Approches méta-génomiques en Microbiologie Pascal SIMONET Ecologie Microbienne, Univ. Lyon1-CNRS...
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Approches méta-génomiquesen Microbiologie
Pascal SIMONET
•Ecologie Microbienne, Univ. Lyon1-CNRS•Laboratoire Ampère, ECL-CNRS
CONTEXTE
•Eucaryotes microscopiques
•Procaryotes
Whitman et al. 1998 PNAS, 95, 6578-6583. Prokaryotes: The unseen majority.
4-6 x 1030 cellules bactériennes
1,2 x 1029 Océan 2,6 x 1029 Sol3,5 x 1030 Sol profond0,25 - 2,5 x 1030 Sous sol océanique
Microorganismes
The diversity of life
Overview
• Microbes dans l’environnement Microorganismes (bactéries, archaea, champignons, levures)
colonisent tous les écosystèmes de notre planète.
Un gramme de sol de jardin >100 000 000 cellules microbiennes
(100 – 1000 espèces différentes).
Le corps humain: 1 milliard de cellules microbiennes.
Microorganismes: impliqués dans tous les processus globaux
Microorganismes: Rôle fondamental en Biotechnologie (e.g.,
antibiotiques, fermentation, expression, bioremédiation).
Despite temperatures ranging from –5 to –70oC and water contents below 2%, Antarctic terrestrial soils contain 106 – 108 cells per gram.
Large populations of hyperthermophilic bacteria and archaea live in boiling hydrothermal systems.
Culture in vitro
Collections de microorganismes: - Laboratoires académiques- Organisations privées ou publiques
ATTC (USA)LMG (Belgique)DSM (Allemagne)I. Pasteur (France)
- Laboratoires industriels
Approches traditionnelles en microbiologie
Isolats bactériens
Problèmes d’identificationProblèmes de caractérisationProblèmes de taxonomieProblèmes d’évolution (transferts latéraux de gènes)
Problèmes d’accessibilitéProblèmes de représentativité (1% de cultivés)Problèmes de conservationProblèmes de criblage
ADN microbien « environnemental ».
Extraction, Purification, Exploitation
Identification, caractérisation, fonctions et exploitation des bactériesnon cultivées.
Approches « métagénomiques » en microbiologie
PRINCIPE
•Lyse in situ et extraction directe de l’ADN (total), purification.
•Extraction des cellules bactériennes, purification, lyse, purification de l’ADN.
Source ?
•Sélection PCR: Banques de séquences 16S rDNA.•Clonage direct: Banques d’ADN métagénomique•Séquençage direct
Extraction d’ADN
des bactéries (métagénome)
ADN métagénomiq
ue
vecteur
Clonage Transformation
dans hôte cultivable
Banque d’ADN métagénomiqu
ePCR
Clonage séquençage
RISA, T-RFLP DGGE
Criblage moléculaire
Criblage chimique
Criblage biologique
Isolement in vitro de bactéries cultivables
Phylogénie
Estimation de la diversité bactérienne (17)
Caractérisation
Comparaison de différentes situations environnementales
Culture in vitro
OMe CH3O
O
CH3
CH3
O
OHOH
OMe
OMe
Détermination de la structure chimique des molécules produites
Détection directe d’activité antibactérienne ou enzymatique
Détection de gènes par hybridation
Séquençage direct(shotgun)
Création et exploitation de banques d’ADN métagénomiqueCréation et exploitation de banques d’ADN métagénomique
Renaud NALINRenaud [email protected]@libragen.com
3 rue des Satellites3 rue des Satellites31400 Toulouse31400 Toulouse
ATOUTS et LIMITES
Génomique: Définition
C'est l'étude exhaustive des génomes et en particulier de l'ensemble des gènes, de leur disposition sur les chromosomes, de leur séquence, de leur fonction et de leur rôle.
Séquençage massif, Méthodes bio-informatiques
Post-génomique
Sciences en « iques », transcriptomique, protéomique, métabolomique etc…
« Méta -génomique » en Microbiologie ??
Sensu stricto non, mais…
Sensu lato Utilisation de l’ADN oui
Eaux de drainage des mines de fer
Couverture par banque d’ADN métagénomique de 80 x106 pb (23 000 clones)
Génome quasi complet Leptospirillum sp. et Ferroplasma sp. et le Génome partiel de 3 autres bactéries.
Tyson GW et al. (2004) Nature 428, 37-43
Eaux de drainage des mines de fer Couverture par banque d’ADN métagénomique de 80 x106 pb (23 000 clones)
Génome quasi complet Leptospirillum sp. et Ferroplasma sp. et le Génome partiel de 3 autres bactéries. Tyson GW et al. (2004) Nature 428, 37-43
Sols cultivés ou forestiers: 109 cellules par gramme 10 000 espèces génomiques dominantes différentes
9 millions de clones (pour des inserts moyens de 40 kb) nécessaires pour un représentant de chaque espèce.
Banque métagénomique d’un sol de prairie (100 000 clones) Taille totale de l’ADN cloné : 3,5 x 109 pb5% de la diversité totale (x24 /techniques de culture) Ginolhac A et al. (2003) Appl Environ Microbiol 70, 5522-5527
Extraction et purification de l’ADN environ.
Frostegard A., Courtois S., Ramisse V., Clerc S ., Bernillon D., Le Gall F., Jeannin P., Nesme X. and Simonet P. 1999. Quantification of Bias Related to the Extraction of DNA Directly from Soils. Appl. Environ. Microbiol., 65 : 5409-5420.
Lyse cellulaire ??
Taux de récupération de l’ADN ??
APPLICATIONS
Extraction d’ADN
des bactéries (métagénome)
ADN métagénomiq
ue
vecteur
Clonage Transformation
dans hôte cultivable
Banque d’ADN métagénomiqu
ePCR
Clonage séquençage
RISA, T-RFLP DGGE
Criblage moléculaire
Criblage chimique
Criblage biologique
Isolement in vitro de bactéries cultivables
Phylogénie
Estimation de la diversité bactérienne (17)
Caractérisation
Comparaison de différentes situations environnementales
Culture in vitro
OMe CH3O
O
CH3
CH3
O
OHOH
OMe
OMe
Détermination de la structure chimique des molécules produites
Détection directe d’activité antibactérienne ou enzymatique
Détection de gènes par hybridation
Séquençage direct(shotgun)
Criblage moléculaire d’une banque d’ADN métagénomiquepar hybridation de colonies
La structure des polyketides produits par les PKSI est liée à leur organisation linéaire en domaines et modules.
Type I PKS (PKSI)
Criblage de banques d’ADN métagénomique (sol)
• 60 000 clones 139 « KS » +++
• 40 « KS » séquencés Pas de redondanceNouveauté totale(similarité < 67%)
Ginolhac A., Jarrin C., Gillet B., Robe P., Pujic P., Tuphile K., Bertrand H., Vogel T. M., Perriere G., Simonet P., and Nalin R 2004. Phylogenetic Analysis of Polyketide Synthase I Domains from Soil Metagenomic Libraries Allows Selection of Promising Clones. Appl. Environ. Microbiol. 2004;70 5522-5527
Extraction d’ADN
des bactéries (métagénome)
ADN métagénomiq
ue
vecteur
Clonage Transformation
dans hôte cultivable
Banque d’ADN métagénomiqu
ePCR
Clonage séquençage
RISA, T-RFLP DGGE
Criblage moléculaire
Criblage chimique
Criblage biologique
Isolement in vitro de bactéries cultivables
Phylogénie
Estimation de la diversité bactérienne (17)
Caractérisation
Comparaison de différentes situations environnementales
Culture in vitro
OMe CH3O
O
CH3
CH3
O
OHOH
OMe
OMe
Détermination de la structure chimique des molécules produites
Détection directe d’activité antibactérienne ou enzymatique
Détection de gènes par hybridation
Séquençage direct(shotgun)
Streptomyces coelicolor
Bacillus subtilisBacillus subtilis
Pseudomonas fluorescensPseudomonas fluorescens
Escherichia coliEscherichia coli
VecteursVecteurs
A second generation snp-derived Escherichia coli–Streptomycesshuttle expression vector that is generally transferable by conjugation
Nikodinovic, Priestley, Plasmid 56 (2006) 223–227
Criblage chimique
OMe CH3O
O
CH3
CH3
O
OHOH
OMe
OMe
Banques d’ADN métagénomique
ou
Extraction d’ADN
des bactéries (métagénome)
ADN métagénomiq
ue
vecteur
Clonage Transformation
dans hôte cultivable
Banque d’ADN métagénomiqu
ePCR
Clonage séquençage
RISA, T-RFLP DGGE
Criblage moléculaire
Criblage chimique
Criblage biologique
Isolement in vitro de bactéries cultivables
Phylogénie
Estimation de la diversité bactérienne (17)
Caractérisation
Comparaison de différentes situations environnementales
Culture in vitro
OMe CH3O
O
CH3
CH3
O
OHOH
OMe
OMe
Détermination de la structure chimique des molécules produites
Détection directe d’activité antibactérienne ou enzymatique
Détection de gènes par hybridation
Séquençage direct(shotgun)
Venter et al. 2004.
Environmental Genome Shotgun Sequencing of the Sargasso Sea. Science 304, 66-74.
1800 espèces génomiques148 phylotypes bactériens inconnus
MetaGene: prokaryotic gene finding from environmental genome shotgun sequences
Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 34, No. 19 5623–5630
MetaGene can predict a whole range of prokaryotic genes based on the anonymous genomic sequences of a few hundred bases, with a sensitivity of 95% and a specificity of 90% for artificial shotgun sequences (700 bp fragments from 12 species).
Hideki Noguchi*, Jungho Park and Toshihisa Takagi
Department of Computational Biology, Graduate School of Frontier Sciences, University of Tokyo, Kashiwa, Chiba 277-8562, Japan
Extraction d’ADN
des bactéries (métagénome)
ADN métagénomiq
ue
vecteur
Clonage Transformation
dans hôte cultivable
Banque d’ADN métagénomiqu
ePCR
Clonage séquençage
RISA, T-RFLP DGGE
Criblage moléculaire
Criblage chimique
Criblage biologique
Isolement in vitro de bactéries cultivables
Phylogénie
Estimation de la diversité bactérienne (17)
Caractérisation
Comparaison de différentes situations environnementales
Culture in vitro
OMe CH3O
O
CH3
CH3
O
OHOH
OMe
OMe
Détermination de la structure chimique des molécules produites
Détection directe d’activité antibactérienne ou enzymatique
Détection de gènes par hybridation
Séquençage direct(shotgun)
Fortes teneurs en métaux lourds
« Sols » chimiquement déséquilibrés
Ni Cr, Co,
C, N, P…
Carence en éléments essentiels
Modèle : Déblais de mines de nickel en Nouvelle-Calédonie
Gènes de résistance au nickel
Fall, Herrera, Helassa, Bernillon, Simonet, Vogel, Navarro
Banques plasmidiques
Taille des fragments : 2-9Kb
Taille des fragments : 20-40Kb
Banques cosmidiques
50Kb
2 clones MS1 et MS2
8 mM
3 clones MS3, MS7 et MS43
8 mM
ORF1 ORF2
ATPase E1-E2
nreA nreB
HP HP RT
MS3
DedANicOchrB nreB rcnA nreA ORF1 ORF2chrA wcaK
MS7/43
ORFs impliqués dans la résistance au nickel :
nreB - rcnA
101
81
81 1
Determining the antibiotic resistance potential of the indigenous oral microbiota of humans using a metagenomic approachDiaz-Torres et al. 2006 FEMS Microbiol Lett 258, 257–262
Bouche: Prévalence de nombreux gènes de résistance aux antibiotiques
Symbiosis insights through metagenomic analysis of a microbial consortiumWoyke et al. 2006, Nature Vol 443, 26 October 2006
Olavius algarvensis, (vers marin) Microsymbiontes remplacent bouche et tube digestif
Microbial diversity in the deep sea and the underexplored ‘‘rare biosphere’’Sogin et al. 2006, PNAS vol. 103 no. 32 12115–12120
Grande profondeur: Complexité jusqu’à 2 ordres de grandeur > autres environnements. Des milliers de populations faiblement représentées
Metagenomic Analysis of Coastal RNA Virus CommunitiesCulley et al. 2006, SCIENCE VOL 312 23 JUNE 2006
Océans: un réservoir de virus à ARN inconnus
Comparative Metagenomics of Microbial Communities
Tringe,1,2* von Mering,3* Kobayashi,1 Salamov,1 Chen,4 Chang,5 Podar,5 Short,5 Mathur,5 Detter,1 Bork,3 Hugenholtz,1 Rubin1,2.
1Department of Energy (DOE) Joint Genome Institute, 2800 Mitchell Drive, Walnut Creek, CA 94598, USA. 2Lawrence Berkeley National Laboratory, Genomics Division, Berkeley, CA 94720, USA. 3European Molecular Biology Laboratory, Meyerhofstrasse 1, 69117 Heidelberg, Germany. 4University of California, Berkeley, Department of Electrical Engineering and Computer Science, Berkeley, CA 94720, USA.5Diversa Corporation, 4955 Directors Place, San Diego, CA 92121, USA
22 APRIL 2005 VOL 308 SCIENCE
« The identification of environment-specific genes through a gene-centric comparative analysis presents new opportunities for interpreting and diagnosing environments. »
Reduced diversity of faecal microbiota in Crohn's disease revealed by a metagenomic approach.
A reduced complexity of the bacterial phylum Firmicutes as a signature of the faecal microbiota in patients with CD. Presence of new bacterial species.
Six healthy donors and six patients with CD.
Bacterial diversity (16S rRNA gene).
Gut. 2006 Feb;55(2):205-11.
C Manichanh, L Rigottier-Gois, E Bonnaud, K Gloux, E Pelletier, L Frangeul, R Nalin, C Jarrin, P Chardon, P Marteau, J Roca and J Dore
INRA, Genoscope, Genopôle IP, LibraGen etc
ADN environ. Ecologie µbienne Environ.
Détecter, identifier, localiser, compter les µorganismes.
Identifier des gènes / Déterminer des activités potentielles.
Exploiter des ressources génétiques.
Applications méta-génomique?
Improved inverse PCR scheme for metagenome walking
Taku Uchiyama and Kazuya Watanabe
Marine Biotechnology Institute, Kisarazu, Japan
BioTechniques 41:183-188 (August 2006)