Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák •...
Transcript of Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák •...
Biológiai Intézet
Immunológiai
Tanszék
Antigén–ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló
analitikai módszerek II.
Áramlási citofluorimetria
Konfokális lézerpásztázó mikroszkópia
Uzonyi Barbara
2019.11.07.
Fluoreszcens technikák
• érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni
• térbeli és időbeli feloldást is lehetővé tesz
• nem veszélyes (vs. radioaktív technikák)
• egyszerre több jel mérhető ugyanabban a mintában
• élő sejtek vizsgálatára is alkalmas
Módszerek / műszerek:
spektrofluorimetria
fluoreszcens scanner
FLIA (fluorescent immunoassay)
DNS-szekvenálás és DNS-detektálás (PCR, qRT-PCR)
áramlási citometria
fluoreszcens mikroszkópia (FISH, CLSM)
BD FACSCanto II
Az áramlási citométer felépítése
Beckman Coulter CytoFLEX
minta
köpenyfolyadék
Az áramlási citométer felépítése
Hidrodinamikai fókuszálás:
- lamináris áramlás
- véd és irányít
- mérendő részecskék rendezéseFluidikai rendszer
Molecular Probes Tutorial
Az áramlási citométer felépítése
• megvilágítás
• gerjesztés
UVközeli
UVviolett sötétkék kék zöld
sárgás-
zöldnarancs vörös
hullám-
hossz (nm)325/355 375 405/407 445/457 488 514-532 561 592 633-640
Lézer
Molecular Probes Tutorial
Az áramlási citométer felépítése
optikai
rendszer
Lencsék, tükrök, szűrők
• fókuszálják a fényt
• gyűjtik és felosztják a szórt és emittált fényt
Molecular Probes Tutorial
Detektorok
FL
SSC
FSC
Számítógép
• citométer vezérlése
• adatgyűjtés és -tárolás
• analízis
Detektorok
• fotodiódák vagy fotoelektronsokszorozók
• optikai jelet elektromos jellé alakítják
• jelerősítés
Az áramlási citométer felépítése
Molecular Probes Tutorial
MérésFényút a mérőcellában
minta: 105 – 106 sejt/ml
áramlási sebesség: 30-60 µl/perc
~103 -104 sejt/másodperc
>10000 sejt/minta mérésenként
www.bdbiosciences.com
Molecular Probes Tutorial
Fluoreszcencia
Oldalra irányuló fényszórás (SSC)
Mért paraméterek
Előre irányuló fényszórás (FSC)
1-6 (18) csatornában
Molecular Probes Tutorial
Oldalra irányuló fényszórás (SSC)
Előre irányuló fényszórás (FSC)
Mért paraméterek
Előre irányuló fényszórás (forward scatter, FSC)
• fényelhajlás
• arányos a sejt méretével
• a megvilágító fény tengelyén mérjük
(megvilágító fény blokkolása!)
Oldalra irányuló fényszórás (side scatter, SSC)
• fényszórás és fénytörés
• arányos a sejt belső komplexitásával
• a megvilágító fényre merőlegesen mérjük
Mért paraméterek
Fluoreszcencia
Abszorbeált fény Emittált fény
gerjesztés emisszió
Alapállapot
Gerjesztett állapot
Antitest
Antigén
Fluorokróm
DNS
Fluoreszcens
nukleinsav
festékek
A fluoreszcencia forrása
1. autofluoreszcencia
aromás aminosavak, NADH, NADPH...
2. jelölés
Egyéb fluoreszcens próbák:
• pH
• intracelluláris ionok
• membránpotenciál
• reaktív oxigéngyökök
• organellum
• transzportfehérjék
• enzimszubsztrátok
• ...• sejtfelszíni
• intracelluláris
fixálás, permeabilizálás
• direkt
• indirekt
emissziós spektrum
gerjesztési spektrum
hullámhossz (nm)
rela
tív
inte
nzitás
(%)
gerjesztő lézer
(488 nm) detektált hullám-
hossztartomány
A fluorofórok spektrális tulajdonságai
www.thermofisher.com
FITC (fluoreszcein-izotiocianát)
• melyik hullámhosszon optimális az adott fluorofór gerjesztése
• milyen hullámhossztartományban célszerű detektálni
Előre irányuló
fényszórás (FSC)
Oldalirányú fényszórás
(SSC)
Hisztogram: egyparaméteres gyakoriság eloszlás
x-tengely: mért szignálintenzitás
y-tengely: adott intenzitáshoz tartozó eseményszám
Eloszlás
méret alapján
Eloszlás
granuláltság alapján
Az adatok ábrázolása
granulociták
monociták
limfociták
Humán vérminta FSC–SSC képe a vörösvértestek lízise után
Az adatok ábrázolása
Molecular Probes Tutorial
Felhődiagram („Dot-Plot”): kétparaméteres ábrázolás
x- és y-tengelyen is egy mért paraméter intenzitás eloszlása van
dot plot
density
plot
contour
plot
Az adatok ábrázolása
Relatív fluoreszcenciaintenzitás
Sejtszám
Az emittált fluoreszcens fény intenzitása arányos a
sejtek által megkötött fluorokróm molekulák számával.
jelölt sejtekjelöletlen sejtek
(autofluoreszcencia)
www.bdbiosciences.com
Az adatok ábrázolása – fluoreszcencia
Fluoreszcenciaintenzitás 1 (zöld)Flu
ore
szcencia
inte
nzitás
2 (
nara
ncs)
Jelölés többféle ellenanyaggal / festékkel
Az adatok ábrázolása – fluoreszcencia
Kapuzás („gating”): egy adott sejtpopuláció kijelölése
CD45
SS
C
granulociták
monociták SS
C
CD3
CD3– CD3+
CD3–
CD3+
Sejtszám
Fluoreszcenciaintenzitás (CD3)
CD3–
B-sejtek
NK-sejtek
CD3+
T-sejtek
CD45+ limfociták
www.bdbiosciences.com
Az adatok ábrázolása – kapuzás
Fluoreszcenciaintenzitás (CD3)
• alvadásgátolt vér, köldökzsinórvér, vérkészítmények
• testfolyadékok, pl.
csontvelő, gerincvelői folyadék, ízületi folyadék, tüdőváladék, ejakulátum...
• szövetek (a sejtek szuszpenzióba hozása után)
• tenyésztett sejtvonalak
• gyöngyök (latexpartikulumok kalibráláshoz, szolubilis molekulák méréséhez)
• mikroorganizmusok (baktériumok, gombaspórák, egysejtűek)
természetes vizekből, tenyészetekből, testfolyadékokból...
• exoszómák, mikrovezikulák
• kromoszómák
• ...
Citométerrel mérhető minták
Részecskék / sejtek szuszpenzióban (~300 nm – 100 µm)
Kent, Stephen J (June 2017) HIV Vaccine Approaches. In: eLS. John Wiley & Sons, Ltd: Chichester.
Idő (évek)
CD
4+
lim
fociták
szám
a/µ
l vér
Opportunista fertőzések
Wilcox CM & Saag MS, Gut2008;57:861–870.
Immunológiai vizsgálatok:
HIV-fertőzöttek diagnosztizálása és monitorozása
CD4+ > CD8+ CD4+ < CD8+
Diagnózis: szerológiai vizsgálatok (pl. plazmában antitestek és virus kimutatása)
+ hematológiai vizsgálatok
www.med4you.at
Egészséges Beteg
Immunológiai vizsgálatok:
HIV-fertőzöttek diagnosztizálása és monitorozása
Normál tartomány:
CD4+: 31-63 %, 314-1270 sejt/µl*
CD8+: 12-37 %, 147-836 sejt/µl*
Kalibrációs gyöngyök
segítségével meghatározható
az abszolút sejtszám.
Abszolút CD4+ sejtszám szükséges
- profilaktikus kezelés esetén (opportunista fertőzések)
- antiretrovirális terápia megkezdése előtt
www.bdbiosciences.com
CD3/CD4/CD8/CD45
* Bisset RL et al., 2004 Eur J Haematol. 72(3):203-12.
Immunológiai vizsgálatok:
HIV-fertőzöttek diagnosztizálása és monitorozása
• malignus B-sejt limfóma
• monoklonális plazmasejtszaporulat a csontvelőben
• paraprotein / M-Protein (kóros immunglobulin)
Diagnosztika:
• Labor – vizelet- és vérvizsgálatok
• képalkotó eljárások
• immunfenotipizálás
• csontvelővizsgálatokTakeda Oncology
Immunológiai vizsgálatok:
Mielóma multiplex
Plazmasejtek a csontvelőben
Molekuláris biológiai módszerek: allélspecifikus PCR, NGS
- érzékenyebbek lehetnek
- drágábbak
- diagnosztikai mintának kell lenni a terápia előtt
- nem rutin laboratóriumi eljárások
Jelinek et al., Blood Cancer J. 2017 Oct; 7(10):e617.
Minimális reziduális betegség kimutatása
abnormális plazmasejtek
normál plazmasejtek
többi csontvelői sejt
CD45−/CD38dim/CD19−/CD56+/CD27−/CD81−/CD117+/cyKappa+
Immunológiai vizsgálatok:
Mielóma multiplex – betegségkövetés
Sejtaktivitás mérése – fagocitózisteszt
www.imd-berlin.de
Funkciózavarok:
• veleszületett immundefektus
• tumor, krónikus fertőzések, AIDS, TBC
• iatrogén funkcióvesztés
pl. immunszuppresszív kezelés
Neutrofil granulociták:
• veleszülett immunrendszer sejtjei
• fehérvérsejtek 65-70%-a
• baktériumok, gombák eliminációja
• kemotaxis, fagocitózis, reaktív oxigéngyökök
termelése
Fagocitózis teszt
Heparinos vér
+ opszonizált jelölt E. coli
Inkubálás 37°C-on
A festék cask akkor fluoreszkál, ha
alacsony a közeg pH-ja – vagyis
bekerült a fagolizoszómába.
www.thermofisher.com
Sejtaktivitás mérése – fagocitózisteszt
• apoptózis
• sejtciklus analízis
• ploiditás vizsgálat
• ivarsejtek válogatása
• proliferáció
DNS-festékek kötődése
• mindig sztöchiometrikusan kötnek (mennyiségi meghatározás)
• membránpermeábilis és impermeábilis festékek
beépült nukleotid-analóg jelölése
fluoreszcensen
www.thermofisher.com
DNS-tartalom mérése
DNS-tartalom mérése
Hang & Fox, Methods Mol Biol. 2004;241:23-35.
se
jtszám
fluoreszcenciaintenzitás (PI)
se
jtszám
fluoreszcenciaintenzitáswww.thermofisher.com
proliferáció
sejtciklus
Marie D et al., http://citeseerx.ist.psu.edu Alice Longobardi Givan: Flow cytometry: first principles (Wiley, 2001)
T0
20 hKlo
rofill
fluore
szcencia
FSC
Óceanográfia – természetes fikobiliproteinekMit eszik a kagyló?
Fitoplanktonok azonosítása
FSC SSC
SSC
fikoeritr
inF
I
fikoeritrin FI
klo
rofill
FI
klo
rofill
FI
klo
rofill
FI
Antibiotikumrezisztencia mérése
Inokulálás
baktériumok növesztése
40-60 Min
Inkubálás:
antibiotikum és DiBAC4(3)
120 Min
citometria
kontroll és 6 minta
centrifugálás és
reszuszpendálás
Nuding and Zabel. J Bacteriol Parasitol 2013, S:5
DiBAC4(3):
fluoreszcens festék a
membránpotenciál
változásának mérésére
Nuding and Zabel. J Bacteriol Parasitol 2013, S:5
E. coli izolátum antibiotikumrezisztencia vizsgálata
Antibiotikumrezisztencia mérése
Kirby-Bauer korongdiffúziós teszt (24 h)kontroll
antibiotikummal kezelt
Multiplex áramlási citometriás mérés
• CBA – Cytokine Bead Array (Beckton Dickinson)
• Nagy számú analit mérése akár 1 mintából (vs ELISA, ahol sok mintából 1 analit mérése)
• Nem tudjuk, hogy melyik populáció termelte az adott citokint (ELISA-nál sem)
• Detektálható citokinek: IFNγ, IL-10, IL-6, IL-4, IL-2, TNFα...
• Felhasználható mintatípusok: szérum, plazma, sejtkultúra felülúszója
gyöngyök minta
detektáló antitestek
mosás citometriás
mérés
koncentráció
standardgörbe
www.bdbiosciences.com
Multiplex citometria – citokinmérés
citometriás
mérés
PE (FL2) +
APC (FL3)
FITC (FL1)
Multiplex citometria – citokinmérés
Sejtválogatás - szortírozás
FACS: fluorescence-activated cell sorting
https://lombardi.georgetown.edu
Fluoreszcens mikroszkópia
www.edmundoptics.com
fényforrás
• lézer
• lámpa
excitációs filter
• szelektív – csak a jelölt molekulákat látni
• térbeli és időbeli meghatározás
• minta: adherens és kitapasztott sejtek is
• jelölés gyakorlatilag azonos a citometriással
detektor
kamera
fotoelektronsokszorozó
emissziós filter
dikroikus
tükör
Paramecium sp.
www.leica-microsystems.com
minta
Lézer pásztázó konfokális mikroszkóp (CLSM)
http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu
• élő sejtek, folyamatok vizsgálata
(live cell imaging)
• pontos lokalizáció
kolokalizáció, FRET
hátrányok, nehézségek:
• kevés sejtről ad információt
(citometriához képest)
• lassabb (felbontástól függően)
adott idő alatt kevesebb sejt mérése
• fluorofórok halványodása, „kiégése”
• max. 4 paraméter
FRET: fluoreszcencia-rezonancia energia transzfer
Széles mező megvilágítás (WF) vs. pont szkennelés (CLSM)
fényforrás
minta
széles mező konfokális
lyukdiafragma
„pinhole”
Lézer pásztázó konfokális mikroszkópia – optikai szeletelés
www.olympus-lifescience.com
napraforgó pollen
(széles mező, epifluoreszcens kép)
20-40 µm nagy
0,5 µm-es szeletekcam.facilities.northwestern.edu
• fokális sík < minta vastagsága
• kép több fokális síkból leképezi az egész mintát
• fókuszon kívüli jelek kizárása
Kontrasztfelvételek
www.olympus-lifescience.com
• Külön felvételek, digitálisan egymásra vetítve
(merge, overlay)
• A fluoreszcens jel lokalizációja
Fázis kontraszt (PC):
speciális kondenzor + fáziskontraszt objektív
megnövelt kontraszt
vékony (0,1 – 1 µm) mintáknál
Differencia interferencia kontraszt (DIC):
polarizátor + prizmák
relief-szerű kép
relatív vastag minták is vizsgálhatók így
Fibroblasztok
differencia
interferencia
kontraszt
sejtmag (DAPI) egymásra vetítve
Macska agyszövet, Criptococcus fertőzés
fázis kontraszt
neuron (FITC)
Criptococcus
(kongóvörös) egymásra vetítve
Időbeli folyamatok követése:
Neutrofil extracelluláris csapda képződése
Bruns et al., PLoS Pathogens. 2010; 6: e1000873.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000873.s002
Video S1
Összefoglalás
Áramlási citometria
• gyors
• multiparaméteres
• sok sejtről ad információt (statisztika)
• adherens sejtek, szövetek nem fiziológiásan
• lokalizáció nem mérhető
• időbeli folyamatok csak populációszinten
• adatok archiválása könnyű
Konfokális lézer pásztázó mikroszkópia
• lassabb (adott idő alatt kevesebb sejt mérhető)
• max. 4 paraméter
• kevesebb sejtről ad információt
• adherens sejtek, szövetek is fiziológiásan
• pontos térbeli lokalizáció
• időbeli folyamatok sejtszinten mérhetők
• adatok archiválása nehézkes (nagy méretű fájlok)
minta
(szuszpenzió)
fényszórás
fluoreszcencia
minta
(hordozón)
kontrasztkép
fluoreszcencia
Köszönöm a figyelmet!
www. cellcartoons.net