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APLICACIÓN DE TECNICAS BASADAS EN BIOLOGIA MOLECULAR PARA EL DIAGNÓSTICO Y TIPIFICACIÓN DEL VIRUS DE GUMBORO (IBDV) Blas ALI Sánchez Peral, Mª José Rodríguez*. INGENASA. Hermanos García Noblejas 41, 28037. Madrid. Spain. *Corresponding autor: mjrodriguez@ingenasa.es

EL VIRUS DE GUMBOROEl virus de la enfermedad de Gumboro (IBDV), es un avibirnavirus, familia Birnaviridae, género

Birnavirus, [1]el género comprende dos serotipos: el serotipo 1 que afecta a aves de corral [2] y el

serotipo 2 que es apatogénico en este tipo de aves. Los miembros de esta familia presentan como

material genético ARN de doble banda segmentada. La enfermedad de Gumboro es altamente

contagiosa, afecta fundamentalmente a aves jóvenes. Está caracterizada por afectar al sistema inmune

provocando necrosis y atrofia de la bolsa de Fabricio de estas aves, secundariamente produce una

depleción de linfocitos en todos lo órganos linfoides, lo que da lugar a una inmunodepresión severa [3]

El cuadro clínico presenta diarrea, anorexia, depresión, erizamiento de las plumas y finalmente

postración En el mundo, se pueden encontrar dos formas diferentes de la enfermedad. La forma

subclínica producida por variantes antigénicas y la forma clínica producida por cepas de alta virulencia.

Desde el punto de vista del diagnóstico la forma clínica de la enfermedad de Gumboro es la más

interesante, se caracteriza por presentar elevadas morbilidades (100%) y mortalidades (50%)

produciendo grandes pérdidas en la industria avícola La forma clínica producida por cepas de alta

virulencia es la responsable de los numerosos brotes que han aparecido en diversos países a lo largo

de todo el mundo.

BIOLOGIA MOLECULAR, TRASCENDENCIALas técnicas de Biología Molecular ocupan un papel cada vez más importante en lo referido al

diagnóstico, a todos los niveles, desde la Sanidad Humana en la comenzaron a utilizarse hace ya

algunos años, hasta la Sanidad Animal en la que cada vez son más utilizadas como herramientas de

diagnóstico complementarias a los ensayos serológicos. Entre las más utilizadas se encuentran la

reacción en cadena de la polimerasa o PCR y todas sus variantes, el enzimoinmunoensayo o ELISA

sobre amplificado, las técnicas de caracterización como la secuenciación automática, la restricción

enzimática, etc. Por su rapidez, sencillez y elevada sensibilidad y especificidad, la PCR es una de las

técnicas más populares, hasta el punto de constituir un pilar central dentro de la mayoría de los

protocolos en las pruebas de diagnóstico molecular conocidas. La PCR es una técnica que utiliza

fundamentalmente tres propiedades; por un lado, dos intrínsecas a los ácidos nucleicos como son la

complementariedad de bases y la desnaturalización/renaturalización de las cadenas de los ácidos

nucleicos por efecto de la temperatura (temperatura de fusión o Tm) y por otro, la capacidad

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polimerizante de las enzimas termoestables denominadas polimerasas capaces de sintetizar ácidos

nucleicos en presencia de sus monómeros específicos, es decir nucleótidos. La técnica de amplificación

mediante un suceso cíclico que consta de tres fases (desnaturalización, hibridación y elongación), puede

amplificar específicamente y con elevada sensibilidad secuencias cortas del ácido nucleico de interés.

La técnica de amplificación génica por si sola o acoplada a otras ya mencionadas (ELISA, secuenciación

automática, restricción enzimática), permite diseñar ensayos diagnósticos fiables, rápidos y de fácil

interpretación dirigidos específicamente para cada patología, con el objetivo de identificar la presencia

del patógeno y si es posible, su posterior caracterización.

DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE IBDV

El uso de técnicas moleculares en estos últimos años para detección de IBDV ha sido muy notable ([4];

[5]; [6]) la detección del virus esta basada en una transcripción reversa acoplada a amplificación por

PCR o RT-PCR sobre la región hipervariable del gen vp2 . Los amplificados resultantes son procesados

por restricción enzimática [7]; [8]; [9]), o directamente por secuenciación automática ([10]) a partir de

Bursa de Fabricio. En ambos casos es posible caracterizar el tipo de virus: salvaje, salvaje muy virulento

o vacunal ([11]; [12]; [13]; [14]) si bien, la secuenciación ofrece más información que la restricción. En

ocasiones, es necesario aumentar la sensibilidad de la técnica, para ello se realiza una nested o

segunda PCR después de la RT-PCR sobre el primer amplificado que da lugar a un fragmento de

menor tamaño (o bien directamente una RT-PCR, Banda y Villegas, 2003), el resultado se revela por gel

de agarosa del mismo modo que en la RT-PCR. Mediante restricción enzimática se puede determinar el

grupo molecular al que pertenece. En el caso del primer amplificado que tiene 744pb, se utilizaban

inicialmente 2 enzimas ([15]) pasando posteriormente a 7 enzimas o a una combinación de varias

enzimas [16]; [17, 18]) lo que ofrece un patrón más completo. La diana Ssp I es en la mayoría de los

casos, no en todos, un marcador de alta virulencia, aunque hay cepas altamente virulentas que no tienen

la diana y cepas que tienen la diana Ssp I y no son de alta patogenicidad (encontradas en Georgia por el

Dr. P. Villegas). En el caso que se detecte IBDV mediante nested PCR o bien directamente una RT-PCR, el fragmento es de 248 pb, en este caso se utilizan 4 o más enzimas para la tipificación.

En nuestro laboratorio se realiza un protocolo muy similar al descrito (ver esquema de detección /

tipificación), es decir, una RT-PCR sobre extraído de Bursa de Fabricio con oligonucleótidos específicos

para la región hipervariable del gen vp2; si la muestra resulta positiva por un lado se secuencia el

amplificado de 744pb y por otro se realiza la restricción enzimática con 7 enzimas: Mbo I, Bst NI, Sac I, Sty I, Nco I, Ssp I, Taq I; con ello se obtiene toda la información posible sobre el tipo

de virus, dianas de virulencia (Ssp I), tipo de cepa, etc; valorando la correlación del tipo de cepa y la

presencia/ausencia de diana Ssp I. Si el resultado de la RT-PCR es negativo se realiza una nested PCR

sobre el primer amplificado de 744bp dando lugar a un fragmento de 248bp, con ello se descartan

posibles falsos negativos. Para este caso se procede del mismo modo, realizando secuenciación (más

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limitada en cuanto a la información que en el caso anterior) y restricción enzimática con 4 enzimas:

Sac I- Taq I -Sty I- Ssp I. En general, la determinación de los grupos moleculares mediante restricción enzimática, en particular en

INGENASA se realiza teniendo en cuenta las publicaciones, los estudios y trabajos realizados por

especialistas reconocidos tales como el Dr. P. Villegas, el Dr. A. Banda, el Dr. D. Jackwood, el Dr. A.

Pàges, y la Dra. N. Majó, entre otros. Para ello se utilizan una serie de tablas muy accesibles, referidas a

ambos segmentos (744bp, 248bp) que clasifican las distintas cepas en 6 grupos moleculares, en cada

caso el valor diagnóstico de la restricción enzimática viene determinado por la ausencia o presencia de

las diferentes dianas indicadas en el esquema así el como del tamaño de los fragmentos originados en la

región hipervariable VP2, de esta forma se pueden valorar potencialmente no sólo las cepas clásicas o

vacunales (incluso multivalentes) también aquellas de alta virulencia y variantes emergentes. La

información que ofrece la restricción enzimática es importante aunque limitada por las características

propias de la técnica, de ahí que exista la posibilidad adicional de secuenciar la muestra para conocer en

detalle el tipo virus ([10]), es decir la cepa concreta, es actualmente el ensayo de tipificación más

recomendable debido a la información que ofrece frente a la restricción enzimática.

En nuestra experiencia en el diagnóstico de IBDV se analizaron en el laboratorio un total de 35 bolsas de

Fabricio representativas en este caso de diferentes lotes enviados con sintomatología relacionada con

IBDV, incluso en algún caso con estudios histológicos y anatomopatológicos, procedentes de pollos

entre los 20 y 50 días de edad. El 54% (19) de las cepas se identificaron como muy virulentas ( vvIBDV,

dentro del grupo molecular VI), sólo en un caso se encontró una cepa vvIBDV sin diana Ssp I. El 29%

(10) de las muestras positivas se identificaron como vacunales dentro de los grupos moleculares IV

(228E, D78) y grupo V (Bursine-2) además de algunas cepas relacionadas con cepas clásicas tipo VG-

311, VG-262, VG-208. EL 11% (4) de las muestras remitidas no se pudieron estudiar por ausencia de

amplificación. Finalmente, el 6% (2) de las muestras presentaron coinfecciones o al menos presencia de

dos tipos de virus procedentes de diferentes grupos moleculares en concreto del grupo IV y grupo VI (ver

fotos del esquema tipificación en el fragmento de 744bp). Respecto del total de muestras analizadas, en

el 43% se pudo estudiar el fragmento de 744bp; dentro del 57% restante, el 46% se analizaron sobre el

fragmento de 248bp, en el resto no se pudo identificar la presencia de IBDV. Este dato nos pareció muy

significativo, puesto que pone de manifiesto la importancia de la nested PCR en esta prueba en

particular. De otro modo no hubieran sido consideradas como positivas la mayoría de las muestras.

Respecto de los últimos estudios publicados por otros colegas, decir que se esta trabajando en la misma

línea descrita en cuanto al diagnóstico molecular se refiere. Se han publicado recientemente trabajos

sobre análisis molecular y de patogenicidad en pollos de Malasia ( [19]) y Egipto ([20]), análisis de

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secuenciación sobre la región hipervariable Vp2, caracterización de cepas exóticas por restricción

enzimática con Bmr I ([21]), amplificación y diferenciación de cepas muy virulentas y vacunales por RT-

PCR ([22]), detección de IBDV mediante la nueva generación de técnicas de amplificación a tiempo real,

más eficientes y rápidas que la PCR convencional, permiten incluso la cuantificación del virus y la

tipificación de IBDV mediante curvas de fusión de los amplificados, entre otras ventajas ([23]).

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Detección y tipaje de IBDV mediante RFLP-RT PCR realizado en INGENASA

Bursa de Fabricio

Método de extracción de RNA

ARN vírico

RT-PCR (SET oligos Vp2)

DNA vírico (744 bp)

RFLP Nested PCR (SET oligos )

Mbo I- Bst NI- Sac I- Sty I- Nco I- Ssp I- Taq I

DNA vírico (248 bp)

Secuenciación

Secuenciación

Chomczynski y Sacchi

ARN ADNAmplificación por PCR

Proteína Vp2

Actividad RT

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RFLP

Sac I- Taq I -Sty I- Ssp I

REFERENCIAS

1. Dobos, P., Peptide map comparison of the proteins of infectious bursal disease virus. J Virol, 1979. 32(3): p. 1047-50.

2. Jackwood, D.H. and Y.M. Saif, Antigenic diversity of infectious bursal disease viruses. Avian Dis, 1987. 31(4): p. 766-70.

3. Saif, Y.M., Immunosuppression induced by infectious bursal disease virus. Vet Immunol Immunopathol, 1991. 30(1): p. 45-50.

4. Wu, C.C. and T.L. Lin, Detection of infectious bursal disease virus in digested formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections by polymerase chain reaction. J Vet Diagn Invest, 1992. 4(4): p. 452-5.

5. Jackwood, D.J., G. Hanes, and S.H. Miller, Infectious bursal disease viral RNA amplification using RT/PCR from bursa tissue following phenol: chloroform inactivation of the virus. Avian Dis, 1996. 40(2): p. 457-60.

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8. Jackwood, D.J. and S.E. Sommer, Restriction fragment length polymorphisms in the VP2 gene of infectious bursal disease viruses. Avian Dis, 1997. 41(3): p. 627-37.

9. Ture, O., Y.M. Saif, and D.J. Jackwood, Restriction fragment length polymorphism analysis of highly virulent strains of infectious bursal disease viruses from Holland, Turkey, and Taiwan. Avian Dis, 1998. 42(3): p. 470-9.

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11. Lin, Z., et al., Sequence comparisons of a highly virulent infectious bursal disease virus prevalent in Japan. Avian Dis, 1993. 37(2): p. 315-23.

12. Liu, H.J., J.J. Giambrone, and T. Dormitorio, Detection of genetic variations in serotype I isolates of infectious bursal disease virus using polymerase chain reaction and restriction endonuclease analysis. J Virol Methods, 1994. 48(2-3): p. 281-91.

13. Jackwood, D.J. and R.J. Jackwood, Infectious bursal disease viruses: molecular differentiation of antigenic subtypes among serotype 1 viruses. Avian Dis, 1994. 38(3): p. 531-7.

Grupo molecular IV (vacuna)

Grupo molecular VI (vvIBDV)

Coinfección Gpo molec IV/VI

Gpo molec VI (Bursine 2)

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14. Jackwood, D.J. and C.K. Nielsen, Detection of infectious bursal disease viruses in commercially reared chickens using the reverse transcriptase/polymerase chain reaction-restriction endonuclease assay. Avian Dis, 1997. 41(1): p. 137-43.

15. Jackwood, D.J. and S.E. Sommer, Genetic heterogeneity in the VP2 gene of infectious bursal disease viruses detected in commercially reared chickens. Avian Dis, 1998. 42(2): p. 321-39.

16. Jackwood, D.J., R.J. Jackwood, and S.E. Sommer, Identification and comparison of point mutations associated in classic and variant infectious bursal disease viruses. Virus Res, 1997. 49(2): p. 131-7.

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