Approche Diagnostique des

Infections Fongiques Invasives

Frédéric Lamoth, M.D.

Service des Maladies Infectieuses

Institut de Microbiologie

CHUV, Lausanne

Bactériologie

VirologieParasitologie

Laboratoire de Microbiologie

Place de la Mycologie

Les Champignons sont partout !

Mycoses Superficielles / Localisées4ème maladie la plus fréquente (1 billion d’individus / an)

Pytiriasis versicolor

(Malassezia furfur)

Tinea nigra

(Hortaea werneckii)Onychomycosis

(Trichophyton rubrum)

Phaeohyphomycosis

(Exiophiala jeanselmei)

Atteintes cutanées / sous-cutanées

Fungal keratitis

(Fusarium solani)

Atteintes muqueuses / oculaires

Oral candidiasis

(Candida albicans)

1 million de cas

de cécité / an

Infections Fongiques Invasives

300 millions d’individus / an

1.3 millions de décès

Mycoses endémiques

Histoplasmose

Blastomycose

Coccidioidomycose

Paracoccidioidomycose

Mycoses opportunistes

Pneumonie à Pneumocystis

Cryptococcose

Pénicilliose (P. marneffei)

Candidiase invasive

Aspergillose invasive

Mucormycose

Fusariose

Diagnostic des Infections Fongiques Invasives

Facteurs de

l’hôte

Critères

cliniques

Critères

mycologiques

1 1+

Possible

1 1+

Probable

1+

Classification selon EORTC-MSG

Ascioglu et al. Clin Infect Dis 2002; 34:7-14, De Pauw et al. Clin Infect Dis 2008: 46:1813-21

Histopathologie / culture

sites stérilesProuvée

Critères Mycologiques

Type Test

Direct Microscopie

Histologie

Culture

Indirect Galactomannane

Beta-D-Glucan

Mannane / Anti-mannane

Antigène Crypto

Antigène Histoplasma

PCR

Espèce HSCT SOT

Aspergillus spp. 65% 63%

Mucorales 12% 8%

Fusarium spp. 5%22%

Other molds 10%

Unspecified 8% 7%

Infections à Champignons Filamenteux

Incidence cumulative des infections fongiques invasives

chez patients à risques (onco-hématologiques, transplantés

d’organes): 2 – 8% / an

Champignons filamenteux: 30-60%

Kontoyiannis et al., Clin Infect Dis 2010; 50:1091-1100

Pappas et al., Clin Infect Dis 2010; 50:1101-1111

Aspergillose

Degré d’invasion

Immunité

normale

Traitement

stéroïde

Transplantation

organes solides

Greffe de moelle

allogénique

Aspergillose

broncho-

pulmonaire

allergique

Aspergillose

pulmonaire

chronique

Aspergillose

invasive

Degré d’immunosuppression

Neutropénie

Nodule isolé

Forme fibrosante

Forme nécrosante

Aspergillome

Pneumopathie

chronique

Spectre de présentation clinique

Subgenus Section

Circumdati Circumdati, Flavi, Candidi, Flavipedes, Nigri, Terrei

Nidulantes Nidulantes, Usti, Ochraceorosei, Sparsi

Fumigati Fumigati, Clavati, Cervini

Aspergillus Cremei, Restricti, Aspergillus

Famille des Trichochomaceae

3 Lignées: Aspergillaceae, Thermoascaceae, Trichochomaceae

14 clades

Clade: Aspergillus (Env. 344 espèces)

Autres clades:

Penicillium, Penicilliopsis, Paecilomyces, Rasamsonia, Monascus,

Phialomyces, Thermoascus, Talaromyces, Trichocoma,

Thermomyces, Sclerocleista, Sagenomella, Hamigera

Aspergillus spp.

Culture - Identification

Macroscopique

Examen morphologique

Microscopique

Identification à la

section

Séquençage rDNA (ITS, 18S, 26S/28S)

Séquençage gènes spécifiques (beta-tubuline

+/- calmoduline)Identification à

l’espèce

Lab

ora

toir

e

sta

nd

ard

Lab

ora

toir

e

sp

écia

lisé

MALDI-TOF (section et espèce !?)

Lab

ora

toir

e

Bio

l. M

ol.

Aspergillose Invasive

PATH Alliance SENTRY (HSCT) SENTRY (SOT)

A. fumigatus 73% A. fumigatus 59% A. fumigatus 64%

A. flavus 10% A. niger 11% A. flavus 8%

A. niger 9% A. flavus 10% A. niger 6%

A. terreus 4% A. terreus 7% A. terreus 5%

mixtes, autres 4% mixtes, autres 13% mixtes, autres 17%

Leader: A. fumigatus

Outsiders: A. flavus, A. niger, A. terreus

Marginaux: A. nidulans, A. ustus, A. versicolor, A. glaucus…

Steinbach WJ et al. J Infect 2012; 65:453-64

Kontoyiannis DP et al. Clin Infect Dis 2010; 50:1091-100

Pappas PG et al. Clin Infect Dis 2010; 50:1101-11

Aspergillus Section Fumigati

Première cause de l’aspergillose invasive (75-90%)

63 espèces: anamorphes: Aspergillus (ex.: A. fumigatus)

téléomorphes: Neosartorya (ex.: N. fischeri)

A. fumigatus 95-97% des cas d’AI

Formes cryptiques

A. lentulus

A. udagawae

A. viridinutans/felis

A. thermomutatus

…

Rares AI (3-5%)

Défaut de sporulation

Moins de thermotolérance

Résistance naturelle aux

azoles !

A. felis: aspergillose sino-orbitale chez chats / chiens

Aspergillus Section Flavi

Deuxième cause de l’aspergillose invasive (10%)

Première cause d’aspergillose sinusale ou cérébrale dans certaines

régions du monde (Asie, Afrique, Moyen Orient)

Fléau de l’agriculture (contamination des céréales, aflatoxine)

A. flavus Principal pathogène de la

section

Formes

cryptiques

A. alliaceus

A. tamarii

A. oryzae

…

Rares « case reports »

d’infection

Résistance à l’amphotéricine

B (A. alliaceus)

Aspergillus Section Nigri

Rare cause (5-10%) d’aspergillose invasive

La cause d’otite externe fongique

« Black mold » (fruits, légumes, cuir, murs, papiers peints)

Production d’acide oxalique (atteinte rénale)

Ochratoxine A (A. carbonarius, pourriture du raisin)

Champignon domestique (acide citrique, amylases)

Fréquent contaminant des laboratoires

A. niger Otite externe, endocardite,

aspergillose invasive

Formes cryptiques

A. tubingensis

A. awamori

A. carbonarius

A. brasiliensis

…

Jusqu’à 50% des isolats

cliniques

Quelques cas d’infection

décrits

Aspergillus Section Terrei

Rare cause d’aspergillose invasive (5-10%)

Historiquement: haute mortalité (réfractaire aux traitements)

Résistance intrinsèque à l’amphotéricine B

Source initiale de la mévinoline (lovastatine)

Champignon domestique: production d’acide itaconique

(peintures, cosmétiques)

A. terreus Le plus fréquent en clinique

Aspergillose pulmonaire invasive

Autres infections (ostéomyélites)

Formes cryptiques

A. citrinoterreus

A. alabamensis

Pathogènes potentiels (rares)

Aspergillus Section Usti

Rare cause d’aspergillose invasive (<3%)

Pathogène émergent

Majorité des cas observés sous prophylaxie de triazoles

Résistance intrinsèque aux triazoles

(Sensibilité diminuée aux autres antifongiques)

Colonise les systèmes de distribution d’eau

Infections fongiques réfractaires aux traitements

(infections disséminées extrapulmonaires: cutanées primaires)

A. calidoustus Seul pathogène reconnu de

la section

Formes cryptiques

A. ustus

A. insuetus

A. granulosus

…

Non pathogènes (?)

(Non thermotolérants)

Aspergillus Section Nidulantes

Aspergillus (Emericella) nidulans

Champignon « modèle » de laboratoire

2ème cause d’aspergillose invasive chez les

patients atteints de maladie granulomateuse

chronique (atteintes pulmonaires, osseuses)

Très rare chez les autres populations

immunosupprimées (neutropéniques,

SOT…)

Cause d’eumycétome en régions tropicales

Sensibilité diminuée à l’amphotéricine B

Test Detection Site

Galactomannan

Platelia EIA (Bio-Rad)

Aspergillus

(Fusarium, Histoplasma)

Serum, LBA,

LCR

Beta-D-Glucan

Fungitell (ACC)

Wako / Maruha

Fungitec-G (Seikagaku)

Aspergillus, Candida, Others

Exceptions: Mucorales,

Cryptococcus

Serum

PCR

« Home-made »

qq kits commerciaux

Aspergillus-Specific

Multiplex Aspergillus / Mucor

Panfungal

Serum, Plasma

LBA

Tissus

Marqueurs Fongiques

Marqueurs Fongiques - Serum

Performance (Meta-Analyses)

Test Author (Year) Sensitivity Specificity

Galactomannan Pfeiffer (2006)

Leeflang (2008)

61

78

93

81

Beta-D-Glucan Karageorgopoulos (2011)

Lu (2011)

Lamoth (2012)

Onishi (2012)

77

76

62

80

85

85

91

82

PCR Mengoli (2009)

Arvanitis (2015)

88

84

75

76

PCR or

Galactomannan

Arvanitis (2015) 99 64

Patients onco-

hématologiques

Transplantés d’organes

solides

Galactomannane (Se / Sp)

58 / 95 41 / 85

Beta-glucan (Se / Sp)

62 / 91 (71 / 59)

Marqueurs Fongiques - Serum

Performance Variable

Une valeur Deux valeurs

consécutives

Galactomannane (Se / Sp)

97 / 90 92 / 97

Beta-glucan (Se / Sp)

62 / 91 50 / 99

Performance

(Se et Sp)

médiocre !

Se

Sp ~ 100% !

Marqueurs Fongiques - LBA

Performance (Meta-Analyses)

Test Author (Year) Sensitivity Specificity

Galactomannan Guo (2010)

Zou (2012)

Heng (2015)

85

86

92

94

95

98

PCR Sun (2011)

Avni (2012)

91

90

92

96

PCR or

Galactomannan

Avni (2012) 97 98

Performance similaire dans diverses populations (HM, SOT…)

Onco-Hem

Autres IS

Exclusion “Zone grise” Confirmation

- Negatif

1x positif

2x positif

- Negatif

Positif

Marqueurs Fongiques – Interprétation ?

Exclusion “Zone grise” Confirmation

Negatif Positif

0.5 - 3

Positif ≥3

SERUM (GM, BDG)

LBA (GM)

Onco-HEM et

autres IS

2x ?

CAVE:

Mucormycose !

Faux pos ?

Mucormycose

Mucorales

Mucor spp.

Rhizopus spp.

Rhizomucor spp.

Lichtheimia spp. (Absidia spp.)

Cunninghamella spp.

Atteinte rhino-sinusal, pulmonaire

Patients diabétiques ou immunocompromis

Résistances multiples (voriconazole; échinocandines)

Traitement: amphotéricine B, isavuconazole, (posaconazole)

Mucormycose - Diagnostic

Test Utilité

Culture ? OUI (sensibilité médiocre)

Galactomannan ? NON

Beta-Glucan ? NON

PCR ? OUI

Millon L et al. Clin Infect Dis 2013; 56:95-101.

Millon L. et al. Clin Microbiol Infect 2015 (in press)

PCR multiplex (Rhizopus, Mucor, Rhizomucor, Lichtheimia)

Positive dans 80% des cas de mucormycoses prouvées/probables

Pas de kits commercialisés actuellement

Fusarium spp.

F. solani

F. verticilloides

F. oxysporum

Patients neutropéniques

Origine pulmonaire ou cutanée

Fongémie (40%)

Galactomannane et/ou beta-

glucan souvent positifs

Multi-résistants

Mortalitée très élevée

Fusariose

Nucci and Anaissie, Clin Infect Dis 2002; 35:909-20

Gram stain – Blood culture

Scedosporiose

Scedosporium apiospermum complex

- Scedosporium apiospermum

- Scedosporium (Pseudallascheria) boydii

- Scedosporium auranthiacum

Cause d’eumycétomes en régions tropicales

Colonisant fréquent chez patient avec mucoviscidose

Infections type aspergillose pulmonaire chronique ou invasive

Résistance intrinsèque à l’amphotéricine B (traitement: voriconazole)

Scedosporium prolificans Lomentospora prolificans

Multi-résistance !

Les Penicillium

P. citrinum P. roqueforti P. camemberti

P. marneffei

Ceux du quotidien…

Celui qui sauve… Celui qui tue…

P. chrysogenum

Les “Penicillium-Like” Pathogènes Chez l’Humain

Paecilomyces variotii

Rares infections, souvent extrapulmonaires:

Péritonite, endophtalmite, otite, infection de

plaie, fongémie

Résistance au voriconazole

Purpureocillium lilacinum

(Paecilomyces lilacinus)

Nématophage (agent de biocontrôle)

Infections oculaires, cutanées

Rares infections disséminées (immunosupp.)

Résistance à l’amphotéricine B (ttt: voriconazole)

Rasamsonia (Geosmithia) argillacea

Très fréquemment confondu avec P. variotii

Rares infections disséminées, d’origine

pulmonaire (patients avec CGD)

Colonisation fréquente chez mucoviscidose

Multi-résistant (surtout voriconazole)

Pas de traitement Triazoles

Amphotericin B

Echinocandines

Fongicide FongistatiqueCroissance normale

Standard

(CLSI / EUCAST)

E-TestsMicrodilution manuelle Sensititre YeastOne

Test de Sensibilité aux Antifongiques en Routine

Alternatives

Fastidieux

Lent

Interprétation ? Corrélation clinique ?

Sensibilité Amphotericin Voriconazole Posaconazole Echinocandins

Aspergillus spp.

A. fumigatus

A. lentulus

A. terreus

A. ustus

Champignons filamenteux autres

Mucorales

Fusarium

S. apiospermum

S. prolificans

P. variotii

P. lilacinum

Profils de Sensibilité Antifongique –

Champignons Filamenteux

Inactif Actif

Environnementale

« Hollandaise »

Acquise

« Anglaise »

Source Fongicides

(agriculture)

« In patient »

Patients Naïfs de traitement Exposés aux azoles

Maladie Aspergillose invasive Aspergillose pulmonaire

chronique

Résistance Pan-azole Variable

Mécanisme CYP51A:

- TR34/L98H

- TR46/Y121F/T289A

Divers (CYP51A, ABC

transporters)

Fréquence 0-15% 0-25%

Distribution Europe (Pays-Bas),

Asie, Amérique

Partout (Grande-

Bretagne)

Résistance aux Azoles Chez A. fumigatus

1026 clinical isolates (22 states)

2 TR34/L98H

2 TR46/Y121F/T289AWiederhold NP, JCM 2016; 54:168-71

60 soil samples (flower fields)

1 TR34/L98H

17 TR46/Y121F/T289ALe Pape P, EID 2016; 22:156-7

Azole Resistance of Aspergillus fumigatus Worldwide

You won’t find it if you don’t look !

First Detection of TR34/L98H Mutation in Aspergillus fumigatus

Isolates from Environmental Samples in Switzerland

Riat A, Ischer F, Schrenzel J, Gindro K, Sanglard D.

Poster SGM 2016 (Bern, 13-16th June 2016)

20 clinical samples (cystic fibrosis patients), 69 environmental samples

(Romandy)

SamplesMIC (mg/l) Gene

mutationsCSP Types

ITZ VRZ POZ5d >16 0.25 1 G54R t0115a >16 >8 1 TR34/L98H t0215f >16 4 0.25 TR34/L98H t1137c >16 2 0.25 TR34/L98H t02

50a >16 4 0.25 TR34/L98H t0261a 1 0.5 0.12 TR34/L98H t03

geodata © swisstopo

Figure 2. Map of southwest Switzerland showing the locations of azole-resistant A.

fumigatus, which are illustrated with colour stars.

Recycling centre

Commercial samples

Public garden

Agriculture field

5 (7%) environmental

samples with Cyp51A

mutations

-4 TR34/L98H

-1 G54R

Conclusions

• Mycologie: souvent considérée comme un secteur

marginal au sein d’un laboratoire de microbiologie

MAIS:

• Science complexe

– Identification (requiert une grande expertise)

– Lecture / interprétation des antifongigrammes

– Indication / interprétation tests indirects

• Importance croissante

– Augmentation et diversité de la population immunosupprimée

– Progrès dans les méthodes diagnostiques (PCR, MALDI-TOF)