.5).

Este tipo de resolucin ayuda al ajuste de los resultados. Si la muestra tiene mas de diez com-

ponentes, en cambio, la exigencias de la resolucin sern mas flexibles (1.0

1.1. CONDICIONES PARA EL DESARROLLO DE MTODOS DE HPLC

Cuadro 1.2: Condiciones para la separacin de muestras especiales.

Iones inorgnicos Es problema ms importante es la deteccin. Utilizar cro-matografa inica y detector de conductividad.

Ismeros Algunos ismeros se pueden separar con HPLC de fase re-versa y clasificarse como muestras normales. Los resulta-dos ms adecuados se obtienen con HPLC de fase normalo con columnas de fase reversa basadas en ciclodextrina -slica.

Enantimeros Se necesitan condiciones quirales para la separacin.Ctos. Biolgicos Algunos factores convierten a este tipo de muestras en es-

peciales: la conformacin molecular, la polaridad y un am-plio intervalo de hidrofobicidad.

Macromolculas Las molculas muy grandes necesitan materiales de empa-quetamiento de poro grande ( >>10 nm). Las molculasbiolgicas necesitan condiciones especiales.

Cuadro 1.3: Condiciones iniciales de uso para HPLC de muestras normales.

Mtodo/Columna Condiciones de usoHPLC de fase reversa:

Agua-fase orgnica

C18 (ODS), C8, fenil, trime-tilsilil (TMS) o ciano

Es la primera eleccin para la mayora de muestras,especialmente compuestos neutros o no ionizados so-lubles en agua o mezclas acuoso - orgnicas

HPLC de pares inicos:

Agua-fase orgnica + buffer+ cto. formador de pares i-nicos

C18, C8, o ciano

Es la eleccin ms aceptable para compuestos inicoso ionizables, especialmente bases y cationes

HPLC de fase normal :

Mezcla de disolventes org-nicos

Ciano, diol, amino, slica

Es una buena segunda opcin cuando la fase reversao la formacin de pares inicos no es efectiva.Es la primera opcin para molculas lipoflicas queno se disuelven bien en mezclas acuoso - orgnicas.Es la primera opcin para mezclas de ismeros y paraHPLC a escala preparativa (mejor con slica).

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1.1. CONDICIONES PARA EL DESARROLLO DE MTODOS DE HPLC

Cuadro 1.4: Objetivos de separacin del mtodo HPLC.

Caracterstica NotasResolucin Para un anlisis cuantitativo preciso y adecuado se

necesita que Rs >1.5Tiempo de separacin Para procedimientos de rutina

1.2. FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIN

1.2. Fundamentos de la separacin

Entre las caractersticas de la separacin la resolucin es la de mayor importancia. En conse-

cuencia ser la ecuacin de la resolucin vista en el Captulo 7 la que se tomar como punto de

partida:

Rs =N4

(k

k+1

)(1) (1.1)

donde k es el factor de capacidad, N el numero de platos tericos de la columna y el factorde separacin. Como se dijo en su momento, la ecuacin 1.1 es la relacin fundamental de

la cromatografa de lquidos puesto que resume las variables de la separacin en tres grupos:

retencin (k), eficacia de la columna (N) y selectividad (). Cambiando las condiciones deseparacin, por ejemplo haciendo k ms pequeo la resolucin disminuir y aumentando elvalor de k la resolucin mejorar. Cuando se aumenta , los tiempos de retencin de dos picosconsecutivos pueden cambiar de forma distinta aumentando, en cualquier caso, la resolucin.

Cuando se aumenta la eficacia de la columna, los picos sern ms estrechos y la resolucin entre

ellos ser, por tanto, mayor. Por una parte, los valores de k y sern funcin de los siguientesfactores que regulan el equilibrio de los analitos entre la fase estacionaria y la fase mvil:

Componentes de la fase mvil

Componente de la fase estacionaria

Temperatura

Por otra parte, los valores de N dependen de las condiciones de la columna:

Velocidad de flujo

Longitud de columna

Tamao de partcula

1.2.1. Variabilidad de la retencin (k)

La influencia de la fuerza del disolvente es muy importante: mientras que los disolventes fuertes

disminuyen la retencin, los disolventes dbiles ayudan a la retencin. Para formar la fase mvil

7

1.2. FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIN

se utilizar como mnimo una mezcla de dos disolventes (A y B) siendo la fuerza de B mayor que

la de A. Para predecir la influencia del disolvente es muy til hacer una estimacin de k. Para ellose pueden utilizar los tiempos de elucin de los compuestos que no son retenidos y de esta forma

transformar una escala de k sobre esos valores de elucin (t = to k = 1; tr = 2 to k = 2). A lahora de elegir el disolvente de la fase mvil hay que tener en cuenta que el objetivo a conseguir

es el siguiente: que el intervalo de k existente entre el primer y ultimo analito est en el intervalo0.5

1.2. FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIN

sistema detector el espectrofotmetro UV-V es transparente a longitudes de onda bajas. Por otra

parte, las mezclas de AcN son de baja viscosidad y eso, en cierta manera, aumenta la eficacia de

la columna (N) y la presin a utilizar es menor. Algo menos que el AcN se utiliza el metanol y

algo menos todava el THF.

Cuadro 1.5: Caractersticas fsicas de disolventes ms usados en las fases mviles.

Disolvente Polaridad Barrera UV Viscosidad Ta Ebullicin(P)3 (nm) (cP) (0C)

Acetona 5.1 330 0.36 56.3Acetonitrilo 5.8 190 0.38 81.6Cloroformo 4.1 245 0.57 61.1

Dimetilsulfoxido 7.2 268 2.24 189.01,4-dioxano 4.8 215 1.37 101.3

Acetato de Etilo 4.4 256 0.45 77.1ter etlico 2.8 215 0.24 34.5Hexano 0.1 195 0.31 68.7

Iso-octano 0.1 215 0.50 99.2Metanol 5.1 205 0.55 64.7

Metil-etilcetona 4.7 329 0.43 79.6Tetrahidrofurano 4.0 212 0.55 66.0

Tolueno 2.4 284 0.59 110.6o-Xileno 2.5 288 0.81 144.4Agua 10.2 190 1.0 100

Aparte de la fase mvil, las retenciones presentan dependencia respecto a la fase estacionaria.

Es as que las retenciones de los analitos dependen de tres caractersticas de la columna: tipo de

fase enlazada, concentracin y superficie. Si se analiza el tipo de fase enlazada la retencin de

analitos apolares y no inicos sigue el siguiente orden:

Slica no unida <

1.2. FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIN

de cambios en la fase mvil, el empaquetamiento de la columna y/o la temperatura. De las op-

ciones anteriormente citadas el cambio en la fase mvil es la que parece ms simple y esto se

puede llevar a cabo de dos formas: cambiando la fuerza del disolvente y cambiando el tipo de

disolvente. La primera de las opciones est en funcin del intervalo de retencin de los analitos,

esto es, cuando la relacin de k entre el primer analito y el ultimo es del orden de 40 (ms con-cretamente, 0.5

1.2. FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIN

2t = 2h+

2p+

2d (1.5)

h Poder de formacin de enlaces de hidrgenop Polaridadd Coeficiente de dispersin

Los anteriores desarrollos empricos llevan a la segunda opcin que es la del cambio de disol-

vente. Basndose en la definicin de polaridad de Snyder se han clasificado muchos disolventes

y la consecuencia ms practica de ello es la de la Figura 1.2. La utilidad de esa clasificacin se

basa en el hecho de que no se utilizan ms de tres disolventes en la HPLC.

Figura 1.2: Tringulo de selectividad del disolvente.

Las caractersticas de los disolventes utilizados en la cromatografa de fase reversa (AcN, MeOH

y THF) son de otro tipo y por eso se puede poner a punto mtodos con estos disolventes sin

mayores problemas. Si bien en algunos casos es posible obtener con esos disolventes una elucin

inversa, un cambio pequeo en la selectividad ( 2-5%) puede ser suficiente para obtener unaresolucin adecuada.

Si el ajuste de las variables anteriores resulta intil, se puede pensar en un cambio en el empa-

quetamiento de la columna. Igualmente, el cambio de la columna trae consigo un ajuste total de

la fase mvil. En el caso de la RPC las posibilidades iniciales son columnas C18 o C8 y luego

ciano o fenilo.

11

1.2. FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIN

1.2.3. Eficacia de la columna

Caractersticas del empaquetamiento

En la cromatografa de lquidos se usan columnas empaquetadas. En este tipo de cromatografas

no es posible utilizar columnas capilares puesto que siendo la difusin de los lquidos 100 veces

menor que la de los gases, la fase liquida disolvente es demasiado ancha como para que pueda ser

atravesada en un tiempo corto por los analitos y llegar as a la fase estacionaria de las paredes de

la columna. En las columnas empaquetadas, en cambio, como la fase estacionaria est a lo largo

de la columna, los analitos no tienen problema para entrar en contacto con la fase estacionaria.

Las columnas para HPLC son tubos de acero inoxidable o plstico que poseen una longitud de

5-30 cm y un dimetro interno de 1-5 mm. La tendencia de hoy en da es utilizar columnas cada

vez ms pequeas (3-5 cm) y de dimetro interno tambin cada vez ms pequeo (1-2 mm)

para de esta forma hacer los tiempos de anlisis ms cortos. Las columnas capilares (dimetros

internos de 180-30 m) estn obteniendo cada vez ms fama puesto que reducen el tiempo de

anlisis y ahorran disolvente. La columnas son caras y con el material particulado (suciedad)

del disolvente o la muestra se pueden degradar fcilmente. En consecuencia, por delante de la

columna se coloca una precolumna o una columna pequea de proteccin. La precolumna es una

columna corta del mismo material que la columna analtica. Puesto que los solutos y partculas

finas quedan totalmente pegados, esa precolumna habr que cambiarla frecuentemente.

Los soportes de las fases estacionarias de la HPLC son partculas de slice. En el mercado se

pueden encontrar slices de distinto tamao de partcula, distinta superficie externa y distinto

tamao de poro. Las partculas pueden esfricas o irregulares. Las columnas llenas de partculas

irregulares tienen una menor eficacia pero son ms baratas y se utilizan en cromatografas de

pretratamiento. Puesto que por encima de valores de pH = 8 la slice es soluble en agua, no se

puede trabajar por encima de ese pH. Ya hay algunos tipos de slice aptos para ser utilizados en

el intervalo de pH 9-10 y para cromatografiar compuestos bsicos en el intervalo de pH 8-12

utilizando soportes polimricos del tipo del poliestireno.

En funcin de la fase estacionaria, la cromatografa de lquidos se puede clasificar, entre otras,

en cromatografa de adsorcin, de intercambio de iones, de exclusin por tamao de partcula y

cromatografa de afinidad. En la Figura 1.3 en la pgina siguiente se recoge la utilizacin relativa

de las fases estacionarias4.

La slice pura y la almina tambin se pueden usar como fase estacionaria en la cromatografa

de adsorcin siendo la primera la ms utilizada. Debido a los grupos silanol, la slice tiene una

4LCGC, 1998

12

1.2. FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIN

Figura 1.3: Naturaleza de las fases estacionarias usadas en HPLC y su utilizacin relativa.

alta actividad superficial y estos grupos pueden interaccionar con los grupos polares (alcoholes,

aminas, cetonas y cidos carboxlicos) que tienen las molculas de soluto.

Ms normal es la cromatografa de reparto liquido-liquido. Para la cromatografa de reparto se

une al soporte de la slice una fase estacionaria liquida como se puede ver en las siguientes

reacciones:

El enlace siloxano (Si-O-Si-R) se puede hidrolizar por debajo de pH = 2 y en consecuencia la

utilizacin de fases enlazadas lquidas que tienen un soporte slido est limitada al intervalo de

pH 2-8.

Cuadro 1.6: Algunas fases estacionarias utilizadas en la cromatografa de separacin liquido-liquido.

Fases enlazadas polares Fases enlazadas no polares(CH2)3NH2 amino (CH2)17CH3 octadecilo(CH2)3CN ciano (CH2)7CH3 octilo

(CH2)2OCH2CH(OH)CH2OH diol (CH2)3C6H5 fenilo

Las columnas de fase reversa (apolares) son muy utilizadas, puesto que los tipos de muestra que

pueden ser analizados en estos casos son muchos. Adems, las columnas de fase reversa que

hoy en da se producen son de buena calidad y muy estables para las condiciones de trabajo.

Basndose en la hidrofobia, predecir el orden de elucin de los analitos es fcil. Las fases m-

viles que se utilizan con este tipo de fases estacionarias son mezclas de disolventes miscibles en

agua. Adems, el agua como componente principal de la fase mvil es un disolvente barato y

sin peligro.

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1.2. FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIN

Para una fase reversa hay distintos tipos de columna (C22, C18, C8, C6, C4, C1/2) y se diferencian

en el grupo funcional que se une al soporte silcico. La ms utilizada es la fase octadecilo (C18 u

ODS) y tiene muchas aplicaciones en el anlisis de compuestos apolares desconocidos.

En cuanto a la permeacin de geles o cromatografa en funcin del tamao hay que decir que es

una tcnica muy usada en el caso de molculas de alto peso molecular. Tiene aplicaciones en el

campo de la bioqumica para separar protenas y carbohidratos y tambin tiene aplicaciones en

el campo de los polmeros. En esta cromatografa la fase estacionaria es una matriz porosa. Las

molculas de dimetro mas pequeo que los poros de la matriz entran en los poros y pueden ser

retenidas durante un tiempo en la columna. Las molculas de mayor tamao que los poros no se

retienen y se eluyen en la columna. Las fases estacionarias ms usadas son geles de dextrano y

poliacrilamida.

La cromatografa de afinidad se utiliza para la separacin de un solo componente en mezclas

complejas. Es muy utilizada en bioqumica y est basada en las interacciones especificas que se

dan entre encimas y substratos, anticuerpos y antgenos y receptores y hormonas.

Caractersticas de la fase estacionaria

El empaquetamiento de la columna tiene su efecto directo en la separacin entre los picos. De

todas formas, no es muy conveniente mezclar empaquetamientos diferentes en la misma columna

aunque se puedan unir unos con otros. En consecuencia, el cambio de la columna trae un cambio

simultaneo de la selectividad a diferencia del cambio de la fase mvil. Ese acontecimiento es

el que limita la habilidad de la columna para ajustar la separacin de muchos componentes. En

consecuencia, el cambiar la columna acarrea un readecuamiento de la fase mvil para poder

llevar a cabo la separacin.

La mayora de las columnas de la HPLC tienen una fase estacionaria enlazada, es decir, superfi-

cies de partculas de slica con capas orgnicas de revestimiento unidas por enlaces covalentes.

Independientemente del tipo de empaquetamiento, las siguientes caractersticas fsicas de la fase

estacionaria resultan muy influyentes en la separacin cromatogrfica:

Caractersticas qumicas o grupo funcional de la fase enlazada (por ejemplo, C18 o C8).

Densidad superficial de la fase enlazada (2 o 4 mol/m2)

Tipo de enlace de la fase enlazada y de la slica (de nica funcin o varias funciones).

Caractersticas de las superficies de slica.

14

1.2. FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIN

Cuadro 1.7: Caractersticas deseables de las partculas usadas en columnas analticas de HPLC.

Caracterstica UtilidadPartculas de 5 m totalmente porosas La mayora de separacionesPartculas de 3 m totalmente porosas Separaciones rpidasPartculas peliculares de 1.5 m Separaciones muy rpidas (especial-

mente macromolculas)Distribucin de tamao de partcula 50% (de lamedia)

Columnas estables, reproducibles yms eficientes con menores cadas depresin

Poros de 7-12 nm, 150-400 m2/g (poros estrechos) Separacin de molculas pequeasPoros de 15-100 nm, 10-150 m2/g (poros anchos) Separacin de macromolculas

La mayora de las columnas de fase reversa tienen grupos funcionales organosilanol unidos

mediante enlace covalente a soportes de slica. Esos enlaces se pueden llevar a cabo de distintas

formas con muestra la Figura 1.4 en la pgina siguiente. La polimerizacin puede ser a travs

de grupos monofuncionales silanol o grupos polifuncionales. En funcin de ello se obtendrn

estabilidades qumicas diferentes. Igualmente, la fase estacionaria presentar una reactividad

mayor o menor en funcin del numero de grupos silanol libres que quedan sin saturarse en la

reaccin de silanizacin. Para que este tipo de cosas no ocurran, los fabricantes de las columnas

suelen desactivar los grupos silanol que quedan libres con trimetilsilano (C1 o TMS) y los grupos

funcionales utilizados tienen dos sustituyentes muy voluminosos para proteger los TMS-s o los

grupos OH.

Influencia de la eficacia de la columna

Una vez de que se han ajustado las variables analizadas en los apartados anteriores cabe esperar

que se obtenga una separacin adecuada. De todas formas, como ha quedado demostrado en

la ecuacin 9.1 si se aumenta N, manteniendo y k constantes aumenta la resolucin de loscompuestos. En consecuencia, una vez ajustados y k se puede pensar en ajustar el valor de Nbien para aumenta la resolucin o si sta fuera muy grande (Rs >>2) para acortar los tiempo de

elucin de la separacin. Igualmente, se producir un aumento del numero de platos tericos en

las siguientes condiciones:

Con un empaquetamiento adecuado de la columna

Con columnas ms largas

15

1.2. FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIN

Figura 1.4: Distintas fases enlazadas con estructura C18.

16

1.2. FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIN

Con flujos bajos (no demasiado bajos)

Con empaquetamientos de partculas mas pequeas

Con viscosidades ms pequeas de la fase mvil y temperaturas ms altas

Con molculas de analito de la muestra ms pequeas

Minimizando cualquier efecto exterior sobre la columna

Adems de las expresiones conocidas para estimar el valor de N en la HPLC, tambin es muy

utilizada la siguiente expresin:

N = 2pi(tRh

A

)2(1.6)

donde h y A son, respectivamente, la altura y el rea del pico. Para expresar la calidad de la

columna a travs de N es mejor utilizar un sistema de prueba en condiciones ideales. Estas

seran las siguientes:

1. Usar como muestra de prueba un compuesto neutro y pequeo (por ejemplo tolueno, naf-

taleno).

2. Utilizar un flujo de 1 ml/min con columnas de dimetro interno entre 0.4 y 0.5 cm.

3. Utilizar viscosidades () de la fase mvil menores de 1 cP (por ejemplo 0-100% AcN -agua para T >20 oC).

4. Usar temperaturas

1.2. FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIN

N =3500Ldp

(1.7)

donde dp es el dimetro de la partcula. Como se puede entender a travs de la expresin cuanto

ms pequeo es el tamao de partcula el numero de platos tericos ser mayor y por lo tanto

tambin la resolucin.

Figura 1.5: Platos tericos en funcin del tamao de poro de la partcula y del flujo.

Las razones por las cuales al disminuir el tamao de partcula se produce un aumento de la

resolucin son dos. Por un lado, al disminuir el tamao de partcula el flujo de la fase mvil

es ms uniforme y esto origina una disminucin de A en la ecuacin de Van Deemter. Por otro

lado, al disminuir el tamao de partcula la trayectoria que han de recorrer los solutos a lo largo

de la fase mvil es menor y esto provoca una disminucin del trmino C de la ecuacin de Van

Deemter relacionado con la difusin molecular.

Una de las desventajas de disminuir el tamao de partcula es que disminuye la resistencia que

ofrecen al flujo de la fase mvil. En la HPLC se necesitan presiones muy altas (7-40 Mpa o

70-400 atm) para conseguir flujos de 0.5-5 ml min1.

El tamao de los poros de las partculas condiciona el rea de la superficie externa. De esta

forma, las partculas de poros grandes tendrn una superficie externa menor y viceversa. Para

la mayora de las usos, las partculas de poro pequeo ( >10 nm)

18

1.2. FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIN

Masa molecular < 2000

Soluble en disolventes orgnicos Soluble en agua

No inico o par inico Inico

Cromatografade intercambio

inico

Cromatografa de fase normal

enlazada

Ciano, amino

Soluble en disolventesno polares o dbilmente polares

(de hexano a CHCl3)

Soluble en disolventespolares o dbilmente polares

(de CHCl3 a CH3OH)

Cromatografade faseenlazadareversa

Grupos C18,C8,C4, C1,

ciano o fenil

Soluble enCHCl3

Cromatografiade adsorcin

Slice

Soluble en alcohol,

acetonitriloo acetatode etilo

Cromatografa de fase normal

enlazada

Ciano, aminoo diol

Figura 1.6: Gua de separacin de muestras/analitos comunes.

Masa molecular > 2000

Soluble en disolventes orgnicos Soluble en agua

No inico o par inico Inico

Cromatografade intercambio

inico

Tamao < 30 nm Tamao30-400 nm

Cromatografade faseenlazadareversa

C18,C8,C4

Tamao < 30 nmTamao

30-400 nm

Cromatografade separacinpor tamao

Cromatografade faseenlazadareversa ointeraccinhidrofbica

Grupos C18,C8,C4

polietero fenil

Cromatografade separacinpor tamao

Figura 1.7: Gua de separacin de muestras/analitos especiales.

19

1.3. INSTRUMENTACIN

1.2.4. Efecto de la temperatura

Calentando las columnas cromatogrficas, en general, disminuye la viscosidad del disolvente y

las presiones necesarias para conseguir flujos ms rpidos son menores. Al aumentar la tempe-

ratura, disminuyen los tiempos de retencin y se mejora la resolucin puesto que aumenta la

velocidad de difusin del soluto. Por contra, el aumento de la temperatura puede disminuir la vi-

da de la columna. Si no se controla, la temperatura puede cambiar con las condiciones del medio.

Manteniendo el horno a una temperatura un grado superior a la del ambiente se puede mejorar

la repetitividad de los tiempos de retencin as como la exactitud del anlisis cuantitativo.

Es conocido que si se aumenta 1 oC la temperatura la retencin (k) disminuye en 1 o 2%. Loscambios en el factor de capacidad pueden tener tambin su efecto en la selectividad, por lo que

la temperatura es un factor a tener en cuenta para ajustar la resolucin y la separacin. Tomar la

temperatura como variable influyente tiene una consecuencia directa: es muy fcil de controlar

y no implica cambiar la columna y la fase mvil. De todas formas, hasta hace poco no se han

tenido en cuenta los cambios de temperatura por las siguientes razones:

La instrumentacin de un sistema tpico HPLC no tena la capacidad de termostatizar la

columna.

Muchas de las columnas utilizadas en HPLC no son estables a temperaturas altas sobre

todo cuando el pH de la fase mvil es inferior a 3 o superior a 6.

Las viscosidades y las presiones de vapor del disolvente dependen mucho de la tempera-

tura y como consecuencia de ello los mrgenes de temperatura que se pueden utilizar son

muy cortos.

Hoy en da estos argumentos estn en duda y cada vez ms mtodos utilizan un control de la

temperatura, sobre todo si se trata de compuestos inicos.

1.3. Instrumentacin

La instrumentacin de la HPLC se puede decir que es flexible. Como se puede ver en la Fi-

gura 1.8 en la pgina siguiente, cada elemento puede tener un origen distinto y despus de en-

samblarlos todos se puede llegar a una situacin adecuada para la separacin. Como elementos

fsicos obligatorios, entre otros, estn: bomba, portal de inyeccin, columna y detector. Adems

de stos, impregnando la muestra y los analitos, est la fase mvil.

20

1.3. INSTRUMENTACIN

Figura 1.8: Esquema de un cromatgrafo de lquidos de alta resolucin.

1.3.1. Fase mvil

Puesto que la fase mvil es una variable que influye en el reparto de los compuestos, su eleccin

es un factor importante. De todas formas, la eleccin est limitada a la columna. La distincin

mas importante se da entre las cromatografas de fase normal e reversa. Mientras que en la

cromatografa de fase normal los disolventes utilizados son los apolares hexano o iso-octano, en

la de fase reversa es tpica la utilizacin de disolventes polares como el agua, el acetonitrilo y el

etanol.

Las caractersticas fsicas del disolvente van a limitar tambin la eleccin de la columna. Los

factores a tener en cuenta sern la polaridad, capacidad de mezcla con otros disolventes, visco-

sidad, longitud de onda limite en el ultravioleta y toxicidad del disolvente. En la Tabla 1.5 en la

pgina 9 se recogen las caractersticas de varios disolventes utilizados como fase mvil.

En los sistemas de HPLC se puede trabajar de manera isocrtica o en gradiente. En la forma

isocrtica, la composicin de la fase mvil permanece constante a lo largo de todo el anlisis.

Cuando se trabaja en gradiente, la composicin de la fase mvil es variada poco a poco a lo largo

del anlisis. La razn por la que se trabaja en gradiente es porque se mejora la resolucin y se

reduce el tiempo de anlisis.

A la hora de trabajar con la fase mvil, hay que tener en cuenta las siguientes normas:

Para la HPLC hay que utilizar reactivos de alto grado de pureza. Las impurezas pueden

provocar un aumento de la lnea base.

21

1.3. INSTRUMENTACIN

La fase mvil no ha de tener partculas. Para ello se suele colocar un filtro de acero inoxi-

dable en el extremo del tubo que va de los recipientes de fase mvil a la bomba.

Hay que eliminar el aire disuelto en la fase mvil, puesto que debido a bombeos irregulares

pueden producirse distorsiones de las seales. Para ello la fase mvil se puede desgasificar

con helio, someter a vaco o introducir en un bao de ultrasonidos.

Los compuestos voltiles de la fase mvil originados al mezclar disolventes pueden eva-

porarse y en consecuencia cambiar la composicin de la fase mvil. Para evitar esto, a lo

largo de la desgasificacin hay que mantener fra la disolucin y las botellas de fase mvil

han de estar cerradas en todo momento.

La muestra a analizar ha de poder disolverse en la fase mvil.

Cuando se usan los detectores UV, hay que tener en cuenta que la fase mvil pueda ab-

sorber en el esta zona del espectro. Esta absorcin viene dada por la longitud de onda del

limite UV y los analitos que absorben por debajo de este valor lmite caracterstico de

cada fase mvil no podrn ser analizados (

1.3. INSTRUMENTACIN

La mayora de sistemas para HPLC utilizan un esquema basado en bombas recprocas del estilo

al que se ve en la Figura 1.9. Con el fin de disminuir el volumen muerto (35-400 l), estas

bombas poseen dentro de la despensa un pistn de zafiro. El pistn absorbe la fase mvil de

recipientes que se encuentran a baja presin y la enva a la columna a alta presin a travs de un

sistema de vlvulas tal y como se ve en la Figura 1.9. Con este mtodo, adems de obtener altas

presiones y flujos constantes, es fcil obtener una elucin en gradiente puesto que el volumen

interno de la bomba es pequeo. Sin embargo, se obtiene un flujo a pulsos y para evitar esto se

utilizan sistemas que poseen dos pistones.

Figura 1.9: Esquema de bombas recprocas y de desplazamiento.

Unas bombas menos utilizadas que las anteriores son las bombas de desplazamiento que con-

sisten en un reservorio o despensa grande que poseen un mecanismo de tornillos. Se obtiene un

flujo sin pulsos pero tienen una capacidad limitada (250 ml).

Las bombas neumticas se valen de la presin de un gas aplicado en el recipiente de la fase

mvil. Son bombas muy simples, obtenindose flujos sin pulso pero estn limitadas a presiones

muy bajas.

1.3.3. Sistemas de inyeccin

El mecanismo usado para introducir las muestras en la columna suele ser el paso que limita el

carcter repetitivo de las medidas. Con el fin de que la columna no se sature, los volmenes que a

inyectar han de ser pequeos y al introducirlos en la columna el sistema no ha de perder presin.

De todas formas, este sistema esta limitado a presiones mximas de 1500 psi.

En sistema ms utilizado en HPLC son las vlvulas de inyeccin que poseen bucles de volumen

conocido (ver la Figura 1.10 en la pgina siguiente).

En la posicin de llenado (Figura 1.10 en la pgina siguiente(a)) la fase mvil pasa directamente

a la columna y la muestra se introduce en el bucle de inyeccin con la ayuda de una microjeringa.

Una vez de que el bucle est lleno la vlvula gira a la posicin de inyeccin (Figura 1.10(b)) y

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1.3. INSTRUMENTACIN

Figura 1.10: Vlvula de inyeccin: (a) Llenado; (b) inyeccin.

la fase mvil impulsa la muestra hacia la columna. La desventaja que presenta este sistema se

basa en el hecho de que la exactitud de esta inyeccin se puede alterar con el tamao del bucle.

Los equipos que contienen sistemas de inyeccin automticos miden el volumen a travs de

microjeringas y no a travs de bucles. De este modo, en distintas inyecciones pueden entrar

masas de analito distintas sin tener que cambiar la concentracin del estndar.

1.3.4. Detectores

Detector ultravioleta

El detector ultravioleta (UV) es muy corriente y se puede usar para el anlisis de muchos com-

puestos orgnicos. Los analitos que absorben en la zona UV cuando salen de la columna e

interfieren en la trayectoria de la luz, absorben la radiacin UV y el detector mide la reduccin

de la seal (Figura 1.11 en la pgina siguiente).

La capacidad que tienen los analitos de absorber tanto en el visible como en el ultravioleta depen-

de de sus grupos cromforos. De esta forma, el detector UV se utiliza bastante si los compuestos

poseen en su estructura grupos tiol, carbonilo, amina, etilen, acetilen, nitrilo, sulfona, yodo as

como heterociclos cromforos.

Hay distintos tipos de detectores UV. Algunos de ellos solo miden en una nica y determinada

longitud de onda (en muchos casos 254 nm). Otros miden tambin a una longitud de onda

determinada pero esta longitud de onda se puede elegir en un rango amplio (190-800 nm). Puesto

que en estos detectores se puede llevar a cabo la eleccin de la longitud de onda, se puede

mejorar la sensibilidad respecto a cada compuesto, ya que se puede elegir la longitud de onda

ms adecuada.

24

1.3. INSTRUMENTACIN

Figura 1.11: Clula de flujo de forma de U.

El detector de fila (matriz) de diodos puede medir en todo el espectro de longitud de ondas

al mismo tiempo y el usuario puede determinar absorciones concretas a longitudes de ondas

diferentes.

A la hora de elegir las longitudes de onda para llevar a cabo medidas con el detector UV, se

pude encontrar en bibliografa la longitud de onda correspondiente a la mxima absorcin de

cada cromforo. Otra posibilidad es obtener de forma preliminar el espectro de absorcin de los

distintos analitos.

Detector de fluorescencia

Muchos compuestos tienen la habilidad de absorber la radiacin de luz a una determinada lon-

gitud de onda para luego emitir fluorescencia a una longitud de onda ms larga. Los compuestos

fluorescentes ms habituales son sistemas cclicos de alta conjugacin, entre otros, compuestos

aromticos policclicos, quinoleinas, esteroides, alcaloides etc.

Los detectores de fluorescencia para HPLC son parecidos a los fluormetros y espectrofluor-

metros. Lmparas de deuterio de xenon originan radiaciones de excitacin, por medio de mo-

nocromadores se elige la longitud de onda de la radiacin incidente y el detector se coloca

perpendicular a sta (Figura 1.12 en la pgina siguiente).

25

1.3. INSTRUMENTACIN

Figura 1.12: Esquema del detector de fluorescencia.

Detector de ndice de refraccin

En el detector de ndices de refraccin la fase mvil fluye por una clula y la seal que mide el

detector es funcin del ndice de refraccin de la sustancia que pasa por la clula. De esta forma,

cuando la fase mvil pase sola la seal ser menor que cuando pase con el analito (Figura 1.13).

Figura 1.13: Esquema del detector de ndice de refraccin.

Detector de dispersin de luz

El detector de dispersin de luz es sensible a compuestos bastante ms voltiles que el disolvente.

El eluato se introduce por la parte superior del detector. En el nebulizador, el eluato se mezcla

con nitrgeno y se hace pasa por el capilar. En el extremo del capilar se originan gotas. Estas

gotas se hacen pasar por un tubo caliente, vaporizndose el disolvente y quedando una serie

de partculas slidas finas. Estas partculas slidas pequeas entran al lugar de deteccin y su

26

1.3. INSTRUMENTACIN

deteccin se realiza por medio de una luz procedente de un diodo lser que va al fotodiodo de

dispersin (Figura 1.14).

Figura 1.14: Esquema del detector de dispersin de luz.

Las seal del detector de dispersin es proporcional a la masa del analito y no es funcin ni

de la estructura del analito ni de su masa molecular. La seal tampoco es lineal respecto a

la concentracin y normalmente hay que valerse de polinomios para construir las curvas de

calibracin.

Este detector puede usarse con una elucin en gradiente. Adems, no hay pico relacionado con

la elucin del disolvente y de esta forma la fase mvil no interfiere con los compuestos que elu-

yen al principio del cromatograma. De aadir a la fase mvil una disolucin amortiguadora esta

ltima ha de ser voltil. Las disoluciones amortiguadoras que no son voltiles pueden generar

partculas slidas como consecuencia de la evaporacin. Estas partculas slidas dispersaran la

luz y no se podra diferenciar la seal de los analitos. Utilizando cido actico, cido frmi-

co, cido trifluoroactico, acetato de amonio, fosfato de diamonio, amoniaco o trietilamina se

pueden preparar disoluciones amortiguadoras de baja concentracin.

Detector electroqumico

El detector electroqumico es sensible analitos que se puedan tanto oxidar como reducir, entre

otros, fenoles, aminas aromticas, perxidos, mercaptanos, cetonas, aldehidos, nitrilos conju-

gados, compuestos halogenados y nitroaromticos. Las tcnicas electroqumicas ms utilizadas

son la amperometra, voltamperometra y la culombimetra.

27

1.3. INSTRUMENTACIN

Los detectores electroqumicos corrientes utilizan tres electrodos: electrodo de trabajo, electro-

do de referencia y electrodo auxiliar. Como electrodo de referencia se usa el Ag/AgCl y el de

Calomelanos (Hg/HgCl). En cambio, como electrodo auxiliar se usan tanto electrodos de car-

bono vitrificado como de platino. Para analitos oxidables se utilizan electrodos de trabajo tanto

de cobre como de carbono (de pasta de carbono, carbono vitrificado, grafito, fibra de carbono,

etc.). Para especies reducibles es tpico usar el electrodo de gotas de mercurio. Tanto en un caso

como en el otro la corriente medida es proporcional a la concentracin.

En la amperometra se mide la intensidad de corriente que pasa entre el electrodo auxiliar y el

electrodo de trabajo manteniendo el potencial fijo con respecto al electrodo de Ag/AgCl. Puesto

que el rea del electrodo es muy pequea (

1.3. INSTRUMENTACIN

trabajo en condiciones de alto vaco y no aceptan flujos de disolvente de 1ml/min. De esta

forma, en el caso de los espectrmetros de masas se utilizan columnas de 2.1 mm de dimetro y

hay que utilizar flujos de 0.2 ml/min. Adems no se pueden aadir a la fase mvil sustancias no

voltiles (como disoluciones amortiguadora de fosfatos).

Durante tiempo, el problema para acoplar el espectrmetro de masas a la cromatografa de l-

quidos ha sido el de generar interfases a travs de iones que se encuentran en estado gaseoso.

Hoy en da, las interfases ms utilizadas son la ionizacin qumica a la presin atmosfrica y la

electronebulizacin por medio de gases.

En la ionizacin qumica a la presin atmosfrica, por medio de un calefactor y de un flujo

coaxial de nitrgeno el disolvente se evapora y el eluato liquido se convierte en un aerosol. Esta

tcnica es la ms utilizada como interfase entre la cromatografa de lquidos y la espectrometra

de masas, puesto que se puede aplicar a distintos tipos de analitos y puesto que admite los flujos

que se utilizan en cromatografa (flujos de hasta 2 ml/min). Sin embargo, los analitos inestables

pueden descomponerse a la temperatura de 125 o C del aerosol.

Figura 1.15: Esquema de la interfase de ionizacin qumica a presin atmosfrica.

Una vez que se ha obtenido el aerosol, viene la etapa de la ionizacin. En la ionizacin qumica

a la presin atmosfrica, la corona de descarga de alto voltaje aplicada a una aguja manda elec-

trones al aerosol antes obtenido. Estos electrones van a impulsar la generacin de reacciones en

las que se obtengan aniones y cationes. En estas reacciones la molcula M va a generar el catin

MH+. En la ionizacin qumica a la presin atmosfrica el fraccionamiento del catin MH+ es

pequeo. De esta forma los espectros obtenidos son fcilmente interpretables pero se obtiene

poca informacin acerca de la estructura de las molculas.

En la ionizacin por electronebulizacin, en la salida del cromatgrafo se coloca un campo elc-

trico intenso y se aplica tambin un flujo coaxial de nitrgeno. En consecuencia, se obtiene

un aerosol de partculas cargadas. El aerosol se carga positivamente si el capilar de salida de

la columna con respecto a la entrada al espectrmetro de masas esta cargado positivamente y

viceversa. Como ocurre en la ionizacin qumica a presin atmosfrica aqu tambin el fraccio-

namiento es pequeo y se obtienen espectros de masas sencillos.

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1.3. INSTRUMENTACIN

Figura 1.16: (a) Interfase de ionizacin por electronebulizacin. (b) Detalles para la creacin deiones en fase gas.

El espectrmetro de masas puede medir todos los iones originados por cada analito o iones

particulares que pueden ser elegidos. En el caso de que solo se midan estos iones particula-

res elegidos (el llamado mtodo SIM), el cromatograma se simplifica, porque solo darn seal

aquellos compuestos que tengan esos iones particulares.

El tndem selectividad y sensibilidad tambin se puede obtener por medio de la espectrometra

de masas. Este tndem se conoce como espectometra MS/MS. En este tipo de sistemas existen

cuatro cuadropolos. El primer cuadropolo filtra los iones originados de la ionizacin en funcin

de la relacin m/z. De esta forma, al segundo cuadropolo llegarn iones con una relacin m/z

determinada. Estos iones de m/z concreta (iones madre) al llegar al segundo cuadropolo van

a chocar con gases como el nitrgeno y el argn y se dividirn en iones-producto. Al tercer

cuadropolo llegarn estos iones-productos de m/z concreto que van a atravesarlo llegando al

detector. De esta forma, los detectores MS/MS son muy especficos porque es muy difcil que

dos molculas distintas se rompan en los mismos iones madre e iones producto.

Figura 1.17: Fundamento de la espectrometra MS/MS.

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