Aplicação de Lipídios na Microencapsulação - SBOG Grosso.pdf · Process yield Efficiency of...
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Aplicação de Lipídios na Microencapsulação Produção, Caracterização e Aplicações
Carlos Grosso
Dep. de Alimentos e Nutrição – Fac. de Engenharia de Alimentos UNICAMP – Campinas – São Paulo
Florianópolis, 12 a 14 de novembro, 2013
Process yield
Efficiency of encapsulation
Release profile
Surface and cross section morphology
Mean size and Size distribution
Microencapsulation
Physical rupture
Temperature
Diffusion
Trigger Mechanisms
Fonte: REINECCIUS, 1995
Dissolution
Biodegradation
Adaptado de: V. Popov; Nanotechology – Food and Cleaning Applications – EFFOST – 2007, Lisboa
Escala de Tamanho
Ativo Parede Ativo Matriz
Estruturas e nomenclatura
(Sistema reservatório) (Sistema monolítico)
PARTÍCULAS
MICROPARTÍCULAS
Microcápsula Microesfera
Alimentos ácidos
Probióticos e Bactérias
Aminoácidos
Ingredientes para Alimentação Animal
Soluções aquosas e alcoólicas
Pigmentos e corantes
Óleos Comestíveis
Minerais e Vitaminas
Enzimas
Frutas, grãos e sementes
Flavors e Óleos Essenciais
Ingredientes Funcionais
Extratos Vegetais
Agentes de fermentação
Ácidos Graxos Essenciais
Aplicação na Industria de Alimentos
Adaptado de Microencapsulation in Food applications – IFT Meeting, 2008 – New Orleans
ESTABILIDADE
PROTEÇÃO/BARREIRA
PERMEAÇÃO/LIBERAÇÃO
. . .
FUNÇÃO NA PARTÍCULA
Materiais de parede
Proteínas Princípio: matriz seca ou úmida
Lipídios Princípio: emulsão, ponto de fusão
Carboidratos Amidos, Gomas, Celulose e derivados
Princípio: matriz seca ou úmida
O recheio é sólido ou líquido?
Hidrofílico ou hidrofóbico?
Tamanho final desejado para a partícula
Quantidade necessária de recheio
Condições de processamento, estocagem, distribuição e consumo
Como deverá ser a liberação do recheio?
Qual método de encapsulação a ser usado?
Adaptado de: Microencapsulation in Food applications – IFT Meeting, 2008 – New Orleans
Questões Críticas!
Micropartículas Lipídicas
Atomização a frio
Formatação das partículas
Similar ao Spray Drying
Fase contínua são os lipídeos fundidos
Spray Chilling
Micropartículas lipídicas sólidas
Sistemas coloidais de liberação
Emulsões
Lipossomas
Alternativa
(Siekmann and Westesen, 1992; Muller et al, 2000)
Spray Chilling
Processo brando
Capacidade para produzir grande quantidade
Comercialmente viável
Bastante utilizado em nível industrial
Rapidez e segurança
Melhorar a estabilidade ao aquecimento
Retardar a liberação em meio aquoso
VANTAGENS
Spray Chilling
Materiais de parede são bem tolerados
Não apresentam toxicidade aguda ou crônica,
Ativos hidrofílicos ou hidrofóbicos,
Liberação modulada
Excelente estabilidade física,
Produção em grande escala é possível
Flexibilidade quanto ao ajuste do tamanho.
VANTAGENS
Spray Chilling
Produtos hidrofílicos:
como minerais, vitaminas, enzimas,
acidulantes,
Produtos voláteis e sensíveis a altas temperaturas,
Produtos hidrofóbicos:
flavours, óleos essenciais, entre
outros
Spray Chilling
Lipídeos
(Reithmeier et al, 2001).
Fosfolipídeos
Misturas
Ácidos graxos Ceras
Glicerídeos
Ajustar o ponto de fusão da matriz
Diferentes composições de matriz – melhor retenção do ativo
MATERIAIS DE PAREDE
Spray Chilling
Contato com o ar frio
Solidificação do lipídeo
Enrijecimento da matriz da parede
T Tfusão
Spray Chilling
Diâmetro médio característico de
produtos atomizados (1 – 100 microns)
São insolúveis em água
Liberação:
quanto maior a
solubilidade do ativo
=
mais pronunciada é a
liberação
(efeito “burst”)
CARACTERÍSTICAS
Spray Chilling
Capacidade limitada de armazenamento do ativo,
Expulsão do ativo durante a estocagem,
Quantidade de ativo superficial.
Limitações
Spray Chilling
Expulsão do ativo
tempo
Redução das regiões amorfas
Transições polimórficas
Carregadores Lipídicos
Nanoestruturados (NLC)
Lípideo sólido + Óleo
Aumentar a capacidade de carga
Minimizar a expulsão do recheio
ALTERNATIVA
Spray Chilling
Ponto de amolecimento – “Melting Point”
método do tubo capilar aberto (Cc 3-25 da AOCS, 1990)
Difração de Raios-X – define a forma polimórfica
Avaliação Calorimétrica (DSC): modificações: físicas,
fracionamento, hidrogenação e interesterificação.
Distribuição de tamanho e diâmetro médio
Morfologia das micropartículas
Eficiência de encapsulação
Perfil de liberação do ativo
Spray Chilling
Caracterização das partículas
Micropartículas lipídicas sólidas contendo compostos hidrossolúveis com diferentes
massas molares: produção, caracterização e perfis de liberação.
H. N. M., Chambi; I. D., Alvim; D. Barrera-Arellano ; C. R. F., Grosso
Materiais
• Ácido esteárico (C18:0, p.f. = 69,6 °C)
• Ácido oléico (C18:1, p.f. = 13,4 °C)
• Ácido láurico (C12:0, p.f. = 44,0 oC)
• D-glicose anidra
• Caseína (proteína : 88,6 ± 2.0%; cinza: 2.51 ± 0.02%; umidade: 11.01 ± 0.08% base seca, material obtido por precipitação ácida)
• Caseína Hidrolisada
• Triesterato de sorbitana (Dhaytan S60, HLB: 2.1)
Proporções de AE/AL e AE/AO • AE/AL 57/43 (w/w, %)
• AE/AO nas proporções 50/50 (w/w, %).
• pontos de fusão em torno de 56,8°C.
Fatty Acid Data Book (Unichema International, 1987).
Caracterização das micropartículas lipídicas sólidas
Eficiência de encapsulação
Diâmetro médio das partículas
Morfologia e distribuição do hidrolisado de caseína nas micropartículas lipídicas
Materiais
1 2 3
16.9 kDa
14.4 kDa
10.7 kDa
8.6 kDa
6.2 kDa
Eletroforese SDS-PAGE da caseína ácida comercial e do hidrolisado de caseína. Coluna 1 – Padrão contendo proteínas de diferentes massas moleculares; coluna 2 - caseína hidrolisada e coluna 3 - caseína comercial.
Resultados
Planejamento experimental fatorial 23 com três pontos centrais e tempos de liberação de 50% da glicose, em água e a temperatura ambiente (T50) e respectivos coeficientes de correlação (R2) obtidos no planejamento experimental.
a p/p; b Mistura lip í dica (AE/AL ou AE/AO, p/p lipidico ); c( Lip í dio/sol glicose, p/p), d (p/p lip í dico ),
Vari á veis Resposta
Ensaios Sol. Gli .
(%) a Lip
b /Sol. gli
c Surfactante (%)
d T50 (min)
Este á rico/ Laurico Este á rico/Ol é ico
1 50 70/30 3,0 5,8 (0,986) 21,4 (0,973)
2 50 70/30 7,0 29,5 (0,980) 44 ,7 (0,943)
3 50 90/10 3,0 2,2 (0,967) 27,7 (0,975) 4 50 90/10 7,0 20,9 (0,957) 44,7 (0,912)
5 70 70/30 3,0 3,6 (0,967) 12,3 (0,967)
6 70 70/30 7,0 5,4 (0,979) 16,2 (0,979)
7 70 90/10 3,0 2,2 (0,977) 34,7 (0,954)
8 70 90/10 7,0 9,5 (0,979) 20,4 (0,958)
9 60 80/20 5,0 5,3 (0,986) 131,8 (0,921)
10 60 80/20 5,0 4,0 (0,965) 123,0 (0,929)
11 60 80/20 5,0 8,3 (0,976) 128,0 (0,925)
a p/p; b Mistura lip í dica (AE/AL ou AE/AO, p/p lipidico ); c( Lip í dio/sol glicose, p/p), d (p/p lip í dico ),
Vari á veis Resposta
Ensaios Sol. Gli .
(%) a Lip
b /Sol. gli
c Surfactante (%)
d T50 (min)
Este á rico/ Laurico Este á rico/Ol é ico
1 50 70/30 3,0 5,8 (0,986) 21,4 (0,973)
2 50 70/30 7,0 29,5 (0,980) 44 ,7 (0,943)
3 50 90/10 3,0 2,2 (0,967) 27,7 (0,975) 4 50 90/10 7,0 20,9 (0,957) 44,7 (0,912)
5 70 70/30 3,0 3,6 (0,967) 12,3 (0,967)
6 70 70/30 7,0 5,4 (0,979) 16,2 (0,979)
7 70 90/10 3,0 2,2 (0,977) 34,7 (0,954)
8 70 90/10 7,0 9,5 (0,979) 20,4 (0,958)
9 60 80/20 5,0 5,3 (0,986) 131,8 (0,921)
10 60 80/20 5,0 4,0 (0,965) 123,0 (0,929)
11 60 80/20 5,0 8,3 (0,976) 128,0 (0,925)
Resultados
Eficiências de encapsulação e diâmetros médios para micropartículas lipídicas contendo glicose obtidas segundo o planejamento experimental.
a M é dia ± desvio padrão.
Eficiência de encapsula ç ão ( % ) Diâmetro ( m m) a
Ensaios AE/AL AE/AO AE/AL AE/AO 1 100 100 15,4 6,6 23,2 8,3 2 100 82,9 21,0 9,2 24,4 7,9 3 77,6 95,6 21,4 10,5 17,2 6,5
4 91,1 100 17,9 6,8 16,7 5,4 5 100 76,4 13,5 6,1 15,8 8,0 6 100 100 17,2 9,2 14,7 7,1 7 99,6 100 16,6 10,6 12,6 6,8 8 100 99,6 14,5 7,5 15,9 8,4 9 96,0 99,5 15,1 8,6 16,1 8,8
10 94,0 95,2 12,3 6,4 13,8 8,7 11 100 96,6 13,0 6,7 16,8 8,3
a M é dia ± desvio padrão.
Eficiência de encapsula ç ão ( % ) Diâmetro ( m m) a
Ensaios AE/AL AE/AO AE/AL AE/AO 1 100 100 15,4 6,6 23,2 8,3 2 100 82,9 21,0 9,2 24,4 7,9 3 77,6 95,6 21,4 10,5 17,2 6,5
4 91,1 100 17,9 6,8 16,7 5,4 5 100 76,4 13,5 6,1 15,8 8,0 6 100 100 17,2 9,2 14,7 7,1 7 99,6 100 16,6 10,6 12,6 6,8 8 100 99,6 14,5 7,5 15,9 8,4 9 96,0 99,5 15,1 8,6 16,1 8,8
10 94,0 95,2 12,3 6,4 13,8 8,7 11 100 96,6 13,0 6,7 16,8 8,3
Resultados
Porcentagem de proteína liberada para as misturas lipídicas AE/AL e AE/AO. CH: caseína hidrolisada; CC: caseína comercial; T3: tratamento 3
(tabela 1); T9: tratamento 9
Os valores apresentados ao lado das barras no gráfico representam a média de três repetições (desvio padrão).
24,6
(1,6)
43,6(1,2)
0,0(0,0)
29,3(3,7)
49,4(0,5)
58,4(0,2)
6,1(1,0)
55,2(3,2)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
CH(T3) CC(T3) CH(T9) CC(T9)
Fonte protéica (Tratamento)
AE/AL AE/AO
Pro
teín
a Li
be
rad
a (%
)
Resultados
MEV: Micropartículas Lipídicas (contendo hidrolisado de caseína) a e b - Mistura lipídicas AE/AL c e d – Mistura lipídicas AE/OL
barras = 10 µm
A B
C D
Resultados
Microscopia confocal Micropartículas lipídicas contendo caseína
hidrolisada (matriz AE/AL)
Nile Red
FITC
sobreposição
Resultados
Materiais
•Gordura extraída de Pacu (Piaractus mesopotamicus); •Ácido esteárico (C18:0, p.f. 69,6 °C,); •Alginato de sódio; •Goma gelana; •Pectina cítrica (BTM) amidada; •Cloreto de cálcio dihidratado; •D- glicose anidra; • Isolado protéico de soro de leite; •Monoestearato de sorbitana, triestearato de
sorbitana, poliglicerol polirricinoleato
Ponto de fusão das misturas de gordura de peixe (GP) e ácido esteárico (AE).
S= Sólido; L= Líquido
Temperatura (° C)
25 35 40 45 50
70:30 S S S S L 80:20 S S L L L 90:10 S L L L L
GP: AE (%)
Planejamento experimental (variáveis numéricas e codificadas) e respostas de eficiência de encapsulação (E.E) e liberação após 60 minutos (LIB60’), para avaliação da produção de micropartículas lipídicas contendo glicose
* Os números entre parênteses representam as variáveis codificadas.
Variáveis * Respostas
Ensaio GLY (%) LIP/GLY (%)
E.E. (%) LIB60’(%)
1 80(+1) 60/40 (+1) 93,89 65, 25 2 80(+1) 80/20 ( - 1) 97,85 41,11 3 50 ( - 1) 60/40 (+1) 98,43 33,53 4 50 ( - 1) 80/20 ( - 1) 100,00 26,75 5 65 ( 0 ) 70/30 ( 0 ) 97,55 13,70 6 65 ( 0 ) 70/30 ( 0 ) 96,10 15,57 7 65 ( 0 ) 70/30 ( 0 ) 96,10 11,69
Planejamento experimental (variáveis numéricas e codificadas) e respostas de eficiência de encapsulação (E.E) e liberação após 60 minutos (LIB60’),para avaliação da produção de micropartículas lipídicas contendo proteína.
Os números entre parênteses representam as variáveis codificadas
Variáveis * Respostas
Ensaio WPI (%) LIP/WPI (%) E.E. (%) LIB60’(%)
1 40(+1) 70/30 (+1) 100,00 59,11
2 40(+1) 90/10 ( - 1) 81,99 22,08
3 8 ( - 1) 70/30 (+1) 87,20 44,36
4 8 ( - 1) 90/10 ( - 1) 94,41 28,50
5 24 ( 0 ) 80/20 ( 0 ) 97,23 76,48
6 24 ( 0 ) 80/20 ( 0 ) 93,13 86,97
7 24 ( 0 ) 80/20 ( 0 ) 93,49 87,51
Valores médios e respectivos desvios padrões de eficiência de encapsulação dos compostos hidrofílicos (EE). sólidos totais e diâmetros médios (mm) dos sistemas geleificados contendo micropartículas (MP) ou emulsão lipídica (EM) com glicose (GLY) ou proteína (WPI).
Sistema Tratamento EE (%)
Sólidos totais
(%)
Diâmetro m édio ( m m)
GLY - MP 47,9 ± 6, 5 5,4 ± 0, 6 296,2 ± 199,2 GLY - EM 1, 2 ± 0,2 5 , 0 ± 0, 3 145,8 ± 1 18,8 WPI - MP 67,8 ± 7, 6 5,2 ± 0, 3 330,4 ± 196,9
PECTINA
WPI - EM 63, 9 ± 1, 9 5,1 ± 0, 1 273,9 ± 200,1
GLY - MP 62,7 ± 7,3 5,1 ± 0,2 164,6 ± 145,8
GLY - EM 3, 7 ± 0,2 5, 5 ± 0, 2 161,7 ± 147,7
WPI - MP 70, 6 ± 5,2 4, 4 ± 0,4 149,1 ± 111,3 PE/GE/AL
WPI - EM 74, 7 ± 2, 4 5,2 ± 0,0 2 155,8 ± 118,3
A
10 m m
B
10μm
Microscopia ótica das micropartículas lipidicas. A – conteúdo de glicose; B – conteúdo de proteína. Aumento de 12,5x (barra = 10µm)
500x 10 kV 10µm500x 10 kV 10µm 500x 10 kV 10µm500x 10 kV 10µm
mistura lipídica com proteína mistura lipídica com glicose
MEV de micropartículas gelificadas com pectina
0 50 100 150 200 2500
10
20
30
40
50
gly
wpi
wpiEM
Lib
era
çã
o (
%)
Tempo (minutos)
0 50 100 150 200 2500
10
20
30
40
50
gly
wpi
wpiEM
Lib
era
çã
o (
%)
Tempo (minutos)
A – sistema com pectina; B - sistema com pectina/gelana/alginato.
B A
Liberação (%) da glicose (gly) e da proteína (wpi), retida em micropartículas lipidicas ou em emulsão lipídeo+proteína (wpi-EM), encapsuladas em matrizes de gel, úmidas.
Material Characterization
Low Metoxyl Amidated Pectin (CP Kelco – Limeira, BR)
81.3 ± 1.2% galacturonic acid, 30.4 ± 1.6% sterification degree 10.4 ± 1,0% amidation degree.
Sodium Alginate (Manugel DMB, FMC – Campinas, BR)
Protein content: 80.5 ± 0.3% Moisture content: 7.2 ± 0.3%
Lipids: 7.6 ± 0.3% Ash: 3.9 ± 0.1%
Model Oil 16:0 (palmitic) – 10.04%, 18:0 (stearic) – 5.13%, 18:1
(oleic) – 20.17%, 18:2 (linoleic) – 50.68%, 18:3 (linolenic) – 10.18%
Material Characterization
Whey protein concentrated (WPC, Arla Foods – Cordoba, AR)
Protein content: 80.5 ± 0.3% Moisture content: 7.2 ± 0.3%
Lipids: 7.6 ± 0.3% Ash: 3.9 ± 0.1%
White Egg – Ovalbumin (Saltos Alimentos – Salto, BR)
Protein content: 90.5 ± 0.8% Moisture content: 6.7 ± 0.4%
Lipids: 0.40 ± 0.06% Ash: 5.0 ± 0.1%
WPC – b-lactoglobulin ( 50%)
MW - 18.3 kDa 162 aa residues One Thiol group
Two disulfide bonds Resistant to proteolysis by gastric proteases
White Egg - Ovalbumin (50 – 65%)
MW - 45 kDa 365 aa residues Four Thiol group
One disulfide bonds Monomeric phosphoglycoprotein
Globular Proteins
Methods
Emulsion: 2% LMAP or 2% Alginate, 1,65% sun flower oil (w/w solution) 14,000 rpm/3 min
Double fluid atomizer, calcium chloride solution 2%, 30 min (hardening time).
Particle Production
Particle Recovering
2, 4, 6 and 8 % of protein in solution, 30 min
Methods
Morphology: Optical Microscopy and SEM
Mean Size: Light scattering (Mastersizer)
Calcium content and real density
Protein and moisture content (AOAC, 2006)
Confocal microscopy and electrophoresis
Particle Characterization
Zeta potential o f solutions: Zetasizer Nano-Z
Peroxide values – stability during 28 days at 45 oC
3 4 5 6 7
-40
-20
0
20
40
OVA
OVA WPC (1:1)
WPC
Zeta
Pote
nti
al
(mV
)
pH
Results – Zeta Potential
3 4 5 6 7
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
Zet
a P
ote
nti
al (
mV
)
pH
ALG + OIL
ALG
3 4 5 6 7
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
Zet
a P
oten
tial
(m
V)
pH
PEC + OIL
PEC
Results – Calcium content (DB) and density
Ppectin – 1.435 ± 0.02 mmol Ca/mg of particles (d.b.)
Palginate – 2.475 ± 0.01 mmol Ca/mg of particles (d.b.)
Ppectin – 1.097 ± 0.006 g/cm3
Palginate – 1.214 ± 0.007 g/cm3