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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERtVAlVIBUCO

Centro de Cincias Biolgicas

Departamento de Biofsica e Radiobiologia

PRTICA DE FOTOCOLORIMETRIA

Prof. Milton Marcelino Filho

Recife, 2004

SUMRIO

1 - rf,rTRO])UO , 2

2 - FIJNDA"l\1ENTOS TERICOS ..................................................................................................... 2

3 - O EQUIPAMENTO 2

3. 1 - FOTOCOLORMETRO , 2

3.1.1-FontedeLuz 2

3.1.2 - Filtro 2

3.1.3 - Cubeta 2

3.1.4 - Fotoclula : : ~ ~ 2

3.1.5 - Miliampermetro " ?3.2 - ESPECTROFOTMETRO : 2

4 - Ul~rr.,IZA..O DO FOTOCOLORlVIETRO , 2

4.1 - ASPECTO EXTERNO DO FOTOCOLORMETRO 2

4.2 - RELAO MATEMTICA ENTRE ABSORBNCIA E TRANSMIT.NCIA 2

4.3 - CJ>JJBRAAO DO APARELHO : 2

5 --PltOCE][)IMENTO PRTICO 2

5.1 - PREPARAO DAS SOLUES 2

5.2 - CONSTRUO DO ESPECTRO DE ABSORO : 2

5.3 - CONSTRUO DA.CUR VA PADRO 2

5.4 - UTILIZAO DA. CURVA PADRo 2

6 - ClllDADOS A SEREM OBSERVADOS DURANTE OS EXPERIMENTOS 2

7 - DI:sCUSS.~O ~.............................................................................................................. , 2

8 - B1JBLIOGRAFIA ........................................... ,............................................................................... 2

II1

A fotocolorimetria um mtodo biofisico dJ anlise de substncias largamente utilizado emlaboratrios de anlises clnicas e em laboratrior de pesquisa, tendo como principal objetivo adeterminao da concentrao de solues.

Este mtodo baseia-se na relao existente entre a absoro de radiaes elet.romagnticas(luz) e a concentrao da substncia em questo. Sabemos, atravs da nossa experincia cotidiana,que quanto mais concentrada urna soluo mais escura ela se apresenta, ou seja, maior a quantidadede luz absorvida pela soluo.

1 - INTRODUO

2 - FUNDAMENTOS TERICOS

2

Estudos experimentais realizados por Lambert e Beer demonstraram que existe uma relaodireta E) exponencia! entre a concentrao de uma soluo e a luz por ela absorvida, ou seja, tomando-se dois recipientes iguais, transparentes, contendo a mesma substncia em soluo, porm comconcentraes diferentes (C1 e C2), sendo C2 > C1, observa-se que a intensidade deluz emergente dorecipiente 2 (12) menor do que a intensidade de luz que emerge do recipiente 1 O;).

d, = d,e

C, > c,

10 = intensidade de luz incidenteh e 12 = intensidade de luz emergenteC, e C2 = concentrao da soluodi e d2 = percurso ptico

Fig. 1: Absoro de luz em funo da concentrao da soluo.

Lambert e Beer, tambm demonstraram que dados dois recipientes transparentes contendo amesma soluo em concentraes iguais (C3 = C4), sendo o recipiente 4 maior que o recipiente 3, aintensiclade de luz emergente do recipiente 4 (14) ser menor que a intensidade de luz que emerge dorecipiente 3 (b). Assim, a luz.emergente depende tambm do percurso ptico, ou seja, distnciapercorrida pela luz atravs da soluo.

c, = C.e

d, > o,

',< "10 = intensidade de luz incidente13 e, 14 = intensidade de luz emergenteC3 e C4 = concentrao da soluod3 e d, = percurso ptico

Fig. 2: Absoro de luz em funo do percurso ptico.

3A partir dos experimentos descritos, os 'pesquisadores chegaram seguinte equao, conhecidacomo Lei de Larnbert-Beer:

(eq. 1)

Esta equao relaciona a luz emergente de uma soluo (I) com a intensidade luminosaincidente (Is), a sua concentrao (C), o percursoptco (d) e uma constante ele absoro (k), que caracterstica de cada substncia.

3 - O EQUIPAMIENTO

3.1 - FOTOCOLORMETRO

l ..

A figura 3 apresenta um diagrama em blocos de .um fotocolormetro. Em seguida so descritosdetalhadarnente os seus diversos componentes.

IIIL

J'1. ,< I

Luz branca(policromtica)

~

r==)

Luz rnonocrorntica

1Fotoclula

I~

Fontede luz

Filtros Cubeta

Fig. 3: Diagrama em blocos de um fotocolormetro.

3.1.1 - Fonte de Luz

A fonte de luz deve apresentar como principais caractersticas a estabilidade na intensidadeemitida e um espectro de emisso adequado.

utilizada uma lmpada de filamento de tungstnio alimentada por uma tenso proveniente deum circuito regulador de voltagem. Este circuito fornece uma voltagem constante independentementede variaes na tenso de alimentao do equipamento (oscilaes na rede de distribuio de energiaeltrica) e independentemente da temperatura ambiente. A utilizao deste circuito necessria pois alurninosidade emitida pelas lmpadas de filamento depende da tenso a que elas esto submetidas.

Em relao ao espectro de emisso necessrio que a lmpada emita luz branca, ou seja,todos os comprimentos de onda do espectro de luz visvel, figura 4.

43.1.2 - Filtro

Atravs de filtros pticos possvel retirar (separar) desta luz branca as diferentes cores (luzmonocromtica) que a constituem. Sendo que cada cor corresponde a uma faixa de comprimento deonda () do espectro de radiaes eletrornaqnticas.

A banda passante tpica de um filtro de vidro de 50 nm, o que significa dizer que no possvel selecionar faixas do espectro da luz visvel com largura inferior a 50 nm.

Luz visvel

Raios y

Q)

s "E1i! ~

Raios X UV IV Microondas Ondas de rdioI ~-1====~~==~i-~~;:~~~~~~~~~1 pm 1 nm 400 nm 750 nm 25 11m 1 mm A

Fig. 4: Espectro de radiao eletromagntica em ordem crescente de seus comprimentos de onda(), pm = 10-12 m, nm = 10-9 m; ~m = 10-6 m; mm = 10-3 m. ;.....

o espectro de radiao eletromagntica inclui os raios gama, os raios x, o ultravioleta, a Iuzvisvel, o infravermelho, as microondas e as ondas de rdio. Esses nomes indicam reas do espectro,divididas com fins didticos e prticos, entretanto o espectro contnuo e no h diferenas marcantesentre as diversas regies. Exceto pelas diferenas nos comprimentos de ondas, que esto associadas adiferentes nveis de energia da radiao, conforme equao 2.

Eh .c

(eq.2)

Onde E a energia da onda eletromagntica, h a constante de Plank, C a velocidade da luze o comprimento de onda da radiao.

Estes diferentes nveis de energia acarretam diferentes caractersticas, como o poder depenetrao dos raios X ou o aquecimento do infravermelho. No mais apresentam propriedades que Ihesso comuns como, por exemplo, propagao pelo espao com a mesma velocidade (300 mil km/s),conhecida como "velocidade da luz", sofrem reflexo, refrao, difrao e interferncia.

3.1.3 - Cubeta

O recipiente onde se coloca a soluo a ser analisada, chama-se "cubeta". No caso dofotocoiorimetro utilizado na aula prtica a cubeta de medio tem a forma de um tubo de ensaio, tendoas cirnenss.s compatveis com o porta-cubetas (receptculo que aloja a cubeta) e confeccionada comum vidro especial.

Como a luz que se transmite atravs da cubeta no uniformemente absorvida, ou seja, o vidrono perfeitamente homogneo, o fabricante marca a cubeta com um risco na parte superior da cubetacom o objetivo de padronizar a luz absorvida pelo vidro da cubeta e eliminar possveis variaes das

5leituras de amostras, colocadas em diferentes cubetas. Este risco existente na cubeta deve coincidircom a marca no porta-cubetas.

Fig. 5: Cubeta e porta-cubetas ressaltando a posio de colocao.

A forma e as dimenses da cubeta variam com a marca e o modelo do equipamento, podendoser quadradas, retangulares ou cilndricas. Alm do vidro tambm utilizam-se cubetas descartveis depolistireno e acrlico. Cubetas de quartzo so utilizadas nos espectrofotrnetros (descrito no sub-itern3.2, pg. 5), que operam na regio do ultravioleta. A figura 6 mostra alguns exemplos de cubetas ..

r-.

I ibJ ~,Jt4l ~__j~___~_ ~-~~-i,-L--l_4_)__ ~

Fig. 6: Diferentes tipos de cubetas.

3.1.4 - Fotoclula

A fotoclula (ou clula fotoeltrica) um dispositivo opto-eletrnico que tem a propriedade deconverter luz em corrente eltrica. Fotoclula um termo genrico que inclui diferentes. tipos decomponentes como o fotoresistor, fotodiodo, clula fotovoitica etc., cada um deles baseado em um .princpio fsico diferente.

As fotoclulas so dispositivos largamente utilizados em diferentes situaes do nosso cotidiano;como exemplos podemos citar: abertura de portas automticas, acendimento automtico de iluminaoao escurecer, controle remoto de aparelhos de TV/vdeo/ar condicionado, foco de mquinasIotcqrflcas, etc. .

3.1.5 - Miliampermetro

o dispositivo que mede a corrente eltrica gerada pela fotoclula. O elemento principal destedispositivo um galvanmetro, o qual basicamente constitudo de um m permanente em forma deferradura e de uma bobina enrolada em torno de um ncleo cilndrico de ferro, chamada de bobinamvel (figura 7). A bobiba mvel est localizada entre os plos do m e fixada axialmente, podendoportanto, girar em torno de seu eixo.

6A corrente eltrica a ser medida ( I )passa atravs da bobina criando um campo magntico, quese ope ao campo magntico do m, fazendo-a girar at uma determinada posio, a qual

proporcional intensidade da corrente que circula pela bobina mvel.Desta forma a intensidade da luz que se transmitiu pela soluo, contida na cubeta de medio,

quantificada em uma escala construda no painel do miliampermetro.A corrente eltrica gerada pela fotoclula tambm pode ser medida por ampermetros digitais.

Neste caso, os valores so apresentados por nmeros (dgitos) em um mostrador digital, difer~ntemente

do sistema escala/ponteiro do medidor analgico descrito.

ESCALA GRADUADA

IM PERMANENTE PONTEIRO

BOBiNA MVEL

I~

. Fig. 7: Galvanmetro do tipo bobina mvel.

3.2 - ESPECTROFOTMETRO

Os espectrofotmetros so equipamentos semelhantes aos fotocolormetros, que utilizam almdas radiaes eletromagnticas na regio da luz visvel, radiaes na regio do infravermelho (IV) e doultravioleta (UV). No espectrototmetro a separao dos diferentes comprimentos de onda realizadapor urn dispositivo ptico chamado de grade de difrao, o qual permite a seleode faixas bastanteestreitas do espectro de radiaes eletromagnticas (1nrn, 2nm ou 5nm) e neste caso ao invs de seincidir, por exemplo, um feixe de luz azul atravs de uma soluo, se utilizar uma das tonalidades doazul.

A grade de difrao construda inscrevendo-se um grande nmero de linhas paralelas, muitoprximas umas das outras (500 linhas/mm), na superfcie de uma placa de vidro. A separao dosdiferentes comprimentos de onda na grade de difrao baseia-se no princpio de que raios de luzcurvam-se em torno de cantos agudos, sendo o grau de curvatura funo do comprimento de onda.Assim, em cada linha inscrita no vidro ocorre a refrao da luz e a gerao de um espectro, havendoum fenmeno de canceiamento e somao ao longo do vidro, figura 8.

Um anteparo com uma fenda, que se desloca em frente grade, utilizado para separar a faixade comprimento de onda desejada. Com as grades de difrao possvel separar faixas do espectrocom larquras de at 0,5 nm e a sua faixa de operao vai de 200 a 1000 nm, incluindo portanto, aregio do ultravioleta e do infravermelho.

7~~~ .Fenda->-\1'- ---4- .Fo~e '--,de luz

Espelhocncavo

Feixem onocrom tico

o espectrofotmetro alm de ser utilizado para determinao da concentrao de solues,tambm utilizado para identificao de substncias em soluo e para determinao do seu grau depureza. Arribas aplicaes baseadas no Espectro de Absoro da substncia, grfico que mostra comoa refenida substncia absorve cada um dos comprimentos de onda. A figura 9 apresenta trs exemplos;,deste orfico.

OXIHEMOGLOBINA DESOXIHEMOGLOBINA AZUL DE METILENO

. Fig. 8: Grade de difrao.

ca

'"c:'caeotn.c

. 11 .

IL-+--+- ~o oo o'" '"Comprimento de Onda

8....

'"'"cca-eoC/J.o

BOT()ES DE CALlBRAO: o aparelho possui trs botes de calibrao em seu painel. Soeles: aiuste de 100% grosso, 100% fino e ajuste do 0%.

MOSTRADOR DE LE!TURA: duas grandezas podem ser medidas no totocolormetro:Transrnitncia (T%) e Absorbncia (A).

A transmitncia expressa a quantidade de luz que se transmite atravs de uma soluo e definida matematicamente como sendo a relao percentual entre o feixe de luz emergente (1) e o feixede luz incidente (10):

8

PORTA - CUBETAS

+ SELETOR DE FILTROI T%. ~~ ~o 2 A ~ 100100 % 0%.-..

410 nm8 480 nmo 520 nmo 580 nmo 660 nm

o

grosso fino

Fig. 10: Painel frontal do fotocolormetro.

I.,

T% = i.100%10 (eq. 3)

A absorbncia expressa a capacidade que tem uma soluo de absorver uma certa quantidadede enarqia do feixe de luz incidente e definida matematicamente como o logaritmo da relao entre ofeixe de luz incidente (10) e o feixe de luz emergente (1):

A10

log -1 (eq.4)

Baseado nas definies matemticas constatamos que a Transmitncia uma grandeza linear evaria ele O %, a 100 %. O que significa dizer que 50% est localizado no meio da escala e que sedividirmos a escala em dez partes iguais cada uma delas representar 10%, conforme figura 11.

T%

Fig. 11: Mostrador de leituras do fotocolormetro, ressaltando a correspondnciaentre os valores de transmitncia e de absorbncia.

9J a escala de Absorbncia logartmica e varia de O (zero) a 00 (infinito), segundo os valores dafuno logaritmo. A representao do intervalo O a 2 corresponde praticamente a toda a escala. O quesignifica que valores acima de 2 no p.odem ser lidos com a acurcia desejvel. Deve-se darpreferncia s medies realizadas no intervalo de O a 1, assim, quando a soluo a ser analisadaapresentar uma concentrao, tal que a 'absorbncia corresponda a valores acima de 1, ela deve serdiluda por um fator conhecido, de modo que os valores de absorbncia a serem medidos permaneamno intervalo de medies mais acuradas.

4.2 RELAO MATEMTICA ENTRE ABSORBNCIA E TRANSMITNCIA

Partindo-se das definies matemticas de Absorbncia . e de Transmitncia, aplicando-sepropriedades da funo logaritmo e substituindo-se os valores de uma equao na outra, possvelobter-se o valor de T% a partir de A:

10A - log"- = log l , - log I

I(eq. 5)

T% = ~"10010 (eq. 6)

Aplicando-se a funo log aos dois membros da equao 6, temos:

1 '\log T% = log lIo -100 )

( 1)=logllo +logl00

= logl -loglo + 2

= - (log 10 - log 1) + 2

=-A+2 (eq. 7)2 -logT%ou

Assim, para T% = 100 A=Opara T% = 10 A = 1

para T% = 1 => A = 2

e no limite quando T% tende a O =>

ou seja, uma transmitncia nula corresponde a uma absorbncia infinita.

10

4.3 - CAUBRAO DO APARELHO

o fotocolormetro deve ser calibrado sempre que for ligado, devido a instabilidade doscomponentes pticos e eletrnicos, e durante o uso sempre que o seletor de filtro for acionado, devidos diferenas de absoro de luz apresentadas pelos diferentes filtros.

A calibrao do fotocolormetro se faz nos dois pontos extremos da escala de transmitncia: 0%e 100%. Este ajuste feito atuando-se nos trs Botes de Calibrao, apresentados no sub-item 4. 'I.Apesar dos ajustes se referirem escala de transrrutncia, uma vez calibrado, podem ser realizadastanto medidas de transrnitncia como de absorbncia.

O ajuste do 100% deve ser feito de forma que o fotocolormetro desconsidere a luz absorvidapela cubeta e pelo solvente da soluo, para tal utiliza-se o que ns chamamos de "branco"..O "branco" constitudo por uma cubeta contendo o solvente e tudo o mais presente na soluo, exceto o solutocuja concentrao deseja-se determinar. Em nossa experincia o "branco" ser constitudo por umacubeta contendo gua destilada.

Assim, uma vez ajustado o 100% de transmitncia com o "branco", ao colocarmos a cubetacontendo a soluo a ser analisada, a luz absorvida devida somente ao soluto presente na soluo.

A calibrao de 0% de transmitncia feita retirando-se a cubeta do porta-cubetas e atuando-seno boto de ajuste do 0% at que o ponteiro do galvanmetro coincida com o 0% da escala detransrnitncia. Como dito no sub-item 4.1, ao retirar-se a cubeta nenhuma luz atinge a fotoclula, o quedeve corresponder a 0% de transmitncia.

,....

ROTEIRO PARA CALlBRAO DO FOTOCOLORMETRO:

1) Ligar o equipamento;2) Selecionar o comprimento de onda a ser utilizado;3) Ajustar o 0%;4) Colocar o "branco" no porta-cubetas do fotocolormetro; .5) Atuar no ajuste 100% grosso e em seguida no ajuste 100% fino, de forma que o ponteiro coincida

com a marca de 100% da escala de transmitncia;6) Retirar a cubeta e verificar se o ponteiro retorna para a posio 0%, caso o ponteiro no fique

exatamente sobre o 0%, repetir os passos 3, 4, 5 e 6.

5 - PF~OCEDIMENTO PRTICO

O objetivo desta aula prtica a determinao da concentrao de uma soluo de anilinautilizando o mtodo fotocolorimtrico, para tal devem ser seguidos o? passos abaixo descritos.

5.1 - PREPARAO DAS SOLUES

Cinco solues de anilina vermelha, com diferentes concentraes devem ser preparadas apartir de uma soluo me de concentrao 0,04% (g/100ml).

Sugere-se que seja feita uma diluio seriada com razo dois, seguindo-se o procedimentoabaixo1) Separar cinco tubos de ensaio;2) Colocar 5 ml de gua destilada em cada um dos cinco tubos;3) Colocar 5 ml da soluo de anilina (0,04%) no primeiro tubo obtendo-se uma soluo com volume

final de 10 ml e concentrao 0,02%;

11

4) Retirar 5 ml do primeiro tubo (0,2%) e colocar no segundo;5) Repetir o procedimento 4 para os tubos 2, 3 e 4, no tubo 5 teremos 10ml da soluo com

concentrao de 0,00125%.

Soluome0.04%

5ml

Diluio seriada

Fig. 12: Preparao das solues a partir da soluo me.

0.02% 0.01% 0.005% 0.0025% 0.00125 %

;' ..

Fig. 13: Tubos de ensaio contendo as solues preparadas.

5.2 - CONSTRUO DO ESPECTRO DE ABSORO

Neste item sero obtidos os dados para a construo do grfico Espectro de Absoro(Absorbncia x Comprimento de Onda). Para isso escolhe-se uma das cinco solues de anilina,anteriormente preparadas, e mede-se a absorbncia em cada um dos cinco comprimentos de ondadisponveis no fotocolormetro. Deve-se dar preferncia a uma das trs solues intermedirias, pois asoluo mais diluda e a mais concentrada tendem a apresentar, respectivamente, valores muito baixo emuito elevado na escala de absrbncia.

Levantados os valores, estes devem ser colocados em uma tabela e depois utilizados paraconstruo do grfico, em papel milimetrado, conforme modelo abaixo (figura 14).

A

(nm) A

410

480

520

580

660

Fig. 14: Tabela e grfico para Espectro de Absoro.

12

o objetivo da construo deste grfic a obteno do comprimento de onda correspondenteao fotopico {valor de absorbncia mais elevado do Espectro de Absoro de uma substncia). Estecomprimento de onda deve ser utilizado na obteno dos dados para construo da Curva Padro.

5.3 - CONSTRUO DA CURVA PADRO

Neste item sero obtidos os dados para construo da Curva Padro ou Curva de Calibrao,grfico que relaciona valores de absorbncia com os respectivos valores de concentrao da soluo.Para isso, fixa-se o comprimento de onda que apresentou maior absorbncia no Espectro de Absoro(fotopico) e mede-se as absorbncias das cinco solues preparadas anteriormente. Levantados osvalores, estes devem ser colocados na tabela abaixo e depois serem usados para traar o grfico empapel milirnetrado.

C (g/

0,00,00,00,00,0

100ml) A01250250512 L

cFig. 15: Tabela e grfico para Curva Padro.

A utilizao do fotopico para a construo da Curva Padro proporciona uma maior sensibilidadena determinao de concentraes desconhecidas por este mtodo, como ser explicado na aula dediscusso.

5.4 - UTILIZAO DA CURVA PADRO

o objetivo final desta prtica a determinao da concentrao de uma soluo de anilinavermelha (Cx), utilizando o fotoclormetro e a Curva Padro, construda anteriormente.

Para tal deve-se medir a absorbncia da soluo de concentrao desconhecida (Ax) e ler nogrfico da Curva Padro a concentrao Cx correspondente.

Alm do mtodo grfico, a determinao de concentraes desconhecidas pode tambm serrealizada matematicamente, atravs do Fator de Calibrao, que calculado a partir da Curva Padro(Curva de Calibrao) e corresponde ao inverso do coeficiente angular da reta de calibrao. Nestecaso, mede-se a absorbncia Ax e multiplica-se pelo Fator de Calibrao (F), obtendo-se assim aconcentrao Cx desconhecida, conforme equao 8.

(eq. 8)

13..6 - CUIDJ\DOS A SEREM OBSE~VADOS DURANTE OS EXPERIMENTOS

1) Calibrar o aparelho ao lig-Ia e sempre que for alterado seu filtro;2) Transferir as solues para a cubeta antes de coloc-Ias no fotoclormetro;3) Lembrar de enxugar a cubeta antes de introduzi-Ia no fotocolormetro;4) No encostar nenhum tipo de objeto no mostrador de leituras do instrumento;5) Posicionar-se adequadamente em relao ao mostrador de leituras a fim de evitar o erro .de

paralaxe. Este erro deve-se a um desvio entre o ponteiro e a escala de medio e ocorre sempre queo mostrador de leituras esteja esquerda ou direita do campo de viso do observador. Algunsequipamentos possuem um espelho associado escala de medio para ajudar no corretoposicionarnento do operador. Quando posicionado corretamente o operador no deve ver a imagemdo ponteiro projetada no espelho.

7 - DISCUSSO

Na aula de discusso sero abordados os seguintes tpicos:

1) Construo dos grficos em papel milimetrado.2) Relao linear entre absorbncia e concentrao: A = kCd.3) Efeito da concentrao da soluo no Espectro de Absoro.4) Efeito da utilizao do fotopico na Curva Padro.5) Rewesso linear.6) Obteno do Fator de Caiibrao.

8 - BIBLIOGRAFIA

- Campbell,J.M. e Campbell J.B., Matemtica de Laboratrio, 3a ed., Livraria Roca, So Paulo, 1986.. Carneiro Leo, M.A., Prticas de Biofsica, 2a ed., Editora Guanabara Dois, Rio de Janeiro, 1911,- Hargreaves, A.B., Mtodos Fsicos de Anlises - Fotocolorimetria e pHmetria - Livraria Atheneu, Rio deJaneiro, 1D79.

- Heneine, I.F., Biofsica Bsica, Livraria Atheneu, 1993.- Lehninger, Princpios de Bioqumica, Editora Sarvier, 1995.

Agradecimentos:

Agradecemos a colaborao, na elaborao desta apostila, das monitoras do Departamento deBiofsica e Radiobiologia: Bianca Samson Reis e Silva e Thayse Neves Santos Silva,

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