ANTICORPI MONOCLONALIANTICORPI MONOCLONALI

Pure single Ab

After immunization, the mouse spleen contains B cells producing specific antibodies.Each B cell produces only one kind of antibody, which binds to its specific antigen. Conventional antiserum is the mixture of all antibodies produced by B cells from spleen.If a single B cell was picked up and cultured, then it will produce only one kind of antibody. But B cell can not survive well in the culture.Myeloma cell can be cultured in the test tube, but can not produce useful antibody.Each hybridoma line can produce pure single antibody, called monoclonal antibody.If B cell is fused with myeloma, the fused cell might be cultured and produce antibody.

Adapted from Milstein (1980) Scientific American, Oct. p.58

1

23

4

mm

mm

1

2 34

1 2 3 4

Monoclonalantibodies

Cell fusion

Spleen cells

+Myeloma

x

Antiseum

Antigen

Immunization

A mixture of all Ab

1 23 4

BALB/c

1 2 3 4

1 23 4

B cell

Antibodies

Polyclonal Monoclonal

Antibodies that are collected from sera of exposed animal

recognize multiple antigenic sites of injected biochemical.

Individual B lymphocyte hybridoma is cloned and cultured.

Secreted antibodies are collected from culture media

recognize ONE antigenic site

of injected biochemical

Hybridoma

1975 Kohler and Milstein

http://www.immunecentral.com/images/immune_series/immune29.gif

Multiple myeloma (human disease)

Bence Jones proteins in urine

Fusions generated by Sendai virus

or PEG

Creation of monoclonal antibodies (mAb’s)

1. Hyperimmunize mouse with Ag

2. Fuse B cells with tumor fusion partner (+ PEG)

3. Limiting dilution (96 wells) to fractionate fused cells in HAT media selection

B cells die (mortal, HGPRT-positive)Tumor cells die (HGPRT deficient and cannot utilise salvage pathway)

Fusions live (HAT Resistant and immortal)

HAT media (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).

Hybridoma selection (HAT media) The de novo pathway can be inhibited using

aminopterin, which inhibits the transfer of methyl groups

from activated dihydrofolic acid.

cells need Hypoxanthine and Thymine as sources of purines and pyrimidines

for the salvage pathway.

Myeloma cells are HGPRT- and cannot create nucleotides in the salvage pathway.

Plasma cells are HGPRT+ and can utilize hypoxanthine in the salvage pathway.

Expand in mice or expand in vitro

in vitro material is less concentrated

and contains bovine serum

ascites fluid contain high [mAb]

and minor contaminationwith mouse Ig

How to purify your MAb

Monospecific antibodies

Affinity Purification•

Or use Ag or epitope to make

affinity column

http://www.tulane.edu/~wiser/methods/handouts/pwpt/17_mab.pdf

IMPIEGHI DEGLI ANTICORPI IMPIEGHI DEGLI ANTICORPI MONOCLONALIMONOCLONALI

• Protein purification• Identification and isolation of cell sub-

populations using fluorescence cell sorting.• Tumor detection and imaging• Tumor killing• Diagnostic reagents.• Drug Detoxification• Catalytic antibodies

IMMUNODIFFUSIONE

Immunoprecipitation

• At appropriate ratio of antigen:antibody, complex forms an insoluble aggregate.

• Technique can be used to purify specific protein from a mixture

• Co-immunoprecipitation – interacting proteins also found in the immunoprecipitate

• Determinazione delle concentrazioni relative di anticorpi o di antigeni

• Confrontare diversi antigeni tra loro

• Stabilire la purezza di un preparato antigenico

Impieghi dell’immunoprecipitazioneImpieghi dell’immunoprecipitazione

Immunodiffusione

• Quando l'immunoprecipitazione avviene all'interno di un gel si parla più propriamente di immunodiffusione.

• Immunodiffusione radialeImmunodiffusione radiale

• Immunodiffusione doppiaImmunodiffusione doppia

• immunoelettroforesiimmunoelettroforesi

Diagrammi di possibiliModelli di precipitazionecon la doppia immuno-diffusione eseguita su un antisiero e 2 diversi preparati antigenici

A: epitopi identiciB:nessun epitopo in comuneC:identità parziale

IMMUNOELETTROFORESI

Archi di precipitazione

Separazione elettroforetica degli Ag

• Determinare se un paziente produce quantità troppo basse di Ab isotipi, come si verifica in alcune immunodeficienze

• Si può vedere se produce se produce un eccesso di alcune proteine, quali albumina, immunoglobuline

Immunoelettroforesi quantitativaImmunoelettroforesi quantitativa

Ponendo in grafico l’altezza degli archi contro la concentrazioneSi otterrà una retta di taratura che può servire per determinare

la concentrazione di Ag in un campione incognito

TEST DI GRAVIDANZA: ES. DI INIBIZIONE DI AGGLUTINAZIONE

(Presenza o assenza di gonadotropina)

IMMUNOFLUORESCENZA

Gli Ab sono marcati con molecole fluorescenti

• Le molecole fluorescenti assorbono luce a una determinata lunghezza d’onda (eccitazione)e la emettono ad un’altra lunghezza d’onda (emissione).

• Se gli Ab sono marcati con i fluorocromi, possono essere rilevati attraverso la valutazione della luce colorata emessa in seguito all’eccitazione a una determinata lunghezza d’onda

• La luce emessa può essere rivelata con un microscopio a fluorescenza

• I coloranti possono essere coniugati alla regione Fc di una molecola senza modificarne la specificità

• Coloranti: fluoresceina, rodamina, ficoeritrina

Immunofluorescense

Bullous pemphgoid with linear deposits of IgG at dermal-epidermal junction

IFA of Ehrlichia chaffeensis in DH82 cells, 400X

Very good rapid diagnostics

Citofluorimetria e fluorescenza

• Queste tecniche si basano sull’impiego di Ab fluorescenti a hanno carattere qualitativo

• FACS (fluorescence-activated cell sorter)• Quando una cellula passa davanti al raggio laser, la luce viene

deviata dal rilevatore e questa interruzione del segnale laser viene registrata. Le cellule che possiedono l’Ab fluorescente legato ai loro Ag di membrana vengono eccitate dal laser ed emettono luce, che viene registrato da un secondo sistema, localizzato ad angolo retto rispetto al raggio laser.

• Lo strumento conta ogni cellule quando passa davanti al raggio laser e registra i livelli di fluorescenza emessa dalla cellula

• Un computer collegato crea i diagrammi con il numero delle cellule in ordinata e la loro intensità di fluorescenza in ascissa

SEPARAZIONE DI CELLULE MARCATE CON Ab

DIAGNOSTICA

ELISA – Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

Test antigenTest antiserum

Visualization of reaction

ELISA to test MAb production itself

www.ch.tum.de/wasser/weller/ formerprojects_im...

The dark blue spot represents a positive clone. The light blue spots are positive controls,

the next two wells to the right are negative controls

SAGGIOELISPOT

Saggio radio-immunologico• Il metodo è basato sulla competizione tra un antigene non marcato e una quantità fissa

dello stesso antigene marcato, per il legame con un numero limitante e costante di siti

anticorpali. – Ab + Ag* Ab/Ag*

– Ab/Ag* + Ag Ab/Ag Ab/Ag*

• E' necessario costruire prima di tutto una curva di taratura, % conc. Ag

Marcato legato a Ab

Conc. Ag non marcato

Tratto lineare

FRAZIONI DI Ab

The Fab fragment contains the antigen binding site Could be cleaved out by papain digest;

pepsin digestion even better, as it produces F(ab’)2

www-structure.llnl.gov/ fab/fab_tutl.htm

Often it is enough for diagnostic purposes – and it is easier to produce

Anti Botulinum toxin

Equine FAB fragment product made by DoD at time of Gulf War,

anti-ABCDEFGHinge region

Single chain Fv fragments

http://www.gene-therapeutics.com/Service/custom%20scFv%20antibodies/Abb-scFv.gif

The size and specificity of the ScFv fragment

may allow for attachment to cryptic sites

IMPIEGHI COME FARMACI

About 25-30% of women who have metastatic breast cancer overexpress HER-2 (EGF) receptor

Determination of HER2-protein overexpression (semiquantitative DAKO Hercep Test™)

Fluorescence in situ hybridisation (FISH)of HER2 amplification

www.roche.com/pages/ facets/9/herc.htm

http://www.roche.com/pages/facets/9/herc1.jpg

Herceptin (TrastuzuMAb) anti-HER MAbs

Approved!

Problemi con la terapia basata su mAb

• Gli Ab di topo sono visti come estranei dal sistema immunitario umano

• Innesco della risposta immunitaria contro gli HAMA (human anti-mouse antibody)

• Danni nell’ospite

• mAb causerebbero meno problemi

• (volontari cercasi??!!)

• Soluzione: anticorpi ibridi uomo-topo

• Anticorpi chimerici: Combinazione della regione variabile di topo con la regione costante di uomo

• Anticorpi umanizzati: Ab combina solo gli aa della regione ipervariabile di topo con il resto di Ab umano

Anticorpi umanizzati

Clone those genes and express them

as a recombinant protein in the protein expression system

Sales of Rituxan/MabThera by Year

http://www.sh.lsuhsc.edu/intragrad/micro/micro297/4

Topi transgenici con segmenti genici di anticorpi umani

http://www.sh.lsuhsc.edu/intragrad/micro/micro297/4

Xenomouse(topo con IgH e Igk umani)

Abgenix

Immunotoxin: Antibody-Toxin Conjugate

waynesword.palomar.edu/ images/antibod2.gif

ricin from the castor bean (Ricinus communis).

Antibody is tumor-specific

Only the targeted tumor cells are killed by the toxin

Common side effect –Vascular leak syndrome.

Could be relieved by usage of mutated toxin

Bunch of other toxins could be used

Saponin (from soapwort)

: www.som.soton.ac.uk/.../members/ DFlavell/djf2.htm

                                                                                                              

potent single chain ribosome inactivating protein

Goal: treatment of leukemias

and lymphomas

For T-cell leukemia could be targeted via CD7

OctreoScan in a patient with metastatic small cell carcinoma of the prostate

www.stjosephs-marshfield.org/

Monoclonal antibodies, which are specific for a certain antigen, i.e. prostate carcinoma cells, can be tagged with a radioactive tracer,

which when injected into the body will localize in areas of these recurrent carcinoma cells