APOPTOSIS EN TRASPLANTE DE PULMON. Influencia del lavado …

126 Medicina Infantil Vol. XVI N° 2 Junio 2009

TRABAJOSORIGINALES

APOPTOSIS EN TRASPLANTE DE PULMON. Influencia del lavado y la reperfusión del órgano

INTRODUCCIONLa apoptosis es una forma de muerte celular

programada cuya finalidad es la de eliminar cé-lulas del huésped, que ya no son necesarias, a

Dres. M. Boglione, M. Cadario, M. Siminovich, L. Galluzzo, E. Berensztein, D. Haag, C. Castaño, M. Barrenechea, J. C. Vasallo, M. Asprea, G. Williams, A. Fernández, D. Aguilar

Areas de Trasplante de Pulmón y Cirugía Experimental Hospital de Pediatría Juan P. GarrahanCorrespondencia: Mariano Boglione — [email protected] de los Pozos 1881 - Ciudad Autónoma de Buenos AiresHospital de Pediatría Juan P. Garrahan

RESUMENObjetivo: Determinar el rol de la irrigación con soluciones depreservación, la reperfusión y el rechazo en la apoptosis pul-monar en un escenario de trasplante pulmonar. Material y mé-todo: Veinticuatro cerdos Landrace con un peso de 15 a 30kilogramos fueron usados como donantes y receptores en unmodelo de trasplante pulmonar izquierdo con 5 días de so-brevida. Las muestras se obtuvieron en la siguiente secuen-cia: 1A: Donante, pulmón izquierdo, inmediatamente luegode la apertura del tórax. 1B: Donante, pulmón derecho, in-mediatamente luego de la apertura del tórax. 1C: Receptor,pulmón izquierdo, inmediatamente luego de la apertura deltórax. 2A: Donante, pulmón izquierdo, inmediatamente luegode la irrigación del órgano. 2B: Donante, pulmón derecho, sinirrigar. 3A: Pulmón izquierdo implantado, 1 hora luego de re-perfundido en el receptor. 3B: Pulmón derecho (nativo), 1 ho-ra luego de reperfundido el pulmón donante en el receptor. 4A:Pulmón izquierdo, biopsia transbronquial a las 48 horas pos-trasplante. 4B: Pulmón derecho, biopsia transbronquial a las48 horas postrasplante. 5A: Pulmón izquierdo, 5º día postras-plante (sacrificio). 5B: Pulmón derecho, 5º día postrasplante(sacrificio). Todos los pulmones fueron irrigados con soluciónde Euro-Collins fría (4Cº) durante la ablación. Seis recepto-res no recibieron inmunosupresión y otros 6 receptores reci-bieron 15 mg / kg / día de ciclosporina intravenosa. Los ni-veles plasmáticos de ciclosporina fueron dosados en tiempo0 al 2º y al 5º día postrasplante. Cada muestra fue analizadapor un observador ciego para determinar el grado de recha-zo (A0 y A1 negativo, A2, A3 y A4 positivo), proliferación ce-lular, y el índice de apoptosis en neumonocitos I y II emplean-do la técnica de TUNEL y Caspasa. Las pruebas de Chi cua-drado, prueba t de Student y Kruskal Wallis fueron utilizadaspara el análisis estadístico. Se consideró significativo un va-lor de p menor a 0,05. Resultados: El grado de rechazo fuenegativo en todas las muestras excepto en 4A (1 animal) y5A (5 animales sin ciclosporina y 3 animales de los que reci-bieron ciclosporina) (p<0,05). La proliferación celular fue ne-gativa en todas las muestras excepto 4A (1 animal 3%) y 5A(2 animales <1% y otro animal 1%). La media del índice deapoptosis en neumonocitos I y II expresado en porcentaje fueel siguiente: 1A: 4,88 y 10,59 respectivamente; 1B: 4,21 y15,05; 1C: 5,97 y 14,32; 2A: 7,32 y 11; 2B: 5,47 y 9,10; 3A:5,55 y 9,49; 3B: 4,76 y 8,32; 4A: 0,93 y 2,60; 4B: 6,97 y 15,62;5A: 5,49 y 17,83; 5B: 2,13 y 6,89. No se observó diferenciacomparando los animales tratados con y sin ciclosporina:6,30 y 17,45 versus 4,52 y 18,28 respectivamente. Los valo-res séricos de ciclosporina fueron 623 ng (± 513) en el 2º díaposoperatorio y 455 ng (± 179) en el 5º día posoperatorio.Conclusión: Si bien la diferencia estadística no fue significa-tiva, se observó una tendencia que sugiere que la irrigacióncon solución de preservación fría y el rechazo incrementan laapoptosis en el pulmón trasplantado.

Palabras clave: Trasplante de pulmón. Apoptosis. Isquemia.Reperfusión.

Medicina Infantil 2009; XVI: 126 - 133.

ABSTRACTObjective: Aim of this study is determine the role of lung flus-hing, reperfusion and rejection in pulmonary apoptosis. Ma-terial and method: Twenty-four Landrace pigs weighing 15 to30 kilograms were used as donors and recipients in a five dayssurvival left lung transplant model. Lung samples were obtai-ned as follows: 1A: Left lung, donor. Immediately after chestopening. 1B: Right lung, donor. Immediately after chest ope-ning. 1C: Left lung, recipient. Immediately after chest ope-ning. 2A: Left lung, donor. Immediately after lung irrigation. 2B:Right lung, donor. Without irrigation. 3A: Left lung, 1 hour af-ter donor lung reperfusion into the recipient. 3B: Right lung(native), 1 hour after donor lung reperfusion into the recipient.4A: Left lung. Transbronchial biopsy, 48 hours after implanta-tion. 4B: Right lung. Transbronchial biopsy, 48 hours after im-plantation. PI: Left lung, 5th postoperative day (POD) (at sa-crifice). PD: Right lung, 5th POD (at sacrifice). All donor lungswere flushed with cold (4ºC) Euro-Collins solution during har-vest. Recipients from transplants 1 to 6 received no immuno-supression. Recipients from transplants 7 to 12 received 15mg / kg / day of intravenous cyclosporine. Cyclosporine bloodlevels were measured at time 0 on POD 2 and 5. Each speci-men was analyzed by a blind observer to determine rejectionscore (A0 and A1 negative; A2, A3 and A4 positive), cell pro-liferation, and pneumonocytes I and II apoptosis using theTUNEL and Caspasa techniques. Chi square and Kruskal Wa-llis test were used for statistical analysis. A p value less than0.05 was considered significant. Results: Rejection score wasnegative in all samples except 4A (1 animal) and PI (5 animalswithout cyclosporine and 3 animals in those that received cy-losporine) (p<0.05). Cell proliferation was 0% in all samples ex-cept 4A (1 animal 3%) and PI (2 animals < 1% and 1 animal1%). Mean percentages of apoptotic pneumonocytes I and IIwere as follows: 1A: 4.88 and 10.59 respectively; 1B: 4.21and 15.05; 1C: 5.97 and 14.32; 2A: 7.32 and 11; 2B: 5.47 and9.10; 3A: 5.55 and 9.49 ; 3B: 4.76 and 8.32; 4A: 0.93 and2.60; 4B: 6.97 and 15.62; PD: 2.13 and 6.89; PI: 5.49 and17.83. No difference in apoptosis was observed comparinggroups with and without cyclosporine: 6.30 and 17.45 versus4.52 and 18.28, respectively. Median cyclosporine blood le-vels were 623 (± 513) on POD 2 and 455 (± 179) on POD 5.Conclusion: Although statistical difference was not signifi-cant, a trend suggesting that cold irrigation and rejection in-crease apoptosis was observed.

Key words: Lung transplantation. Apoptosis. Ischemia.Reperfusion.

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Apoptosis en trasplante de pulmón 127

través de la activación de una serie coordinadade acontecimientos, iniciada por un grupo deproductos génicos1. Esto contrasta con la ne-crosis, la cual resulta de una injuria o daño en lacélula, con la liberación de enzimas lisosoma-les, la desintegración celular y la subsecuenteinflamación1.

La apoptosis puede observarse en los siguien-tes contextos generales:- Durante el desarrollo.- Para el mantenimiento de las poblaciones ce-

lulares en tejidos maduros.- Como mecanismo de defensa en las reaccio-

nes inmunitarias.- Cuando hay lesión celular por enfermedades

o agentes lesivos.- En el envejecimiento.

La apoptosis puede ser activada por diver-sas señales o estímulos que van desde falta dehormonas o factores tróficos, hasta una interac-ción positiva ligando-receptor, o agentes lesivosespecíficos.

Se reconocen cuatro componentes en la cas-cada que finaliza con la apoptosis:1- Vías de señalización, que puede ser trans-

membrana (citoquinas, hormonas, factores decrecimiento) o intracelulares (calor, radiación,hipoxia, infecciones virales).

2- Control e interacción, llevada a cabo por pro-teínas específicas que establecen conexiónentre las señales de muerte y el programa deejecución (proteínas inhibidoras y facilitado-ras).

3- Fase de ejecución, realizada por una familiade proteasas conocidas como caspasas. És-tas alteran el citoesqueleto al fragmentar lasproteínas del mismo y de la matriz nuclear.

4- Eliminación de las células apoptóticas, tantoellas como sus fragmentos presentan molécu-las marcadoras en su superficie, lo que faci-lita su reconocimiento por macrófagos. De-saparecerán sin dejar huella, y en ausenciacasi completa de inflamación3.La estrategia de preservación de órganos só-

lidos para trasplante se basa en la disminucióndel metabolismo celular del órgano mediante lairrigación (lavado) del mismo con soluciones depreservación fría (4ºC)4. Luego, una vez implan-tado, el órgano es reperfundido con la sangredel receptor. El proceso de reperfusión está aso-ciado a un incremento agudo en la producción deradicales libres de oxígeno y acumulación signi-ficativa de calcio intracelular. Ambos fenómenosson potentes inductores de apoptosis3.

Tanto la injuria oxidativa severa, como la is-quemia prolongada producen necrosis celular,recientemente se demostró que la injuria por is-quemia/reperfusión también induce apoptosis.

Esto podría representar un marcador de injuria ce-lular, indicando un peor pronóstico postrasplan-te, o por el contrario corresponder a una formade muerte celular “protectora”, inevitable hastacierto punto luego del estrés del procedimiento.Esta muerte celular controlada sería preferiblepor sobre la muerte destructiva e inflamatoria dela necrosis5.

Por otra parte, en cualquier contexto de tras-plante de órganos, se hace presente una reaccióninmunitaria de parte del receptor hacia el tejidoimplantado conocida como rechazo (huéspedversus injerto) que determina una agresión al im-plante, dando como resultado grados variablesde daño tisular que pueden ocasionar desde dis-función mínima del órgano implantado hasta lapérdida completa del mismo6.

Los objetivos de este estudio son los siguien-tes:• Primarios

- Describir el desarrollo de apoptosis y pro-liferación celular en tejido pulmonar de cer-dos que recibieron un trasplante de pul-món.

- Evaluar la influencia de la irrigación del ór-gano con soluciones de preservación fríaen el desarrollo de apoptosis.

- Evaluar la influencia del rechazo en el de-sarrollo de apoptosis.

• Secundarios- Describir el desarrollo de apoptosis y pro-

liferación celular (PC) en el período post-isquemia inmediato y alejado luego deltrasplante.

- Describir el desarrollo de apoptosis y pro-liferación celular en las distintas series ce-lulares del tejido pulmonar postrasplante(neumonocitos I y neumonocitos II, célulasepiteliales, endoteliales y polimorfonuclea-res).

MATERIAL Y METODOAnimal y principios éticos

Veinticuatro cerdos Landrace, con un pesoentre 20 y 40 kilogramos fueron utilizados en unmodelo experimental de trasplante pulmonar con5 días de sobrevida, 12 fueron utilizados comodonantes y los restantes 12 como receptores.Todos los animales recibieron trato humanizadoacorde con los “Principios de Cuidados de Ani-males de Laboratorio” formulados por la Natio-nal Society for Medical Research y la “Guía pa-ra el Cuidado y el Uso de Animales de Labora-torio” preparada por el Institute of LaboratoryAnimal Resources, National Research Council ypublicada por la National Academy Press, revi-sada 1996 (www.nap.edu/catalog/5140.html).

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DonanteLos cerdos fueron anestesiados con la admi-

nistración intramuscular de 20 mg/kg de keta-mina seguido de una inducción con isofluorano3%. Como mantenimento anestésico se utilizóisofluorano al 1-2%, fentanilo 2 gamas/kg y bro-muro de pancuronio 0,01 mg/kg. Luego de efec-tuarse intubación endotraqueal, fueron colocadosen posición supina y sujetados a la mesa. Se lle-vó a cabo una esternotomía mediana. El pericar-dio y ambas pleuras fueron abiertos, se diseca-ron y repararon las venas cavas superior e infe-rior, aorta ascendente y tronco de arteria pulmo-nar. Una infusión endovenosa de 300 UI/Kg de he-parina se aplicó en una vena periférica, se rea-lizó una jareta de nylon 5/0 (Prolene®) en el tron-co de la arteria pulmonar, y se canuló la mismacon una cánula aórtica n° 14 (dlp®); luego se ad-ministró 500 mcg de prostaglandina PGE1 (Al-prostadil®), ambas venas cavas fueron ligadas,la aorta ascendente clampeada, la orejuela de laaurícula izquierda fue seccionada y ambos pul-mones perfundidos a través de la cánula en la ar-teria pulmonar con solución de Euro-Collins fría(4°C) a 40 cm H2O de presión hasta obtener sa-lida de la solución limpia (sin restos de sangre)por la orejuela izquierda. El bloque cardiopulmo-nar fue extraído con los pulmones insuflados alfinal de la inspiración (final de volumen tidal); laarteria pulmonar izquierda, el bronquio izquier-do, y un rodete de aurícula izquierda de 5 mm en-globando la desembocadura de las venas pul-monares del mismo lado fueron disecados y sec-cionados manteniendo el órgano insuflado de-jando el pedículo lo más largo posible.

Técnica de ampliación auricularEn todos los animales se aumentó la superfi-

cie de aurícula izquierda disponible para anasto-mosis mediante la disección y ligadura de lasvenas del lóbulo inferior derecho y lóbulo me-diastinal dejando incluídas la desembocadura delas mismas en el rodete de aurícula izquierda de5 mm junto con la desembocadura de las venaspulmonares del lado izquierdo7.

Receptor y procedimiento quirúrgicoLos animales fueron anestesiados de igual

manera que los donantes y fueron ventilados ini-cialmente con un volumen tidal de 15 ml/kg, unafrecuencia respiratoria de 20 por minuto y unapresión positiva al final de la espiración de 3 cmde H20. Los parámetros de respirador fueron mo-dificados durante el procedimiento para mante-ner un estado ácido-base de 7,40 ± 5. Una to-racotomía izquierda en el quinto espacio intercos-tal permitió disecar las estructuras del hilio pul-monar y clampearlas proximalmente para reali-

zar la neumonectomía. El pulmón donante fueimplantado uniendo los elementos del pedículoen el siguiente orden: bronquio, arteria y aurícu-la. El bronquio se anastomosó mediante suturacontinua de poligalactina 910 (Vicryl®) 4/0 en laporción membranosa y puntos en equis del mis-mo material en la porción cartilaginosa. La anas-tomosis de la arteria pulmonar y de la aurícula iz-quierda se llevaron a cabo empleando suturacontinua de nylon (Prolene®) 5/0. Quince minu-tos antes de desclamplear los elementos vascu-lares para reperfundir el órgano implantado, seadministró al receptor 10 mg/kg de metilpredni-solona (Solumedrol®) a través de una vena pe-riférica. Luego se realizó el cierre de la toraco-tomía dejando un drenaje pleural bajo agua quefue cambiado por una válvula de Heimlich cuan-do el animal se recuperó de la anestesia.

Técnica de anastomosis atrio-atrialSe colocó un clamp de Oschner tomando par-

te de la orejuela izquierda y toda la pared auri-cular del receptor por encima de los muñonesde las venas pulmonares izquierdas ligadas du-rante la neumonectomía teniendo especial cuida-do en no ocluir con el clamp la desembocadurade las venas pulmonares derechas; esto se con-firmó mediante control de parámetros hemodi-námicos (presión arterial sistémica y presión dearteria pulmonar). Se incidió la pared auricularcon hoja de bisturí número 11 y se realizó atrio-tomía hasta dejar una boca de anastomosis com-patible con el tamaño de la aurícula donante.Luego, el rodete de aurícula del pulmón donan-te se anastomosó empleando sutura continua denylon 5/0 (Prolene®) directamente a la paredabierta de la aurícula izquierda del receptor7.

Previamente a su instrumentación los anima-les fueron asignados, en forma randomizada me-diante tabla de números aleatorios, a uno de dosgrupos:• Sin inmunosupresión (Grupo A)• Con inmunosupresión (Grupo B)

En el grupo con inmunosupresión, se adminis-tró azatioprina 4 mg/kg intravenoso (IV) dos ho-ras antes del implante, metilprednisolona 10mg/kg IV 15 minutos antes del desclampeo de laarteria pulmonar y cada 8 horas el primer día yluego cada doce horas. Una vez extubado el ani-mal se comenzó con Ciclosporina IV a 15 mg/kg-/día cada 12 horas, con controles de concentra-ción plasmática de la misma al 2º y al 5º día pos-trasplante. El tratamiento se continuó con lastres drogas durante 5 días (metilprednisolona a2 mg/kg/día IV, azatioprina 2 mg/kg/día IV y Ci-closporina 15 mg/kg/día cada doce horas, conajustes en la dosis para mantener un nivel dedroga plasmático de 300 ± 100 ng/ml.




MuestrasLas muestras de tejido pulmonar se obtuvie-

ron en la siguiente secuencia:1A. Donante, pulmón izquierdo, inmediatamen-

te luego de la apertura del tórax.1B. Donante, pulmón derecho, inmediatamente

luego de la apertura del tórax.1C. Receptor, pulmón izquierdo, inmediatamen-

te luego de la apertura del tórax.2A. Donante, pulmón izquierdo, inmediatamen-

te luego de la irrigación del órgano.2B. Donante, pulmón derecho, sin irrigar.3A. Pulmón izquierdo implantado en el receptor,

1 hora luego de reperfundido en el receptor.3B. Pulmón derecho (nativo del receptor), 1 ho-

ra luego de reperfundido el pulmón donan-te en el receptor.

4A. Pulmón izquierdo (implantado), biopsia trans-bronquial a las 48 horas postrasplante.

4B. Pulmón derecho (nativo), biopsia transbron-quial a las 48 horas postrasplante.

5A. Pulmón izquierdo (implantado), 5º día pos-trasplante (sacrificio).

5B. Pulmón derecho (nativo), 5º día postrasplan-te (sacrificio).

Todas las muestras fueron fijadas en formol al10%, luego embebidas en parafina, y teñidascon Hematoxilina y Eosina.

FibrobroncoscopíaA las 48 horas luego del trasplante los recep-

tores fueron nuevamente anestesiados y se lespracticó una fibrobroncoscopía con biopsia trans-bronquial del parénquima de ambos pulmonestomando entre 2 y 3 muestras de cada lóbulo. Lasmuestras se fijaron en formol al 10%, luego fue-ron embebidas en parafina, y teñidas con Hema-toxilina y Eosina.

SobrevidaAl 5º día postrasplante los animales fueron

instrumentados otra vez, se tomaron muestraspara las mediciones de las variables en estudioy luego fueron sacrificados.

Estudio histológico e inmunohistoquímica

El bloque cardiopulmonar fue extraído y se lepracticó una infusión traqueal de formol al 10%para su fijación, luego fue sumergido durante 48horas en la misma solución. Para el estudio his-topatológico se tomaron muestras de cada ló-bulo de ambos pulmones, de los que se realiza-ron cortes en parafina que fueron teñidos conHematoxilina y Eosina.

Cada muestra fue analizada por un observa-dor ciego para determinar el grado de rechazo (A0y A1 negativo, A2, A3 y A4 positivo)8, prolifera-

ción celular, y el índice de apoptosis en neumo-nocitos I y II empleando la técnica de TUNEL yCaspasa9.

El grado de rechazo se determinó de acuer-do al sistema de gradación de la Sociedad Inter-nacional de Trasplante Cardíaco y Pulmonar(ISHLT)8:A0. Sin evidencia de infiltrado mononuclear pe-

rivascular.A1. Infiltrados de células mononucleares peri-

vasculares aislados.A2. Infiltrados perivasculares frecuentes rodean-

do arteriolas y vénulas.A3. Infiltrados perivasculares densos que inva-

den septos alevolares.A4. Infiltrados perivasculares difusos, con infil-

tración intersticial y alveolar, daño neumono-citos alveolares, necrosis de parénquima, in-farto o vasculitis necrotizante.

ApoptosisPara el estudio de apoptosis se aplicó sobre

cortes en parafina de 4 mm el método colorimé-trico de detección, conocido como “Dead End”,basado en el sistema TUNEL (Tdt mediated dUTPnick end labeling). En esta técnica la enzimatransferasa terminal (TdT) marca fragmentos deDNA producidos por apoptosis, con extremos3OH- libre a los cuales les acopla nucleótidosbiotinilados. Mediante este método los núcleosapoptóticos se tiñen de marrón. Los cortes his-tológicos se fijaron en paraformaldehído al 4%,en buffer fosfato salino. Luego de la permeabi-lización de las membranas con proteínasa K, seagrega una mezcla de nucleótidos biotinilados yse incuba con la enzima TdT. Luego se bloqueala peroxidasa endógena y se incuba con estrep-tavidina acoplada a peroxidasa. Se agregan lue-go los componentes de diaminobenzidina y seobserva el desarrollo de color. Se realiza unacontratinción con hematoxilina y finalmente secuentan el total de núcleos de neumonocitos porcampo y el porcentaje de núcleos positivos apop-tóticos (marrones).

Proliferación celularPara el estudio de proliferación celular, se rea-

lizaron cortes en parafina de 4 micrones, a los quese agregó el Anticuerpo Monoclonal de RatónKi67 (clon MIB-1), de Dako, en una dilución de1/100. Se realizó rescate antigénico en vaporie-ra, con buffer citrato (PH6). Posteriormente seagregó DCAB+ y se realizó contratinción con he-matoxilina. Para su evaluación se contaron el nú-mero de núcleos y el porcentaje de positividaddado por la coloración marrón en núcleos deneumonocitos, células endoteliales y polimorfo-nucleares.




EstadísticaLos datos se resumieron en valores absolutos

y porcentuales para variables discretas y comomediana y rango para las variables numéricas. Eltratamiento estadístico se realizó con Chi cuadra-do, prueba “t” de Student, o con una pruebaANOVA no paramétrico (Kruskal-Wallis).

Se consideró significativo un valor de p me-nor a 0,05.

Tamaño muestralEstimando un desarrollo del 10 al 30% de

apoptosis en el grupo tratado, para hallar unadiferencia del 15 al 25% entre el grupo sin tra-tamiento inmunosupresor versus el grupo contratamiento inmunosupresor y entre las distintasmuestras entre sí, para una respuesta favorableen el número de células apopotóticas, se calcu-laron 12 cerdos en total (6 por rama) conside-rando un error alfa del 5% y un poder de discri-minación del 80%.

RESULTADOSEl grado de rechazo fue negativo en todas las

muestras excepto las siguientes:- Una muestra tomada a las 48 horas postras-

plante (4A), en un animal que no recibió trata-miento inmunosupresor.

- Ocho muestras tomadas al 5º día postrasplan-te (5A). De ellos 5 animales no habían recibi-do drogas inmunosupresoras mientras los otros3 animales sí recibieron tratamiento inmuno-supresor (p<0,05).La proliferación celular fue negativa en todas

las muestras excepto en una muestra 4A que fuedel 3%; y en tres muestras 5A (2 animales <1% yotro animal 1%).

En la Tabla 1 se puede observar la media delíndice de apoptosis en neumonocitos I y II expre-sado en porcentaje.

Los valores séricos de ciclosporina fueron 623ng (± 513) en el 2º día posoperatorio y 455 ng (±179) en el 5º día posoperatorio.

No se observó diferencia estadísticamente sig-nificativa comparando los animales tratados con

y sin ciclosporina: 6,30 y 17,45 versus 4,52 y 18,28respectivamente.

En la Tabla 2 se detallan los resultados obte-nidos en las muestras tomadas después de la ad-ministración de ciclosporina (postrasplante), y selo compara con aquellas que no recibieron ciclos-porina.

Muestra Neumonocitos I Neumonocitos II

1A: D, PI, inmediatamente luego de la apertura del tórax. 4,88 10,59

1B: D, PD, inmediatamente luego de la apertura del tórax. 4,21 15,05

1C: R, PI, inmediatamente luego de la apertura del tórax. 5,97 14,32

2A: D, PI, inmediatamente luego de la irrigación del órgano. 7,32 11

2B: D, PD, sin irrigar. 5,47 9,10

3A: PI implantado en el receptor, 1 hora posreperfusión en el receptor. 5,55 9,49

3B: PD (nativo), 1 hora posreperfusión del pulmón donante en el receptor. 4,76 8,32

4A: PI, biopsia transbronquial a las 48 horas postrasplante. 0,93 2,60

4B: PD, biopsia transbronquial a las 48 horas postrasplante. 6,97 15,62

5A: PI, 5º día postrasplante (sacrificio). 5,49 17,83

5B: PD, 5º día postrasplante (sacrificio). 2,13 6,89

D: Donante; R: Receptor; PI: Pulmón izquierdo;PD: Pulmón derecho.

TABLA 1: INDICE DE APOPTOSIS EN NEUMONOCITOS IY II. LOS VALORES ESTAN EXPRESADOS EN MEDIA Y ENPORCENTAJE.

Muestras Con inmunosupresión Sin inmunosupresión

Neumonocitos I Neumonocitos II Neumonocitos I Neumonocitos II

4A 2,65 2,05 0,36 2,78

5A 6,30 17,45 4,52 18,28

4A: Pulmón izquierdo implantado, biopsia transbronquial a las 48 horas postrasplante.4B: Pulmón izquierdo implantado, 5º día postrasplante.

TABLA 2: INDICE DE APOPTOSIS EN MUESTRAS DE ANIMALES QUE RECIBIERON INMUNOSUPRESION VERSUSMUESTRAS DE ANIMALES SIN INMUNOSUPRESION.




En el pulmón nativo el índice de apoptosis dis-minuyó al 5º día postrasplante comparado con el2º día postrasplante (2,13 y 6,89 versus 6,97 y 1562 respectivamente) (Figura 1).

En el pulmón implantado se observó un impor-tante aumento de la apoptosis al 5º día postras-plante comparado con el 2º día postrasplante(5,49 y 17,83 contra 0,93 y 2,60 respectivamen-te) (Figura 1).

El pulmón izquierdo implantado mostró mayoríndice de apoptosis que el pulmón derecho nati-vo al 5º día postrasplante (5,49 y 17,83 versus2,13 y 6,89) (Figura 1).

DISCUSIONEn una misma célula, al menos en algunos ca-

sos, y dependiendo de la intensidad y duración delestímulo, puede ocurrir apoptosis o necrosis1-3,9.Necrosis es otra forma de muerte celular, que seacompaña de pérdida de integridad de las mem-branas celulares, lo que resulta, en tumefaccióncelular y mitocondrial, con liberación de enzimasintracitoplasmáticas y lisosimas. Se agregan ede-ma, inflamación y migración leucocitaria. Pode-mos considerar a la apoptosis o mecanismo de“suicidio” celular como un evento biológico in-trínseco a cada tipo celular que juega un rol esen-cial tanto en el desarrollo y la homeostasis comoen muchos procesos de enfermedad2. En términosde cambios morfológicos la apoptosis incluye lareducción del volumen celular, la condensacióndel núcleo y la rotura de la membrana plasmáti-ca. Las células que sufren apoptosis contienencuerpos apoptóticos unidos a su membrana queson fagocitados y digeridos por macrófagos uotras células vecinas sin generar una respuesta in-flamatoria2. Esto contrasta con la necrosis, la cual

resulta de un daño en la célula, con la liberaciónde enzimas lisosomales, la desintegración celulary la inflamación10,11.

En el citoplasma de células apoptóticas sonactivadas muchas proteasas, todas tienen el ami-noácido cisteína en su sitio activo y clivan proteí-nas blanco en ácido aspártico, por lo que son lla-madas caspasas. Cada una se genera como unprecursor inactivo (una procaspasa) que se acti-va por clivaje por otras caspasas. Una vez acti-vadas, algunas caspasas clivan otras proteínasespecíficas en la célula para ayudar a matarla rá-pida y prolijamente. Por ejemplo clivan proteínasque forman la membrana nuclear y así desmante-lar el núcleo; proteínas que contienen DNAsas enuna forma inactiva, liberando la DNAsa para quecorte el DNA; proteínas constituyentes del citoes-queleto y otras involucradas en la unión de lascélulas con sus vecinas ayudando a la célula queestá muriendo a despegarse y redondearse y fa-cilitar así su digestión12. En el núcleo de célulasapoptóticas, se generan fragmentos de DNA porla acción de endonucleasas endógenas como laDnasa caspasa-dependiente. Esta fragmentacióndel DNA es una de las características de la apop-tosis: el DNA es clivado en una población de mul-tímeros de fragmentos 180-200 pares de bases,que pueden ser observados en geles de agarosacomo una sucesión de bandas o “ladder” o por elmétodo de TUNEL2,3.

Ha sido postulado que en trasplante pulmonarel fenómeno de apoptosis recién comienza luegode la reperfusión del órgano implantado13. Estáausente durante el período de isquemia fría, y esmínima durante el período de isquemia calientenecesario para el implante, esto probablementesea causado por la disminución del metabolismocelular secundario a la hipotermia14-16.

El proceso de reperfusión está asociado a unincremento agudo en la producción de radicaleslibres de oxígeno y acumulación significativa decalcio intracelular. Ambos fenómenos son poten-tes inductores de apoptosis17.

Tanto la injuria oxidativa severa, como la is-quemia prolongada producen necrosis celular; re-cientemente se demostró que la injuria por isque-mia/reperfusión también induce apoptosis18. Estopodría representar un marcador de injuria celular,indicando un peor pronóstico postrasplante, o porel contrario corresponder a una forma de muertecelular “protectora”, inevitable hasta cierto pun-to luego del estrés del procedimiento. Esta muer-te celular controlada sería preferible por sobre lamuerte destructiva e inflamatoria de la necrosis19.

Podría interpretarse además que la habilidaddel órgano implantado para eliminar células porapoptosis, evitando el proceso destructivo de ne-crosis, constituye parte de la recuperación del ór-

Figura 1: Indice de apoptosis en neumonocitos I y II deambos pulmones. PI NI: Pulmón izquierdo, neumonocitosI. PI NII: Pulmón izquierdo, neumonocitos II. PD NI: Pul-món derecho, neumonocitos I. PD NII: Pulmón derecho,neumonocitos II.




gano luego del daño de la reperfusión, y no sola-mente pérdida de tejido y de función20.

En nuestro caso decidimos tomar tambiénmuestras de tejido pulmonar a las 48 horas lue-go de efectuado el trasplante debido a que entreel 2º y el 5º día postrasplante es cuando tienemayor incidencia de presentación la injuria de is-quemia/reperfusión en el escenario de trasplanteclínico en humanos21.

Se conoce que uno de los potenciales meca-nismos deletéreos que pueden ser activados du-rante el período isquémico es la endotelina 1 (ET-1), una de las más potentes sustancias vasocons-trictores conocidas10. La ET-1 es sintetizada y li-berada por múltiples tipos de células, tales comomacrófagos, células del epitelio bronquial, vas-cular, tejido muscular liso y células del endotelioen respuesta a múltiples estímulos que incluyenhipoxia e isquemia. Además de promover la vaso-constricción, la ET-1 aumenta la permeabilidadcapilar, promueve la coagulación y estimula laacumulación de neutrófilos, siendo atribuidos es-tos efectos, en parte, a la injuria pulmonar y elrechazo postrasplante5,18.

Se desconoce el rol exacto que tiene el desa-rrollo de apoptosis en tejido pulmonar postrasplan-te. Existen diversos trabajos que describen el de-sarrollo de muerte celular programada en un núme-ro elevado de células del tejido pulmonar10-20, ma-yor al 39%, en forma próxima al trasplante, y rela-cionan esta pérdida con la disfunción orgánica ob-servada en una elevada proporción de pacientespostrasplante3. Aun así, si bien prevenir esto podríaser un objetivo de importancia en el futuro, se des-conocen la distribución de la apoptosis en las di-versas series celulares, el grado de relación entrela necrosis y apoptosis en el tejido pulmonar pos-trasplante, y si la magnitud y proporción entre ellastienen alguna relación sobre la lesión histológica,el desarrollo de mediadores que puedan potenciaro regular el proceso inflamatorio que acompaña lamuerte celular o la disfunción orgánica.

La inmunosupresión, hipotéticamente, podríamodificar ciertos estímulos inductores de apop-tosis (Factor de Necrosis Tumoral, células T Cito-tóxicas), mientras que otros (radicales libres) só-lo dependerán del grado de injuria por isquemia-/reperfusión14,15.

En nuestro estudio alcanzamos niveles de deciclosporinemia que serían protectores contra elrechazo, tanto en las mediciones realizadas al 2ºcomo al 5º día postrasplante. Sin embargo, si bienno se observó una diferencia estadísticamentesignificativa comparando ambos grupos (con ysin inmunosupresión), vimos una tendencia a pre-sentar un incremento de la apoptosis en los pul-mones trasplantados cuando comparamos lasmuestras obtenidas en el 5º día con las muestras

del mismo pulmón obtenidas tres días antes (2º díapostrasplante). También notamos un mayor índi-ce de apoptosis en los pulmones implantados enlas muestras tomadas al 5º día postrasplante,cuando los comparamos con las muestras obte-nidas al mismo tiempo de los pulmones nativos delreceptor. Más aún, esta diferencia se hace másmarcada debido a que el índice de apoptosis delpulmón nativo disminuye al 5º día con respecto amediciones previas. Esto podría sugerir que elprocedimiento quirúrgico en sí mismo afecta losniveles de inducción de apoptosis y que la mis-ma se iría desacelerando a medida que nos ale-jamos del evento (injuria quirúrgica).

Si bien la descripción del grado y selectividadde la apoptosis en tejido pulmonar postrasplan-te no están claramente asociados a la evolucióndel órgano trasplantado, ni ello está incorporadoen la práctica habitual de seguimiento de los pa-cientes sometidos a estas intervenciones, seríaimportante distinguir los mecanismos generado-res de lesión, que por un lado permitan compren-der la relación entre la apoptosis y los hallazgoshistológicos, mediadores inflamatorios y funcióny su modulación en el órgano blanco5, y por otrolado, adecuar los tratamientos preventivos y/o cu-rativos referentes a la disfunción del órgano tras-plantado3.

Dado que todavía no se han identificado cla-ramente los factores de riesgo para la disfunciónpulmonar postrasplante, son importantes los in-tentos de identificar marcadores de enfermedad,con el fin de evitar, reducir o modificar la mismay disponer anticipadamente de alternativas com-plementarias para esta situación clínica poten-cialmente mortal en los grupos de mayor riesgo.Podrían así limitarse o reducir los efectos catas-tróficos de esta grave complicación, o mejorar laevolución al largo plazo.

Creemos que la evolución de esta línea expe-rimental de trabajo permitiría relacionar la apop-tosis y necrosis en las diversas series celularespresentes en el pulmón postrasplante, con la le-sión histológica y/o el desarrollo de mediadoresinflamatorios.

Muchos niños que han sido trasplantados yotros más que se encuentran en lista de espera yaún aguardan un órgano, podrían beneficiarse enel futuro del desarrollo de estrategias de aplica-ción clínica que contemplen la modulación del fe-nómeno apoptótico. Más aún, ese beneficio po-dría extenderse para el tratamiento de otras do-lencias que afectan a la población en general y ala pediátrica en particular.

CONCLUSIONES1. La inducción anestésica y la apertura quirúrgi-

ca tienen igual índice apoptótico en donante y




receptor (esternotomía vs toracotomía). Losneumonocitos I tienen menor índice de apop-tosis que los neumonocitos II.

2. La irrigación con soluciones de preservación(Euro-Collins) aumentó levemente la apopto-sis en neumonocitos I y II comparado con elmismo pulmón sin irrigar, si bien comienza adisminuir con respecto a la apertura.

3. La reperfusión del pulmón no aumentó la apop-tosis en forma inmediata (1 hora pos reperfu-sión).

4. La apoptosis disminuye en el pulmón trasplan-tado a las 48 horas del posoperatorio.

5. La apoptosis se mantiene igual para neumono-citos I y aumenta para neumonocitos II en elpulmón nativo.

6. En el pulmón nativo la actividad apoptóticadisminuyó al 5º día postrasplante (con respec-to a las previas).

7. En el pulmón trasplantado aumentó la apopto-sis al 5º día postrasplante con respecto al pul-món nativo y también cuando se lo comparacon las muestras previas del mismo pulmón.

8. Si bien la diferencia estadística no fue signifi-cativa, se observó una tendencia que sugiereque la irrigación con solución de preservaciónfría y el rechazo incrementan la apoptosis enel pulmón trasplantado.

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