Anatomic Molecular Pathology:Anatomic Molecular Pathology:An Emerging FieldAn Emerging Field

Antonia R. Sepulveda M.D., Ph.D.Antonia R. Sepulveda M.D., Ph.D.University of PennsylvaniaUniversity of Pennsylvania

asepu@mail.med.upenn.eduasepu@mail.med.upenn.edu

2008 ASIP Annual Meeting2008 ASIP Annual Meeting

Anatomic pathology (U.S.) is a medical specialtythat is concerned with the diagnosis of diseasebased on the gross, microscopic, and molecularexamination of organs, tissues, and cells.

Molecular pathology

Molecular pathology is an emerging discipline within anatomicalpathology which is focused on the use of nucleic acid­basedtechniques such as in­situ hybridization, reverse­transcription,PCR, and nucleic acid microarrays for specialized studies ofdisease in tissues and cells.

Molecular pathology shares some aspects of practice with bothanatomic and clinical pathology, and is sometimes considered a"crossover" discipline.

Anatomic PathologyAnatomic Pathologynn Surgical PathologySurgical Pathologynn Surgical resection specimensSurgical resection specimensnnDiagnosis, stagingDiagnosis, stagingnnPrognostic/predictive markersPrognostic/predictive markers

nn BiopsiesBiopsiesnndiagnostic, stagingdiagnostic, stagingnn Prognostic/predictive markersPrognostic/predictive markers

nn CytopathologyCytopathologynn Cells in biological fluidsCells in biological fluidsnn Fine needle aspirationFine needle aspiration

nn Autopsy PathologyAutopsy Pathology

Surgical PathologySurgical Pathology

nn Surgical specimenSurgical specimennn SamplingSampling

nn Paraffin embedded tissueParaffin embedded tissue

Surgical PathologySurgical Pathology

Diagnosis:Diagnosis:Moderately differentiated adenocarcinomaModerately differentiated adenocarcinoma

SR08­6XX

Molecular Tests in AnatomicMolecular Tests in AnatomicPathologyPathology

nn Tumor tissueTumor tissueüü Mutational analysis: EGFR, BRAF,Mutational analysis: EGFR, BRAF, KrasKras, LOH, LOHüü Microsatellite Instability & DNA MMR IHCMicrosatellite Instability & DNA MMR IHCüü CpG methylation: hMLH1CpG methylation: hMLH1üü Chromosomal TranslocationsChromosomal Translocationsüü Gene expression profilesGene expression profiles­­predictive markerspredictive markersnn Microarray gene expression profilesMicroarray gene expression profilesnn MicroRNAMicroRNA profilesprofilesnn Proteomic testingProteomic testing

nn NonNon­­neoplasticneoplasticüü Infectious agentsInfectious agents

nn OtherOtherüü Identity tests (STR panels)Identity tests (STR panels)

Tissue Based Molecular Tests forTissue Based Molecular Tests forHereditary Nonpolyposis colorectal

Cancer (HNPCC) WorkupHNPCC) Workup

HNPCC and DNA Mismatch Repair Proteins

nn MutS:MutS: MSH2MSH2,, MSH6MSH6, MSH3, MSH3nn MutL:MutL: MLH1MLH1,, PMS2PMS2, MLH3, MLH3

MMR proteins function as heterodimersMMR proteins function as heterodimersThe heterodimers are required for protein stabilityThe heterodimers are required for protein stability

Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer (HNPCC):1­ Loss of function/expression of DNA mismatch

repair protein in tumors (germline mutation)2­ Mutator Phenotype: Microsatellite Instability (MSI)

Algorithm forLaboratoryTestingfor HNPCC

Lindor, NM et al. JAMA,296 (12), 2006

Algorithm forAlgorithm forLaboratoryLaboratoryTestingTestingfor HNPCCfor HNPCC

Lindor, NM et al. JAMA,296 (12), 2006

MSI

MLH1 methyland/orBRAF mut

TESTING MSI IN TUMORSTESTING MSI IN TUMORSPROTOCOLPROTOCOL

nn Unstained sections from formalin fixedUnstained sections from formalin fixedparaffin embedded tissueparaffin embedded tissue

nn Scrape selected areas for DNA extractionScrape selected areas for DNA extractionnn PCR amplification with MSI panelPCR amplification with MSI panelnn DNA fragment characterization byDNA fragment characterization by

electrophoresiselectrophoresis

BAT25 BAT26 D5S346 D17S250

N N N N

T T T T

COLORECTAL ADENOCARCINOMA:

ØHigh Level MicrosatelliteInstability (MSI­H)ØLoss of hMLH1 Protein

Expression

Gologan & Sepulveda et al.Arch Pathol Lab Med 2005;129: 1390­1397

Incidence and functional consequences ofIncidence and functional consequences ofhMLH1hMLH1 promoter hypermethylation in colorectalpromoter hypermethylation in colorectal

carcinomacarcinoma

11 of 13 (84%) MSI­positive cancersexhibited prominent methylation,compared with 2 of 21 MSI­negative cancers (P =0.0001).

Methylation specific PCR (MSP)

James G. Herman et al. and Stephen B.James G. Herman et al. and Stephen B. BaylinBaylinPNAS, Vol. 95, Issue 12, 6870PNAS, Vol. 95, Issue 12, 6870­­6875, 19986875, 1998

Distinction of HNPCC and Sporadic MicrosatelliteDistinction of HNPCC and Sporadic Microsatellite­­Unstable CRC through Quantification ofUnstable CRC through Quantification of

MLH1 Methylation by RealMLH1 Methylation by Real­­time PCRtime PCR

MM BettstetterBettstetter et al and Wet al and W DietmaierDietmaier.. Clinical Cancer ResearchClinical Cancer Research 13, 322113, 3221­­3228, 20073228, 2007

BRAF Mutation is Frequently Present in SporadicCRC with Methylated hMLH1, but not in HNPCC

nn BRAF:BRAF: cytoplasmic serine/threonine kinasecytoplasmic serine/threonine kinasenn Function:Function: mitogenmitogen­­activated protein kinaseactivated protein kinase

signaling pathwaysignaling pathwaynn Most of the mutations inMost of the mutations in BRAFBRAF : thymine to: thymine to

adenineadenine transversiontransversion at nucleotide 1796at nucleotide 1796nn Substitution ofSubstitution of valinevaline for glutamate (V600E)for glutamate (V600E)nn Results inResults in BRAFBRAF activating mutationactivating mutation

nn BRAFBRAF V600E mutationsV600E mutations occur in:occur in:nn Sporadic MSISporadic MSI­­H CRC (40H CRC (40­­74%)74%)nn Sporadic MSS CRC 4% to 12%Sporadic MSS CRC 4% to 12%nn BRAF V600E mutations not detectedBRAF V600E mutations not detected

in HNPCC patientsin HNPCC patientsG Deng et al. and YS Kim Clin Cancer Res, 10, 191­195, 2004

EPIDERMAL GROWTH FACTOREPIDERMAL GROWTH FACTORRECEPTOR (EGFR) TESTING INRECEPTOR (EGFR) TESTING IN

LUNG CANCERLUNG CANCER

Molecular Diagnosis in Lung CancerMolecular Diagnosis in Lung CancerNCCN Practice Guidelines (v.2.2008)NCCN Practice Guidelines (v.2.2008)

nn EGFR mutations define a subgroup ofEGFR mutations define a subgroup ofNSCLC patients who will benefit fromNSCLC patients who will benefit fromEGFR  tyrosine kinase inhibitor (TKI)EGFR  tyrosine kinase inhibitor (TKI)treatmenttreatment

Distribution of Mutations andDistribution of Mutations andResponse Rate to TKIResponse Rate to TKI

Cancer Science (OnlineEarly Articles).doi:10.1111/j.1349­7006.2007.00607.x

~90%

EX19 DEL

L858R

Not all EGRF mutationsassociated with response

Detection of EGFR Exon 19Detection of EGFR Exon 19DeletionsDeletions

Exon 19In­frame deletionsusually 9 –24 bp

208 bp –190 bp = 18 bp

Positive fordeletion

Normal

Oncotype DX is validated for use inbreast cancer patients

­­MultigeneMultigene Expression Assay (RTExpression Assay (RT­­PCR)PCR)to Predict Recurrence ofto Predict Recurrence of TamoxifenTamoxifen­­Treated, NodeTreated, Node­­Negative Breast CancerNegative Breast Cancer­­Selection of Patients for ChemotherapySelection of Patients for Chemotherapy

S.PaikS.Paik et al.et al. NEJM. 351:2817NEJM. 351:2817­­2826, 20042826, 2004

nn Gene expressionGene expressionmicroarraymicroarray­­based testbased test

nnHelps identify tissue ofHelps identify tissue oforigin of poorly &origin of poorly &undifferentiated cancersundifferentiated cancers

nn15 tissue types15 tissue types

PathworkPathwork™™ TissueTissueof Origin Testof Origin Test

CancerTYPEMolecularClassification Testn92­gene real­time

quantitative PCR assay

nMolecular classificationof human cancers

nn39 tumor classes39 tumor classes

Molecular Diagnosis of InfectiousMolecular Diagnosis of InfectiousAgentsAgents

nn Whipple’s disease:Whipple’s disease: TropherymaTropheryma whipelliiwhipelliinn Test: PCR forTest: PCR for rRNArRNA DNA sequenceDNA sequencenn Confirmation of diagnosis and followConfirmation of diagnosis and follow­­upup

The Molecular Anatomic PathologyThe Molecular Anatomic PathologyLaboratoryLaboratory

yeinjee.com/.../2007/08/paris­louvre­pyramid.jpg

Anatomic PathologyAnatomic Pathology

Molecular DiagnosticsMolecular Diagnostics

Career Opportunities in MolecularCareer Opportunities in MolecularAnatomic PathologyAnatomic Pathology

Environment:Environment:ØØAcademia, Hospitals, ReferenceAcademia, Hospitals, Reference

Laboratories and IndustryLaboratories and IndustryPositionsPositionsØØScientific DirectorsScientific DirectorsØØResearch and Clinical TechniciansResearch and Clinical Technicians

and Technologistsand TechnologistsRoles:Roles:ØØTranslational researchTranslational researchØØTest developmentTest developmentØØValidation and clinical testingValidation and clinical testing

Acknowledgments:Acknowledgments:

nn ViviannaVivianna VanVan DeerlinDeerlin MD, Univ. PennsylvaniaMD, Univ. Pennsylvania