1

Особенности температурных зависимостейспектрально-временных характеристик

флуоресценции пигмент-белковых комплексов цианобактерий

Клементьев К.Е., н.с.кафедра биофизики биологического факультета

МГУ

Сверху: строение фотосинтетических мембран цианобактерии Synechocystis sp. PCC6803. PC – фикоцианин, APC – аллофикоцианин, D1, D2, – белки комплекса ФС2, OCP – orange carotenoid protein. В центре: схематическое представление структуры тримеров аллофикоцианина по данным рентгеноструктурного анализа. Показано расположение хромофоров и элементы вторичной структуры. Снизу: химическое строение хромофора - фикоцианобилина. Пиррольные кольца пронумерованы от A до D.

Уровни организации фикобилипротеинов

Регистрация мгновенных спектров флуоресценции

Слева: схема установки для регистрации мгновенных спектров флуоресценции, обозначения: 1 – лазер, 2 – световод лазера, 3 – нейтральные светофильтры, 4 – кюветное отделение, 5 – фокусирующие линзы и граничные светофильтры, 6 – световод полихроматора, 7 – полихроматор, 8 – многоканальный детектор, 9 – система циркуляции воздуха, 10 – вычислительная плата и компьютер. Справа: мгновенные спектры флуоресценции аллофикоцианина при температуре 25 °С. Возбуждение 405 нм, 25 пс, 50 МГц.

4

Температурные зависимости

-200 -150 -100 -50 0 50

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

2200

медленное замораживание, Na-Pi быстрое замораживание, Na-Pi

, пс

Температура, °C

123

Аномальная температурная зависимость времени жизни флуоресценции аллофикоцианина.

[Е.Г. Максимов, Г.В. Цораев, В.З. Пащенко, А.Б. Рубин, Природа аномальной температурной зависимости времени жизни флуоресценции

аллофикоцианина, ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2012, том 443, № 3, с. 1–5.]

5

Методика замораживания

Термостатируемая ячейка Жидкий азот

Аномальная температурная зависимость времени жизни флуоресценции

аллофикоцианина

-200 -150 -100 -50 0 50

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

2200

2400

slow, Na-Pi fast, Na-Pi slow, 90% glycerol slow, dehydrated sample

Fluo

resc

ence

life

time

(ps)

Temperature (°C)

123

Аномальная температурная зависимость аллофикоцианина, медленное замораживание (красная кривая), быстрое замораживание (черная кривая), медленное замораживание в глицерине(синяя кривая), высушенный образец (желтая кривая)

-250 -200 -150 -100 -50 0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

2200

Temperature (K)

Fluo

resc

ence

lifet

ime

(ps)

Temperature (°C)

APC PE PC

0 50 100 150 200 250 300

Аномальная температурная зависимость времени жизни флуоресценции

фикобилипротеинов

Температурная зависимость фикобилипротеинов, аллофикоцианин (APC, красная кривая),фикоэритрин (PE ,черная кривая), фикоцианин (PC, синяя кривая).

Аномальная температурная зависимость времени жизни флуоресценции

аллофикоцианина с D2O

-200 -150 -100 -50 0 50500

750

1000

1250

1500

1750

2000

2250

2500

Fluo

resc

ence

life

time

(ps)

Temperature (°С)

D2O H2O

ps

Медленное замораживание аллофикоцианина в воде (красная кривая) и в дейтерированной воде (черная кривая)

Аномальная температурная зависимость времени жизни флуоресценции

аллофикоцианина

-200 -150 -100 -50 0 5028

30

32

34

36

38

40

42

44

46

FWHM

, нм

Температура, °С

быстрое замораживание, медленное замораживание,

Полуширина спектра флуоресценции АФЦ. Красные квадраты – медленное замораживание, Na-Pi буфер, рН 7,0. Черные круги – быстрое замораживание, Na-Pi буфер рН 7,0.

Стационарные спектры флуоресценции АФЦ на различных участках температурной зависимости при медленном замораживании.

575 600 625 650 675 700 725 750 775 800

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Медленное замораживание Быстрое замораживание

Инт

енси

внос

ть ф

луор

есце

нции

, о.е

.

Длина волны, нм

10

Влияние рН на времена жизни

Влияние рН на времена жизни флуоресценции (красная кривая) и полуширину (черная кривая).

11

Спектры кругового дихроизма (КД)

300 350 400 450 500 550 600-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

(

deg)

Длина волны (нм)

pH 7.0 pH 2.3

Спектр кругового дихроизма фикоэритрина при рН=7, красная линия, и рН=2.3, синяя линия

∆ 𝜀=𝜀𝑙−𝜀𝑟=∆𝐷𝑙∗𝑐

12

Измерение размера частиц фикоэритрина

10 100 1000

0

5

10

15

20

25

30Ч

исло

час

тиц

данн

ого

разм

ера,

%

Гидродинамический диаметр, нм

pH=7.0 pH=3.0 pH=2.3

М

ТА

А

Зависимость числа частиц фикоэритрина одного размера в % от гидродинамического диаметра, нм, при различных рН раствора.

М-мономер, Т-тример, А-агрегаты

13

Переход тример-мономер

тример мономер

14

Визуализация эквипотенциальных поверхностей

Мономер

Тример

рН=2рН=4рН=7

-200 -150 -100 -50 0 50

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

APC, slow, ex 635 nm APC, slow, ex 405 nm

Fluo

resc

ence

life

time

(ps)

Temperature, °C

123

Среднее время жизни флуоресценции аллофикоцианина при медленном замораживании . Красная кривая возбуждение 635нм (красный лазер), синяя кривая 405нм (синий лазер).

Аномальная температурная зависимость времени жизни флуоресценции

аллофикоцианина

Фотоизомеризация фикоэритрцианина

Marius Schmidt,§ Anamika Patel, Yi Zhao and Wolfgang Reuter, Structural Basis for the Photochemistry of R-Phycoerythrocyanin, Biochemistry 2007, 46, 416-423

Изменение конформации хромофора приводит к изменению спектральных

характеристик.

Изменение конформации фикобилипротеинов

17

18

Выводы1. Аномальные температурные зависимости времени жизни

флуоресценции характерны для всех типов фикобилипротеинов и зависят от наличия воды.

2. Визуализация эквипотенциальных поверхностей фикоэритрина показала, что мономеры в тримере удерживаются за счет специфических электростатических взаимодействий.

3. Изменение конформации белка приводит к изменению конформации флуорофора, что можно оценить по сокращению времен жизни и квантового выхода.

4. Фикобилипротеины являются удобным модельным объектом для изучения донорно-акцепторных механизмов миграции энергии.

19

Спасибо за внимание!