PLATAFORMA DE CITOMETRIA DE FLUXO

NÚCLEO DE ANÁLISE E SORTING INSTITUTO OSWALDO CRUZ – FIOCRUZ

APOSTILA DE INSTRUÇÕES PARA AQUISIÇÃO DE AMOSTRAS EM CITÔMETRO DE FLUXO

FACSCALIBUR

Elaborado por

ÁLVARO LUIZ BERTHO Raquel Ferraz

Amanda Torrentes

© agosto de 2012

AQUISIÇÃO DE AMOSTRAS Nota: Ligar sempre o citômetro antes do computador. A página inicial do Macintosh abrirá, exibindo ícones e os menus no topo da página; Clicar na “maçã” no canto superior esquerdo; Selecionar o programa Cell Quest; abrirá a página inicial do programa com todos os menus para o Setting (Fig. 1); clicar em Acquire (seta vermelha) (Fig. 1); Figura 1

Figura 1

e em seguida em Connect to Cytomete” (seta) (fig. 2).

Figura 2 Ao conectar o computador ao citômetro aparecerá o menu de aquisição Acquisition Contro” (Fig.3);

Figura 3 Neste menu, você pode Iniciar a aquisição (Acquire); Reiniciar a aquisição (Restart); Salvar a aquisição (Save); ou Abortar a Aquisição (Abort). Nota: Para aquisições ininterruptas mantenha o item Setup acionado (seta vermelha, Fig. 3) Para definir a quantidade de eventos a serem adquiridos, parâmetros e as resoluções de aquisição, clicar em Acquire (Fig. 1 - seta) mais uma vez; clicar em Acquisition and Storage (Fig. 2); aparecerá o menu exibido na Fig. 4.

Figura 4 Neste menu se podem escolher os critérios para salvar e exibir os eventos da amostra. Em Acquisition Gate (Fig. 4) se definem quais eventos serão salvos, desta forma, na própria aquisição se determina se serão aceitos ou rejeitados eventos que componham uma determinada população. Estes eventos podem compor uma população no dot plot de morfologia ou mesmo uma população fenotipada, por exemplo rejeitar as células CD4+. Desta forma, no arquivo haverá todos os eventos, exceto as CD4+. Em geral deixa-se este item como mostrado na figura, pois é melhor ter todas as populações celulares no arquivo adquirido e excluí-las apenas na análise. No item Collection Criteria se define apenas que a aquisição será encerrada quando o número de eventos determinado pelo usuário for alcançado, seja de eventos totais ou de eventos de uma região. Em Storage Gate os eventos que passam no Gate de aquisição (Acquisition Gate) e no Storage Gate serão salvos no arquivo. É aconselhável deixar também como exibido no menu default. No item Resolution se deve selecionar o valor 256. Em Parameters Saved se determinam quais parâmetros serão salvos, como mostrado na Fig. 5. Nota: Devem ser selecionados sempre FSC, SSC (morfologia) e as cores das fluorescências usadas no experimento que está sendo adquirido.

Figura 5 Clicar mais uma vez em Acquire (Fig. 1) e em seguida em Parameter Description (Fig. 2); O Menu exibido na Fig. 6 aparecerá, onde se determinam o nome e o destino dos arquivos a serem salvos; Para selecionar a pasta onde os arquivos serão salvos deve-se clicar em Folder e em seguida na pasta desejada, se a lista de pastas não aparecer clique em Desktop à direita e em seguida na pasta. Após selecionar a pasta na lista clique no botão longo abaixo da lista Select XXX. Em seguida clique em File, aparecerá o Menu exibido na Fig. 7, onde deve-se escolher o nome dos arquivos em Custom Prefix. Nota: Não esqueça de anotar o nome do arquivo no seu caderno de protocolos para saber as marcações de cada “file” para análise.

Figura 6

No mesmo Menu, se escolhe em File Name Prefix (Fig. 7 seta) a opção Sample ID. Em File Name Suffix manter como na Figura 7 em File Count. Se for mantida esta configuração, todos os arquivos terão o mesmo nome e serão numerados em ordem crescente a partir do número 1, automaticamente.

gura 6 Figura 7

Ainda no Menu Parameter Description (Fig. 6) se repete no item Sample ID o nome dado aos arquivos (Fig 7 - Custom Prefix) e se coloca o nome dos eixos dos gráficos gerados. Por exemplo: P1-FSC; P2-SSC; P3-FL1; P4-FL2; P5-FL3. Pode-se ainda escolher outros nomes para os eixos, como por exemplo, as moléculas reconhecidas pelos anticorpos: antiCD3-FITC, não se colocaria FL1 como nome do eixo P1, mas sim CD3. A desvantagem em experimentos grandes é que nem sempre o FITC está conjugado só ao CD3. Geralmente há outros anticorpos conjugados ao mesmo fluorocromo e é melhor simplesmente colocar a fluorescência mesmo (FITC) e na análise alterar o eixo de cada gráfico para o anticorpo pertinente. O Menu da Fig. 6 não tem OK, deve-se fechá-lo no quadrado superior esquerdo. De volta ao Menu principal exibido na Fig. 1, clicar em Cytometer e em seguida em Detectors/Amps (Fig. 8, seta). Figura 8 O Menu exibido na Fig. 9 aparecerá e é onde fazemos o ajuste dos Ganhos (Amp Gain) e Voltagens (Voltage) nos PMTs. Nota: É importante que estes ajustes sejam feitos corretamente durante a aquisição já que não poderão ser alterados na análise off-line.

Figura 9

Nota: Perda de populações na aquisição O padrão morfológico ideal ajustado deve conter todos os eventos de interesse, pois eventos excluídos nesta etapa não serão salvos e, logo, não serão analisados quanto à fluorescência. Notar que em C os linfócitos foram perdidos e isso não deve acontecer. Em D é mostrado o perfil ideal de aquisição da população, sem excesso de debris ou perda de populações celulares. Nota: Definindo a região de debris e células vivas Ao passar no citômetro amostras com padrão morfológico desconhecido, que não se sabe ao certo qual é a região de debris e as regiões de células viáveis, deve-se fazer marcação com iodeto de propídio (PI) (10-50 ug/ml - PI, altamente tóxico). Os debris marcarão principalmente em vermelho (FL3) e as células viáveis serão PI negativas por manterem a integridade de membrana.

Nota: Excluindo os debris na aquisição Após definir a população de debris, há duas formas de excluí-los: a) baixar a voltagem de FSC até que a população de debris seja excluída do dot plot de morfologia e, consequentemente, haja pouca marcação de debris com PI no histograma em FL3 ou; b) aumentar o Threshold de FSC até que a população de debris deixe de ser visualizada no dot plot e no histograma de FL3. O Threshold deve ser acessado clicando em Cytometer (Fig. 1) e em seguida no item Threshold (Fig. 8). O default de cada um dos itens é o valor de 52, deve-se ajustar o para valor desejado como indicado acima.

Exemplo: Em A a voltagem de FL1 está muito baixa e em B muito alta.

Em C a voltagem está ideal e será mais fácil fazer a compensação em uma

etapa posterior. O Default do item Mode aparece em linear para todos os parâmetros e ao adquirir amostras de células de mamíferos o Mode de FSC e SSC deve ser mantido em linear. As fluorescências, no entanto, devem ser alteradas para Log, exceto em

A B C

análises de DNA. Neste Menu ainda se pode ligar o segundo laser do citômetro em Four Color (635 nm – HeNe – laser vermelho) se houver anticorpos conjugados a fluorocromos excitados neste compimento de onda. Se forem usados protocolos de duas, três e quatro cores, deve-se abrir o Menu de compensação (Fig. 10); Clicar em Cytometer (Fig. 1), aparecerá o Menu da Fig. 8; Clicar em Compensation (Fig. 10).

Figura 10 Exemplo: Em A e D se observa sinal em FL-1, apesar de haver apenas marcação com PE, o que significa que há vazamento da fluorescência laranja

A B C

D E F

para o canal do verde. Este vazamento deve ser compensado aumentando o valor da subtração FL1 – FL2. Se este valor for muito alto, haverá hipercompensação (overcompensation), como mostrado em B e E. O perfil correto de ajuste de FL1 é mostrado em C e F.

A compensação é feita no Menu Compensation (Fig. 10): Nota: Para facilitar a escolha dos parâmetros a serem compensados na aquisição, vamos nomear a coluna da esquerda como “canal que recebe a interferência de cor” e a coluna da extrema direita “cor que está interferindo” (Fig. 11).

Figura 11

Desta forma, se colocarmos um tubo apenas com FITC e o dot plot estiver como ilustrado abaixo, devemos proceder da seguinte forma: canal que recebe o vazamento, no caso FL2 (pois só tem FITC, que fluoresce em FL1) menos a cor que está vazando, que só pode ser FITC (FL-1). O parâmetro a ser alterado é o FL2 - X.X% FL1. O número a ser colocado em X.X deve deixar a população falsa duplo positiva como simples positiva para FL1. Nota: Se as amostras forem muito heterogêneas, p. ex. células de indivíduos normais e infectados, deve-se fazer um ajuste do citômetro que enquadre corretamente a morfologia e marcação de todas as amostras. Entretanto, se esta condição ideal não for possível, pode-se fazer o ajuste das amostras normais (experimentais e controles) e salvar os arquivos. Em seguida, fazer o ajuste para infectados e salvar. Na análise não se pode juntar (fazer overlay (sobreposição) nos histogramas) de arquivos de normais e infectados, mas as estatísticas de cada grupo (normal ou infectado) será válida uma vez que os controles obedecem ao mesmo ajuste do grupo. É melhor fazer desta forma do que fazer um ajuste único para ambos grupos e não ter um “setting” ideal para nenhum deles.

cor que está interferindo

canal recebe a interf.

FL1-Height

Figura 12

Voltar ao Menu principal (Fig. 1) e selecionar o item Plots; escolher o item dot plot, aparecerá o Menu exibido na Fig. 12. Em Plot Source selecionar o item Acquisition e em seguida aparecerão as opções nos itens X parameter e Y parameter que foram selecionadas no menu Parameters Save” na Fig. 5. Escolher os eixos desejados, p. ex. FSC x SSC, FSC x FL3, FL1 x FL2, etc... Normalmente o primeiro dot plot é o de morfologia (FSC x SSC). Você pode optar por exibir no dot plo” todos os eventos como mostrado na Fig.12 -

, ou apenas os eventos que lhe interessarem em uma região. É só fazer uma região e escolher no item Gate a região definida. Mesmo que você tenha selecionado no item Acquisition & Storage (Fig. 4) para salvar 10.000 eventos totais. Nesta configuração todos os eventos estarão sendo salvos, como você determinou, mesmo que nesse dot plot só apareçam os eventos na região que você escolheu visualizar na Fig. 12. Repetir este processo para cada dot plot que desejar abrir. Por exemplo, se você fez marcação com FITC, PE e Cychrome deve abrir os dot plots FL-1xFL-2, FL1 x FL-3 e FL-2 x FL-3, além do dot plot de morfologia. Para abrir os histogramas retorne ao Menu principal exibido na Fig. 1 e clique de novo em Plots, selecione agora histogram. Aparecerá uma janela semelhante à mostrada na fig. 11 com as mesmas instruções para abrir os histogramas. No caso do exemplo da marcação acima se devem abrir três histogramas, de FL-1, FL-2 e FL-3.

Neste ponto já é possível colocar as primeiras amostras para ajustar o aparelho, sempre com o item setup exibido na Fig. 3 selecionado. Desta forma nenhum arquivo será salvo durante o processo de ajuste. Quando o ajuste do citômetro estiver satisfatório em termos de morfologia, voltagens e sem vazamentos, deve-se clicar no item setup (Fig. 3). O menu exibido na Fig. 13 aparecerá e é só clicar em Acquire para que o aparelho faça a aquisição dos eventos determinados pelo usuário. A aquisição irá parar quando o número de eventos pré-determinado for alcançado e o próximo arquivo mudará automaticamente para o próximo número em ordem crescente.

Figura 12