APPUNTIDI

CHIMICA FARMACEUTICAPER BIOTECNOLOGIE

Prof. Antonello MaiDip. Studi FarmaceuticiUniversità “La Sapienza” Roma antonello.mai@uniroma1.it

Scoperta del “LEAD COMPOUND”

SCREENING:• Estensivo• Random• HTS• Intermedi e

sottoprodotti di sintesi

VALORIZZAZIONEDI INFORMAZIONI

BIOLOGICHE:•Studio medicine

indigene•Studio effetti biologici•Studio effetti secondari

dei farmaci•Scoperta fortuita da

prodotti industriali

APPROCCIO RAZIONALE:

•Conoscenza eziologia della malattia

•Conoscenza target

•“computer-aided drug design”

SCREENING

1. Estensivo: piccolo numero di molecole su uno studio farmacologico completo

FENOTIAZINEBENZODIAZEPINE

N

NO

Cl

H

Es.

sintetizzate per errore e saggiatecon s. estensivo dopo 5 anni

N

S

NCH3

CH3

Cl

attività neurolettica scopertada s. estensivo condotto su

antistaminici sedativi

•TAXOLO (Paclitaxel) (antitumorale)

PIRENZEPINA (antiulcera)

2. Random: gran numero di molecole su target (e attività) mirate

Es. •Antibiotici•Ciclosporina A (polipeptide ciclico screenato come potenziale antibiotico e scoperto ad

attività immunosoppressiva)

NEVIRAPINA (anti-AIDS)

N N

HN

N

OCH3

N N

HN

N

N

H3C

O

O

3. High Throughput Screening (HTS) automatizzato:moltissime molecole su diversi sistemi biologici(soprattutto enzimi)

ASPERLICINA (inibitore CCK) INDOLIL-CARBOSSIAMIDI

LOVASTATINA (ipolipidemizzante)

O

O

CH3

C2H5

O

OHO

H3C

CH3

N

N

O

NHN

HO

O

N

O

H

Es.

N

HN

NH

O NH

O

4. Intermedi o sottoprodotti di sintesi:

Es.: CLORDIAZEPOSSIDO (ansiolitico)

Cl N

NNHCH3

OCLORDIAZEPOSSIDO

N

HN

NHCH3

ClO

N

HN

Cl

NH2CH3

OCl

tiosemicarbazoni(promettente attività

antimicobatterica)

ISONIAZIDE (antitubercolare), 1912-1945Es.

S

NN

NH

O2S R

H2N

S

N

NH

O2S

H2N

SULFATIADIAZOLI SULFATIAZOLI

(antibatterici)

S

NN

H2NR

2-amminotiadiazoli

H2N

S

NH

N R H2N

S

NH

NH2

R-CHO

N

CHO

piridin-4-carbossialdeide

N

CONHNH2

idrazide isonicotinica

N

COOC2H5

etileisonicotinato

N

COOH

acidoisonicotinico

N

CH3

4-metilpiridina

VALORIZZAZIONE DI INFORMAZIONE BIOLOGICA

1. Studio di medicine indigene:

COOH

OH

AC. SALICILICO

N

NHO

H3CO CHININA, CHINIDINA

2. Studio degli effetti biologici:

Es. 1: trifoglio essiccato ---> emorragia letale allo stomaco

Es. 2: Penicillina

• Pasteur (1878): antagonismo tra 2 ceppi di microorganismi• Roux-Duchesne (1897): “Contributo allo studio della competizione

vitale tra microorganismi: antagonismo tra muffe e microbi”• Fleming (1928)• Chain-Florey 1940: da studi sul LISOZIMA, antibiotico

antimicrobico che era creduto attivo contro le ulcere duodenali

O

NH

N

S

O

CH3

CH3

COOH

O O

CUMARINA

BENZIL-PENICILLINA

O O OO

OH OH

DICUMAROLO

3. Studio di effetti secondari dei farmaci

Es. 1

MOSTARDA AZOTATA

-BLOCCANTI (coronarodilatatori) ---> (antiipertensivi)

Aggressivo chimico nella Ia Guerra Mondiale in Europa ---> distrugge i globuli bianchi

Cl

NH

Cl

O

OH

HN

CH3

CH3

R

O

OH

NH

CH3

H3C

O

OH

NH

CH3

H3C

analogo ciclico

Es. 2

COMPOSTO 1antiipertensivo ad

attività vasodilatatrice

periferica diretta: no -bloccante

COMPOSTO 2100 volte più

potente

CROMAKALIM3 volte più potente

attivatore canali del Ksulla fibrocellula

muscol. liscia delle arterie

ipopolarizz. ---> vasodilat.

CLONIDINA

-agonista pre-sinaptico ===> antiipertensivo

O

OH

NH

CH3

H3C

O2N

CH3

CH3

O

OH

N

NC

CH3

CH3

O

OH

N

NC

CH3

CH3

O

NNH

HNCl

Cl

-agonista da usarsi come vasocostrittore nasale o nel sapone da barba:

Es. 3

INI (ISONIAZIDE) antitubercolare ---> solleva l’umore: IDRAZIDI ANTI-MAO

IPRONIAZIDE(antidepressivo)

ISOCARBOSSIAZIDE(antidepresivo)

N

CONHNH2

N

O HN

NH

CH3

CH3

O

N

H3C

NH

O HN

Es. 4

CLORPROMAZINA(neurolettico)

IMIPRAMINA(antidepressivo triciclico)

PROMETAZINA (antiistaminico) ---> (sedativo) PROMAZINA

antiistaminico/sedativo

Es. 5

N

S

N

CH3

H3C CH3

N

S

N

H3C

CH3

N

S

N

H3C

CH3

ClN

N

CH3

CH3

SULFANILAMIDE SULFAMIDICIantibatterici

eff. collater.: diuretici, ipoglicemizzanti

TOLBUTAMIDE(ipoglicemizzante)

ACETAZOLAMIDE(diuretico)

Es. 6

H2N

O2S

NH2

H2N

O2S

NH

Het

H3C

O2S

NH

NH

O

CH3

NN

S SO2

NH2NH

H3C

O

4. Scoperta fortuita da prodotti industriali

NITROGLICERINAesplosivo

vasodilatatore delle coronarie

CARBIMAZOLO(antitiroidei)

DIETILDITIOURAME (DISULFIRAM)antiossidante nell’industria della gomma

disassuefacente dall’alcool

ONO2

ONO2

O

NO2

N

SH2N

2-amminotiazolo

Es. 1 Es. 2 N

NH

HS

2-mercaptoimidazolo

N

NHS

CH3

TIAMAZOLO

N

NS

CH3

C2H5O

O

N SC2H5

C2H5

S

S

S

N

C2H5

C2H5

Es. 3

H3C OH H3C H

O

H3C OH

O

APPROCCIO RAZIONALE

Basato sulla conoscenza:

1. delle alterazioni biochimico-metaboliche caratteristiche di determinate condizioni patologiche e responsabili, in taluni casi, della malattia e più frequentemente dei suoi sintomi più fastidiosi;

2. delle caratteristiche strutturali e/o funzionali di determinati target macromolecolari (enzimi, recettori, canali ionici, proteine trasportatrici);

3. della struttura chimica e delle funzioni biologiche dei ligandi fisiologici dei target sopracitati: agonisti, antagonisti, agonisti parziali ed inversi nel caso dei recettori; substrati, prodotti, attivatori ed inibitori nel caso di enzimi.

Contributi essenziali da parte di:Biochimica, fisiologia, genetica, biologia molecolare, metodiche chimico-fisiche (N.M.R., E.P.R., spettrometria di massa, raggi X, scattering di neutroni), informatica.

ESEMPI:

A. Terapia sintomatica ma razionale del morbo di Parkinson.I sintomi compaiono quando il contenuto di DOPAMINA nel corpo striato diventa il 20-40 % dei valori normali.

DOPAMINA(mediatore endogeno)non attraversa BBB

3,4 – DIIDROSSIFENILALANINA (L- DOPA)(precursore fisiologico della dopamina)

attraversa BBB

HO

HO NH2

HO

HO NH2

COOH

DOPA-decarbossilasi(DDC)

L - DOPA

BBB(barriera emato encefalica)

1 %

CERVELLO

DDC

DOPAMINA

SANGUE ETESSUTI

PERIFERICI

TRATTO GI

DDCMAO

90% 9 %

DDCCOMT

HO

HO NHNH2

COOH

CH3

CARBIDOPA

inibitori DOPA-decarbossilasinon attraversano BBB

NH

HN

O

NH2

OH

OH

OHHO

BENSERAZIDE

B. Scoperta degli inibitori dell’enzima di conversione dell’angiotensina.

B. Scoperta degli inibitori dell’enzima di conversione dell’angiotensina (ACE).

Dettagli biochimici del sistema renina-angiotensina noti dai primi anni ‘60.

angiotensinogeno

renina --->

angiotensina I (10 AA)(inattiva)

angiotensina II (8 AA)(vasocostrittore 40 volte

più potente di nor-adrenalina:stimola il rilascio di aldosterone)

chininogeno

<--- callicreina

bradichinina (9 AA)(potente vasodilatatore)

eptapeptide inattivo

<------------ ACE ------------>

TEPROTIDE (9 AA)

primo inibitore noto di ACE ad attività antiipertensiva (1965) non biodisponibile per via orale

pyro-Glu-Trp-Pro-Arg-Pro-Glu-Ile-Pro-Pro-OH

O

O-

O

O-

ac. benzilsuccinicoinibitore carbossipeptidasi A

N

R

O O

O-

S-

N

R

O O

O-O

O-

ipotesi di design di inibitori ACE

N COOH

O

O

OH

N-succinilprolina (330 M)

N COOH

O

O

OH

H3C H

N COOH

O

O

OH

H CH3

1(22 M)

2(1480 M)

N COOH

O SH

3(0.20 M)

N COOH

O SH

H3C H

CAPTOPRIL(0.023 M)

C. Scoperta di antagonisti selettivi del recettore istaminergico H2.

Antistaminici classici (mepiramina) non antagonizzano la secrezione acidagastrica da IST = nuova sottoclasse recettoriale (Black et al., 1964)

HNN

NH2

ISTAMINAligando endogeno

agonista puro

HNN

NH

NH

NH2

sintesi di oltre 200composti correlati N-GUANILISTAMINA

1° lead compoundagonista parziale

n = 2-4; X = S, NH; Y = SCH3, CH3, NH2

Tutti agonisti parziali

Requisiti per attività antagonista:•anello imidazolico•catena alchilica n = 2-4•gruppo finale protonabile (funzionalità amidinica) per leg. H bidentato con ossiacido

HNN

X

( )nY

NH

HNN

X

( )nY

NH

HNN

HN

S

NHCH3

BURIMAMIDE1° antagonista puro

non biodisponibile per os

HNN

S

HN

S

NHCH3

H3C

METIAMIDE10 vv più potente

biodisponibile per ostossicità dovuta a residuo di tiourea

HNN

S

HN

N-CN

NHCH3

H3C

CIMETIDINA1° anti-H2 approvato contro

l’ulcera peptica (1976)

D. Computer-aided drug design

Si utilizza un modello 3D sperimentale o ipotetico del sito di bindingdel target molecolare sviluppando nuovi ligandi mediante:- Ottimizzazione di ligando già noto- Ricerca nei database di strutture 3D di composti con caratteristiche stereoelettroniche ottimali per l’interazione- Progettazione “de novo” di ligandi specifici

A. PROGETTAZIONE DIRETTA DI LIGANDO

BASATA SU STRUTTURA 3D NOTA DEL SITO DI BINDING

B. PROGETTAZIONE INDIRETTA DI LIGANDO

BASATA SU UN MODELLO3D DEL SITO DI BINDING

DEDOTTO DA ALTRI LIGANDIA STRUTTURA 3D NOTA

(AGONISTI O ANTAGONISTI)

LIGAND-BASED DRUG DESIGN

STRUCTURE-BASED DRUG DESIGN

STRUCTURE-BASED DRUG DESIGN

• Isolamento e produzione su vasta scala di target (tecnologia: DNA ricombinante)

• Determinazione della sua struttura 3D attraverso:

cristallografia a raggi Xtecniche NMRscattering di neutroni

• Identificazione e caratterizzazione sito di bindingsterica (DOCK)elettrostatica (GRID)

• Determinazione della conformazione di binding di ligando noto

(AUTODOCK, MACROMODEL)• Ricerca o design di nuovi ligandi• Calcolo di energie di affinità (G) e costanti di

inibizione (Ki)

LIGAND-BASED DRUG DESIGN

•Impossibile isolare e/o produrre il target in quantità adeguate per risoluzione struttura 3D•Unici dati disponibili = dati di serie più o meno ampie di agonisti e antagonisti•Identificazione del farmacoforo o modello farmacoforico•Mappatura del sito di binding, cioè deduzione del modello 3D dello stesso•Ricerca e design di nuovi ligandi•3D-QSAR (CoMFA)

Ottimizzazione del “LEAD COMPOUND”

1. Principio di Isosteria2. Principio di Omologia lineare e ciclica3. Composti Viniloghi e Benzologhi4. Semplificazione e Complicazione Molecolare

(approcci disgiuntivi e congiuntivi)5. Distanze intramolecolari6. Raddoppiamento molecolare (farmaci gemelli)

Principio di Isosteria

Concetto base: introdurre nel lead compound modificazioni chimichetali che, pur variandone alcune caratteristiche strutturali e chimico-fisiche, ne mantengano intatta la capacità di interagirecon il target biologico.

Nuovo composto = profilo farmacologico complessivo migliore

1918, Langmuir:

isosteri due molecole che contengono lo stesso numero e disposizionedi elettroni:

O2-, F-, Ne, Na+, Mg+2, Al+3 MOLECOLE MONOATOMICHECO, N2 MOLECOLE BIATOMICHECO2, N2O MOLECOLE TRIATOMICHEClO4

-, SO4-2, PO4

-3 MOLECOLE POLIATOMICHE

1925, Grimm (legge dello spostamento dell’idruro):

l’aggiunta di un idrogeno ad un atomo conferisce al’aggregato la proprietà dell’atomo successivo nella tavola periodica:

n° elettroni gruppi isosteri isoelettronici

7 N CH

8 O NH CH2

9 F OH NH2 CH3

14 CH=CH N=N C=O

16 CH2-CH2 NH-NH S

36

42

44

O NH

N

NH

N

O

NO

N NN

N

N

N

N

S

N

S

NN

S

NS

1932, Erlemmeyer (ampliamento del concetto di isosteria):

Isosteri = atomi, ioni, gruppi funzionali o molecole che presentano lastessa configurazione elettronica ESTERNA

O S SeVI GRUPPO (6 elettroni nel guscio più

esterno)

N PV GRUPPO (5 elettroni nel guscio più

esterno)

C SiIV GRUPPO (4 elettroni nel guscio più

esterno)

Inclusi anche gruppi funzionali con marcate analogie chimico-fisiche:Cl, CN, SCN

Equivalente di anello: solo in composti ciclici S è isostere di CH=CH

S

1951, Friedman (da isosteria a bioisosteria):

bioisosteri = gruppi o molecole aventi almeno una analogia chimica ofisica, che producono effetti biologici spiccatamente simili

HN

NH

R1

R

O

O

O

NH

R1

R

O

O

Es. 1:

OSSAZOLIDINDIONI IDANTOINE

entrambi Antiepiletticiisosteri e bioisosteri

Es. 2:H2N

O

OH

H2N

SO2

NH2

AC. P-AMINOBENZOICO SULFANILAMIDE

antimetabolitibioisosteri

Es. 3:

HN

OHO

H

GABA

N

OHO

H

ISOGUVACINA

N

H

O

NHO

THIP

GABA-agonisti:-pKa circa = 4 per tutti-funzione basica protonabile-distanza intercarica = 5Å

Es. 4:

H2N

O

O

N

C2H5

C2H5

H2N

HN

O

N

C2H5

C2H5PROCAINA

anestetico localePROCAINAMIDE

antiaritmico

isosteri classici non bioisosteri

Omologia lineare e ciclica

Serie omologa = insieme di composti che differiscono per una o piùunità metileniche (-CH2-) ed hanno differenze qualitative e/oquantitative di attività farmacologica

A. OMOLOGIA LINEARE (derivati monoalchilati)

R-X → R-CH2-X → R-CH2-CH2-X → … → R-(CH2)n-X

NCH3Cl

CETILPIRIDINIO CLORURO (Cepacol)

tensioattivo cationico ad attività antisetticaomologhi con n. di metileni <15 sono inattivi come germicidi

Es. 1:

Es. 2: Analoghi della NOR-ADRENALINA

OH

N

H

R

HO

OH

R recett.Eff.

ipertensivo

Eff. ipotensiv

o

H ++ -

Me ++ -

Et + +

n-Prop - +

iso-Prop - ++

n-But - ++

iso-But - ++

Esempio di inversionedi attività farmacologicain serie omologa

B. OMOLOGIA CICLICA (composti ciclopolimetilenici)

(CH2)nX (CH2)n+1

X

serie omologa di compostiad attività antiipertensiva

NH

NH2

NH

N(CH2)n

NH

NH2

NH

N GUANETIDINAoptimum di attività antiipertensiva per n = 7

(CH2)n

HOOC NH

N

O

COOH

analoghi dell’ENALAPRILATO (ACE-inibitore)

n IC50, nM2 19.0003 1.7004 195 4.86 8.1

HOOC NH

N

O

CH3

COOH

ENALAPRILATO

Es. 1:

Es. 2:

Es. 3:

N

O

OC2H5

CH3

MEPERIDINAanalgesico narcoticocon attività tossicomanogena

O

OC2H5

N

H3C

ETOEPTAZINAanalgesico narcoticoprivo di attività tossicomanogena

H2N

O2S

NH

O

NH

GLICICLAMIDEipoglicemizzante orale

H2N

O2S

NH

O

NH

N

TOLAZAMIDEipoglicemizzante orale

Es. 4:

esempio di omologazione + isosteria = aza-omologazione

C. OMOLOGIA LINEARE 2 (composti polimetilenici bifunzionali acatena aperta)

X-(CH2)n-Y X-(CH2)n+1-Y X = o ≠ Y

N N

CH3

H3C

H3C

CH2

CH3CH3

n

COMPOSTI POLIMETILENICI BIS-AMMONICI(METONI)

A partire da n = 1: attività bloccante dei recettori colinergicinicotinici deigangli del sistema nervoso autonomo (GANGLIOPLEGICA), che raggiungeil massimo per n = 6 (ESAMETONIO BROMURO, utilizzato come agenteipotensivo).Da n = 7 in poi l’attività ganglioplegica diminuisce, per scomparire del tuttonegli analoghi superiori, nei quali compare una nuova attività di blocco deirecettori colinergici nicotinici a livello della placca motrice (CURARO-MIMETICA), che raggiunge il suo culmine per n = 10 (DECAMETONIOIODURO, bloccante neuromuscolare utilizzato come succedaneo della d-tubocurarina per indurre rilassamento muscolare nell’anest. chirurgica)

N

CH3

H3C

H3C

N

CH3

Ch3CH3

Br Br

ESAMETONIO BROMUROganglioplegicoantiipertensivo

DECAMETONIO IODUROcuraromimetico

rilass. muscolatura scheletr.

N

CH3

H3C

H3C

I I

N

CH3

CH3CH3

Vinilogia e benzologia (Principio di Angeli)

Due sostituenti X e Y posti in posizione orto o para di un anello benzenico,oppure separati tra loro da catene insature (doppi legami coniugati) si comportano in genere come se fossero direttamente uniti tra loro

X-Y → X-CH=CH-Y X-Y → X

Y

YX

Es. 1:

NH

NH3CO

H3COOCOCH3

OCO-X

OCH3

OCH3

OCH3

X =

RESERPINA

RESCINAMINAAlcaloidi naturali della Rauwolfia Serpentina ad azione ipotensiva e neurolettica

Es. 2:

N

COOC2H5

CH3

MEPERIDINA (analgesico narcotico)

vinilogo ad azionepiù breve perchémeno stabile

N

COOC2H5

CH3

OCH3

OCH3

OCH3

vinilogo della meperidina

Es. 3:

H3C

O

ON

H2C CH3

CH3

vinilogo dell’ACETILCOLINA

ACETILCOLINA (Ach)

compostoattività

nicotinica

attività muscarinic

a

sensibilità alla Ach-esterasi

Ach + + sensibile

vinilogo + - insensibile

ON

H2C CH3

CH3

O

H3C

vinilogo dell’Ach

Es. 4: H2N

SO2

NH2

H2N

SO2

NH2

SULFANILAMIDEantibatterico

DAPSONE (DDS)antileprotico

(compostibenzologhi)

Es. 5:

H2N

NH

O

NC2H5

C2H5

H2N

NH

O

N C2H5

C2H5

PROCAINAMIDE cicloviniloghi della procainamide

compostoattività anestetica

localeattività

antiaritmica

procainamide 1 1

ciclovinilogo orto 0 0.17

ciclovinilogo meta

47 0

ciclovinilogo para 35 0

Semplificazione e Complicazione molecolare(Approccio disgiuntivo e congiuntivo)

A. SEMPLIFICAZIONE MOLECOLARE

O

N

HO

HO

CH3

MORFINAanalgesico narcotico

inconvenienti ed eff. collaterali:-depressione del respiro-azione stupefacente-dipendenza fisica e psichica

NH

O

epossimorfinano

NH

morfinano

NH

benzomorfanoNH

4-fenil-piperidine

NH2

fenil-alchil-ammine

NCOOCH3

O

O

H3C

COCAINAanestetico localestimolante il CNS

N

O

O

H3C

CH3

H3C

H3C

CH3

COOCH3

EUCAINA Aanestetico locale

O

O

NC2H5

C2H5

NH2

PROCAINAanestetico locale

B. COMPLICAZIONE MOLECOLARE

NH

S

NH

NS

PETTanti-HIV-1

NH

S

NH

NS

H

H

forma conformazionalm. ristrettadei PETT

HN

OHO

H

GABA

N

OHO

H

ISOGUVACINA

N

H

O

NHO

THIPpotente GABA agonista

HN

OHO

H

AC. 4-AMMINO-CROTONICO

Distanze intramolecolari

DECAMETONIOcurarizzante

SUSSAMETONIO (SUCCINILCOLINA)

curarizzante

N

ON

O

CH3H

H3COHO

OCH3

H3C CH2

D-TUBOCURARINAcurarizzante naturale

NH3C

H3C

H3C

N

CH3CH3

CH3

NH3C

H3C

H3C

O

O

N

CH3CH3

CH3

O

O

NH3C

H3C

H3C

N

CH3

CH3

CH2

ESAMETONIOganglioplegico

14,5 Å

ESTRADIOLOormone naturale estrogeno

TRANS-DIETILSTILBESTROLOestrogeno di sintesi

CIS-DIETILSTILBESTROLOinattivo

HO

OHCH3

OH

HO

CH3

H3C

HO

CH3

CH3

OH

14,5 Å

Raddoppiamento Molecolare (Farmaci Gemelli)

H3C

O

ON

H2C CH3

CH3

H3C

O

ON

H2C CH3

CH3

ACETILCOLINA (2 molecole)colinergico

O

ON

H2C CH3

CH3

O

ON

H3CCH3

CH3

SUCCINILCOLINAcurarommetico (pseudo-

raddopiam.)

S

NH2

OO

H2N

S

NH2

OO

H2N

SULFANILAMMIDE (2 molecole)antibatterico

S

OO

H2N

NH2

DAPSONEantileprotico

O O

Nh

NH2

NH

H2N

PENTAMIDINAintercalante il DNA

tripanocida

NH

H2NNH

N

NH

N

( )n

NH

NH2

BIS-BENZOIMIDAZOLIintercalanti il DNA

max affinità per DNA = n num. pari