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Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial
aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B
Yeimy Johana Rodríguez Molina
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Departamento de Química
Bogotá, Colombia
2019
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial
aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B
Yeimy Johana Rodríguez Molina
Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:
Magister en Ciencias Química
Director:
León Darío Pérez Pérez, Ph.D.
Línea de Investigación:
Síntesis química
Grupo de Investigación:
Grupo de Investigación en Macromoléculas
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Departamento de Química
Bogotá, Colombia
2019
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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Dedicatoria
A mi abuelo José del Carmen, desde el cielo tus ojos son mi guía.
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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Agradecimientos
Agradezco especialmente a mi director de tesis, el profesor León D. Pérez, por su
dedicación, ideas y consejos que hicieron posible la finalización de este trabajo.
A la Universidad Nacional de Colombia y al grupo de investigación en macromoléculas por
el acompañamiento, las instalaciones y los recursos brindados durante este tiempo.
Sin dejar atrás a mis amigos y compañeros, su ayuda, apoyo y motivación en todo
momento ha sido fundamental para lograr estos resultados, en especial: Elsa, Gladys
Sofía, Lucimar, Andrea y Angie.
Finalizo agradeciendo a quienes para mí han sido motivo de trabajo, amor y constancia,
mi familia, mi mamá Graciela, mi papá Florián, mis hermanos Diana y Camilo y a mi novio
Andrés, por su compañía y conocimientos.
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Resumen
En este estudio, se describe la síntesis de copolímeros anfifílicos de PEG-b-PCL
bioconjugados con colesterol o retinol del tipo AB y ABA a través de polimerización por
apertura de anillo (ROP) y esterificación de Steglich. La copolimerización fue confirmada
empleando resonancia magnética nuclear protónica (RMN1H), espectroscopia infrarroja
(FTIR) y cromatografía de permeación en gel (GPC), las propiedades térmicas fueron
estudiadas por calorimetría diferencial de barrido (DSC).
Posteriormente, se realizó el estudio de las relaciones entre las propiedades coloidales de
las micelas y los copolímeros anfifílicos sintetizados. La micelización de los copolímeros y
su concentración micelar critica (CMC) se estudió empleando el método de fluorescencia
con pireno. De acuerdo con los resultados, se evidencia que los métodos de polimerización
y bioconjugación empleados dieron lugar a copolímeros con entidades terpénicas
enlazadas covalentemente a su estructura. Por su parte, las propiedades coloidales de las
micelas evidencian que el incremento del segmento hidrofóbico de los materiales genera
disminución en la CMC, conveniente para la estabilidad de las dispersiones micelares
empleadas en la liberación controlada de fármacos. Adicionalmente, se caracterizaron los
sistemas micelares empleando DLS, potencial Z y TEM, en su orden, se obtuvieron
partículas micelares de tamaños que comprenden el rango entre 22,0 y 136,8 nm; la
estabilización de los sistemas micelares establecida por el potencial Z es de tipo estérico,
teniendo en cuenta que la carga de las partículas fue cercana a cero; En tanto, la
morfología de las micelas mostrada en las imágenes TEM confirma la presencia de
partículas nanométricas con estructura tipo “core-shell”.
Finalmente, se evaluó la potencial aplicación de estos copolímeros bioconjugados en la
encapsulación de AmB, el estudio de su liberación controlada y el efecto sobre el estado
de agregación en cada sistema micelar cargado con AmB. Se evidenció que las unidades
de terpeno inciden favorablemente en la encapsulación de AmB, encontrándose mayores
contenidos de fármaco cuando se bioconjugan con retinol (10,21%). No obstante, la
conjugación con colesterol también incrementa la solubilización de AmB (5,88%) con
respecto a los copolímeros blanco (<3,16%). Los estudios de liberación demuestran
condiciones controladas y porcentajes de liberación menores en los copolímeros
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bioconjugados con terpenos, corroborando que el núcleo micelar genera un microambiente
con interacciones favorables que retardan la salida de AmB al medio de liberación.
Finalmente, los estudios de agregación realizados por espectrofotometría UV-Vis,
demostraron que la AmB cargada en las micelas se encuentra formando autoagregados.
Palabras clave: Micelas poliméricas; Policaprolactona; Polietilenglicol; Colesterol; Retinol;
Anfotericina B.
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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Abstract
In this study, the synthesis of amphiphilic PEG-b-PCL copolymers type AB and ABA
bioconjugate with cholesterol or retinol through ring open polymerization (ROP) and
Steglich esterification are described. The copolymerization was confirmed using proton
nuclear magnetic resonance (¹H NMR) and infrared spectroscopy (FTIR) and gel
permeation chromatography (GPC), the thermal properties were studied using differential
scanning calorimetry (DSC). Then, the study of the relationship between the colloidal
properties of the micelles and the amphiphilic copolymers synthetized were carry out. The
copolymers micellization and its critical micelle concentration (CMC) were perform using
fluorescence method with pyrene. According to the results, it is evident that the
polymerization and bioconjugate methods used gave rise to copolymers with terpene
entities covalently linked to its structure. In the same way, the colloidal properties of the
micelles show that an increase in the hydrophobic segment of the material generates a
CMC decrease; this is convenient for the stability of the micellar dispersion used in drug-
controlled release.
The micellar systems were characterized employing Dynamic Light Scattering (DLS), Z
potential and transmission electron microscopy (TEM). In its order, micellar particles of
sizes that comprise the range between 22,0 and 136.8 nm were obtained; the stabilization
of the micellar systems stablished using Z potential exhibit a steric type, taking in account
that the particle charge was near to cero. While, the morphology shown in TEM images
confirm the presence of nanometric core-shell type particles.
The application of this bioconjugate copolymers in the AmB encapsulation, the study of
their controlled release and the aggregation state were evaluated for each micellar system
charged with AmB. It was evidenced that the terpene units favorably affect the
encapsulation of AmB, when the AmB was bioconjugate with retinol the obtained drug
content was 10,21%. However, the conjugation with cholesterol increase also the AmB
solubilization (5,88%) compared to blank copolymers (<3,16%). Release studies
demonstrate controlled conditions and lower release rates in bioconjugate copolymers with
terpenes, this confirms that the micellar core generates a microenvironment with favorable
interactions that delay the exit of AmB to the release medium. Finally, aggregation studies
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performed by UV-Vis spectrophotometry showed that the AMB loaded in the micelles is
arranged in self-aggregates form.
Key words: Polymeric micelles, Polycaprolactone, Polyethylene glycol, Retinol,
Cholesterol, Amphotericin B.
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Contenido
1. Introducción .......................................................................................................... 16
2. Marco teórico ......................................................................................................... 19
2.1. Copolímeros en bloque .................................................................................... 19
2.2. Síntesis de copolímeros en bloque anfifílicos ................................................... 20
2.3. Polimerización por apertura de anillo (ROP)..................................................... 20
2.3.1. Polimerización por apertura de anillo (ROP) de Coordinación-Inserción ... 21
2.4. Esterificación de Steglich ................................................................................. 22
2.5. Micelización de copolímeros en bloque: autoensamblaje en solución acuosa .. 23
2.6. Encapsulación de fármacos ............................................................................. 24
2.7. Liberación controlada de fármacos ................................................................... 24
2.8. Anfotericina B ................................................................................................... 25
2.8.1. Mecanismo de acción de la AmB .............................................................. 25
2.9. Antecedentes ................................................................................................... 26
3. Objetivo general .................................................................................................... 28
3.1. Objetivos específicos ....................................................................................... 28
4. Diseño metodológico ............................................................................................ 29
4.1. Síntesis de copolímeros anfifílicos tipo AB y ABA bioconjugados con colesterol y
retinol 30
4.1.1. Protocolos de síntesis ............................................................................... 31
4.2. Caracterización de los copolímeros anfifílicos bioconjugados tipo AB y ABA ... 33
4.3. Estudio de las relaciones entre las propiedades coloidales de las micelas y los
copolímeros anfifílicos tipo AB y ABA ......................................................................... 34
4.3.1. Determinación de la concentración micelar crítica (CMC) ......................... 34
4.3.2. Caracterización de los sistemas micelares ................................................ 35
4.4. Encapsulación de anfotericina B, liberación controlada y efecto sobre su
agregación .................................................................................................................. 35
4.4.1. Encapsulación de AmB ............................................................................. 35
4.4.2. Estudio de liberación controlada de AmB .................................................. 36
4.4.3. Estado de agregación de AmB .................................................................. 38
5. Resultados y discusión ........................................................................................ 39
5.1. Síntesis de los copolímeros anfifílicos tipo AB y ABA bioconjugados con
colesterol y retinol ....................................................................................................... 39
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5.1.1. Espectroscopia infrarroja por Transformada de Fourier (FTIR) .................. 41
5.1.2. Resonancia magnética nuclear protónica (RMN1H) ................................... 43
5.1.3. Cromatografía de permeación en gel (GPC) .............................................. 45
5.1.4. Calorimetría diferencial de barrido (DSC) .................................................. 46
5.1.5. Espectrofotometría UV-Vis ......................................................................... 48
5.2. Estudio de las relaciones entre las propiedades coloidales de las micelas y los
copolímeros anfifílicos tipo AB y ABA .......................................................................... 49
5.2.1. Determinación de la concentración micelar critica (CMC) .......................... 50
5.2.2. Caracterización de los sistemas micelares ................................................ 54
5.3. Encapsulación de AmB, liberación controlada y efecto sobre su agregación .... 57
5.3.1. Encapsulación de AmB .............................................................................. 57
5.3.2. Estudio de liberación controlada de AmB ................................................... 61
5.3.3. Estado de agregación de AmB .................................................................. 64
6. Conclusiones ......................................................................................................... 67
7. Anexos .................................................................................................................... 69
8. Referencias ............................................................................................................ 71
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Lista de figuras
Figura 1. Representación de las distintas morfologías de copolímeros en bloque ............ 19
Figura 2. Mecanismo de reacción propuesto para la ROP de coordinación-inserción ..... 21
Figura 3. Estructura química del catalizador octanoato de estaño (Sn(Oct)2) .................... 22
Figura 4. Mecanismo de reacción general para la esterificación Steglich .......................... 22
Figura 5. Representación del proceso de micelización por el autoensamblaje en medio
acuoso de copolímeros en bloque anfifílicos. ........................................................................... 23
Figura 6. Estructura química de la anfotericina B (AmB) ....................................................... 25
Figura 7. Esquema general del diseño metodológico de la investigación ........................... 29
Figura 8. Representación esquemática de la encapsulación de AmB ................................. 36
Figura 9. Representación esquemática de la liberación controlada de AmB ..................... 37
Figura 10. Representación esquemática de la ROP iniciada por COL (a) e iniciada por
mPEG (b) ........................................................................................................................................ 39
Figura 11. Representación esquemática de la carboxilación de los materiales para COL
(a) y para RET (b) ......................................................................................................................... 40
Figura 12. Representación esquemática de la esterificación de Steglich de los materiales
para COL (a) y para RET (b) ....................................................................................................... 41
Figura 13. Espectro FTIR del copolímero anfifílico tipo ABA COP-COL1 ........................... 42
Figura 14. Espectro FTIR del copolímero anfifílico tipo ABA COP-RET1 ........................... 42
Figura 15. Espectro RMN1H del copolímero anfifílico tipo ABA COP-COL1 en CDCl3. .... 43
Figura 16. Espectro RMN1H del copolímero anfifílico tipo ABA COP-COL1 en CDCl3 ..... 44
Figura 17. Curvas GPC de los CBA con unidades de retinol (A) y con unidades de
colesterol (B) .................................................................................................................................. 46
Figura 18. Termogramas DSC de materiales poliméricos A. enfriamiento de 100 ° C
hasta -20 °C a 10 °C/min y B. calentamiento de -20 °C hasta 120 °C a 10 °C/min ........... 47
Figura 19. Espectro UV-Vis del retinol y los CBA bioconjugados con retinol ..................... 49
Figura 20. Espectro de excitación de pireno a diferentes del copolímero COP-COL1 ..... 51
Figura 21. Relación de intensidad de fluorescencia (I335/I332) vs el logaritmo de la
concentración de los copolímeros bioconjugados. .................................................................. 52
Figura 22. Efecto de la temperatura en el diámetro hidrodinámico de las micelas de los
CBA B1, COP-COL1 y COP-RET1 ............................................................................................ 55
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Figura 23. Estabilidad estérica en sistemas micelares .......................................................... 56
Figura 24. Imágenes TEM de las micelas de los copolímeros anfifilicos de mPEG-b-PCL-
Terpeno y Terpeno-PCL-b-PEG-b-PCL-Terpeno .................................................................... 57
Figura 25. Contenido de AmB (%) cargado en las micelas ................................................... 59
Figura 26. Perfiles de liberación para las micelas de copolímeros anfifílicos
bioconjugados cargados con AmB ............................................................................................. 62
Figura 27. Porcentaje de liberación de AmB máximo obtenido en cada sistema micelar 63
Figura 28. Espectros UV-Vis de absorción de AmB en DMSO y en PBS (DMSO 1% v/v)
......................................................................................................................................................... 64
Figura 29. Espectros UV-Vis de absorción los copolímeros anfifílicos bioconjugados con
terpenos .......................................................................................................................................... 65
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Lista de tablas
Tabla 1. Condiciones de reacción de los copolímeros anfifílicos bioconjugados con
terpenos vía ROP y esterificación de Steglich. ........................................................................ 31
Tabla 2. Características de los copolímeros mPEG-b-PCL-Terpeno y Terpeno-PCL-b-
PEG-b-PCL-Terpeno .................................................................................................................... 45
Tabla 3 Propiedades térmicas de los copolímeros mPEG-b-PCL-Terpeno y Terpeno-
PCL-b-PEG-b-PCL-Terpeno ........................................................................................................ 48
Tabla 4. Concentraciones micelares críticas (CMC) de los copolímeros bioconjugados
con terpenos................................................................................................................................... 53
Tabla 5. Propiedades de las micelas de copolímeros anfifílicos bioconjugados con
terpenos .......................................................................................................................................... 54
Tabla 6. Eficiencia de encapsulación y contenido del fármaco en los sistemas micelares
cargados con AmB ........................................................................................................................ 58
Tabla 7. Efecto de la carga de AmB en el diámetro hidrodinamico de las micelas ............ 60
Tabla 8. Estado de agregación de AmB basado en la relación de la intensidad de las
bandas I y IV (I/IV) del espectro UV-Vis. ................................................................................... 66
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Lista de símbolos y abreviaturas
Símbolo Término
PEG Polietilenglicol
mPEG Metoxipolietilenglicol
e-CL Épsilon-Caprolactona
PCL Policaprolactona
COL Colesterol
RET Retinol
COP Copolímero
CBA Copolímero en bloque anfifilico
MP Micelas poliméricas
AmB Anfotericina B
FDA Food and Drug Administration
ROP Polimerización por apertura de anillo
DCC N, N'-diciclohexilcarbodiimida
DMAP N-(dimetilamino)piridina
RMN1H Resonancia Magnética Nuclear Protónica
FTIR Espectroscopia Infrarroja por Transformada de Fourier
DSC Calorimetría diferencial de barrido
GPC Cromatografía de permeación en gel
CMC Concentración micelar crítica
DLS Dispersión dinámica de luz
Dh Diámetro hidrodinámico
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PDI Índice de polidispersidad
DNa Desoxicolato de sodio
DMSO Dimetil sulfóxido
PBS Buffer fosfato salino
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1. Introducción
El continuo desarrollo de materiales poliméricos desempeña un papel protagónico en el
campo de las ciencias biomédicas, esto se debe a la versatilidad con la que puede
controlarse su composición, peso y arquitectura molecular [1]. Por ejemplo, la
copolimerización en bloque permite unir segmentos hidrófobos e hidrófilos en la misma
molécula, esta característica les confiere la habilidad de autoensamblarse
espontáneamente en medios acuosos formando micelas poliméricas (MP) [2]. Las MP,
están compuestas por dos dominios separados, un núcleo interno capaz de solubilizar
fármacos hidrófobos como Anfotericina B (AmB) y una cubierta externa hidrófila encargada
de estabilizar coloidalmente las micelas y asegurar su biocompatibilidad [3].
Los copolímeros en bloque anfifílicos (CBA) empleados en liberación controlada de
fármacos deben ser biocompatibles y biodegradables, asimismo, tener la capacidad de
proteger el fármaco, reducir su toxicidad y conservar su actividad durante la circulación [4].
Por tal motivo, sistemas micelares obtenidos a partir de copolímeros de polietilenglicol
(PEG) y policaprolactona (PCL) han sido el eje de investigaciones en biomateriales, ya que
ambos son aprobados para uso clínico por la FDA. El PEG (segmento hidrófilo), incrementa
la solubilidad y biocompatibilidad, tiene baja inmunogenicidad y toxicidad y ayuda a
proteger las partículas del reconocimiento por el sistema reticuloendotelial (SRE) [5][6]. Por
su parte la PCL (segmento hidrófobo), es biocompatible, biodegradable, no es toxica y
presenta una alta capacidad de encapsulación de sustancias hidrófobas [3]. Por lo anterior,
estos materiales han sido ampliamente estudiados y aplicados en liberación controlada de
fármacos, usualmente, la conjugación PEG-PCL suele estar acompañada por la inserción
de otras moléculas bioactivas que aumenten la interacción fármaco-copolímero.
Los terpenos o terpenoides son compuestos orgánicos derivados de unidades de isopreno,
ellos representan una clase de compuestos naturales con diferentes estructuras químicas
y bioactividades, por su biocompatibilidad han generado gran interés en el desarrollo de
materiales biohíbridos [7]. Entre los compuestos que mayor interés han generado, se tiene
el colesterol (Col) el cual es biocompatible, ampliamente usado en la síntesis de
biomateriales y presenta interacciones que benefician la encapsulación de fármacos
insolubles en agua [8]. De manera análoga, el retinol (RET), además de su intervención
vital en el ciclo visual, se une a receptores específicos y regula varios procesos biológicos
como la proliferación y diferenciación celular [9]. Debido a la cadena lateral isoprenoide
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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rica en electrones, el retinol es inestable en presencia de luz y oxígeno, sin embargo, se
ha demostrado que la conjugación con un polímero incrementa su estabilidad química y su
biodisponibilidad [2]. Asimismo, esta característica estructural le confiere interacciones
favorables con sustancias liposolubles, por lo que su participación es ventajosa en la
encapsulación de fármacos hidrófobos, sin alterar la biocompatibilidad de los copolímeros
que lo contienen. En el caso de AmB, se favorece interacciones intermoleculares tipo π-π,
debido a que ambos presentan segmentos poliénico.
La AmB es un agente antifúngico lipófilo que cuenta con un amplio espectro de acción, su
uso clínico se remonta a 1959 cuando fue aprobado por la FDA [10]. Es una molécula
compuesta por una cadena polihidroxilada enlazada a una cadena poliénica hidrofóbica.
Este antifúngico aislado naturalmente de cepas de Streptomices nodosus, es el fármaco
de elección en el tratamiento de infecciones fúngicas, su mecanismo de acción consiste
en la unión con el ergosterol de la membrana celular fúngica promoviendo la disfunción y
muerte celular [11]. Pese a su alta eficacia, se encuentra limitado por su toxicidad y baja
solubilidad en la mayoría de disolventes [12]. Actualmente, la administración de AmB para
el tratamiento de infecciones fúngicas se lleva a cabo vía parenteral empleando
Fungizone®, una dispersión coloidal de AmB con desoxicolato de sodio en la que
prevalece la toxicidad del fármaco. Por esta razón, los avances para disminuir la toxicidad
asociada a la AmB se han centrado en formulaciones liposomales, como lo son
AmBisome®, Amphocil® y Abelcet®, sin embargo, su elevado costo es un impedimento
para realizar un tratamiento en la mayoría de los pacientes [13]. El uso de micelas
poliméricas como vehículos para fármacos con limitada solubilidad en agua ha demostrado
mejorar la solubilización de estos principios activos, asegurar una liberación controlada y
aumentar la seguridad de administración a pacientes contraindicados [14]. Debido a esto,
en la presente contribución con el fin de abordar estos problemas, se sintetizaron
copolímeros anfifílicos del tipo ABA y AB con PCL-b-PEG-b-PCL y mPEG-b-PCL,
respectivamente, empleando diferentes longitudes del segmento hidrófobo, bioconjugados
con colesterol (COL) y retinol (RET) vía ROP y esterificación de Steglich, que luego se
emplearon para obtener micelas a partir de su autoensamble en medio acuoso. En este
trabajo, se presenta el protocolo de síntesis y la caracterización estructural de los
copolímeros por FTIR, RMN1H, DSC y GPC, así como también el proceso de micelización
y su caracterización empleando diferentes técnicas como fluorescencia, DLS, potencial
zeta y TEM. Finalmente, se estableció la capacidad de las micelas como una formulación
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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antimicótica de AmB, evaluando el efecto de la composición del copolímero sobre el estado
de agregación, la eficiencia de encapsulación y su liberación controlada.
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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2. Marco teórico
2.1. Copolímeros en bloque
Los polímeros son macromoléculas constituidas por la unión de unidades repetitivas o
monómeros. En función de la repetición o variedad de monómeros, los polímeros se
clasifican en homopolímeros (formados por un solo tipo de monómero), o copolímeros
(formados por al menos dos monómeros diferentes) [15]. La síntesis de copolímeros es
una estrategia interesante para generar estructuras con características beneficiosas que
no presenta cada homopolímero por separado [16]. Según el método de polimerización
empleado, es posible obtener diferentes tipos de arquitecturas en las cadenas
copoliméricas, estas pueden ser, de injerto, al azar, alternado, en estrella o en bloques. En
los copolímeros en bloque, cada monómero se encuentra separado por secciones distintas
dentro de la cadena principal, sin embargo, su distribución puede variarse obteniendo
estructuras dibloque (AB) o tribloque (ABA/BAB)[17] [18].
Los copolímeros en bloque son estructuras macromoleculares que poseen segmentos
poliméricos de distinta composición química enlazados covalentemente [19]. Dentro de
esta gama de materiales existen dos estados diferentes, uno desordenado, en donde se
presenta miscibilidad de los segmentos y uno ordenado, que presenta segregación de los
segmentos. En la mayoría de aplicaciones el estado segregado es el más provechoso,
puesto que se establecen dominios entre cada bloque [20]. Dentro de este tipo de
estructuras, se encuentran los copolímeros en bloque anfifílicos que consisten en
segmentos hidrófilos e hidrófobos enlazados covalentemente [21].
Figura 1. Representación de las distintas morfologías de copolímeros en bloque
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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2.2. Síntesis de copolímeros en bloque anfifílicos
Para predecir y controlar las propiedades de un sistema micelar es importante que los
copolímeros empleados se encuentren bien definidos. La naturaleza del polímero a
sintetizar determinará el método de polimerización más adecuado para usar; dentro de
estos métodos se destacan las polimerizaciones radicalarias vivientes, la polimerización
aniónica y polimerización por apertura de anillo (ROP) [22].
ROP, proporciona uno de los mejores enfoques para sintetizar macromoléculas
biodegradables a partir de compuestos tales como éteres cíclicos, acetales, amidas
(lactamas), esteres (lactonas) y siloxanos [23]. La síntesis de CBA a partir de este método,
garantiza la obtención de materiales con estructura y composición bien definidas.
Alternativamente, estas estructuras poliméricas sintetizadas vía ROP pueden emplearse
en combinación con métodos de síntesis convergentes que permiten la funcionalización de
los materiales con distintas clases de compuestos, por ejemplo, moléculas bioactivas que
mejores las características farmacológicas de los CBA [16] [24].
2.3. Polimerización por apertura de anillo (ROP)
La ROP ha mostrado ser un método eficiente para la síntesis de poliésteres alifáticos con
propiedades específicas y controlables. En este tipo de polimerización es necesario el uso
de un iniciador y de monómeros cíclicos con grupos funcionales que sean susceptibles al
ataque por parte del iniciador [25]. Esta reacción se ve favorecida por la pérdida de tensión
del anillo, aunque en el caso de monómeros cíclicos de seis miembros como la lactida, la
presencia de grupos éster con una conformación planar le confiere mayor tensión al anillo
y por lo tanto la polimerización se ve favorecida [26].
Una gran variedad de monómeros cíclicos se ha polimerizado exitosamente vía ROP,
incluyendo las lactonas [27]; esta versatilidad está dada por su habilidad de proporcionar
materiales con arquitecturas definidas, altos pesos moleculares y pocos subproductos de
reacción. Este tipo de polimerización es favorecida por factores termodinámicos y
cinéticos. Un factor significativo que establece si un monómero cíclico es susceptible de
polimerizarse por esta técnica, es el termodinámico, es decir, si la estructura lineal que
adquiere con la formación del polímero es más estable que el correspondiente monómero
[28].
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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Dentro de los mecanismos más comunes para sintetizar macromoléculas por ROP, se
encuentran el catiónico, aniónico y de coordinación-inserción, siendo este último el que
presenta mejores resultados a la hora de obtener materiales con altos pesos moleculares
y estructuras bien definidas ya que presentan una menor incidencia de procesos de
terminación y transferencia de cadena intramolecular [22].
2.3.1. Polimerización por apertura de anillo (ROP) de
Coordinación-Inserción
La ROP de coordinación-inserción ha sido investigada recientemente, puesto que permite
la síntesis de poliésteres con arquitectura definida a través de una polimerización “viviente”.
Dentro de sus aplicaciones destacadas se encuentra el diseño de copolímeros en bloque
que se forman por la adición secuencial de un segundo monómero [29].
Este tipo de polimerización también denominada ROP pseudo aniónica, propone que la
propagación procede por la coordinación del monómero con la especie activa, seguida de
la inserción del monómero en el enlace metal-oxígeno por medio del reordenamiento de
electrones. En la figura 2 se muestra el mecanismo general a través del cual ocurre una
ROP de coordinación-inserción [22] [29].
Figura 2. Mecanismo de reacción propuesto para la ROP de coordinación-inserción
Durante la propagación, la cadena que está creciendo permanece unida al metal a través
de un enlace de coordinación que involucra al grupo alcóxido. La reacción termina por
hidrólisis del complejo terminal para formar de grupo hidroxilo terminal. Dentro de los
catalizadores más empleados se destaca el octanoato de estaño (Sn(Oct)2) (figura 3), el
uso amplio de este reactivo se debe a su disponibilidad comercial, alta actividad,
solubilidad en solventes orgánicos, fácil manejo y estar aceptado por la FDA como un
aditivo en alimentos [30].
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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Figura 3. Estructura química del catalizador octanoato de estaño (Sn(Oct)2)
2.4. Esterificación de Steglich
La esterificación de Steglich es un método de síntesis en el cual un ácido carboxílico
terminal en la molécula reacciona con un activador como la N, N'-diciclohexilcarbodiimida
(DCC) en presencia de una base fuerte como N-(dimetilamino)piridina (DMAP) como
catalizador nucleofílico. En una etapa posterior, el intermedio o-acilúrea formado se hace
reaccionar con un compuesto que posea un grupo hidroxilo primario, bien sea una
molécula de bajo peso molecular o polimérica (figura 4) [31]. La reacción fue descrita por
primera vez en 1978 por Bernhard Neises y Wolfgang Steglich, siendo una adaptación de
un método más antiguo para la formación de amidas empleando DCC como activador [31].
Figura 4. Mecanismo de reacción general para la esterificación Steglich
Generalmente, esta reacción tiene lugar a temperatura ambiente empleando
diclorometano (DCM) como disolvente, por esta razón, es posible obtener esteres a partir
de moléculas sensibles térmicamente e impedidas estéricamente tal como es el caso del
terbutanol [31].
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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2.5. Micelización de copolímeros en bloque: autoensamblaje
en solución acuosa
El autoensamblaje de CBA en medio acuoso se basa en interacciones hidrofóbicas entre
las cadenas poliméricas formadoras de núcleos lipófilos, el proceso se lleva a cabo por
una ganancia en entropía de las moléculas de solvente a medida que los componentes
hidrofóbicos se retiran de los medios acuosos [32]. El proceso de micelización ocurre
cuando se disuelve el copolímero en un solvente selectivo para uno de los bloques, una
vez superada la concentración micelar crítica (CMC) el copolímero adopta una estructura
tipo “core-shell” y alcanza tamaños entre 10 - 100 nm (figura 5) [33]. Como consecuencia
de esta característica estructural, este tipo de nanopartícula tiene aplicación en la
encapsulación, transporte y liberación de principios activos hidrofóbicos. De manera que
el dominio hidrofóbico se asocia formando el núcleo micelar, zona en la cual se pueden
alojar fármacos hidrofóbicos, mientras que, el dominio hidrofílico forma la corona de la
micela, la cual interacciona con el medio externo proporcionando estabilidad física a las
partículas [34].
Figura 5. Representación del proceso de micelización por el autoensamblaje en medio
acuoso de copolímeros en bloque anfifílicos.
Dentro de las características que determina la micelización de un CBA se encuentra el
valor de su concentración micelar crítica (CMC), dado que es una medida indirecta de la
favorabilidad de la formación de las micelas, que a su vez se relaciona con la estabilidad
coloidal y termodinámica de las estructuras micelares que genera. Cuando un CBA tiene
una concentración inferior a su CMC, se encuentra como unímeros disueltos, solo hasta
que su concentración igual a la CMC se inicia el proceso de micelización, el sistema se
mantiene en equilibrio, lo cual implica que los unímeros que componen la micelas puede
intercambiarse[19]. La determinación de la CMC puede realizarse empleando diferentes
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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técnicas, dentro de las más destacadas se encuentran: fluorescencia con pireno [35],
también se ha reportado el uso de dispersión de luz [36], medidas de tensión superficial y
conductividad [37].
2.6. Encapsulación de fármacos
El proceso de encapsulación se basa en la inclusión de un principio activo en una matriz
polimérica, preferiblemente biocompatible y biodegradable. En este sentido, las micelas
poliméricas presentan un alto potencial dada su capacidad de encapsulación, transporte y
liberación de fármacos con baja solubilidad en agua. En el cuerpo humano, estos
materiales poseen la habilidad de incrementar el tiempo de vida medio de los fármacos en
la sangre, reduciendo las dosis efectivas, así como la ocurrencia de efectos secundarios
[38]. En el caso de sustancias hidrófobas, su encapsulación es favorecida por interacciones
hidrofóbicas con el núcleo micelar, siendo factores críticos en el proceso la compatibilidad
del fármaco/polímero, la longitud del bloque hidrofóbico, la concentración del polímero y
su cristalinidad, entre otros [39].
Han sido reportadas diversas metodologías para encapsular fármacos, dentro de las que
se destacan la evaporación de solvente, secado en spray y separación de fases [40]. Los
factores fisicoquímicos que intervienen en la encapsulación de principios son: la longitud
del segmento hidrófobo, la cristalinidad del segmento hidrófobo, la concentración del
copolímero y finalmente la afinidad entre el núcleo micelar y el fármaco [41].
2.7. Liberación controlada de fármacos
La liberación controlada de medicamentos a partir de micelas poliméricas ofrece mayores
ventajas en comparación con otros sistemas de entrega, esto debido a que presentan
mayor eficacia, toxicidad reducida y disminución de los efectos secundarios. Comúnmente,
la liberación de fármacos sucede en tres fases, inicialmente una salida rápida, seguida por
un periodo de liberación lenta y finalmente una liberación acelerada causada por erosión
[42]. La liberación del fármaco se produce por difusión de los poros y por degradación del
copolímero, por acción enzimática o bien por la combinación de los dos mecanismos [43].
Los factores fisicoquímicos que intervienen en la liberación de principios activos son: el
tamaño de las partículas, la porosidad y las longitudes de los segmentos poliméricos [44].
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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2.8. Anfotericina B
La Anfotericina B (AmB) es un antifúngico poliénico de amplio espectro comúnmente
empleado para el tratamiento de infecciones fúngicas sistémicas [45]. Es producido
naturalmente por el actinomiceto Streptomyces nodosus, por su estructura química
presenta dos principales propiedades fisicoquímicas: posee comportamiento anfifílico
debido a las cadenas policarbonadas (hidrófobas) y polihidroxiladas (hidrófilas) y
comportamiento anfótero debido a la presencia de grupos carboxilo y amina ionizables
(figura 6) [46].
Figura 6. Estructura química de la anfotericina B (AmB)
Como consecuencia de su naturaleza anfifílica y la asimétrica distribución de los grupos
polares y apolares, la AmB es prácticamente insoluble en la mayoría de solventes acuosos
a pH fisiológico, poco soluble en metanol y etanol y soluble en dimetilsulfóxido (DMSO) y
dimetilformamida (DMF) [47].
Pese a su alta actividad, el uso clínico de AmB es limitado debido a su elevada toxicidad,
que se debe a que a concentraciones superiores a 1 mg/mL forma agregados que se
acomplejan con moléculas de colesterol presentes en las membranas de las células
mamíferas generando canales que ocasionan la salida del contenido citoplasmático y por
como consecuencia la muerte celular [48].
2.8.1. Mecanismo de acción de la AmB La cadena policarbonada de la molécula de AmB actúa uniéndose preferencialmente al
ergosterol de la membrana celular fúngica, lo que promueve un canal transmembrana que
permite la fuga de sustancias celulares esenciales, como iones de potasio, nucleótidos y
aminoácidos. Las interacciones intermoleculares entre los enlaces de hidrogeno de los
grupos hidroxilo, carboxilo y amino estabilizan el canal transmembrana [49]. La pérdida de
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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estas sustancias junto con el ingreso de protones al interior de la célula, causa acidificación
del interior fúngico, precipitación del citoplasma y finalmente la muerte del hongo [49] [10].
El ergosterol, es el esterol principal de la membrana celular de los hongos, empleándose
como el blanco de acción del fármaco, sin embargo, la AmB también tiene la capacidad de
unirse al colesterol de las membranas celulares en los mamíferos, esta cualidad es
responsable de su potencial toxico [49][50]. Las propiedades farmacéuticas desfavorables
en el uso de las formulaciones de AmB con desoxicolato de sodio (DNa) (Fungizone®)
están relacionadas con la dosis y la duración del tratamiento (desde 30 hasta 40 días) los
efectos secundarios se manifiestan como nefrotoxicidad y perfusión (fiebre, escalofrío,
náusea, vómito y dolor de cabeza) [51].
2.9. Antecedentes
Los copolímeros basados en PEG y PCL han sido ampliamente estudiados en aplicaciones
biomédicas por ser biocompatibles y biodegradables. Por consiguiente, han sido evaluados
como candidatos promisorios en la encapsulación y liberación de fármacos, estos sistemas
de entrega pueden ser polimerizados a través de diferentes rutas de polimerización, sin
embargo, ROP ha sido una herramienta destacada en estas aplicaciones. Zhang y
colaboradores, reportan la síntesis de copolímeros de injerto basados en PCL-g-PEG
combinando ROP con química click, posterior a la síntesis, los copolímeros se
ensamblaron espontáneamente dando lugar a sistemas micelares con alta capacidad de
carga de sustancias hidrofóbicas [28]. La esterificación de Steglich ha sido estudiada por
Erothu e investigadores, como una alternativa para enlazar polímeros utilizando
condiciones de reacción amigables con el medio ambiente, en su estudio, se muestran las
ventajas de ese enfoque de acoplamiento sobre otros métodos de síntesis, esto se basa,
en la ausencia de catalizadores metálicos sin afectar los rendimientos de reacción [18].
Zhao y colaboradores emplearon ROP aniónica para sintetizar PEG conjugado con
terpenos (mentol, retinol, colesterol y betulina). Estas biomoléculas fueron empleadas
como iniciadores en la polimerización del óxido de etileno, los materiales se sintetizaron
con buenos rendimientos de reacción y baja dispersidad, de esta manera, se considera
que la ruta sintetiza seleccionada puede ser utilizada para obtener otros materiales
biohíbridos con distintas funcionalidades [2]. En un estudio similar, Yildirim e
investigadores, prepararon nanopartículas de poli(D,L-Lactida) y retinol a través de un
enlace éster biodegradable vía ROP, las nanopartículas poliméricas obtenidas por el
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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método de nanoprecipitación presentaron tamaños inferiores a 250 nm, estas
nanopartículas podrían ser empleadas en el ataque a adipocitos hepáticos, debido a que
su función es el almacenamiento de grasa, y, por tanto absorberían fácilmente el retinol
[52].
En una investigación previa, Diaz y Pérez, emplearon micelas poliméricas obtenidas a
partir de copolímeros tribloque anfifílicos, compuestos por policaprolactona y
poli(metacrilato de N,N-dimetilamino etilo) (PDMAEMA) con diferentes pesos moleculares
en la encapsulación anfotericina B. Los copolímeros PDMAEMA-b-PCL-b-PDMAEMA
presentaron concentraciones críticas micelares en el rango de 0.9 a 7.0 mg/L, dependiendo
del peso molecular de PCL. Las micelas obtenidas en medio acuoso a pH 6.0 presentaron
estructuras esféricas con tamaños inferiores a 100 nm. Las principales características de
estos sistemas fueron: menor estado de agregación del fármaco, liberación controlada a
lo largo de 170 h presentaron porcentajes de liberación acumulados cercanos al 80 %,
menor actividad hemolítica, pese a todos los aspectos positivos encontrados en esta
formulación, se encontró que los porcentajes de encapsulación de AmB bajos [38]. En una
investigación posterior realizada por Villamil, Parra y Pérez se evaluó el desempeño de
copolímeros de mPEG-b-PCL empleados como vehículos micelares para la entrega de
AmB a través de su conjugación con colesterol, los resultados publicados, revelan que la
molécula de colesterol incrementa la solubilización de AmB en el núcleo de las micelas,
asimismo, la liberación sostenida del medicamento se monitoreo durante 160 h [8].
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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3. Objetivo general
Diseñar formulaciones micelares antimicóticas de Anfotericina B a partir de copolímeros
en bloque anfifílicos biodegradables conjugados con colesterol y retinol que reduzcan su
toxicidad y permitan su liberación controlada.
3.1. Objetivos específicos
• Proponer un protocolo para la síntesis de copolímeros anfifílicos compuestos por
policaprolactona y polietilenglicol bioconjugados con colesterol y retinol del tipo AB
y ABA.
• Establecer relaciones entre propiedades tales como concentración micelar crítica,
tamaño y estabilidad de los sistemas micelares con la composición y estructura de
los copolímeros en bloque anfifílicos usados como precursores.
• Evaluar la capacidad de los sistemas micelares obtenidos para solubilizar
anfotericina B, su liberación controlada y el efecto sobre su agregación.
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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4. Diseño metodológico
El presente trabajo de investigación fue llevado a cabo en tres etapas. En la primera, se
sintetizaron copolímeros dibloque y tribloque de polietilenglicol y policaprolactona
bioconjugados con colesterol y retinol. Posteriormente, en la segunda se evaluó su
autoensamble en medio acuoso para formar micelas poliméricas y se estudió el efecto de
la estructura sobre las propiedades coloidales. Finalmente, en la tercera etapa se realizó
la solubilización de AmB en el núcleo micelar, se efectuaron ensayos de liberación
controlada y, por último, se evaluó el efecto de agregación en la formulación micelar
antimicótica.
Figura 7. Esquema general del diseño metodológico de la investigación
Materiales
La -caprolactona ( -CL) (98%) se adquirió comercialmente de Sigma-Aldrich y se secó
sobre hidruro de calcio (CaH2) durante 48 h. El tolueno se secó por destilación reactiva con
sodio empleando benzofenona como indicador de humedad, el solvente seco fue
almacenado sobre tamices moleculares de 3 Å. El metoxi polietilenglicol (mPEG) con peso
molecular de 5 kDa y polietilenglicol (PEG-diol) con peso molecular de 6 kDa se secaron
empleando destilación azeotrópica con tolueno seco. El etilhexanoato de estaño (II)
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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(Sn(Oct)2) (95%) se secó sobre tamices moleculares durante 48 h. Los demás reactivos:
colesterol (≥ 99%), retinol (≥ 95%), diclorometano (DCM), anhidrido succínico (≥ 99%), N’N-
Diciclohexilcarbodiimida (DCC), 4-(Dimetilamino) piridina (DMAP) y trietilamina (TEA),
fueron suministrados por Sigma-Aldrich y usados sin purificación adicional.
4.1. Síntesis de copolímeros anfifílicos tipo AB y ABA
bioconjugados con colesterol y retinol
Se sintetizaron copolímeros anfifílicos del tipo AB y ABA empleando la combinación de
métodos sintéticos como ROP y esterificación de Steglich. En la primera etapa, la -CL se
polimerizó vía ROP empleando como iniciadores mPEG para copolímeros tipo AB y PEG-
diol para copolímeros tipo ABA siendo A el segmento hidrofóbico y B el segmento
hidrofílico. Asimismo, en los bioconjugados con colesterol, la molécula terpénica fue quien
dio inicio a la ROP de -CL al ser térmicamente estable. Posteriormente, todos los
materiales obtenidos por ROP fueron carboxilados por un método tradicional utilizando
anhídrido succínico. Finalmente, la esterificación de Steglich fue realizada con el fin de
obtener los copolímeros bioconjugados con colesterol y retinol.
Los materiales de mPEG-b-PCL-OH y HO-PCL-b-PEG-b-PCL-OH con diferente longitud
de -caprolactona (1,5 kDa y 3,0 kDa) usados como precursores de la bioconjugación con
terpenos se emplearon como copolímeros blancos con la finalidad de determinar la
capacidad que presentan los terpenos en la encapsulación y liberación controlada de AmB.
En la tabla 1 se describen las condiciones experimentales llevadas a cabo.
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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Tabla 1. Condiciones de reacción de los copolímeros anfifílicos bioconjugados con
terpenos vía ROP y esterificación de Steglich.
Muestra
Polimerización por apertura de
anillo (ROP) Esterificación de Steglich
Copolímero
obtenido Iniciador
Relación
molar
(mmol)a
Mn PCL
teórica
(kDa)
Alcohol
(OH)
Ácido carboxílico
(COOH)
Relación
molar
(mmol)b
COP-
RET1
PEG-diol 6
kDa (0,5:0,6:7,9) 1,5 RET
HOOC-PCL-b-
PEG-b-PCL-
COOH
(2:5:1:6) RET-PCL-b-PEG-b-
PCL-RET
COP-
RET2
mPEG 5
kDa (0,6:0,6:7,9) 1,5 RET
mPEG-b-PCL-
COOH (2:5:1:6) mPEG-b-PCL-RET
COP-
COL1 COL (2,6:1,3:36) 1,5
PEG-
diol 6
kDa
COL-b-PCL-
COOH (5:2:1:6)
COL-PCL-b-PEG-
b-PCL-COL
COP-
COL2 COL (2,6:1,3:72) 3,0
PEG-
diol 6
kDa
COL-b-PCL-
COOH (5:2:1:6)
COL-PCL-b-PEG-
b-PCL-COL
COP-
COL3 COL (2,6:1,3:36) 1,5
mPEG 5
kDa
COL-b-PCL-
COOH (2:5:1:6) mPEG-b-PCL-COL
COP-
COL4 COL (2,6:1,3:72) 3,0
mPEG 5
kDa
COL-b-PCL-
COOH (2:5:1:6) mPEG-b-PCL-COL
B1 PEG-diol 6
kDa (0,5:0,6:7,9) 1,5 - - -
HO-PCL-b-PEG-b-
PCL-OH
B2 mPEG 5
kDa (0,6:0,6:7,9) 1,5 - - - mPEG-b-PCL-OH
B3 PEG-diol 6
kDa (0,5:0,6:16) 3,0 - - -
HO-PCL-b-PEG-b-
PCL-OH
B4 mPEG 5
kDa (0,6:0,6:16) 3,0 - - - mPEG-b-PCL-OH
aRelaciones molares ROP: (Iniciador:Sn(Oct)2:-CL)
bRelaciones molares esterificación Steglich: (COOH:OH:DCC:DMAP)
4.1.1. Protocolos de síntesis
Polimerización por apertura de anillo (ROP):
Todas las polimerizaciones vía ROP se llevaron a cabo en condiciones anhidras,
empleando un balón de fondo redondo de dos bocas como reactor, la temperatura se
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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mantuvo a 115 °C bajo atmosfera de argón, se usó tolueno seco como disolvente y
agitación magnética continua durante 24 h. Para la síntesis de segmentos de PCL, la -
CL se polimerizó vía ROP iniciada por mPEG, PEG-diol o colesterol, para obtener pesos
moleculares de PCL Mn de 1,5 kDa y 3,0 kDa. En un procedimiento característico para la
síntesis de copolímeros dibloque tipo AB de mPEG-b-PCL-OH, el iniciador mPEG (0,6
mmol) se disolvió en tolueno seco, seguido por la adición del catalizador Sn(Oct)2 (0,6
mmol) bajo atmosfera de argón. Después de diez minutos, se añadió -CL (7,9 mmol) para
obtener PCL de 1,5 kDa [29]. Terminada la reacción, los productos crudos se purificaron
por cromatografía en columna usando alúmina básica como fase estacionaria, seguido por
tres precipitaciones sucesivas con un exceso de hexano frio, finalmente, los materiales
fueron secados aplicando presión reducida a temperatura ambiente.
Carboxilación de copolímeros terminados en PCL-OH:
Los materiales poliméricos con grupos terminales hidroxilo fueron modificados para
obtener ácidos carboxílicos empleando esterificación con anhidrido succínico, tomando
como referencia el método reportado por Yoon y colaboradores [53]. Brevemente, el
mPEG-b-PCL-OH (5 mmol) y el anhidrido succínico (6 mmol) se colocaron en un balón
fondo plano y se disolvieron en cloroformo, posteriormente, se añadió DMAP (6 mmol) y
TEA (6 mmol), la reacción transcurrió con agitación continua durante 24 h, bajo atmosfera
de argón a temperatura ambiente. Finalmente, la mezcla de reacción fue filtrada, el
producto final se obtuvo precipitado dos veces sucesivas con un exceso de éter etílico y
secando al vacío durante 4 h.
Esterificación de Steglich:
Los materiales carboxilados (2 - 5 mmol; ver tabla 1) y el DCC (1 mmol) fueron disueltos
en DCM y agitados magnéticamente a 500 rpm durante 30 min, a continuación, se añadió
el DMAP (6 mmol) y la correspondiente sustancia hidroxilada (retinol o PEG) (2 - 5 mmol;
ver tabla 1). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente y en oscuridad durante
6 h (retinol) y 24 h (PEG) [54]. El producto se filtró para remover el subproducto de
diciclohexilurea. Los copolímeros se disolvieron en DCM y se precipitaron con un exceso
de éter etílico, el solvente residual fue removido bajo presión reducida para obtener los
copolímeros bioconjugados con retinol y se almacenaron a 6°C en oscuridad, los
copolímeros bioconjugados con colesterol se almacenaron a temperatura ambiente.
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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4.2. Caracterización de los copolímeros anfifílicos
bioconjugados tipo AB y ABA
La caracterización de los copolímeros anfifílicos obtenidos se llevó a cabo a través de
diferentes técnicas descritas a continuación:
• Espectroscopia infrarroja por Transformada de Fourier: Los análisis de FTIR,
se realizaron en un equipo Shimadzu IR Prestige 21 FTIR, utilizando 2 mg de cada
copolímero y se disolvieron en CHCl3, para la medición se empleó una ventana de
NaCl sobre la cual se depositó la película de copolímero.
• Resonancia Magnética Nuclear de protón: las mediciones de RMN1H se llevaron
a cabo a temperatura ambiente para los biocopolímeros de COL y a temperatura
≤6 ºC para los biocopolímeros de RET, en un espectrofotómetro Bruker 400
Ultrashield operado a 400 MHz. Aproximadamente 20 mg de los copolímeros se
disolvieron en CDCl3, los desplazamientos químicos () fueron expresados en
partes por millón (ppm) con respecto a la señal del disolvente.
• Cromatografía de permeación en gel: los análisis de GPC se realizaron en un
equipo Merck Hitachi D-6000, con un detector de índice de refracción LaChrom L-
7490 y una bomba L-6000A. Se utilizó THF grado HPLC como eluyente a un flujo
de 0,8 mL/min empleando una columna 00H-0444-K0. Para obtener la curva de
calibración relativa se usaron estándares de poliestireno.
• Calorimetría Diferencial de Barrido: Las propiedades térmicas de los materiales
poliméricos se analizaron empleando un calorímetro diferencial de barrido (DSC)
Mettler Toledo DSC 1 STAR System, el método empleado se configuró de la
siguiente manera: primero, se borró su historial térmico calentando desde 30 °C
hasta 100 °C a 10 °C/min; después, se realizó una isoterma durante 5 min; seguido,
las muestras fueron enfriadas hasta -20 °C a 10 °C/min; esta temperatura se
mantiene durante 5 min; finalmente, se calienta desde – 20 °C hasta 120 °C a 10
°C/min.
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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34
• Espectrofotometría UV-Vis: la presencia de unidades de retinol en los CBA (COP-
RET1 y COP-RET2) fue adicionalmente evaluada empleando un espectrofotómetro
Evolution 300 UV/VIS. El retinol y los COP-RET se disolvieron en diclorometano a
una concentración de 0,2 mg/mL (COP-RET) y 0,02 mg/mL (retinol).
Posteriormente se registraron espectros UV-Vis de barrido desde 250 nm hasta
400 nm.
4.3. Estudio de las relaciones entre las propiedades coloidales
de las micelas y los copolímeros anfifílicos tipo AB y ABA
En esta etapa, se prepararon sistemas micelares en medio acuoso a partir del
autoensamblaje de los copolímeros anfifílicos, empleando el método de nanoprecipitación
[3], de acuerdo con el cual, 20 mg del copolímero se disolvieron en 2,5 mL de acetona; la
solución resultante fue goteada lentamente bajo agitación constante sobre 5 mL de agua;
el cosolvente se removió por evaporación a presión reducida y bajo agitación constante
durante 24 h. Asimismo, se estudiaron las propiedades coloidales de las micelas a través
de diferentes técnicas analíticas:
4.3.1. Determinación de la concentración micelar crítica (CMC)
La concentración micelar critica de los copolímeros anfifílicos se determinó mediante
espectrofotometría de fluorescencia utilizando pireno como molécula hidrófoba de prueba
[35] [55]. Para el cual sus características optoelectrónicas dependerán de la polaridad del
medio en que se encuentre. Dicha polaridad se modificará crecientemente con la
concentración de copolímero que se disponga en el medio; cuanta más concentración del
copolímero, el pireno se instalará en mayor medida en los núcleos hidrófobos de las
micelas lo que generara mayor emisión de fluorescencia. los espectros de excitación
fueron tomados en un fluorómetro PTI-710. Brevemente, se prepararon soluciones
micelares con varias concentraciones de cada copolímero (0,01; 0,1; 0,5, 1,0; 5,0; 10,0;
30,0; 50,0; 70,0; 100,0 y 1000,0 mg/L) y una concentración fija de pireno de 0.02 μM, todas
las disoluciones fueron preparadas con agua desionizada. Se midieron espectros de
excitación para el pireno desde 300 nm hasta 360 nm y se monitorearon a 390 nm. La
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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35
CMC se determinó mediante la relación de intensidades a dos longitudes de onda (I335/I332)
frente a la concentración expresada como logaritmo.
4.3.2. Caracterización de los sistemas micelares
La caracterización de las micelas se llevó a cabo empleando:
• Dispersión dinámica de luz (DLS): los diámetros hidrodinámicos (Dh) de las
partículas se midieron tanto para las micelas sin AmB como a las micelas cargadas
con el fármaco, las muestras fueron diluidas hasta una concentración de 0,5
mg/mL, los análisis fueron realizados a dos temperaturas (25 y 37 ºC) en un equipo
DLS, Litesizer 500, Anton Paar.
• Potencial zeta: esta técnica brindará información sobre la carda superficial de las
micelas poliméricas y por ende su estabilidad, para ello, se empleará el método de
movilidad electroforética. Las medidas de potencial zeta fueron realizadas en
solución acuosa de las micelas sin carga de fármaco a una concentración de 0,5
mg/mL, empleando un equipo DLS, Litesizer 500, Anton Paar
• Microscopia electrónica de transmisión (TEM): la morfología de las dispersiones
micelares se observó con un microscopio electrónico de transmisión Jeol 1400
Plus. Las muestras se prepararon diluyéndose hasta una concentración de 0,1
mg/mL y posteriormente se dejaron caer 5 μL de la solución micelar sobre el grid
(rejilla de cobre recubierta con una película de formvar) las cuales se dejaron
secar durante 48 h.
4.4. Encapsulación de anfotericina B, liberación controlada y
efecto sobre su agregación
4.4.1. Encapsulación de AmB
Las micelas cargadas con AmB se prepararon de acuerdo con el método de evaporación
de solvente [56]. Inicialmente, se prepararon dispersiones micelares pesando 20 mg de
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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36
cada copolímero disuelto en 25 mL de agua desionizada (concentración del copolímero
0.8 mg/mL). Paralelamente, se disolvieron 5 mg de AmB en 5 mL de metanol, esta solución
fue adicionada gota a gota a las dispersiones micelares. La mezcla resultante se dejó bajo
agitación constante durante 48 h. Por último, la AmB no incorporada en el núcleo micelar
se removió por centrifugación a 13000 rpm durante 15 min. La concentración de AmB
solubilizada en el núcleo de las micelas fue cuantificada por espectrofotometría UV-Vis a
una longitud de onda de 406 nm.
Figura 8. Representación esquemática de la encapsulación de AmB
4.4.2. Estudio de liberación controlada de AmB
La cinética de liberación controlada de las formulaciones antimicóticas de AmB fue
estudiada in vitro empleando el método de diálisis [56]. El estudio se realizó empleando 10
mL de un medio de liberación constituido por deoxicolato de sodio al 0,5% y dimetil
sulfóxido (DNa:DMSO 2:1) que proporciono “sink conditions”. La diálisis de AmB se realizó
utilizando membranas de diálisis MWCO de 10 kDa, las cuales fueron activadas por
agitación en agua desionizada (conductividad <0.1 μS/cm) durante 5 min. En un microtubo
con tapa rosca de 5 mL se dispuso 3 mL de las dispersiones micelares cargadas con AmB,
en la parte inferior del tubo se ubicó la membrana y se selló permitiendo el contacto con el
medio de liberación. Las muestras se mantuvieron bajo agitación constante (200 rpm) con
control de temperatura a 37 ºC. Durante diferentes tiempos (1, 2, 3, 4, 5, 6, 24, 48, 72 y 96
h) se tomó una alícuota de 1mL para analizar la concentración de AmB liberada por UV-
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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37
Vis a una longitud de onda de 406 nm, el volumen del medio de liberación se mantuvo
constante reconstituyendo con la misma alícuota tomada para la lectura.
Figura 9. Representación esquemática de la liberación controlada de AmB
Cuantificación de AmB encapsulada y liberada por espectrofotometría UV-
Vis
La cuantificación de AmB encapsulada en las micelas y liberada fueron realizadas
empleando un espectrofotómetro UV-Vis. Para ello, se realizó una curva de calibración de
AmB a diferentes concentraciones (0.1; 0.5; 1.0; 1.5; 2.0; 4.0 y 5.0 mgAmB/L). Se realizó
un barrido desde 300 nm hasta 450 nm, obteniéndose una longitud de onda de máxima
absorción a 406 nm, la cual se seleccionó para los análisis posteriores.
Para conocer el contenido del fármaco en cada una de las formulaciones se empleó la
siguiente ecuación:
𝐶𝑜𝑛𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜 𝑑𝑒 𝐴𝑚𝐵 = 𝑚𝑔 𝐴𝑚𝐵 𝑒𝑛 𝑙𝑎𝑠 𝑚𝑖𝑐𝑒𝑙𝑎𝑠
𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑝𝑜𝑙𝑖𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑢𝑠𝑎𝑑𝑜 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑝𝑟𝑒𝑝𝑎𝑟𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛 × 100 (1)
Asimismo, se calculó la eficiencia de la encapsulación empleando la siguiente
ecuación:
𝐸𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑒𝑛𝑐𝑎𝑝𝑠𝑢𝑙𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛 = 𝑚𝑔 𝐴𝑚𝐵 𝑒𝑛 𝑙𝑎𝑠 𝑚𝑖𝑐𝑒𝑙𝑎𝑠
𝑚𝑔 𝐴𝑚𝐵 𝑢𝑠𝑎𝑑𝑎 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑝𝑟𝑒𝑝𝑎𝑟𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛× 100 (2)
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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38
Por su parte, la AmB liberada se cuantifico utilizando la curva de calibración descrita
anteriormente, se tomaron alícuotas de la solución de liberación (DNa:DMSO 2:1) a
diferentes tiempos. Los resultados se expresaron en mg/L y en porcentaje de liberación.
4.4.3. Estado de agregación de AmB
Para determinar el estado de agregación en las formulaciones antimicóticas de AmB, se
prepararon soluciones de AmB a una concentración de 10 mg AmB/L en dimetil sulfóxido
(DMSO) y en buffer de fosfato salino (PBS) pH 7.4 unidades (la solución de PBS contenía
1%v/v de DMSO). De la misma manera, se obtuvieron soluciones de las formulaciones
micelares a la misma concentración. Posteriormente se registraron espectros UV-Vis de
barrido de todas las muestras desde 300 nm hasta 450 nm utilizando un espectrofotómetro
Evolution 300 UV/VIS. Para conocer el estado de agregación se analizó la relación de
absorbancia del primer (I) y cuarto pico (IV) en el espectro UV-Vis se tomó como parámetro
semicuantitativo [56].
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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5. Resultados y discusión
5.1. Síntesis de los copolímeros anfifílicos tipo AB y ABA
bioconjugados con colesterol y retinol
La polimerización de los materiales, mPEG-b-PCL-COL, COL-PCL-b-PEG-b-PCL-COL,
mPEG-b-PCL-RET y RET-PCL-b-PEG-b-PCL-RET, con diferente longitud de segmento
hidrofóbico, se llevó a cabo mediante el empleo de tres métodos sintéticos, en su orden,
polimerización por apertura de anillo (ROP), carboxilación empleando anhidrido succínico
y finalmente esterificación de Steglich. Inicialmente, se sintetizó una serie de copolímeros
dibloque y tribloque de mPEG-b-PCL, PCL-b-PEG-b-PCL y COL-PCL. Para ello, se
polimerizó -CL por medio de ROP para obtener PCL con pesos moleculares de 1,5 kDa y
3,0 kDa, en esta etapa de síntesis se empleó mPEG, PEG o COL como iniciadores de la
polimerización y Sn(Oct)2 como catalizador (Figura 10).
Figura 10. Representación esquemática de la ROP iniciada por COL (a) e iniciada por
mPEG (b)
Posteriormente, se carboxilarón los materiales obtenidos por ROP empleando anhidrido
succínico como se muestra a continuación (Figura 11):
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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Figura 11. Representación esquemática de la carboxilación de los materiales para COL
(a) y para RET (b)
Finalmente, a través de esterificación de Steglich se bioconjugarón los copolímeros con
mPEG o PEG-diol en el caso de copolímeros de COL y de la manera análoga la
esterificación de los bioconjugados con RET empleo el terpeno como molécula hidroxilada
(Figura 12). El primer paso de la reacción implica la activación del ácido carboxílico por
medio del acoplamiento con DCC, lo que conduce a la formación de un éster intermedio,
en esta etapa el alcohol puede realizar un ataque nucleofílico al carbonilo activado
terminando en la formación del éster, sin embargo, una variación de la reacción incluye el
uso de DMAP para minimizar la formación del subproducto de acilo improductivo en la
reacción (reorganización del intermediario O-acilo a una N-acilurea donde ya no sería
posible el ataque nucleofílico del alcohol). Las reacciones en las que se emplea un exceso
de DMAP, consisten en la formación de un intermedio acilpiridinio el cual reacciona con el
alcohol formando el compuesto esterificado y regenerando el DMAP [57].
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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Figura 12. Representación esquemática de la esterificación de Steglich de los materiales
para COL (a) y para RET (b)
Bajo este protocolo de síntesis se obtuvieron copolímeros del tipo AB (mPEG-b-PCL-
Terpeno) y tipo ABA (Terpeno-PCL-b-PEG-b-PCL-Terpeno) con diferentes grados de
polimerización (Xn), controlando los parámetros de síntesis como, por ejemplo: la longitud
del segmento de PCL de 1,5 kDa y 3,0 kDa, tiempos de reacción, temperaturas de reacción
y relaciones molares de los reactivos, entre otros. Los copolímeros obtenidos se analizaron
por espectroscopia FTIR y RMN1H para caracterizar la estructura química de cada material;
DSC para identificar sus propiedades térmicas, GPC para conocer la distribución de pesos
moleculares y finalmente se realizó espectrofotometría UV-Vis a los CBA bioconjugados
con retinol. Los resultados obtenidos se muestran a continuación:
5.1.1. Espectroscopia infrarroja por Transformada de Fourier
(FTIR)
En las figuras 13 y 14, se muestran los espectros vibracionales obtenidos por FTIR de los
copolímeros COP-COL1 y COP-RET1. Estos espectros confirman la presencia de los
principales grupos funcionales en los copolímeros resultantes y sus precursores.
Inicialmente el PEG, presenta la banda correspondiente al estiramiento del grupo éter C–
O–C a 1100 cm−1, asimismo, se identifican las vibraciones debidas al estiramiento del
grupo metileno -CH2 en 2865 cm-1. En los espectros de PEG-b-PCL, aparece la banda de
absorción acentuada característica del estiramiento del grupo éster (C=O) a 1725 cm-1,
correspondiente a la señal intensa del grupo carbonilo. Por su parte, los biohíbridos
conjugados con retinol presentan las bandas entre 1610 y 1555 cm-1 debidas a los
estiramientos de C=C presentes en las insaturaciones de la cadena isoprenoide, además,
se observa el estiramiento C-H de los grupos metilo que aparece a 2927 cm-1. En tanto,
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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42
los biohíbridos que contienen colesterol, no mostraron señales características, debido a
que solo poseen un solo grupo alqueno, el cual se caracteriza por una banda débil y por
ende dada su abundancia relativa en el copolímero no es observada.
Figura 13. Espectro FTIR del copolímero anfifílico tipo ABA COP-COL1
Figura 14. Espectro FTIR del copolímero anfifílico tipo ABA COP-RET1
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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5.1.2. Resonancia magnética nuclear protónica (RMN1H)
Con el fin de facilitar la determinación estructural de los materiales poliméricos, la
composición y el peso molecular (Mn), se empleó espectroscopia RMN1H. Los espectros
representativos de los copolímeros purificados de COP-COL1 y COP-RET1 se presentan
en las figuras 15 y 16, respectivamente, en los cuales se pueden observar las señales
debidas a las secuencias de los monómeros y terpenos; ambos espectros presentan las
señales características de los grupos metileno (-CH2-) de la PCL ( ~ 2,32; 1,65; 1,40 y
4,08 ppm) y también la señal debida a los grupos -CH2CH2O- del PEG ( ~ 3,65 ppm),
igualmente, la señal de los grupos -CH3-O ( ~ 3,35 ppm) para el caso del mPEG. Además
de la copolimerización base de PEG-b-PCL, los espectros RMN1H obtenidos por
bioconjugación con terpenos revelaron la inserción de la molécula terpénica en la
estructura del polímero. En consecuencia, el espectro RMN1H de COP-RET1 fue obtenido
del copolímero almacenado bajo refrigeración (≤6 °C), la bioconjugación con retinol se
distingue por las señales asignadas a los dobles enlaces conjugados ( ~ desde 5,47 a
6,75 ppm). Por su parte, el espectro de COP-COL1, revela la señal correspondiente a los
protones del grupo -CH3 a ~ 0,70 ppm.
Figura 15. Espectro RMN1H del copolímero anfifílico tipo ABA COP-COL1 en CDCl3.
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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En consecuencia, el espectro RMN1H de COP-RET1 fue obtenido del copolímero
almacenado bajo refrigeración (≤6 °C), la bioconjugación con retinol se distingue por las
señales asignadas a los dobles enlaces conjugados ( ~ desde 5,47 a 6,75 ppm). Por su
parte, el espectro de COP-COL1, revela la señal correspondiente a los protones del grupo
-CH3 a ~ 0,70 ppm.
Figura 16. Espectro RMN1H del copolímero anfifílico tipo ABA COP-COL1 en CDCl3
A partir de los espectros RMN1H, se determinó la composición, la longitud de PCL y el peso
molecular (Mn) de los copolímeros a través de la integración de las señales. Por
consiguiente, se tomó como referencia la intensidad de las señales de los picos
característicos de PEG ( ~ 3,65 ppm) y PCL ( ~ 2,3 ppm). El peso molecular promedio
en número (Mn) de los copolímeros y el grado de polimerización (Xn) de la -CL se calculó
teniendo en cuenta la ecuación 3 y 4:
𝑀n = MnPEG + (PMCL × XnCL) + PMSucc + PMT (3)
𝑋𝑛𝐶𝐿 = 𝑀𝑛 𝑃𝐶𝐿
𝑃𝑀 𝐶𝐿 (4)
Donde, MnPEG es el peso molecular promedio en número del PEG o mPEG, XnCL es el
grado de polimerización de la -CL, PMSucc es el peso molecular del anhidrido succínico,
PMT es el peso molecular del terpeno correspondiente, MnPCL es el peso molecular
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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promedio en número obtenido después de la polimerización y PMCL es el peso molecular
del monómero -CL.
Los resultados de las características de los copolímeros bioconjugados calculadas por
RMN1H se presentan en la tabla 2.
Tabla 2. Características de los copolímeros mPEG-b-PCL-Terpeno y Terpeno-PCL-b-
PEG-b-PCL-Terpeno
Muestra Composición promedio Xn
-CL
Mn
(kDa)a Mw/Mn
b Conversión (%)
COP-RET1 RET-(PCL)9-(PEG)97-
(PCL)9-RET 9,3 8,8 1,29 71
COP-RET2 (mPEG)80-b-(PCL)11-RET 11,2 6,6 1,24 86
COP-COL1 COL-(PCL)9-(PEG)97-
(PCL)9-COL 9,2 9,0 1,34 72
COP-COL2 COL-(PCL)18-(PEG)97-
(PCL)18-COL 17,9 11,1 1,37 71
COP-COL3 (mPEG)80-(PCL)10-COL 9,8 6,6 1,57 76
COP-COL4 (mPEG)80-(PCL)19-COL 18,7 7,6 1,58 73
B1 HO-(PCL)9-(PEG)97-
(PCL)9-OH 9,2 9,0 1,13 72
B2 (mPEG)80-(PCL)10-OH 9,8 6,6 1,20 76
B3 HO-(PCL)18-(PEG)97-
(PCL)18-OH 17,9 11,1 1,10 71
B4 (mPEG)80-(PCL)19-OH 18,7 7,6 1,14 73
a Calculado por RMN1H b Determinado por GPC
5.1.3. Cromatografía de permeación en gel (GPC)
Con el fin de conocer la distribución de peso molecular y el índice de dispersión (Mw/Mn)
de los copolímeros obtenidos se realizaron mediciones empleando GPC. Los índices de
dispersión se observan en la tabla 2, los valores de Mw/Mn obtenidos en los CBA son bajos,
encontrándose valores desde 1,10 en los copolímeros blanco hasta 1,58 en los CBA con
entidades terpénicas enlazadas; los índices de dispersión revelaron valores cercanos a la
unidad, con lo que se afirma el control durante la polimerización, característica distintiva
de la síntesis mediante ROP [58].
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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Las curvas GPC obtenidas se muestran en la figura 17, observándose una distribución
unimodal. Adicionalmente, en los CBA bioconjugados ocurre un corrimiento de la señal a
menores tiempos de retención con respecto a los materiales precursores, lo cual es indicio
del proceso de copolimerización.
Figura 17. Curvas GPC de los CBA con unidades de retinol (A) y con unidades de colesterol (B)
5.1.4. Calorimetría diferencial de barrido (DSC)
Mediante la caracterización por calorimetría diferencial de barrido (DSC), se estableció el
efecto de las propiedades térmicas y morfológicas en la bioconjugación de los copolímeros
PEG-b-PCL con terpenos. En primer lugar, se borró la historia térmica calentando desde
30 °C hasta 100 °C, en seguida, se realizó un enfriamiento hasta -20 °C con una velocidad
de 10 °C/min con la finalidad de estudiar el comportamiento cristalino (figura 18A). Por su
parte, el calentamiento desde –20 °C hasta 120 °C indico la fusión de los materiales (Figura
18B). En las curvas DSC obtenidas, se observa que la caracterización térmica del PEG-
diol de 6 kDa mostro un pico de cristalización a 36,7 °C y un pico de fusión a 64,0 °C, el
alto grado de cristalinidad, obedece al plegado de los grupos éter presentes en la
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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estructura que le confiere flexibilidad [59]. En la unión covalente con PCL, se observa un
comportamiento unimodal dado que los picos de cristalización se encuentran
superpuestos, esto sugiere, que la corta longitud de la cadena PCL comparada con las
unidades de PEG no generan un cambio térmico en la cristalinidad del PEG-b-PCL, como
si el dominio PCL no coexistiera [8].
Figura 18. Termogramas DSC de materiales poliméricos A. enfriamiento de 100 ° C
hasta -20 °C a 10 °C/min y B. calentamiento de -20 °C hasta 120 °C a 10 °C/min
En relación con los polímeros bioconjugados que presentan moléculas de terpeno en su
estructura, se muestra que la cristalinidad de los copolímeros disminuyó. En este sentido,
para el copolímero COP-RET1, se muestra una menor cristalización a una temperatura de
a 15,0 °C. En contraste, el COP-COL1 también redujo la cristalización del material a una
temperatura de 23,7 °C, además, la bioconjugación con COL evidencia la separación de
dominios, donde el PEG y PCL forman cristales independientes, de manera que, la
inserción de la moléculas de terpeno en la estructura al ser moléculas con mayor rigidez
reducen la movilidad de los segmentos [33]. La tabla 3 resume las propiedades térmicas
obtenidas en los materiales poliméricos.
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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Tabla 3 Propiedades térmicas de los copolímeros mPEG-b-PCL-Terpeno y Terpeno-PCL-
b-PEG-b-PCL-Terpeno
Muestra Composición promedio Temperatura
fusión (°C)
Temperatura
cristalización
(°C)
Entalpia de
cristalización
(J/g)
COP-RET1 RET-(PCL)9-(PEG)97-(PCL)9-RET 46,7 15,0 48,2
COP-RET2 (mPEG)80-b-(PCL)11-RET 36,7 7,7 15,2
COP-COL1 COL-(PCL)9-(PEG)97-(PCL)9-COL 51,0 23,7 96,0
COP-COL2 COL-(PCL)18-(PEG)97-(PCL)18-COL 54,0 33,7 98,3
COP-COL3 (mPEG)80-(PCL)10-COL 49,7 29,3 90,8
COP-COL4 (mPEG)80-(PCL)19-COL 45,3 29,3 92,5
B1 HO-(PCL)9-(PEG)97-(PCL)9-OH 45,3 29,3 71,1
B2 (mPEG)80-(PCL)10-OH 54,0 29,3 110,7
B3 HO-(PCL)18-(PEG)97-(PCL)18-OH 49,7 29,3 92,9
B4 (mPEG)80-(PCL)19-OH 54,0 29,3 97,4
5.1.5. Espectrofotometría UV-Vis
El especto UV-Vis del retinol y el CBA bioconjugado con retinol (COP-RET1 y COP-RET2)
en diclorometano se muestra en la figura 19. La absorbancia máxima del retinol es
observada a máx = 331 nm (amarillo), por su parte los COP-RET mostraron una señal con
menor absorbancia a una longitud de absorción máxima de 325 nm. Este pequeño
desplazamiento hacia el azul puede estar relacionado con la agregación o isomerización
del retinol en el copolímero, sin embargo, estos resultados aportan certeza sobre la
presencia del terpeno en la estructura del copolímero.
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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Figura 19. Espectro UV-Vis del retinol y los CBA bioconjugados con retinol
5.2. Estudio de las relaciones entre las propiedades coloidales
de las micelas y los copolímeros anfifílicos tipo AB y ABA
Sistemas coloidales de micelas fueron preparados por el autoensamblaje en medio acuoso
de los copolímeros bioconjugados, para ello, se empleó el método de nanoprecipitación
goteando solución de acetona-copolímero sobre agua. Este método es conveniente dado
que favorece la formación de MP con una distribución de tamaño estrecha, es sencillo y
rápido [60].
En el caso de las dispersiones micelares en medio acuosas, uno de los bloques debe ser
hidrófilo, proporcionando la afinidad de las micelas en medio acuoso. En este estudio, se
seleccionó PEG como dominio hidrófilo por su biocompatiblidad, biodegradabilidad y
aprobación de la FDA en aplicaciones biomédicas [61]. Estudios previos, han demostrado
que la longitud de los segmentos de PEG está relacionada con el comportamiento
fisiológico in vivo. De tal modo que longitudes cortas de PEG han presentado una mayor
captación celular, por el contrario, cuando se presentan longitudes de PEG largas, la
interacción con proteínas disminuye [62]. Por este motivo, se han seleccionado PEG y
mPEG con pesos moleculares de 6 kDa y 5 kDa, respectivamente, para proporcionar
segmentos hidrofílicos largos que permitan ser empleados eficientemente como sistemas
de liberación controlada de fármacos hidrófobos, aumentando así los tiempos de
circulación en el cuerpo, con baja captación celular y liberación a nivel plasmático.
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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5.2.1. Determinación de la concentración micelar critica (CMC)
La concentración micelar critica (CMC), además de constituir una evidencia importante del
autoensamblaje de los copolímeros en el medio acuoso, es un parámetro que proporciona
información sobre la estabilidad de las micelas [63]. Los valores de CMC altos, son poco
deseables debido a que las micelas formadas pueden disociarse después de ser
administradas en el cuerpo. Sin embargo, se ha demostrado que las micelas de
copolímeros en bloque exhiben bajas CMC, ello implica que el equilibrio entre unÍmeros y
agregados micelares se alcanza a concentraciones inferiores, usualmente cercanas a 1
µg/mL, dependiendo de las características químicas de los segmentos que lo componen y
su longitud, así como la arquitectura del copolímero [64].
En este trabajo, la formación de micelas poliméricas se monitoreo empleando fluorescencia
con pireno como molécula de prueba. Este hidrocarburo aromático policíclico ha sido
ampliamente utilizado para sensar la polaridad en sistemas micelares, la naturaleza
hidrofóbica de esta molécula conduce a su preferencia para ubicarse en el interior de las
micelas, dando como resultado, una fluorescencia intensa bajo un entorno hidrófobo,
mientras que en un entorno hidrófilo su intensidad es débil [33].
Con el fin de llevar a cabo la medida, se tomó el espectro de excitación de pireno
monitoreado a una longitud de onda de 390 nm para soluciones micelares del copolímero
en concentraciones cercanas al valor de CMC esperado, tal como se muestra en la Figura
20. De estos espectros, se observa un corrimiento hacia el rojo del máximo de excitación
desde 332 nm hasta 335 nm a medida que la concentración de copolímero aumenta. La
relación de intensidad entre las dos bandas (I335/I332) se emplea como la medida relativa de
la polaridad, exhibiendo valores mayores en entornos menos polares.
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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Figura 20. Espectro de excitación de pireno a diferentes del copolímero COP-COL1
El valor de CMC para los copolímeros se estimó a partir de un gráfico semilogarítmico de
I335/I332 versus concentración del copolímero, el cual exhibe una forma sigmoidal (ver Figura
19). Se observa que, a bajas concentraciones del copolímero, la I335/I332 permanece
constante, sin embargo, a partir de un valor crítico, esta relación aumenta
significativamente. Este valor de concentración corresponde, según el método de
fluorescencia, a la CMC del copolímero, en este punto se presenta un equilibrio de partición
del pireno entre la fase acuosa y los núcleos de las micelas formadas. Los valores de CMC
en mg/L se obtuvieron por intersección de líneas rectas dibujadas en las regiones planas
del gráfico, tal como se muestra en la Figura 21.
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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Figura 21. Relación de intensidad de fluorescencia (I335/I332) vs el logaritmo de la
concentración de los copolímeros bioconjugados.
En este estudio, se obtuvieron CMC de los copolímeros bioconjugados con terpenos y de
los copolímeros blanco, los valores encontrados comprenden el rango entre 0,7 mg/L y 7,4
mg/L, donde se observa una fuerte dependencia de la unidad terpénica en cada caso (tabla
4). Los copolímeros tipo ABA que contienen PEG-diol conjugado con colesterol, presentan
CMC más bajas (inferiores a 1 mg/L), mientras que el PEG-diol conjugado con retinol
presenta una CMC de 5,47 mg/L, al comparar estos resultados con los copolímeros tipo
AB que contienen mPEG se observa que la CMC incrementa en todos los casos. Este
resultado esta atribuido a que la CMC es sensible a la longitud hidrofílica de las micelas,
esto sugiere que el aumento del segmento hidrófilo proporciona valores de CMC bajos,
que está de acuerdo con lo reportado por otros autores [63].
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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53
Tabla 4. Concentraciones micelares críticas (CMC) de los copolímeros bioconjugados con
terpenos
Muestra Composición promedio CMC (mg/L)
COP-RET1 RET-(PCL)9-(PEG)97-(PCL)9-RET 5,5
COP-RET2 (mPEG)80-b-(PCL)11-RET 7,4
COP-COL1 COL-(PCL)9-(PEG)97-(PCL)9-COL 0,8
COP-COL2 COL-(PCL)18-(PEG)97-(PCL)18-COL 0,7
COP-COL3 (mPEG)80-(PCL)10-COL 3,7
COP-COL4 (mPEG)80-(PCL)19-COL 3,0
B1 HO-(PCL)9-(PEG)97-(PCL)9-OH 2,7
B2 (mPEG)80-(PCL)10-OH 4,5
B3 HO-(PCL)18-(PEG)97-(PCL)18-OH 3,0
B4 (mPEG)80-(PCL)19-OH 4,1
Por su parte, en los copolímeros con unidades de RET la hidrofobicidad del medio ocasiona
que la CMC se incremente, aunque la longitud del segmento de PCL obtenida en los
materiales de estudio, parece no tener un efecto significativo en esta propiedad, la
conjugación con los terpenos evidencia cambios significativos, los copolímeros de retinol,
presentan valores de CMC superiores a los conjugados con colesterol, lo cual es
consecuencia de su comportamiento liotrópico.
Conviene destacar, que los valores de CMC obtenidos por los copolímeros en la presente
investigación concuerdan con otros autores, quienes han señalado que un aumento en la
hidrofobicidad del medio proporciona CMC bajas [65], [66]. Una mayor estabilidad
termodinámica de las micelas, corresponde a valores de CMC bajos, investigaciones
similares han reportado valores de CMC mayores a los obtenidos en el presente estudio,
tal como copolímeros tribloque PCL-PEG-PCL para los cuales se reporta valores de CMC
de 30 mg/L, esto sugiere, que los materiales bioconjugados desarrollados en la presente
investigación son más estables termodinámicamente y por ende son promisorios como
vehículos de fármacos hidrófobos [9].
En cuanto a copolímeros en bloque empleados como formulaciones de AmB, el fármaco
ha sido incorporado en micelas poliméricas autoensambladas a partir policarbonato y
polietilenglicol funcionalizado con ácido fenilborónico (PEG-PBC), una mezcla de
polcarbonato y polietilenglicol funcionalizado con urea (PEG-PUC/PEG-PBC (relación
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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54
molar 1:1) y copolímeros dibloque de PEG-PUC, los resultados de CMC encontrados
fueron bajos (8,0; 4,3 y 3,8, respectivamente), indicando que las micelas formadas por
estos materiales tienen asociada una potencial estabilidad termodinámica [36]. En
contraste, los materiales de mPEG-b-PCL-Terpeno y Terpeno-PCL-b-PEG-b-PCL-
Terpeno, obtenidos en esta investigación presentan CMC inferiores a 8,0 mg/L, por lo que
son sistemas altamente estables.
5.2.2. Caracterización de los sistemas micelares
Se prepararon dispersiones micelares con una concentración de copolímero de 4 mg/mL
en medio acuoso. Estos sistemas fueron caracterizados empleando diferentes técnicas,
estas incluyen: dispersión dinámica de luz (DLS) para conocer el diámetro hidrodinámico
(Dh) y la distribución de tamaños de las partículas micelares. Además, fueron realizadas
medidas de potencial zeta para determinar la estabilidad de las partículas y microscopia
electrónica de transmisión (TEM), para confirmar la morfología tipo “core-shell”.
Las medidas de DLS fueron determinadas a dos temperaturas diferentes, 25 y 37 ºC, con
el fin de evaluar el comportamiento de Dh a temperatura de almacenamiento y temperatura
corporal, respectivamente. Los resultados de DLS y potencial Z se muestran en la tabla 5.
Tabla 5. Propiedades de las micelas de copolímeros anfifílicos bioconjugados con
terpenos
Muestra Diámetro hidrodinámico (Dh) (nm)
25 °C PDI 37 °C PDI
COP-RET1 57,5 0,57 80,5 0,50
COP-RET2 53,4 0,54 77,6 0,47
COP-COL1 127,7 0,60 136,8 0,59
COP-COL2 122,7 0,65 126,3 0,58
COP-COL3 123,9 0,62 136,7 0,70
COP-COL4 126,8 0,60 141,6 0,62
B1 31,1 0,34 35,5 0,33
B2 22,0 0,36 32,4 0,35
B3 24,1 0,32 27,4 0,32
B4 39,3 0,35 40,1 0,34
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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Figura 22. Efecto de la temperatura en el diámetro hidrodinámico de las micelas de los
CBA B1, COP-COL1 y COP-RET1
En la tabla 5 y la figura 22 se muestran los resultados de los diámetros hidrodinámicos
(Dh) obtenidos de las micelas en función de la temperatura (25 y 37 °C) observándose una
distribución de Dh unimodal en todos los sistemas micelares evaluados. Los Dh de las
micelas varían de acuerdo con la composición del copolímero, para los copolímeros blanco
basados en PCL y PEG o mPEG se presentan tamaños en el rango de 22,0 hasta 40,1
nm. Por su parte, los copolímeros con entidades terpénicas enlazadas incrementan el Dh
a valores entre 53,4 y 80,5 nm para el caso de RET, mientras que para los bioconjugados
con COL los valores oscilaron entre 122,7 y 244,1 nm, teniendo en cuenta las dos
temperaturas experimentadas.
El efecto de la temperatura también mostro un incremento en los Dh promedio de las
micelas, este fenómeno se encuentra directamente relacionado con la composición en la
sección hidrofílica de los copolímeros, los segmentos de PEG o mPEG disminuyen su
carácter hidrofílico a medida que aumenta la temperatura, generando mayor agregación
de las partículas.
Con respecto al tipo de copolímero, se observa que los tamaños más grandes son
obtenidos en los copolímeros tipo AB, es decir, aquellos que contienen mPEG como
segmento hidrofílico de la cadena polimérica. Esto indica, que el mecanismo por el cual se
forman las micelas nucleación - crecimiento en los CBA que contienen PEG-diol ocurre a
una menor CMC y confiere mayor hidrofobicidad al núcleo micelar ocasionando una
disminución en la agregación de las cadenas poliméricas y por ende menor Dh.
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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Las micelas poliméricas con unidades de terpeno estudiadas por otros autores como
portadores de fármacos han sido reportadas por Huang y colaboradores, en su
investigación emplean copolímeros de (poliamino esteres-g-colesterol)-b-polietilenglicol-b-
(poliaminoesteres-g-colesterol) para formar micelas capaces de encapsular y liberar
doxorrubicina (DOX), los tamaños de partícula obtenidos para estas nanopartículas
estuvieron en el rango de 205,4 nm hasta 247,8 nm [67].
Adicionalmente, se realizaron medidas de potencial zeta de las dispersiones micelares
sin AmB para determinar la estabilidad del sistema, los resultados son mostrados en
la tabla 4. Estos valores indican que las micelas de mPEG-b-PCL-Terpeno y Terpeno-
PCL-b-PEG-b-PCL-Terpeno presentan una carga próxima a cero, lo que involucra que la
estabilidad de las micelas no es de tipo electrostático, siendo posiblemente un efecto
estérico, tal como se muestra en la figura 23 [68].
Figura 23. Estabilidad estérica en sistemas micelares
En cuanto a la morfología de las micelas, se emplearon análisis de microscopia electrónica
de transmisión (TEM). Las imágenes TEM permiten observar la formación de la estructura
micelar de los copolímeros en bloque anfifílicos. En la figura 24 se observa la forma esférica
habitual. Además, las imágenes permiten observar un núcleo oscuro rodeado por una
corteza con menor densidad, esta característica es propia de micelas con estructura tipo
“core-shell”. La distribución de tamaños observada en estas imágenes muestras la
presencia de agregados y de partículas micelares individuales.
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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Figura 24. Imágenes TEM de las micelas de los copolímeros anfifílicos de mPEG-b-PCL-
Terpeno y Terpeno-PCL-b-PEG-b-PCL-Terpeno
5.3. Encapsulación de AmB, liberación controlada y efecto
sobre su agregación
5.3.1. Encapsulación de AmB
Las micelas de copolímeros en bloque se presentan como un sistema de administración
de AmB con características favorables para solubilizar el fármaco. Para llevar a cabo este
tipo de formulaciones, se requiere que la AmB sea afín con el núcleo de la micela. Los
terpenos seleccionados en esta investigación, COL y RET, presentan interacciones con el
fármaco de carácter hidrofóbico e interacciones tipo π-π, respectivamente [39].
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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La encapsulación de AmB en las micelas derivadas de copolímeros anfifílicos
bioconjugados estudiados en este trabajo se llevó a cabo por partición del fármaco en
micelas preformadas. La concentración de AmB solubilizada en las micelas se cuantifico a
una longitud de onda de 406 nm y se determinó mediante una curva de calibración. La
tabla 6 resume los valores obtenidos de la eficiencia de encapsulación y la capacidad de
carga determinada bajo estas condiciones, cada determinación fue realizada por triplicado.
Tabla 6. Eficiencia de encapsulación y contenido del fármaco en los sistemas micelares
cargados con AmB
Muestra Composición promedio Eficiencia de
encapsulación (%)
Contenido del
fármaco (%)
COP-RET1 RET-(PCL)9-(PEG)97-(PCL)9-RET 39,52 ± 0,79 10,21 ± 0,21
COP-RET2 (mPEG)80-b-(PCL)11-RET 29,78 ± 1,23 6,73 ± 0,28
COP-COL1 COL-(PCL)9-(PEG)97-(PCL)9-COL 22,44 ± 0,72 5,72 ± 0,26
COP-COL2 COL-(PCL)18-(PEG)97-(PCL)18-COL 24,97 ± 0,52 5,88 ± 0,12
COP-COL3 (mPEG)80-(PCL)10-COL 16,90 ± 0,55 3,84 ± 0,12
COP-COL4 (mPEG)80-(PCL)19-COL 20,97 ± 0,15 4,81 ± 0,03
B1 HO-(PCL)9-(PEG)97-(PCL)9-OH 11,77 ± 0,71 2,74 ± 0,17
B2 (mPEG)80-(PCL)10-OH 9,53 ± 0,12 2,38 ± 0,03
B3 HO-(PCL)18-(PEG)97-(PCL)18-OH 12,31 ± 0,36 3,16 ± 0,09
B4 (mPEG)80-(PCL)19-OH 9,27 ± 0,14 2,42 ± 0,04
En la figura 25 se observa el contenido de AmB (%) cargado en las micelas para cada
composición de copolímero bioconjugado y su correspondiente precursor sin terpeno o
copolímero blanco. Se destaca que sin importar el terpeno asociado al copolímero el
contenido de fármaco cargado es mayor en todos los materiales bioconjugados. Sin
embargo, los materiales que alcanzaron mayores contenidos encapsulados son aquellos
con unidades de RET en su estructura, esto implica, que las interacciones tipo π-π entre
la cadena de poliéno junto con la cadena de isopreno generan un microambiente con
mayor afinidad a la AmB que las interacciones hidrofóbicas de los bioconjugados con
colesterol. Otra fuerte dependencia que incrementa la solubilización de AmB se observa
en los copolímeros tipo ABA, los copolímeros COP-RET1 y COP-COL1 encapsularon
mayor cantidad de AmB comparados con los copolímeros tipo AB que presentabas la
misma longitud de PCL (1,5 kDa) es decir los COP-COL3 y COP-RET2. También se
observa que una mayor longitud del segmento hidrofóbico de PCL equivalente a 3 kDa en
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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los copolímeros COP-COL2 y COP-COL4 también tuvo incidencia en una mayor
solubilización de AmB, sin embargo, su efecto es menos sobresaliente con respecto a la
bioconjugación con los terpenos.
Figura 25. Contenido de AmB (%) cargado en las micelas
En estudios recientes, Villamil, Parra y Pérez, autoensamblaron micelas poliméricas
compuestas por PEG-b-PCL y PEG-b-PCL-CH (colesterol) para ser usadas como
precursores de vehículos de AmB, los resultados de los contenidos de fármaco expresados
como porcentaje fueron 5,8% para PEG-b-PCL y 12,5% para PEG-b-PCL-CH [8], de
acuerdo con estos resultados, las micelas que contenían colesterol mejoraron la capacidad
de encapsular AmB, tal como los materiales desarrollados en este estudio. Por su parte,
copolímeros con unidades de RET en aplicación de encapsulación AmB en sistemas
micelares a la fecha no han sido reportados, por lo que esta investigación es pionera en
este desarrollo.
5.3.1.1. Efecto de la carga del fármaco sobre el tamaño de las
micelas
Después de la carga del fármaco se estudió el efecto de la carga de AmB sobre el tamaño
de las partículas a temperaturas de 25 °C y 37 °C, los resultados se detallan en la tabla 7.
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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Tabla 7. Efecto de la carga de AmB en el diámetro hidrodinámico de las micelas
Muestra Diámetro hidrodinámico (Dh) (nm)
25 °C PDI 37 °C PDI
COP-RET1 91,0 0,66 115,3 0,70
COP-RET2 80,2 0,83 81,7 0,81
COP-COL1 345,9 0,89 415,2 0,60
COP-COL2 354,1 0,66 471,9 0,82
COP-COL3 220,2 0,71 244,1 0,62
COP-COL4 190,0 0,76 338,0 0,76
B1 57,7 0,59 69,0 0,49
B2 45,9 0,80 67,8 0,55
B3 53,6 0,61 61,6 0,72
B4 51,1 0,73 65,9 0,78
Como se observa para todas las muestras evaluadas se genera un aumento del Dh como
resultado de una asociación intermicelar. El Dh medido a 37 °C incrementa levemente en
comparación con las medidas realizadas a 25 °C, tal como se detalló en las micelas sin
carga de AmB este efecto es promovido por la deshidratación del segmento hidrofílico.
Los Dh obtenidos tras la carga del fármaco confirman la fuerte influencia de la naturaleza
química de la AmB, dado que es una molécula anfifílica puede autoagregarse formando
estructuras más grandes como dímeros o tetrámeros [69]. En investigaciones previas,
otros autores han estudiado este comportamiento, sus resultados revelan que el carácter
autogregado de la AmB modifica la actividad y características estructurales de la molécula
[70]. Esta misma característica ha sido encontrada en sistemas micelares de
BP(DMAEMA-co-MAEBA-co-DTDMA)(PMAIGP)ns (BSP-H) empleados en administración
de doxorrubicina (DOX), los diámetros de BSP-H cargados con DOX fueron más grandes
que los de sus precursores, esto debido al incremento de hidrofobicidad del núcleo
consecuencia del enlace covalente entre DOX y las cadenas de polímero [71].
Micelas empleadas como vehículos de AmB de copolímeros en bloque han sido reportadas
con diferentes Dh, los valores son dependientes del tipo de copolímero de partida. Por
ejemplo, las micelas obtenidas de copolímeros de PEG-b-DSPEI colesterol tienen tamaños
entre 16 y 65 nm, los resultados dependen del grado de colesterol contenido en el
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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copolímero [72]. Shim y colaboradores, realizaron el autoensamblaje de copolímeros de
PCL-b-PDMAEMA obteniendo tamaños en el rango de 65 y 85 nm [50]. De acuerdo con
los resultados, los copolímeros obtenidos en la presente investigación son similares a los
reportados para otros sistemas micelares.
5.3.2. Estudio de liberación controlada de AmB
Los experimentos de liberación controlada de AmB se estudiaron in vitro empleando un
medio de liberación compuesto por DNa:DMSO a una temperatura de 37 °C. La
concentración de AmB liberada al medio fue determinada empleando espectroscopia UV-
Vis a una longitud de onda de 406 nm. En la figura 26, se detallan los perfiles de liberación
de AmB para los diez sistemas micelares cargados con el fármaco, como se puede
observar la liberación de AmB se da de manera controlada durante las 96 h del ensayo.
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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Figura 26. Perfiles de liberación para las micelas de copolímeros anfifílicos
bioconjugados cargados con AmB
Adicionalmente, los perfiles de liberación evidencian que los materiales conducen una
liberación controlada durante las 96 h del experimento. Cada uno de los perfiles de
liberación presentan dos zonas distintas, la primera indica una liberación rápida durante
las primeras 6 horas y posteriormente una liberación lenta a partir de las 24 horas.
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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Figura 27. Porcentaje de liberación de AmB máximo obtenido en cada sistema micelar
Al relacionar los resultados observados en las figuras 26 y 27, con la composición de los
copolímeros anfifílicos, se observa que los copolímeros blanco presentan un porcentaje de
liberación mayor con respecto a la los bioconjugados con terpenos. Este mismo
comportamiento ha sido observado por otros investigadores encontrando velocidades de
liberación lentas cuando la concentración del fármaco en el núcleo es mayor [38]. Un mayor
contenido de fármaco solubilizado en las micelas produce genera mayor interacción ya sea
hidrofóbica o tipo π-π, ya sea en los conjugados con colesterol o retinol, respectivamente,
esto incide en una liberación más lenta cuando las unidades de terpeno están presentes
en la cadena del copolímero, lo cual retarda la salida de AmB al medio de liberación.
Estudios previos de liberación controlada de AmB han sido determinados en otras
investigaciones, por ejemplo, se ha estudiado el efecto de la sustitución de ácidos grasos
de micelas compuestas por PEO-b-PHSA en la liberación de AmB, hallando que el grado
de sustitución de los ácidos graso retarda la liberación de AmB [47]. Vakil y Kwon
compararon la liberación de AmB a partir de micelas poliméricas compuestas por PEG-
DSPE en diferentes soluciones buffer, donde se observan retardo en la liberación cuando
se emplea buffers que promueven la formación de diferentes agregados, esto se debe a
que los agregados dificultan los procesos de difusión del fármaco hacia el medio de
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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64
liberación, asimismo, deducen que la presencia de colesterol en las micelas retrasa la
liberación de AmB [72].
5.3.3. Estado de agregación de AmB
El comportamiento no selectivo de la AmB frente a los esteroles de las membranas
celulares, ergosterol en hongos y colesterol en mamíferos, es una de las principales causas
de la toxicidad del fármaco en mayor medida cuando este se encuentra agregado. Por este
motivo [73]. Por este motivo, un sistema de administración de AmB que encapsule y libere
el fármaco de forma monomérica es deseable ya que causa menor toxicidad, además de
incrementar la selectividad de la AmB por el ergosterol y no por el colesterol [74].
El estado de agregación fue determinado a partir del espectro UV-Vis de AmB. las figuras
28 y 29 muestran los resultados obtenidos para AmB solubilizada en PBS (DMSO 1%v/v),
DMSO y en cada uno de los sistemas micelares en medio acuoso.
Figura 28. Espectros UV-Vis de absorción de AmB en DMSO y en PBS (DMSO 1% v/v)
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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Figura 29. Espectros UV-Vis de absorción los copolímeros anfifílicos bioconjugados con
terpenos
En la figura 24 se observa el espectro de absorción de AmB disuelta de DMSO, en el
espectro se destacan los picos de absorción a 350, 370, 390 y 420 nm (bandas I, II, III y
IV), que corresponden a la AmB en forma monomérica. Por su parte, la figura 25 muestra
los espectros UV-Vis de adsorción de AmB cargada en los copolímeros anfifílicos
bioconjugados con colesterol y retinol. Estos espectros son comparables con el
comportamiento de AmB en PBS donde el fármaco esta agregada. Se observa el
comportamiento batocrómico donde las agregaciones se distinguen por bandas de menor
intensidad a longitudes de onda cercanas a 320, 360, 380 y 410 nm. Estas
autoagregaciones incluyen la mezcla de moléculas de AmB con diferente grado de
asociación y por ende diferentes tamaños, así como también, la interacción que presenta
con el disolvente [47].
Tomando como referencia la relación de intensidades de las bandas I y IV, se puede
calcular el estado de agregación en cada una de las formulaciones, cuando la AmB se
encuentra en estado monomérico esta relación (I/IV) da como resultado valores pequeños
(≤0,3) [14], [70], [73]. Los estados de agregación obtenidos en los copolímeros anfifílicos
bioconjugados se muestran en la tabla 6. En ella se observa que todas las formulaciones
obtenidas se encuentran en un estado agregado, sin embargo, la composición del
copolímero y el contenido de fármaco en la micela proporciona mayor o menos agregación
a la formulación.
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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Tabla 8. Estado de agregación de AmB basado en la relación de la intensidad de las
bandas I y IV (I/IV) del espectro UV-Vis.
Muestra Relación (I/IV) Estado de agregación
DMSO 0,31 No agregada
PBS (DMSO 1% v/v) 4,2 Agregada
COP-RET1 1,8 Agregada
COP-RET2 1,5 Agregada
COP-COL1 1,3 Agregada
COP-COL2 1,2 Agregada
COP-COL3 1,3 Agregada
COP-COL4 1,2 Agregada
B1 1,3 Agregada
B2 1,2 Agregada
B3 1,3 Agregada
B4 1,2 Agregada
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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6. Conclusiones
En esta investigación se sintetizaron copolímeros en bloque anfifílicos tipo AB y ABA
bioconjugados con colesterol o retinol con diferente segmento hidrofílico (mPEG o
PEG-diol) y variaciones en la longitud del segmento hidrofóbico de PCL (1,5 kDa y 3,0
kDa). Los resultados mostraron una síntesis exitosa empleando polimerización por
apertura de anillo y esterificación de Steglich. Los materiales obtenidos se basaron en
copolímeros del tipo mPEG-b-PCL-Terpeno (AB) y Terpeno-PCL-b-PEG-b-PCL-
Terpeno (ABA) con diferentes grados de polimerización. La caracterización estructural,
la composición, distribución de peso molecular, índices de dispersión y los pesos
moleculares promedio en número (Mn) se obtuvieron a partir de espectroscopia
RMN1H, GPC y FTIR, obteniendo materiales con composición de peso molecular
definida, valores de dispersión de peso cercanos a la unidad y rendimientos de reacción
supriores a 70%. Las características térmicas de los materiales mostraron una
disminución de la cristalinidad y punto de fusión al bioconjugarse con COL y RET.
Por otro lado, las propiedades coloidales de las micelas poliméricas obtenidas por el
autoensamblaje en medio acuoso de los copolímeros mostraron un efecto significativo
por el tipo de segmento hidrofílico y la hidrofobicidad del núcleo terpénico, el efecto del
aumento de hidrofobicidad arrojo CMC más bajas (0,7 mg/L) favoreciendo la
estabilidad termodinámica al reducir la energía libre del sistema. Esto sugiere, que las
micelas poliméricas obtenidas de los copolímeros tipo ABA son más estables que las
de copolímeros tipo AB. Los diámetros hidrodinámicos evaluados en las micelas a
temperaturas de 25 °C y 37 °C arrojaron valores inferiores a 136,8 nm lo que posibilita
su empleo en sistemas de administración con bajo reconocimiento por el sistema
reticuloendotelial (SRE).
Los resultados de las micelas obtenidas empleadas como precursores de
formulaciones de AmB, mostraron que la presencia de colesterol y retinol en las
cadenas del copolímero mejoran la capacidad del núcleo micelar para solubilizar el
fármaco logrando contenidos de fármaco máximos en los copolímeros tipo ABA de
10,21% para retinol y 5,88% para colesterol. Asimismo, los estudios de liberación in
vitro indicaron velocidades de liberación lentas para los copolímeros bioconjugados
con terpenos facilitando la salida de AmB en un estado no agregado.
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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La presente investigación mostro un nuevo enfoque de formulaciones para AmB a partir
de copolímeros bioconjugados con unidades de terpeno como una alternativa promisoria
en el tratamiento de afecciones fúngicas sistémicas. Se evidenció que la posibilidad de
modificar la arquitectura del copolímero en bloque formando materiales biohíbridos entre
moléculas bioactivas y copolímeros biocompatibles de PEG y PCL, genera materiales con
mayor capacidad de encapsular AmB y liberarla de manera controlada, sin afectar la
estabilidad del sistema micelar.
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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7. Anexos
7.1. Curva de calibración AmB
7.2. Concentración mínima inhibitoria (MIC) de las
formulaciones
Esta investigación se encuentra incluida dentro de un macroproyecto interdisciplinario en
asociación con la Pontificia Universidad Javeriana (PUJ). Actualmente, las formulaciones
sintetizadas en la presente investigación se encuentran en estudio de concentración
mínima inhibitoria (MIC), características hemolíticas y capacidad antifúngica in vitro. A
continuación, se muestra la MIC obtenida para las formulaciones de AmB comparada con
la formulación comercial de Fungizone®:
Concentración mínima inhibitoria
Muestra Candida albicans SC5314 Candida auris 537 Candida auris 435
Fungizone® 0,46 µg/mL 3,75 µg/mL 0,93 µg/mL
COP-RET1 <0,11 µg/mL 7,50 µg/mL 0,93 µg/mL
COP-RET2 <0,11 µg/mL 7,50 µg/mL 0,93 µg/mL
COP-COL1 <0,11 µg/mL 0,46 µg/mL 0,23 µg/mL
COP-COL2 <0,11 µg/mL 0,46 µg/mL 0,23 µg/mL
COP-COL3 <0,11 µg/mL 0,93 µg/mL 1,87 µg/mL
COP-COL4 <0,11 µg/mL 1,87 µg/mL 1,87 µg/mL
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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70
B1 <0,11 µg/mL 1,87 µg/mL 0,93 µg/mL
B2 <0,11 µg/mL 0,93 µg/mL 0,46 µg/mL
B3 <0,11 µg/mL 0,93 µg/mL 0,46 µg/mL
B4 <0,11 µg/mL 0,93 µg/mL 0,46 µg/mL
Candida auris 537:
Candida auris 435:
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
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71
8. Referencias
[1] C. M. Jewell, C. M. Jewell, and J. H. Collier, “Biomaterials Science,” 2019.
[2] P. Chem, “Polymer Chemistry,” no. Scheme 1, pp. 1763–1768, 2012.
[3] M. Alami-Milani, P. Zakeri-Milani, H. Valizadeh, R. Salehi, and M. Jelvehgari,
“Preparation and evaluation of PCL-PEG-PCL micelles as potential nanocarriers for
ocular delivery of dexamethasone,” Iran. J. Basic Med. Sci., vol. 21, no. 2, pp. 153–
164, 2018.
[4] M. A. Osorio-delgado, L. J. Henao-tamayo, J. A. Velásquez-cock, A. Isabel, L. M.
Restrepo-múnera, P. F. Gañán-rojo, R. O. Zuluaga-, I. C. Ortiz-trujillo, and C. I.
Castro-herazo, “Biomedical applications of polymeric biomaterials • Aplicaciones
biomédicas de biomateriales poliméricos,” vol. 84, no. 201, pp. 241–252, 2017.
[5] L. H. Azouz, F. Dahmoune, F. Rezgui, and C. G. Sell, “Full factorial design
optimization of anti-in fl ammatory drug release by PCL – PEG – PCL microspheres,”
Mater. Sci. Eng. C, vol. 58, pp. 412–419, 2016.
[6] R. Oropesa and U. Jáuregui, “Las nanopartículas como portadores de fármacos :
características y perspectivas Nanoparticles as drug carriers : characteristics and
perspectives,” CENIC Ciebcias Biológicas, vol. 43, no. 3, 2012.
[7] S. A. Castleberry, M. A. Quadir, M. A. Sharkh, K. E. Shopsowitz, and P. T.
Hammond, “AC PT US CR,” J. Control. Release, 2017.
[8] J. C. Villamil, C. M. Parra-giraldo, and L. D. Pérez, “Enhancing the performance of
PEG-b-PCL copolymers as precursors of micellar vehicles for amphotericin B
through its conjugation with cholesterol,” Colloids Surfaces A, vol. 572, no. March,
pp. 79–87, 2019.
[9] L. Wang, “Positively charged micelles based on a triblock copolymer demonstrate
enhanced corneal penetration,” pp. 6027–6037, 2015.
[10] R. J. Hamill, “Amphotericin B formulations: A comparative review of efficacy and
toxicity,” Drugs, vol. 73, no. 9, pp. 919–934, 2013.
[11] X. Tang, L. Xu, Z. Huo, J. Dai, Y. Qian, J. Wang, W. Hou, R. Jiao, C. Xie, W. Xu, and
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
______________________________________________________________________________
72
Y. Liang, “Improved antifungal activity of amphotericin B-loaded TPGS-b-(PCL-ran-
PGA) nanoparticles,” Int. J. Clin. Exp. Med., vol. 8, no. 4, pp. 5150–5162, 2015.
[12] T. A. Diezi and G. Kwon, “Amphotericin B/sterol co-loaded PEG-phospholipid
micelles: effects of sterols on aggregation state and hemolytic activity of
amphotericin B.,” Pharm. Res., vol. 29, no. 7, pp. 1737–1744, 2012.
[13] H. Van De Ven, C. Paulussen, P. B. Feijens, A. Matheeussen, P. Rombaut, P.
Kayaert, and G. Van Den Mooter, “PLGA nanoparticles and nanosuspensions with
amphotericin B : Potent in vitro and in vivo alternatives to Fungizone and AmBisome,”
J. Control. Release, vol. 161, no. 3, pp. 795–803, 2012.
[14] J. Barwicz and P. Tancrède, “The effect of aggregation state of amphotericin-B on
its interactions with cholesterol- or ergo sterol-containing phosphatidylcholine
monolayers,” Chem. Phys. Lipids, vol. 85, no. 2, pp. 145–155, 1997.
[15] “Tesis de doctor en ingeniería química síntesis y caracterización de copolímeros
bloque biocompatibles franco leonardo redondo,” 2018.
[16] H. Cabral, K. Miyata, K. Osada, and K. Kataoka, “Block Copolymer Micelles in
Nanomedicine Applications,” Chem. Rev., vol. 118, no. 14, pp. 6844–6892, 2018.
[17] K. Matyjaszewski, “Inner Sphere and Outer Sphere Electron Transfer Reactions in
Atom Transfer Radical Polymerization,” Macromol. Symp., vol. 134, pp. 105–118,
1998.
[18] H. Erothu, A. A. Sohdi, A. C. Kumar, A. J. Sutherland, C. Dagron-Lartigau, A. Allal,
R. C. Hiorns, and P. D. Topham, “Facile synthesis of poly(3-hexylthiophene)-block-
poly(ethylene oxide) copolymers via Steglich esterification,” Polym. Chem., vol. 4,
no. 13, pp. 3652–3655, 2013.
[19] M. E. Coustet, “Síntesis y propiedades de Copolímeros en Bloque constituidos por
bloques hidrofílico-hidrofóbico,” p. 123, 2014.
[20] B. Li, E. H. Moriyama, F. Li, M. T. Jarvi, C. Allen, and B. C. Wilson, “Diblock
copolymer micelles deliver hydrophobic protoporphyrin IX for photodynamic
therapy,” Photochem. Photobiol., vol. 83, no. 6, pp. 1505–1512, 2007.
[21] M. L. Adams, A. Lavasanifar, and G. S. Kwon, “Amphiphilic block copolymers for
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
______________________________________________________________________________
73
drug delivery - Adams - 2003 - Journal of Pharmaceutical Sciences - Wiley Online
Library,” J. Pharm. …, vol. 92, no. 7, pp. 1343–1355, 2003.
[22] A. C. Albertsson and I. K. Varma, “Recent developments in ring opening
polymerization of lactones for biomedical applications,” Biomacromolecules, vol. 4,
no. 6, pp. 1466–1486, 2003.
[23] G. Odian, PRINCIPLES OF. .
[24] S. T. Cohen-Anisfeld and P. T. Lansbury, “A Practical, Convergent Method for
Glycopeptide Synthesis,” J. Am. Chem. Soc., vol. 115, no. 23, pp. 10531–10537,
1993.
[25] K. M. Stridsberg, M. Ryner, and A.-C. Albertsson, “Controlled Ring-Opening
Polymerization: Polymers with designed Macromolecular Architecture,” Degrad.
Aliphatic Polyesters, vol. 157, pp. 41–65, 2007.
[26] W.-F. Su, Principles of Polymer Design and Synthesis, vol. 82. 2013.
[27] M. Labet and W. Thielemans, “Synthesis of polycaprolactone: A review,” Chem. Soc.
Rev., vol. 38, no. 12, pp. 3484–3504, 2009.
[28] K. Zhang, Y. Wang, W. Zhu, X. Li, and Z. Shen, “Synthesis , Characterization , and
Micellization of PCL- g -PEG Copolymers by Combination of ROP and ‘“ Click ”’
Chemistry via ‘“ Graft Onto ”’ Method,” pp. 2045–2052, 2012.
[29] D. Mecerreyes, R. Jérôme, and P. Dubois, “Novel Macromolecular Architectures
Based on Aliphatic Polyesters: Relevance of the ‘Coordination-Insertion’ Ring-
Opening Polymerization,” Macromol. Archit., vol. 147, pp. 1–59, 2007.
[30] D. Bourissou, O. Dechy-Cabaret, and B. Martin-Vaca, “Controlled ring-opening
polymerization of lactide and glycolide,” Chem. Rev., vol. 104, no. 12, pp. 6147–
6176, 2004.
[31] “Simple Method for the Esterification of Carboxylic Acids "],” vol. 553, no. 7, pp. 12–
14, 1978.
[32] I. Katime, “MICELAS,” vol. 4, no. 2, pp. 123–151, 2003.
[33] M. E. M. Braga and A. Sosnik, Hermínio C. de Sousa Mara E. M. Braga Alejandro
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
______________________________________________________________________________
74
Sosnik (editores). 2015.
[34] H. M. Aliabadi and A. Lavasanifar, “Polymeric micelles for drug delivery,” Expert
Opin. Drug Deliv., vol. 3, no. 1, pp. 139–162, 2006.
[35] L. Piñeiro, M. Novo, and W. Al-sou, “Fluorescence emission of pyrene in surfactant
solutions,” vol. 215, pp. 1–12, 2015.
[36] Y. Wang, X. Ke, Z. X. Voo, S. S. L. Yap, C. Yang, S. Gao, S. Liu, S. Venkataraman,
S. A. O. Obuobi, J. S. Khara, Y. Y. Yang, and P. L. R. Ee, “Biodegradable functional
polycarbonate micelles for controlled release of amphotericin B,” Acta Biomater., vol.
46, pp. 211–220, 2016.
[37] N. Scholz, T. Behnke, and U. Resch, “Determination of the Critical Micelle
Concentration of Neutral and Ionic Surfactants with Fluorometry , Conductometry ,
and Surface Tension — A Method Comparison,” J. Fluoresc., vol. 0, no. 0, p. 0, 2018.
[38] I. L. Diaz and L. D. Perez, “Synthesis and micellization properties of triblock
copolymers PDMAEMA-b-PCL-b-PDMAEMA and their applications in the fabrication
of amphotericin B-loaded nanocontainers,” Colloid Polym. Sci., vol. 293, no. 3, pp.
913–923, 2015.
[39] C. Charbonneau, I. Fournier, S. Dufresne, J. Barwicz, and P. Tancrède, “The
interactions of amphotericin B with various sterols in relation to its possible use in
anticancer therapy,” Biophys. Chem., vol. 91, no. 2, pp. 125–133, 2001.
[40] A. S. Zahr, M. De Villiers, and M. V. Pishko, “Encapsulation of drug nanoparticles in
self-assembled macromolecular nanoshells,” Langmuir, vol. 21, no. 1, pp. 403–410,
2005.
[41] A. Neira, D. Yáñez, P. Aguirre, Y. Amar, S. Vidal, and R. Egaña, “Encapsulación de
Biomoléculas Usando Polímeros Naturales : ‘ Un Nuevo Enfoque en la Entrega de
Fármacos en Medicina ,’” Av. en Ciencias Vet., vol. 28, no. 2, pp. 31–40, 2013.
[42] J. Nicolas, S. Mura, D. Brambilla, N. MacKiewicz, and P. Couvreur, “Design,
functionalization strategies and biomedical applications of targeted
biodegradable/biocompatible polymer-based nanocarriers for drug delivery,” Chem.
Soc. Rev., vol. 42, no. 3, pp. 1147–1235, 2013.
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
______________________________________________________________________________
75
[43] E. Hernáez Laviña, L. Sanz Angulo, I. Katime Amashta, and V. Sáez, “Liberación
controlada de fármacos: micropartículas,” Rev. Iberoam. Polímeros, vol. 5, no. 2, p.
3, 2004.
[44] “Microesferas biodegradables de liberación controlada para administración
parenteral,” Rev. Cuba. Farm., vol. 34, no. 1, pp. 70–77, 2000.
[45] A. Lavasanifar, J. Samuel, S. Sattari, and G. S. Kwon, “Block Copolymer Micelles for
the Amphotericin B,” Pharm. Res., vol. 19, no. 4, pp. 418–422, 2002.
[46] J. D. Cleary, “Amphotericin B: A New Look at Cellular Binding,” Open Antimicrob.
Agents J., vol. 3, no. 1, pp. 30–36, 2011.
[47] R. Espada, S. Valdespina, C. Alfonso, G. Rivas, M. P. Ballesteros, and J. J. Torrado,
“Effect of aggregation state on the toxicity of different amphotericin B preparations,”
Int. J. Pharm., vol. 361, no. 1–2, pp. 64–69, 2008.
[48] J. A. Sánchez-Brunete, M. A. Dea, S. Rama, F. Bolás, J. M. Alunda, S. Torrado-
Santiago, and J. J. Torrado, “Amphotericin B molecular organization as an essential
factor to improve activity/toxicity ratio in the treatment of visceral leishmaniasis,” J.
Drug Target., vol. 12, no. 7, pp. 453–460, 2004.
[49] M. Noemı and R. Laniado-laborı, “Revista Iberoamericana ´ a de Micologı
Amphotericin B : side effects and toxicity,” vol. 26, no. 4, pp. 223–227, 2009.
[50] Y. H. Shim, Y. C. Kim, H. J. Lee, F. Bougard, P. Dubois, K. C. Choi, C. W. Chung,
D. H. Kang, and Y. Il Jeong, “Amphotericin b aggregation inhibition with novel
nanoparticles prepared with poly(ε-caprolactone)/poly(N,N-dimethylamino-2-ethyl
methacrylate) diblock copolymer,” J. Microbiol. Biotechnol., vol. 21, no. 1, pp. 28–36,
2011.
[51] J. L. Italia, M. M. Yahya, D. Singh, and M. N. V. R. Kumar, “Biodegradable
Nanoparticles Improve Oral Bioavailability of Amphotericin B and Show Reduced
Nephrotoxicity Compared to Intravenous Fungizone ®,” vol. 26, no. 6, pp. 1324–
1331, 2009.
[52] C. Weber, T. Yildirim, D. Kalden, G. Festag, N. Fritz, S. Schubert, M. Westerhausen,
S. Schubert, M. Westerhausen, and U. S. Schubert, “Polymer Chemistry,” 2017.
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
______________________________________________________________________________
76
[53] Y. H. Bae and K. Moo, “Amphiphilic poly(ethylene glycol)-poly(ε-caprolactone) AB2
miktoarm copolymers for self-assembled nanocarrier systems: synthesis,
characterization, and effects of morphology on antitumor activity,” Polym. Chem.,
vol. 6, no. 4, pp. 531–542, 2014.
[54] X. Shuai, T. Merdan, F. Unger, M. Wittmar, and T. Kissel, “Novel Biodegradable
Ternary Copolymers hy -PEI- g -PCL- b -PEG : Synthesis , Characterization , and
Potential as Efficient Nonviral Gene Delivery Vectors,” pp. 5751–5759, 2003.
[55] M. M. Mok, R. Thiagarajan, M. Flores, D. C. Morse, and T. P. Lodge, “Apparent
critical micelle concentrations in block copolymer/ionic liquid solutions: Remarkably
weak dependence on solvophobic block molecular weight,” Macromolecules, vol. 45,
no. 11, pp. 4818–4829, 2012.
[56] R. Alex and R. Bodmeier, “Encapsulation of water-soluble drugs by a modified
solvent evaporation Method. I. Effect of process and formulation variables on drug
entrapment,” J. Microencapsul., vol. 7, no. 3, pp. 347–355, 1990.
[57] M. Hamedi, J. Wigenius, F. Tai, P. Björk, and D. Aili, “Linköping University Post Print
Polypeptide-guided assembly of conducting polymer nanocomposites Polypeptide-
Guided Assembly of Conducting Polymer Nanocomposites,” no. 2, pp. 2058–2061,
2010.
[58] C. Tan, S. Xiong, and C. Chen, “Fast and Controlled Ring-Opening Polymerization
of Cyclic Esters by Alkoxides and Cyclic Amides,” 2018.
[59] J. Lu, I. D. Shin, S. Nojima, and A. E. Tonelli, “Formation and characterization of the
inclusion compounds between copolymer and a - and g -cyclodextrin,” vol. 41, pp.
5871–5883, 2000.
[60] T. Chakraborty and I. Chakraborty, “The methods of determination of critical micellar
concentrations of the amphiphilic systems in aqueous medium,” Arab. J. Chem., vol.
4, no. 3, pp. 265–270, 2011.
[61] S. D. Allen and Y. Liu, “Biomaterials Science anti-in fl ammatory treatment for
atherosclerosis †,” 2018.
[62] J. Chen, M. Liu, H. Gong, Y. Huang, and C. Chen, “Synthesis and Self-Assembly of
Thermoresponsive PEG- b -PNIPAM- b - PCL ABC Triblock Copolymer through the
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
______________________________________________________________________________
77
Combination of Atom Transfer Radical Polymerization , Ring-Opening
Polymerization , and Click Chemistry,” pp. 14947–14955, 2011.
[63] “Block Copolymers in Solution : Fundamentals and Applications Block Copolymers
in Solution : Fundamentals and Applications.”
[64] Ö. Topel, B. Acar, L. Budama, and N. Hoda, “Determination of critical micelle
concentration of polybutadiene- block -poly ( ethyleneoxide ) diblock copolymer by fl
uorescence spectroscopy and dynamic light scattering,” vol. 177, pp. 40–43, 2013.
[65] V. P. Torchilin, “Block copolymer micelles as a solution for drug delivery,” pp. 63–75,
2005.
[66] J. Gohy, “Block Copolymer Micelles,” no. October, pp. 65–136, 2005.
[67] D. Press, “pH-sensitive micelles self-assembled from polymer brush ( PAE- g -
cholesterol ) - b -PEG- b - ( PAE- g -cholesterol ) for anticancer drug delivery and
controlled release,” pp. 2215–2226, 2017.
[68] D. S. Horne, “Steric stabilization and casein micelle stability,” J. Colloid Interface Sci.,
vol. 111, no. 1, pp. 250–260, 1986.
[69] I. Gruda and N. Dussault, “Effect of the aggregation state of amphotericin B on its
interaction with ergosterol,” Biochem. Cell Biol., vol. 66, no. 3, pp. 177–183, 2009.
[70] I. L. Diaz, C. Parra, M. Linarez, and L. D. Perez, “Design of Micelle Nanocontainers
Based on PDMAEMA-b-PCL-b-PDMAEMA Triblock Copolymers for the
Encapsulation of Amphotericin B,” AAPS PharmSciTech, vol. 16, no. 5, pp. 1069–
1078, 2015.
[71] C.-Y. Pan, L. Qiu, and C.-Y. Hong, “Doxorubicin-loaded aromatic imine-contained
amphiphilic branched star polymer micelles: synthesis, self-assembly, and drug
delivery,” Int. J. Nanomedicine, p. 3623, 2015.
[72] R. Vakil and G. S. Kwon, “Effect of cholesterol on the release of amphotericin B from
PEG-phospholipid micelles,” Mol. Pharm., vol. 5, no. 1, pp. 98–104, 2008.
[73] M. L. Adams and G. S. Kwon, “Relative aggregation state and hemolytic activity of
amphotericin B encapsulated by poly(ethylene oxide)-block-poly(N-hexyl-L-
aspartamide)-acyl conjugate micelles: Effects of acyl chain length,” J. Control.
Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.
______________________________________________________________________________
78
Release, vol. 87, no. 1–3, pp. 23–32, 2003.
[74] B. Jeong, Y. Han Bae, and S. Wan Kim, “Biodegradable thermosensitive micelles of
PEG-PLGA-PEG triblock copolymers,” Colloids Surfaces B Biointerfaces, vol. 16,
no. 1–4, pp. 185–193, 1999.