APPORT DE LA BIOLOGIE MOLECULAIRE ET DES TESTS RAPIDES Pr Jean-Philippe LAVIGNECHU Nîmes – INSER MU1047

XXIVe Journée Annuelle CCLIN Sud-Est - Lyon

Problématiques des épidémies: risques infectieux émergents

• Modification Quantitative

• Modification Qualitative

Nouveaux sous-types

Résistance de l’agent aux anti-infectieux

Modifications antigéniques

Echappement aux vaccins

Echappement aux tests de dépistage

Acquisition de facteurs de pathogénicité

Nouveaux modes de transmission = bioterrorisme

Causes et mécanismes de l’émergence

Modification du microorganisme : pression de sélection, mutation,...?• Virus de la grippe, BHRe, C. difficile O27, …

Modification du comportement humain: guerre, camps de réfugiés, urbanisation, effondrement des systèmes de santé publique, élevages intensifs…• Tuberculose multiR, MERS-CoV, Grippe aviaire…

Modification de l’environnement : émergence des vecteurs• Dengue, Chikungunya, Ebola…

Modifications des possibilités diagnostiques : progrès scientifiques• Découverte de nouveaux agents pathogènes

Causes et mécanismes de l’émergence

Modification du microorganisme : pression de sélection, mutation,...?• Virus de la grippe, BHRe, C. difficile O27, …

Modification du comportement humain: guerre, camps de réfugiés, urbanisation, effondrement des systèmes de santé publique, élevages intensifs…• Tuberculose multiR, MERS-CoV, Grippe aviaire…

Modification de l’environnement : émergence des vecteurs• Dengue, Chikungunya, Ebola…

Modifications des possibilités diagnostiques : progrès scientifiques• Découverte de nouveaux agents pathogènes

Causes et mécanismes de l’émergence

Modification du microorganisme : pression de sélection, mutation,...?• Virus de la grippe, BHRe, C. difficile O27, …

Modification du comportement humain: guerre, camps de réfugiés, urbanisation, effondrement des systèmes de santé publique, élevages intensifs…• Tuberculose multiR, MERS-CoV, Grippe aviaire…

Modification de l’environnement : émergence des vecteurs• Dengue, Chikungunya, Ebola…

Modifications des possibilités diagnostiques : progrès scientifiques• Découverte de nouveaux agents pathogènes

Causes et mécanismes de l’émergence

Modification du microorganisme : pression de sélection, mutation,...?• Virus de la grippe, BHRe, C. difficile O27, …

Modification du comportement humain: guerre, camps de réfugiés, urbanisation, effondrement des systèmes de santé publique, élevages intensifs…• Tuberculose multiR, MERS-CoV, Grippe aviaire…

Modification de l’environnement : émergence des vecteurs• Dengue, Chikungunya, Ebola…

Modifications des possibilités diagnostiques : progrès scientifiques• Découverte de nouveaux agents pathogènes

Problématique de l’hygiénisteImportante évolution des

connaissances• Diminution très importantes des SARM (MAIS

indicateurs Bactériémies à SARM…)• Augmentation des EBLSE• BHRe: Infos rapatriement ? Notion de voyage ?• BMR et infections communautaires• Epidémies et EHPAD

Problématique économique• Isolement = coût financier pour la structure• Difficulté d’obtenir du personnel dédié

Prévention des épidémies/préventions• SHA• Précautions standards, Précautions

complémentaires• Dépistage, Isolement

Nicolas‐Chanoine MH et al., CMR 2014

Problématique de l’infectiologue

Bon usage des antibiotiques• Réduire la consommation des

ATB toujours aussi importante

• Limiter l’usage des ATB à large spectre

Pas de nouvelles solutions antibiotiques

Alternatives ?

Données ANSM 2014

Butler MS et al., J Antibiot, 2013

Problématique du microbiologiste

Identif.: Mini 48hRésistance: Mini. 48h

JUSQU’À

Tissus mous: 7 jOs: culture 14 jBK: pls semaines

Conditions analytiques souvent longues…

Exemple du dépistage des BMR-BHRe

Milieux chromogènes:

Les difficultés: Diagnostic long: 24-48h miniMaintien de l’isolement du patientPatients à dépister ? Traçabilité des personnes contact changeant d’établissement, revenant du domicile, notion de voyage etcDépistage pendant 3 semaines

HCASE/BLSEVRE

EPC

Vrioni et al., J Clin Microbiol 2012; Malhotra-Kumar et al., J Clin Microbiol 2010; Ledeboer et al., J Clin Microbiol 2007; Réglier-Poupet et al., J Med Microbiol 2008; Moran et al., Diagn Microbiol Infect Dis 2011

SARM

ABRI

Comment améliorer la rapidité du diagnostic?

DIAGNOSTIC CLASSIQUE : Bactérie: mini. 48h jusqu’à 14jRésistance: mini. 48h

BIOLOGIE MOLECULAIREDiag en qq h

SPECTROMETRIE DE MASSEDiag en qq min

TESTS DE DIAGNOSTIC RAPIDEDiag en qq min

Biologie moléculaire: Intérêts

Rapidité

Bactéries non cultivables

Bactéries de culture lente et/ou difficile

Spécificité

Faible charge bactérienne

Traitement ATB déjà en place

Nouvelles technologies de BM

Diagnostiqueo Directement à partir du prélèvemento A partir de la culture (identification, confirmation…)

Aide à l’antibiothérapiePoint of Care

Plateformes BMMultiplexage

Réalisation rapide et facile

Personnel non spécialisé

Point of Care: Système de PCR rapide

*DIAGNOSTIC BMR-BHRe en 1h : - SARM hémoculture, nasal, SSTI- EPC- VRE (vanA)

*Autres diagnostics rapides d’épidémie: -Mycobacterium tuberculosis et résistance-Clostridium difficile et souche O27-Méningite à Entérovirus-Grippe H1N1

30 min à 2h

Multiplexage

Détection en 1 tube ou en 1 programme d’amplification de plusieurs cibles bactériennes et/ou virales et/ou

parasitaires

Problèmes à résoudre:

Eviter les compétitions, être aussi sensible en faisant plusieurs amplifications en même temps qu’en faisant une seule

Etre spécifique

Etre flexible: possibilité d’ajouter ou de remplacer des cibles (bactéries ou virus émergents, dérive génétique, bact. ou virus nouvellement identifié(e))

Etre rapide: rendus de résultats définitifs en 24-48h

Etre convivial: protocole technique et expression des résultats

Coût (30 à 150 €)

Approche syndromique

RespiFinder®, Eurogentec - Pathofinder

3 kits: *RespiFinder® 22:16 virus ARN, 2 virus ADN, 4 bactéries(Chlamydia, Mycoplasma, B. pertussis, Legionella)*RespiFinder® 19: 14 virus ARN, 1virus ADN, 4 bactéries*RespiFinder® 15: 14 virus ARN, 1 virus ADN

Reijans M et al., J Clin Microbiol 2008

4h de travail4h de travail

A VENIR: GASTROFINDER®…

Technologie Luminex

Wessels E et al., Clin Microbiol 2014 Popowitch EB et al., J Clin Microbiol 2013

5h

Staphytype96® (Alere SA- Clondiag)

Lyse-ExtractionAmplification

linéaire

Marquage Hybridation sur puce

Révélation – Analyse

Analyse des souches par biopuce à ADN

IdentificationGénotypageRésistance aux TTT

Sotto A et al., Diabetes Care 2012

Diagnostic d’infections difficiles par biopuces à ADN

Diagnostic classique : Endocardites: 3 – 21 j Ostéites: 14 jPneumopathies: 3-5 j

Diagnostic par Biopuce à ADN :Endocardites: 4 hOstéites: 3,5 hPneumopathies : 4 h

Panels: GastroIntestinal

RespiratoireMéningitesBactériémies

Nouvel outil pour approche syndromique

1h

Identification Bactéries + Virus + ParasitesPrincipales Résistances aux ATB

Comment améliorer la rapidité du diagnostic?

DIAGNOSTIC CLASSIQUE : Bactérie: mini. 48h jusqu’à 14jRésistance: mini. 48h

BIOLOGIE MOLECULAIREDiag en qq h

SPECTROMETRIE DE MASSEDiag en qq min

TESTS DE DIAGNOSTIC RAPIDEDiag en qq min

TDR: Intérêts

Rapidité: quelques minutes

Fiabilité: sensibilité, spécificité

Robustesse: facilité de transport et d’installation , conservation des réactifs à Treambiante

Simplicité: équipements légers, technicité réduite

Faible coût

TDR et infections pulmonaires

Méthode immunologique (ELISA): immunochromatographie

Détection des AG spécifiques des agents pathogènes

20-30 min

20-30 min

*Urines: S. pneumoniae (Antigène C-polysaccharidique)

*Prélèvements nasopharyngés (‘endonasal’, aspiration):Grippe (Antigène à activité intrinsèque agglutinante ou

à activité enzymatique de surface)VRS (Antigène de surface)

Grippe/VRS: Très spécifique (>90%) – Sensibilité faibleConfirme le diagnostic (mais ne l’écarte pas): outil de dépistage et non de diagnosticInutile si symptômes > 3jDétection plus facile du virus influenza AIndications: En période de circulation du virus

Pneumocoque:Sensibilité: 60-80% et >90% si bactériémie - Spécificité: 80-100%Test + plusieurs mois après une infection (Andreo et al, Respir Med 2010:397-403)Pas d’effet de l’antibiothérapie (Porcel et al., Chest 2007:1442-7)

Tests actuels sur Liq pleural (Casado Flores et al, Eur J Pediatr 2010), Liq Péricardique (Nakagawa et al, Intern Med 2010), Nez (Vuorenoja et al, Eur J Clin Microb Infect Dis 2012)

Problèmes de LectureLecture pas toujours aisée Lecteur Automatique

Chartrand C et al., Ann Intern Med, 2012; 156: 500-511. Dominguez J et al., Chest, 2001; 119: 243-249. Smith et al., J Clin Microbiol 2003

TDR et infections pulmonaires

Selles: RotaVirus – AdénoVirus – NorovirusToxines A et B - GDH C. difficile

Performances:

*Tests Rota-Adéno-Noro ont surtout une très bonne spécificité

*Méthode de screening de C. difficile: Test de la GDHspécificité excellentVPN >95%

*Mise en évidence des toxines: EIA toxines A et B (sensibilité 50-80%, spécificité 98%)

TDR et infections digestives

Exemples de Schéma décisionnel pour C. difficile

GDH

+-

Absence d’ICD

Méth. Molécul.

+-

Absence d’ICD

ICD

EIA A/B

GDH

+-

Absence d’ICD

+-

ICDMéth. Molécul.

+-

Absence d’ICD

ICD

< 1 h

Test de diagnostic rapide des EPC

Pantel A et al., JCM 2015

Rapid CARB Screen®

Sensibilité 97,6%, Spécificité 94,4%

Nordmann et al., EID 2012Rapidec CARBA NP®

Poirel L et al., JCM 2015

Sensibilité 96%, Spécificité 96%

< 2 h

Comment améliorer la rapidité du diagnostic?

DIAGNOSTIC CLASSIQUE : Bactérie: mini. 48h jusqu’à 14jRésistance: mini. 48h

BIOLOGIE MOLECULAIREDiag en qq h

SPECTROMETRIE DE MASSEDiag en qq min

TESTS DE DIAGNOSTIC RAPIDEDiag en qq min

Diagnostic plus précoce

Profil protéique des bactéries

Diagnostic par Spectrométrie de Masse :Bactérie (à partir d’une colonie): 2 min

Utilisation en routine Utilisation en Recherche

Autres utilisations de la spectrométrie

Détection de la Résistanceo Détection des SARM: notion de spectre uniqueo Détection des BLSE: via activité enzymatiqueo Détection des carbapénémases: via activité enzymatique

Identification bactérienne à partir du prélèvemento Sang (hémocultures)o Urines

PCR 16S rDNA, 23S rDNA, rpoB, van A, vanB, blaKPC, mecA etcHrabak et al., CMR, 2013

Impact des techniques rapides: diminution des durées de traitement

Impact des techniques rapides: amélioration des prises en charges

Impact des techniques rapides: aide pour l’EOH

Eradication de réservoirs environnementaux

Pantel A et al., AJIC 2015

Patient 1, Room 27, June 2012

Patient 2, Room 27, July 2013

Patient 3, Room 27, November 2013

Sink, Room 27, February 2014 

Patient 4, Room 27, February 2014

Mattress, Room 27, February 2014

Patient 5, Room 28, February 2014

Unrelated strain (main clone in the region)

Impact des techniques rapides: aide pour l’EOH

Rôle des Centres Experts régionaux ++++*Détection des BMR, BHRe,*Détection des épidémies

ARS 244

ARS 247

ARS 252

ARS 298

ARS 258

ARS 261

ARS 284

ARS 260

ARS 265

ARS 271

ARS 19

ARS 21

ARS 20

ARS 160

ARS 232

ARS 53

ARS 155

ARS 157

ARS 246

ARS 250

ARS 242

Pantel A et al., EJCMID 2014

ST101

ST17

ST15

ST15

ST405

ST395

ST472

ST32

ST472

ST473

ST350

ST66

ST88

ST132

K. pneumoniae OXA‐48 E. coli OXA‐48

Conclusion

Révolution bactériologique

Biologie Moléculaire vs/avec Spectrométrie de Masse vs/avec TDR

Point crucial = LE TEMPS…

Modification des habitudes +++

Avenir: séquençage haut débit

Vers une médecine personnalisée ???