ANALYSE VAN MEMBRANAIRE EIWIT EXPRESSIEPATRONEN …...fagocyteren van zodra celdebris in de...
Transcript of ANALYSE VAN MEMBRANAIRE EIWIT EXPRESSIEPATRONEN …...fagocyteren van zodra celdebris in de...
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN
Vakgroep Geneesmiddelenleer
Laboratorium voor Farmaceutische Biotechnologie
Academiejaar 2008-2009
Stefanie ROGGE
Eerste Master in de Farmaceutische Zorg
Promotor
Prof. Dr. Apr. D. Deforce
Commissarissen
Prof. Dr. Apr. J. Van Bocxlaer
Dr. K. Tilleman
ANALYSE VAN MEMBRANAIRE EIWIT
EXPRESSIEPATRONEN IN HET SYNOVIAAL
WEEFSEL VAN PATIËNTEN MET
INFLAMMATOIRE ARTRITIS
AUTEURSRECHT
“De auteur en de promoter geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar
te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de
beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting
uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.”
Juni 2009
Promotor Auteur
Prof. Dr. Apr. D. Deforce Stefanie ROGGE
DANKWOORD
In de eerste plaats wil ik graag mijn promotor Prof. Dr. Apr. D. Deforce bedanken om mij de
mogelijkheid te bieden mijn onderzoekstage op zijn labo te mogen uitvoeren.
Mijn zeer oprechte dank gaat naar Dr. Kelly Tilleman die mij met mateloze toewijding heeft
begeleid bij de onderzoeken, de verbeteringen en het neerschrijven van deze masterproef.
Mijn vriend, Tom Verstraeten, wil ik ook in dit dankwoord betrekken voor de hulp bij
opzoekingen, zijn aanmoediging en zijn geduld bij alle informaticaperikelen die gepaard gingen
met deze scriptie.
Ik wens ten slotte de Research te danken voor de ondersteuning en de vriendschap die
gedurende mijn kort verblijf op de dienst is gegroeid.
Juni 2009
INHOUDSOPGAVE
Auteursrecht
Dankwoord
Inhoudsopgave
Lijst met gebruikte afkortingen
1. INLEIDING 1
1.1. REUMATISCHE AANDOENINGEN 1
1.1.1. Opbouw synoviaal gewricht 1
1.2. INFLAMMATOIRE ARTRITIS 3
1.2.1. Reumatoïde artritis 3
1.2.1.1. Klinische verschijnselen 3
1.2.1.2. Therapeutica 4
1.2.1.3. Pathologie 5
1.2.1.4. Serologische merker 9
1.2.2. Spondyloartropathieën 10
1.2.2.1. Klinische verschijnselen 10
1.2.2.2. Therapeutica 11
1.2.2.3. Pathologie 11
1.2.2.4. Serologische merker 12
1.3. PROTEOMICS 12
1.3.1. Definitie 13
1.3.2. Klassieke approach: gel-based 13
1.3.3. Gel-vrije approach 15
1.3.3.1. Stable isotope labelling with aminoacids in cells (SILAC) 16
1.3.3.2. Combined fractional diagonal chromatography (COFRADIC) 17
1.3.3.3. Isotope-coded affinity tag (ICAT) 17
1.3.3.4. Isobaric tag for relative and absolute quantification (iTRAQ) 18
1.3.4. Principe van massaspectrometrie 19
2. OBJECTIEVEN 23
3. MATERIAAL EN METHODEN 24
3.1. EIWIT-EXTRACTIE 24
3.1.1. Principe 24
3.1.2. Materialen 24
3.1.3. Methode 24
3.1.3.1. Detergent-gebaseerde methode 24
3.1.3.2. Fysische lyse 25
3.2. GELFILTRATIE 25
3.2.1. Principe 25
3.2.2. Materialen 26
3.2.3. Methode 26
3.3. EIWITBEPALING 26
3.3.1. Coomassie Protein assay 26
3.3.1.1. Principe 26
3.3.1.2. Materialen 27
3.3.1.3. Methode 27
3.4. SODIUM DODECYL SULFAAT GELELEKTROFORESE 28
3.4.1. Principe 28
3.4.2. Materialen 28
3.4.3. Methode 29
3.5. iTRAQ ANALYSE 30
3.5.1. Opstelling van de analyse 30
3.5.2. Opzuivering en aanconcentrering met Vivaspin 31
3.5.2.1. Materialen 31
3.5.2.2. Methode 31
3.5.3. Digestie met trypsine en labelling van de stalen 32
3.5.3.1. Materialen 32
3.5.3.2. Principe 32
3.5.3.3. Methode 32
3.6. OPZUIVERING 33
3.6.1. Strong Cation Exchange cartridge (SCX-cartridge) 33
3.6.1.1. Materialen 33
3.6.1.2. Principe 33
3.6.1.3. Methode 34
3.6.2. C18 opzuivering 34
3.6.2.1. Materialen 34
3.6.2.2. Principe 34
3.6.2.3. Methode 35
3.7. Twee-dimensionele vloeistof chromatografie 35
3.7.1. Fractionatie door scheiding op SCX 35
3.7.1.1. Materialen 35
3.7.1.2. Principe 36
3.7.1.3. Methode 36
3.7.2. Identificatie en kwantificatie dmv Online HPLC-ESI-QTOF-MS/MS 37
3.7.2.1. Materialen 37
3.7.2.2. Principe 37
4. RESULTATEN 38
4.1. OPZUIVERING MET GELFILTRATIE EN ANALYSE MET GELELEKTROFORESE 38
4.2. EIWITBEPALING VAN ALLE PATIËNTEN 40
4.3. OPZET iTRAQ ANALYSE 40
4.4. RESULTATEN iTRAQ ANALYSE 41
5. DISCUSSIE 51
6. CONCLUSIE 53
7. LITERATUURLIJST 54
LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN
ACPA: anti-citrullinated protein antibody
APC: antigen presenterende cel
APS: ammonium persulfaat
AS: spondylitis ankylosans
Bcl-2: B-cel lymphoma-2
BFB: broom fenol blauw
CCP: cyclisch gecitrullineerde peptiden
CHAPS: 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate
COFRADIC: combined fractional diagonal chromatography
DIP: distal interphalengeaal
DMARD: Disease-Modifying-Anti-Rheumatic-Drugs
DTT: dithiothreitol
ESI: electrospray ionization
FLS: fibroblast-like synoviocyten
GAG: glycosaminoglycanen
HLA: human leukocyte antigen
ICAM-1: intercellular adhesion molecule-1
ICAT: Isotope-coded affinity tagging
IEF: iso-elektrische focussing
IFNγ: interferon gamma
Ig: immunoglobuline
IL-1: interleukine-1
IPG: geïmmobiliseerde pH gradiënt
iTRAQ: isobaric tag for relative and absolute quantitation
JCA: juveniele chronische arthritis
MALDI: matrix-assisted laser desorption ionization
MG: moleculair gewicht
MHC: major histocompatibility complex
MLS: macrofaag-like synoviocyten
MMP: matrix metalloproteïnase
MMTS: S-Methyl methanethiosulfonate
MQ: milli-Q water
MS: massaspectrometrie
NSAID: Niet-Steroïdale-Anti-Inflammatoire-Drugs
NK: natural killer
OA: osteoartritis
OD: optische densiteit
PAD: peptidylarginine deiminase
pI: iso-elektrisch punt
PP I: phosphatase protease inhibitor I
PP II: phosphatase protease inhibitor II
PsA: psoriasis artritis
PTM: post-translationele modificaties
Q: quadrupool
RA: reumatoïde artritis
ReA: reactieve arthritis
RF: reumafactor
RP-LC: reversed-phase liquid chromatography
SCX: strong cation exchange
SDS: sodium dodecyl sulfaat
SILAC: stable isotope labeling with aminoacids in cells
SLRP: small leucine rich protein
SpA: spondyloartropathieën
TBP: tributylphosphine
TCEP: tris(2-carboxyethyl)phosphine
TEMED: tetramethylethylenediamine
TNFα: tumor necrosis factor alfa
TOF: time-of-flight
UDPGD: Uridine Diphosphoglucose Dehydrogenase
USpA: ongedifferentieerde artritis
VCAM-1: vascular cell adhesion molecule-1
1. INLEIDING
1
1. INLEIDING
1.1. REUMATISCHE AANDOENINGEN
Reumatische ziekten kunnen onderverdeeld worden in inflammatoire en niet-
inflammatoire pathologieën.
Osteoartrose (OA) is een niet-inflammatoire, chronisch degeneratieve
gewrichtsaandoening die zich ontwikkelt ten gevolge van blijvende mechanische belasting of
verwonding van de gewrichtstructuren. De primaire target van OA is het kraakbeen, daar waar
bij reumatoïde artritis (RA) en spondyloartropathieën (SpA) de synoviale membraan de primaire
site van inflammatie is. Ondanks het feit dat OA veroorzaakt wordt door overbelasting of
verwonding, bepalen risicofactoren zoals leeftijd, geslacht en overgewicht mee de graad van
ernst van de klachten. De resulterende pijn verdwijnt evenwel bij rust. Meer dan 80 % van de 3e
leeftijd lijdt aan OA (Arden & Nevitt, 2006). Therapie bij OA bestaat uit symptomatische
behandeling.
RA en SpA zijn de meest voorkomende vormen van inflammatoire chronische artritis
(Baeten et al., 2004b). De naam artritis zegt het immers zelf: gewricht (arthro) en ontsteking
(itis). De oorzaak kan genetisch, infectieus of beiden zijn (Smith & Haynes, 2002) en deze
systemisch inflammatoire ziekten treffen bij voorkeur de diarthroïdale synoviale gewrichten
(Pratt et al., 2009; Poole & Dieppe, 2006).
1.1.1. Opbouw synoviaal gewricht
Een gewricht is de beweeglijke verbinding tussen twee botten (fig. 1.1). Het bestaat uit
gewrichtskraakbeen, ook wel het hyalien kraakbeen genoemd, dat rust op het subchondrale bot
en dat zorgt voor de compensatie van de incongruenties van de gewrichtsvlakken en voor een
reductie van de contactstress. Het kraakbeen is opgebouwd uit collageen, glycosaminoglycanen
en chondrocyten. Deze chondrocyten liggen in een avasculaire omgeving, geïsoleerd in een
lacune. Het collageen verankert in de diepere lagen het gewrichtskraakbeen aan het
subchondrale bot. Naast deze componenten is kraakbeen ook voor 70-75 % opgebouwd uit
water. Dit water zit samen met de aggrecanmoleculen geïmmobiliseerd tussen het
1. INLEIDING
2
collageennetwerk. Wanneer zich inflammatie of degeneratie voordoet, zien we echter de
hoeveelheid water stijgen. Dit fenomeen treedt op door enzymatische afbraak van het
kraakbeen. Hieruit kunnen we afleiden dat het anders zo dichte collageenweefsel niet meer in
staat is de controle over het volume kraakbeen te bewaren (Harris, 1997).
De niet-kraakbenige delen van het gewricht worden afgelijnd door een synoviale
membraan, die normaal 2 tot 4 cellagen dik is en niet bestaat uit epitheelcellen, maar uit
‘synoviale lining’ cellen. Dit synoviale membraan wordt onderverdeeld in een intima en
subintima, waarvan dit laatste losmazig bindweefsel van cellen (fibroblasten, macrofagen en
vetcellen) en bloedvaten is, dat de overgang van de verspreide fibrocyten naar het kapsel vormt
(Firestein, 1997).
De 2 grote celtypes die we terugvinden in de synoviale lining zijn:
Type A synoviocyten of Macrofaag-like synoviocyten (MLS): Ze zijn afgeleid uit
monocyten die hun oorsprong vinden in het beenmerg. Deze cellen hebben een
fagocytaire en antigen-presenterende functie. Zij vertonen een niet-specifieke
esterase activiteit en zijn CD68 positief (Edwards et al., 1993). Zij brengen HLA-DR
genen tot expressie en bezitten Fc-receptoren (Edwards, 1994).
Type B synoviocyten of Fibroblast-like synoviocyten (FLS): In tegenstelling tot type
A synoviocyten hebben deze cellen een secretorische functie. Deze cellen
brengen vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) tot expressie en hebben
een hoge Uridine Diphosphoglucose Dehydrogenase (UDPGD) activiteit. Ze zijn
prolyl hydroxylase positief (Edwards, 1994).
Deze synoviale cellen liggen in een gespecialiseerde extracellulaire matrix en hun functie
varieert naargelang omgevingsfactoren (Baeten & De Keyser, 2004b). Zo zullen de MLS
fagocyteren van zodra celdebris in de gewrichtsholte aanwezig is. De FLS zullen prolifereren en
specifieke proteasen en matrix componenten produceren onder invloed van groeifactoren en
inflammatoire cytokines (Edwards, 2000).
De buitenkant van het gewricht wordt gevormd door het gewrichtskapsel, een stevige
structuur van collageen vezels. Binnenin het gewricht bevindt zich de gewrichtsholte, of ook
synoviale holte genoemd, die gevuld is met synoviaal vocht. Dit vocht is samengesteld uit een
1. INLEIDING
3
geringe hoeveelheid proteïnen in een geconcentreerde hyaluronzuuroplossing: hyaluronzuur,
lubricin, en een ultrafiltraat van plasma. Hyaluronzuur (HA) wordt door de synoviocyten
gesynthetiseerd en gesecreteerd tussen de cellen, waarna het afvloeit naar de gewrichtsholte.
Daar dient het als coating van het synovium en ter diffusie van nutriënten in het kraakbeen.
Aangezien inflammatie gepaard gaat met een verhoogde vascularisatie en permeabiliteit, is het
resultaat een verhoogde aanmaak van dit intra-articulair vocht. Bij chronische inflammatie
produceren B-cellen en plasmacellen grote hoeveelheden immunoglobulinen (Ig), waardoor de
proteïneconcentratie aldaar dus stijgt en de samenstelling verandert (Harris, 1997).
FIGUUR 1.1: OPBOUW VAN HET SYNOVIALE GEWRICHT – DOORSNEDE VAN EEN GEZOND
GEWRICHT (www.boneandspine.com)
1.2. INFLAMMATOIRE ARTRITIS
Hoewel RA en SpA twee vormen van inflammatoire artritis zijn die de gewrichten
aantasten, zijn ze toch verschillend inzake klinische presentatie.
1.2.1. Reumatoïde artritis
1.2.1.1. Klinische verschijnselen
RA is een auto-immuunziekte, die gekarakteriseerd is door symmetrische polyarticulaire
artritis, en gepaard gaat met destructie van kraakbeen en omliggend bot (Firestein, 2003).
1. INLEIDING
4
Destructie van de gewrichten begint vroeg na het ontstaan van de ziekte, zelfs al van het
1e jaar (Harris, 1997). RA wordt getypeerd door een agressieve on-set, gevolgd door periodes
van remissie (Smith & Haynes, 2002). Het gewricht, meer bepaald de synoviale membraan,
wordt als eerste getroffen door inflammatie. Hierbij zien we voornamelijk aantasting en
bilaterale zwelling van de proximale interphalangeale (PIP) gewrichten van hand en voet (fig.
1.2(A)). Naast het gewricht kan deze aandoening ook complicaties veroorzaken ter hoogte van
andere organen, zoals ogen, huid, zenuwen, speekselklieren, longen, hart, nieren en centraal
zenuwstelsel. Extra-articulaire complicaties, zoals nodulen (fig 1.2(B)) en vasculitis, doen zich
ook voor. Niettegenstaande het om een lage graad van inflammatie met periodische opstoten
gaat, veroorzaakt de ontsteking in en rond de gewrichten klachten van pijn en stijfheid en leidt
zij vaak tot beschadiging van kraakbeen, bot en omliggende weefsels (Smith & Haynes, 2002).
De prevalentie van RA bedraagt 1 à 2 % (Firestein, 2003). Bovendien worden met een
verhouding van 3/2 meer vrouwen dan mannen getroffen door RA. Hoewel RA op alle leeftijden
kan ontstaan, doet het zich meer voor tijdens de 5e-6e levensdecade.
(A) (B)
FIGUUR 1.2: KLINISCHE MANIFESTATIES VAN RA – (A) AANTASTING PIP GEWRICHTEN EN ULNAIRE
DEVIATIE VAN DE VINGERS; – (B) SUBCUTANE NODULES (www.hopkins-arthritis.org)
1.2.1.2. Therapeutica
Reumatische gewrichtsaandoeningen kunnen niet genezen worden, enkel
symptomatische behandeling en het beperken van de graad van inflammatie kan verbetering
betrachten en de kwaliteit van het leven verhogen (Schett, 2006). Neerwaartse regulatie van
inflammatoire processen door middel van anti-cytokine therapie kan dus een oplossing bieden.
1. INLEIDING
5
Primaire targets zijn tumor necrosis factor alfa (TNFα) en interleukine-1 (IL-1). Zowel
infliximab, een monoklonaal antilichaam, als etanercept, een recombinante TNFα-receptor,
behoren tot de groep van TNFα-blokkers. B-cel depletie met monoklonale antilichamen tegen
het CD20 membraaneiwit op terminaal gedifferentieerde B-cellen is een nieuwe strategie in de
behandeling van RA. Rituximab biedt in dat opzicht een significante verbetering van de klinische
symptomen bij patiënten met RA die eerder faalden op anti-TNFα behandeling (Smith & Haynes,
2002). Deze nieuwere medicatie zorgt voor een significant betere ziektecontrole in vergelijking
met de oudere medicatie. De laatste jaren wordt ook meer gefocused op de inhibitie van de
angiogenese als optie in de behandeling van RA (Lainer-Carr & Brahn, 2007).
1.2.1.3. Pathologie
De pathogenese van RA is tot op heden niet volledig opgehelderd. Wel is geweten dat
het om een immunologisch antwoord gaat op een antigen. De triggers van dit immunologisch
antwoord kunnen zowel infectie, cross-reactieve immuniteit als auto-immuniteit zijn (Harris,
1997).
Het resultaat van het chronische inflammatoir proces en tevens het meest specifieke
kenmerk van de pathogenese van RA in het gewricht is de synoviale hyperplasie. Tijdens dit
proces verdikt het synoviaal membraan tot 8 à 10 cellagen. De proliferatie van de synoviale
lining cellen wordt, enerzijds, veroorzaakt door infiltratie van lymfocyten en macrofagen;
anderzijds, is vooral een stijging tot 80 % van de hoeveelheid macrofaag like synoviocyten
verantwoordelijk voor de verdikking van het gewrichtsweefsel (fig 1.3). Deze CD68 positieve
cellen secreteren ter hoogte van het synovium cytokines, zoals TNFα en IL-1, waardoor ook de
fibroblast like synoviocyten zullen prolifereren. Zoals hierboven beschreven, zijn de
synoviocyten verantwoordelijk voor de productie en secretie van synoviaal vocht. Proliferatie
van deze cellen resulteert dus in een evenredige stijging in productie van dit vocht. Door de
excessieve toename aan cellen wordt de synoviale holte nauwer; dit doet de intra-articulaire
druk stijgen, waardoor het vocht zich in alle richtingen verplaatst met een gezwollen gewricht
als resultaat.
In enkele studies werd bewezen dat een gewijzigde apoptotische respons ook aangeduid
kan worden als een van de oorzaken van de chronisch gestimuleerde immuniteit en hyperplasie
1. INLEIDING
6
bij RA (Korb, 2009). Wanneer de regelmechanismen in het lichaam verstoord zijn, treedt
reductie of inhibitie van eliminatie van weefselcellen op. Dit fenomeen zien we wanneer bij FLS
en T-cellen een hogere hoeveelheid van Bcl-2 tot expressie komt. Als gevolg van de geremde
apoptose kan klonale expansie van autoreactieve T-cellen verder woekeren, alsook de
proliferatie van synoviaal weefsel. Verscheidene factoren spelen dus een rol in de synoviale
hyperplasie. De verzwakte apoptose van type B synoviocyten is eveneens het gevolg van de
expressie van het p53 tumor suppressor gen en het anti-apoptotische proteïne sentrin-1
(Dhaouadi et al., 2007).
Door de hyperplasie verkrijgt men een hypoxisch microklimaat in het
gewrichtsmembraan; hierdoor stijgt de vraag naar zuurstof, waardoor nieuwe bloedvaten
gevormd worden. Deze angiogenese draagt eveneens bij tot het chronisch karakter van
inflammatoire artritis. Bij RA werd een verhoogde expressie van proangiogenetische
mediatoren, zoals de vascular endothelial growth factor (VEGF), aangetoond, waardoor de
endotheliale cellen prolifereren (Lainer-Carr & Brahn, 2007). Deze molecule wordt door
meerdere types cellen in het synovium gesynthetiseerd, inclusief macrofagen en fibroblasten
(FitzGerald & Bresnihan, 1995).
Te wijten aan de nieuwgevormde bloedvaten en het gebrek aan basale membraan
waardoor het synoviaal vocht in de holte accumuleert, infiltreren inflammatoire cellen (T-
lymfocyten) in de synoviale membraan en induceren aldaar het inflammatieproces. Dit doen ze
door zich vast te hechten aan het vezellumen via oppervlaktemoleculen aan adhesiemoleculen,
die tot expressie worden gebracht door endotheliale cellen. Specifieke adhesiemoleculen
worden tot expressie gebracht door de synoviale cellen: E-selectin op synoviaal endotheel,
vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) en intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) op
endotheliale cellen en macrofagen (Smith & Haynes, 2002). Cytokines en chemoattractanten,
zoals IL-1β en TNFα, regelen de expressie en de binding van deze adhesiemoleculen. Op die
manier migreren lymfocyten doorheen het endotheel naar het synovium. Vooral geheugen T-
cellen accumuleren in het synovium, maar het synovium bevat evengoed CD8+ cellen, natural
killer-cellen (NK-cellen) en B-cellen (Baeten & De Keyser, 2004a). Eens in het synovium worden
T-cellen geactiveerd door herkenning van een compatibel antigen, eventueel een auto-antigen,
1. INLEIDING
7
aldaar gepresenteerd door een antigen presenterende cel (APC); een macrofaag like type A
synoviocyt. De geactiveerde macrofaag activeert de T-cel via IL-1 en TNFα. De T-cel produceert
dan IL-2, hetgeen aanzet tot klonale expansie (fig. 1.4). Wanneer op die manier een
immunologische reactie in het gewricht wordt uitgelokt, treden klinische manifestaties van RA
op de voorgrond. Ze veroorzaken pijn en zwelling. De geactiveerde T-cellen kunnen dan via
cytokines B-cellen aanzetten tot differentiatie en proliferatie, met secretie van
immunoglobulinen.
FIGUUR 1.3: INFLAMMATIE IN HET SYNOVIALE GEWRICHT BIJ RA: NORMAAL VERSUS
GEÏNFLAMMEERD BIJ RA. DE SYNOVIALE MEMBRAAN IS NORMAAL 1-3 CELLAGEN DIK EN OVERLAPT DE
SUBSYNOVIALE LAAG DIE BESTAAT UIT FIBROBLASTEN, ADIPOCYTEN EN SYNOVIALE MACROFAGEN. BIJ EEN
NORMAAL GEWRICHT BEPERKT DE VASCULATUUR ZICH TOT DE SUBINTIMA. BIJ RA INVADEERT DE VASCULATUUR
WEL IN HET SYNOVIUM TE WIJTEN AAN ANGIOGENESE. HIERDOOR RECRUTEREN TALRIJKE INFLAMMATOIRE
CELLEN NAAR HET SYNOVIUM OM ALDAAR EEN VERDIKKING VAN HET SYNOVIUM TE VEROORZAKEN. DE STIJGING
IN AANTAL SYNOVIOCYTEN DRAAGT BIJ TOT DE ONTWIKKELING VAN PANNUS, BOTEROSIE EN GEWRICHTSAFBRAAK
(www.nature.com)
1. INLEIDING
8
De voorbestemdheid van RA zou ook gelinkt zijn aan de expressie van het human
leukocyte antigen DR-4 (HLA-DR4) gen. Dit gen maakt deel uit van de major histocompatibility
complex (MHC) klasse II moleculen en bestaat uit het ‘shared epitoop’ (SE) ter hoogte van de 3e
variabele regio van de DR-β keten. De aminozuren in deze regio zijn positief of neutraal geladen
en verkiezen bijgevolg negatief geladen peptiden om te binden. Deze peptiden worden er
gebonden in de HLA bindingsgroeve en gepresenteerd aan het oppervlak aan T-cellen. Maar de
shared epitoop beperkt zich niet tot binding van specifieke antigenen aan T-cellen, de manier
waarop ze gepresenteerd worden aan T-cellen zou evengoed van belang zijn (Smith & Haynes,
2002).
FIGUUR 1.4: CHRONISCHE INFILTRATIE VAN LYMFOCYTEN LEIDT TOT DESTRUCTIE
(www.nature.com)
ANGIOGENESE
INFILTRATIE INFLAMM. CELLEN
OSTEOCLASTVORMING
PRODUCTIE DESTRUCTIEVE ENZYMEN
1. INLEIDING
9
Synoviocyten die chronisch gestimuleerd worden door cytokines afkomstig van
geactiveerde macrofagen, fibroblasten en lymfocyten, worden getransformeerd tot invasief
pannusweefsel. Het pannusweefsel invadeert finaal het kraakbeen, hetgeen in de hand gewerkt
wordt door matrix metalloproteïnasen (MMP’s) (Miller et al., 2009). Deze MMP’s worden tot
expressie gebracht door fibroblasten op de grens tussen synovium en kraakbeen in RA
gewrichten, en zorgen voor afbraak van de collageen matrix. Aansluitend hierop wordt het
kraakbeen afgebroken. Ook krijgen we boterosie als gevolg van lokale osteoclast vorming
(Baeten & De Keyser, 2004a).
Door de structurele veranderingen in het gewricht krijgen we verlies van de
gewrichtsfunctie. Zo kunnen we zelfs stellen dat de graad van activiteit van de ziekte
rechtstreeks gelinkt is aan de mate van verlies van functionaliteit (Smolen et al, 2009).
1.2.1.4. Serologische merker
Reumafactor (RF) is de meest voorkomende serologische merker voor RA. Dit is een
antilichaam tegen het Fc gedeelte van een lichaamseigen IgG. De interactie tussen antilichamen
onderling vormt een immuuncomplex. 65 à 75 % van de RA patiënten zijn RF positief. RF kan
ook aangetoond worden bij andere ziekten (sclerodermie). Echter hoe hoger de titer, hoe meer
waarschijnlijk het wordt dat het om RA gaat en hoe slechter de prognose (Lisse, 1993).
Later werd bij RA ook nog een ander type auto-antilichaam geïdentificeerd, de anti-
citrullinated proteïn antibody (ACPA), dit zijn antilichamen tegen gecitrullineerde eiwitten.
Citrullinatie is een post-translationele modificatie waarbij een arginine omgezet wordt naar een
citrulline door het enzym peptidylarginine deiminase (PAD) (fig 1.5).
ACPA’s hebben een veel hogere specificiteit voor RA dan RF, nl. 96-98 %, en kunnen veel
vroeger gedetecteerd worden. ACPA-producerende plasmacellen werden gevonden in het
geïnflammeerd synoviaal weefsel van RA; dit wijst dus op de aanwezigheid van gecitrullineerde
eiwitten in het synovium. Zo werd in vorige studies reeds aangetoond dat het synovium
gecitrullineerde eiwitten, zoals fibrinogeen en vimentine, bevat (Lambrecht et al, 2008; Tilleman
et al, 2008a).
1. INLEIDING
10
FIGUUR 1.5: ENZYMATISCHE OMZETTING VAN ARGININE CITRULLINE: ARGININE WORDT
AANGEVALLEN DOOR CYSTEINE RESIDUE VAN HET PAD. HIEROP VOLGT NUCLEOFIELE AANVAL VAN WATER MET DE
VORMING VAN CITRULLINE EN VRIJSTELLING VAN AMMONIAK (György et al., 2006)
1.2.2. Spondyloartropathieën
1.2.2.1. Klinische verschijnselen
Spondyloartropathie (SpA) is een verzamelnaam voor een groep chronisch inflammatoire
reumatische ziekten, uitgelokt door omgevingsfactoren bij genetisch voorbestemde mensen
(Khan, 2002). Na RA is SpA de tweede meest voorkomende vorm van inflammatoire artritis.
Verschillende ziekten behoren tot het concept SpA, zoals spondylitis alkylosans (AS),
reactieve artritis (ReA), juveniele chronische artritis (JCA), artritis geassocieerd met ulceratieve
colitis en ziekte van Crohn, ongedifferentieerde artritis (USpA), psoriatische artritis (PsA)
(Baeten & De Keyser, 2004a). Ondanks hun variërende klinische eigenschappen mag aanvaard
worden dat de onderliggende pathologische oorzaak dezelfde is (Gaston, 2006). De
gemeenschappelijke kenmerken van deze verschillende ziekte-entiteiten zijn sacroiliitis,
spondylitis, enthesitis (fig. 1.6) en perifere artritis. SpA is een oligo-articulaire asymmetrische
gewrichtsaandoening, in tegenstelling tot RA die een polyarticulaire aandoening is.
Ongeveer 1 op 100 nieuwe gevallen van SpA komen er per jaar bij. De verhouding
man/vrouw is 3/2. SpA manifesteert zich tussen de 16 en 40 jaar, maar kan evengoed al in de
kinderjaren ontstaan (Khan, 2002).
1. INLEIDING
11
FIGUUR 1.6: KLINISCHE SYMPTOMEN SPONDYLOARTHROPATHIE: OVERWEGEND PAUCI-ARTICULAIR,
ASYMMETRISCH PATROON MET AANTASTING VAN KLEINE EN GROTE GEWRICHTEN.
1.2.2.2. Therapeutica
Aan patiënten die niet reageren op conventionele therapieën, zoals Niet-Steroïdale-Anti-
Inflammatoire-Drugs (NSAID’s) en Disease-Modifying-Anti-Rheumatic-Drugs (DMARD’s), wordt
net zoals bij RA patiënten gestart met TNFα-blokkers; infliximab of etanercept. Hierbij werd
bewezen dat er snel verbetering optrad van de perifere artritis, enthesitis en van de symptomen
in het algemeen (Khan, 2002).
1.2.2.3. Pathologie
SpA wordt, net zoals RA, gekarakteriseerd door synovitis; d.i. een ontsteking van de
synoviale membraan. Het inflammatoir proces gaat gepaard met een verhoogd aantal T-
lymfocyten en macrofagen en een hogere expressie van pro-inflammatoire cytokines (IL-1,
TNFα, interferon gamma (IFNγ)). De infiltratie van inflammatoire cellen, zoals bv. CD163+
macrofagen, en de hyperplasie van de lining cellen in het synovium geven een idee van de
globale ziekteactiviteit bij SpA, onafhankelijk van het subtype SpA (Baeten et al., 2004b). In
tegenstelling tot RA, is er naast aanwezigheid van bot-erosie ook een poging tot botherstel
(Baeten & De Keyser, 2004a).
De pathogenese van SpA wordt dikwijls gelinkt aan de aanwezigheid van bepaalde
genen. HLA-B27 (MHC I molecule) speelt hierin de belangrijkste factor. HLA I (HLA-A, HLA-B,
HLA-C) moleculen komen tot expressie op alle cellen met een kern en bestaan uit een zware α-
keten en een kleinere β2-microglobuline keten. Hun functie bestaat erin intracellulaire peptiden
te presenteren aan T-celreceptoren van CD8+ T-cellen (Gaston, 2006). HLA-B27 is een polymorfe
vorm van HLA-B die teruggevonden wordt in 95 % van de Europese bevolking met AS (Reveille &
Arnett, 2005). De meeste ziekten geassocieerd met deze HLA-allelen blijken van auto-immune
1. INLEIDING
12
aard te zijn (Gaston, 2006). Vrije zware ketens kunnen tot expressie komen op het oppervlak
van de cel, zonder het β2-micorglobuline, en toch hun bindingsgroeve behouden. Zo ook kunnen
homodimeren gevormd worden wanneer de 2 zware ketens aan elkaar hechten via een
disulfide binding aan de cysteïne-67 residues van het extracellulaire α1-domein. Bijgevolg is de
HLA-B27 molecule verkeerd opgevouwen, wat resulteert in een pro-inflammatoire respons in
het endoplasmatisch reticulum. Alsook de ‘artritogene’ peptide hypothese suggereert dat de
ziekte resulteert vanuit de mogelijkheid dat HLA-B27 een specifiek antigenisch peptide kan
binden in zijn groeve, waarop dan cytotoxische T-celrespons en NK-respons komt (McMichael &
Bowness, 2002). Echter een specifiek artritogenisch peptide werd nog niet aangetoond (Reveille
& Arnett, 2005).
1.2.2.4. Serologische merker
Afwezigheid van reumafactor (RF) werd vroeger beschouwd als een van de belangrijkste
discriminerende factoren tussen SpA en RA. Nu wordt steeds vaker overlap tussen beide
aandoeningen teruggevonden, waardoor de seronegativiteit zeker niet meer als enige zekerheid
kan gebruikt worden. Er zijn immers patiënten die RF-negatief en ACPA-negatief zijn en toch RA
ontwikkelen. Mede hierdoor worden ook radiologische criteria gehanteerd om tot een diagnose
te komen.
1.3. PROTEOMICS
Reumatische aandoeningen zijn complexe en verwante ziekten. Een onderscheid tussen
de verschillende reumatische subtypes, zoals RA en SpA, zou kunnen gebeuren aan de hand van
proteomics technieken die toelaten specifieke eiwit-biomerkers en tevens hoofdrolspelers in de
pathologie te identificeren (Tilleman & Deforce, 2008a). Een biomerker wordt door de
Biomarkers Definition Working Group als volgt gedefinieerd: “Een karakteristiek dat objectief
gemeten wordt en geëvalueerd als een indicator voor normale biologische processen,
pathogenische processen of farmacologische antwoorden biedt op therapeutische interventies”
(Biomarkers Definitions Working Group, 2001).
1. INLEIDING
13
De ziekte RA verloopt progressief, maar dikwijls atypisch en de oorzaak is eveneens nog
onbekend. Daarom zou de kennis van moleculaire merkers mogelijks bijdragen om het
ziekteverloop te voorspellen alvorens de eerste klinische tekenen op de voorgrond treden
(Lambrecht et al., 2008).
1.3.1. Definitie
Volgens Wilkins et al. (1996) is het proteoom : “Een grootschalige karakterisatie van het
volledige eiwit complement, inclusief alle eiwit isovormen en post-translationele modificaties,
van een cel”.
Proteomics is ontstaan wanneer men begreep dat het gedrag van de genoom-producten,
nl. de eiwitten, moeilijk te voorspellen was enkel en alleen door genomicstudies. Recente
studies hebben immers bewezen dat de mRNA expressie dikwijls niet overeenstemt met de
eiwit-niveaus. Dit komt omdat 1 gen overgeschreven kan worden tot meerdere eiwitten, die op
hun beurt post-translationele modificaties (PTM) of degradatie ondergaan of doordat eiwitten
in meerdere isovormen kunnen voorkomen (Nyman, 2001). De relatief lage hoeveelheid aan
menselijke genen kan dus een proteoom genereren van aanzienlijke complexiteit (Patterson &
Aebersold, 2003). Bijgevolg biedt onderzoek op eiwit-niveau een breder perspectief met
betrekking tot de opheldering van de biologische functies, gezien eiwitten betrokken zijn in alle
biologische processen.
1.3.2. Klassieke approach: gel-based
Er zijn 2 manieren om aan proteomics te doen, namelijk een gel-based en een gel-vrije
manier. De gel-based techniek maakt meestal gebruik van 2D-gelelektroforese om eiwitten te
scheiden, gevolgd door massaspectrometrie. 2D gelelektroforese is een hoge resolutie methode
om eiwitten onderling te scheiden in 2 dimensies, naargelang hun iso-elektrisch punt (pI) als 1e
dimensie en naar hun grootte in 2e dimensie (Görg et al., 2004).
Eiwitten worden in een IPG-strip gebracht. Dit is een strip met een geïmmobiliseerde pH
gradiënt. In deze strip gaan de eiwitten migreren onder invloed van een elektrisch veld tot ze
hun pI of iso-elektrisch punt bereiken. Hierdoor verkrijgt men allemaal bandjes naast elkaar.
1. INLEIDING
14
Deze bandjes stellen eiwitten voor ter hoogte van hun pI. Dit is de 1e dimensie van de scheiding
of iso-elektrische focussing (IEF).
Vervolgens worden de IPG-strips op een polyacrylamide gel gebracht, waaruit ze
verticaal zullen migreren doorheen de gel op basis van hun grootte of moleculair gewicht (MG).
De dichtheid van crosslinking van de gel kan selectief gekozen worden, naargelang de grootte
van de eiwitten. Op deze manier worden de in 1e dimensie bekomen eiwitbandjes gefocusseerd
tot eiwitspots (fig. 1.7).
Visualisatie van de eiwitten gebeurt met specifieke kleuringsmethoden. Coomassie Blue,
silver staining, radioactieve labeling en fluorescente kleuring zijn hier enkelen van. Deze
methoden moeten voldoende sensitiviteit en hoge lineaire dynamische range hebben. Verder
moeten ze reproduceerbaar en compatibel zijn met identificatie-procedures zoals MS (Görg et
al., 2004; Patton et al., 2002).
FIGUUR 1.7: PRINCIPE VAN 2D-PAGE: SCHEIDING VOLGENS ISO-ELEKTRISCH PUNT OP DE X-AS EN VOLGENS
MOLECULAIR GEWICHT OP DE Y-AS
(www.edoc.hu-berlin.de)
Een spot geeft informatie op 3 gebieden, de X-as staat voor het iso-elektrisch punt (pI),
de Y-as voor het moleculair gewicht (MG) en de kleur-intensiteit vertelt iets over de hoeveelheid
1. INLEIDING
15
eiwit. Spots van verschillende gels worden vergeleken met elkaar en met een controlestandaard
wat betreft hun intensiteit en relatief voorkomen. De spots van interesse worden uitgesneden
en enzymatisch verknipt met site-specifieke proteasen, zoals trypsine. Op die manier worden de
eiwitten verknipt tot peptiden en kunnen ze geïdentificeerd worden door massaspectrometrie
(MS) (fig. 1.8). De massa’s aldaar bekomen, worden dan vergeleken met de theoretisch
verwachte tryptische peptide massa’s van elk eiwit aanwezig in de database en zo kan het eiwit
geïdentificeerd worden (zie verder) (Tilleman et al., 2005).
FIGUUR 1.8: IN GEL DIGEST VAN EIWITTEN: SPOTS VAN INTERESSE WORDEN UITGESNEDEN EN
GEDIGEREERD MET SITE SPECIFIEKE PROTEASEN EN GEÏDENTIFICEERD MET MASSASPECTROMETRIE
Klassieke proteoomtechnologie gebaseerd op 2D gelelektroforese is complex, arbeids-
en kostintensief en gelimiteerd (Patterson & Aebersold, 2003). Ondanks de voordelen die 2D
gelelektroforese biedt in de scheiding en kwantitatieve analyse van eiwitten, heeft deze
techniek ook vele nadelen, zoals een lage throughput en problemen bij de detectie van eiwitten
die in lage hoeveelheden voorkomen. Ook extreem zure en basische eiwitten en eiwitten met
een hoog moleculair gewicht zijn moeilijk te bestuderen (Görg et al., 2004).
Toch wordt deze techniek nog steeds veel gebruikt bij scheiding en identificatie van
complexe eiwit mengsels. Het is immers nog steeds de beste methode om post-translationele
modificaties (PTM) (glycosylaties, fosforylaties, acetylaties,…) te onderzoeken.
1.3.3. Gel-vrije approach
Hoewel de gel-based methode zijn nut heeft, wordt de gel-vrije methode meer en meer
gebruikt gezien de mogelijkheid tot automatisatie. Bij deze techniek wordt d.m.v.
massaspectrometrie (MS) niet enkel het eiwit geïdentificeerd, maar ook gekwantificeerd.
Excise spot
of interest
Control condition
Experimental conditionSite-specific
cleavage
Mass
Spectrometry
Sample
clean-up
1. INLEIDING
16
Hiervoor worden de stalen gelabeld met een specifieke tag, afzonderlijk te onderscheiden in de
massa-analysator, waarbij via meting van de piekratio’s de peptiden gekwantificeerd kunnen
worden. Vervolgens wordt via tandem MS het eiwit geïdentificeerd. Figuur 1.9 vat enkele van de
methoden samen die gebruikt worden om cellen, eiwitten of peptiden te labelen. Deze worden
verder toegelicht.
FIGUUR 1.9: SCHEMATISCHE VOORSTELLING VAN EIWIT- IDENTIFICATIE EN
KWANTIFICATIEMETHODEN
1.3.3.1. Stable isotope labelling with aminoacids in cells (SILAC)
Stabiele isotoop labelling met aminozuren in celculturen (SILAC) is een eenvoudige
techniek om een label in vitro in eiwitten te incorporeren, om deze via MS kwantitatief te
analyseren. Bij SILAC worden cellen metabool gelabeld door ze op te kweken in media
gesupplementeerd met specifieke aminozuren. Deze aminozuren zijn verrijkt met een lichte of
zware isotoop vorm van C of N. Bij zo een experiment worden 2 celculturen opgegroeid die
identiek zijn behalve dat één ervan bestaat uit een zwaar aminozuur en het ander uit een licht
aminozuur. Na een aantal celdelingen zal elk natuurlijk voorkomend aminozuur vervangen zijn
door zijn isotoop gelabeld analoog. Deze methode is efficiënt en reproduceerbaar gezien de
GEL SILAC ICAT iTRAQ/COFRADIC
LABELING (NIVEAU)
• Cellen
extractie
• Eiwitten
in digest
• Peptiden
SCHEIDING gelelektroforese LC LC LC
KWANTIFICATIE gelkleuring MS MS MS/MS
IDENTIFICATIE MS/MS MS/MS MS/MS MS/MS
1. INLEIDING
17
incorporatie van dit label 100% bedraagt. Bovendien is deze methode, door de afwezigheid van
chemische stappen, compatibel met opzuiveringsprocedures (Aebersold & Mann, 2003).
1.3.3.2. Combined fractional diagonal chromatography (COFRADIC)
COFRADIC is een diagonale chromatografische techniek om peptiden selectief uit een
complex mengsel te isoleren. Deze methode bestaat uit 2 identieke chromatografische
scheidingsstappen (omgekeerde fase vloeistofchromatografie (RP-LC)) met ertussen een
modificatiestap voor een selectieve klasse van peptiden. De gemodificeerde peptiden zullen een
hydrofiele of hydrofobe shift ondergaan en zullen zich op die manier onderscheiden van de rest
van het mengsel (Gevaert et al., 2007). Wanneer we enkel de methionyl peptiden willen,
kunnen we het verknipt proteoom een eerste maal over een RP-HPLC laten fractioneren om
vervolgens het mengsel te modificeren met H202 of waterstofperoxide. Hierdoor worden enkel
de methionyl residues geoxideerd ter hoogte van hun methionine sulfoxide groep. Te wijten aan
de gevormde dipool, ondergaan deze peptiden een hydrofiele shift waardoor ze bij een tweede
RP-HPLC fractionatie vroeger zullen elueren (Gevaert & Vandekerckhove, 2004).
1.3.3.3. Isotope-coded affinity tag (ICAT)
De isotope-coded affinity tagging (ICAT) is een techniek die kan differentiëren tussen 2
populaties van eiwitten door gebruik te maken van reactieve probes die verschillen in isotoop
samenstelling. Een ICAT reagens bestaat uit 3 delen: een proteïne reactieve groep, een
linkergroep en een biotine tag (fig 1.10). De reactieve groep bindt specifiek aan cysteïne
residues in proteïnen en peptiden. De linkergroep is opgebouwd uit 8 deuteriumatomen (d8,
zwaar reagens) of uit 8 waterstofatomen (d0, licht reagens). Na eiwitextractie worden de stalen
of met het licht of met het zwaar reagens gederivatiseerd. Na combinatie en digestie van de
stalen worden via avidine affiniteitschromatografie alle cysteïne bevattende peptiden
opgezuiverd. Via LC-MS kunnen de relatieve hoeveelheden van elk peptide in het staal gemeten
worden, door naar de ratio’s te kijken van de isotooppieken die 8 Dalton van elkaar verschillen.
ICAT kent een aantal beperkingen, zoals geen identificatie van proteïnen met geen of weinig
cysteïne residues, maar vooral de elutie van dezelfde peptiden naargelang ze gelabeld zijn met
het licht of zwaar reagens is licht verschillend, hetgeen de kwantificatie bemoeilijkt. Dit
probleem wordt opgelost door cICAT waarbij de C-atomen gelabeld worden. Ook wordt de ICAT
1. INLEIDING
18
tag beschouwd als zijnde groot voor de soms kleine peptiden, waardoor interferentie met het
ionisatieproces en moeilijkheden met de interpretatie van MS spectra kunnen vastgesteld
worden (Patton et al., 2002; Ross et al., 2004).
FIGUUR 1.10: ICAT REAGENS: BIOTINE TAG – LICHTE OF ZWARE LINKER – THIOL-SPECIFIEKE REACTIEVE GROEP
1.3.3.4. Isobaric tag for relative and absolute quantification (iTRAQ)
iTRAQ is een nieuwere gel-vrije techniek om eiwitten van verschillende stalen te
identificeren en kwantificeren in 1 experiment. Hiervoor werd een multiplex set van reagentia
ontwikkeld die bestaat uit isobare labels. Een volledige molecule bestaat uit een reporter groep,
een balance groep en een amine specifiek peptide reactieve groep (NHS-ester) (fig. 1.11). De
reporter groepen variëren in massa (m/z 114-117). Dit massaverschil wordt gecompenseerd
door de balance groep (31-28 Da), zodat iedere tag dezelfde totale massa (isobaar) heeft (145
Da). Deze tags binden covalent aan lysine of N-termini van peptiden met vorming van een
amidebinding. Labelling gebeurt bij deze techniek op peptide-niveau, dus moeten we het staal
eerst digereren alvorens te labellen (Ross et al., 2004). Na labelling worden de verschillende
stalen bijeengevoegd en onderworpen aan enkele opzuiveringsstappen, zoals fractionatie,
alvorens via chromatografie gescheiden te worden en geïdentificeerd in de massaspectrometer.
Gezien iTRAQ reagentia isobaar zijn, levert dit in single MS peptiden op van dezelfde massa.
Deze laatste zijn dus niet te onderscheiden. Identificatie en kwantificatie gebeuren beiden in
tandem MS. Als resultaat van de fragmentatie is er neutral loss van de balance groep en de
reporter groep vinden we terug in de m/z regio van 114 tot 117. Kwantificatie van de
piekoppervlakten van deze ionen toont ons de relatieve hoeveelheid van een bepaald peptide in
een bepaald staal (Wu et al., 2006).
1. INLEIDING
19
FIGUUR 1.11: iTRAQ ISOBAAR REAGENS: REPORTER GROEP – BALANCE GROEP – AMINE SPECIFIEK PEPTIDE
REACTIEVE GROEP
1.3.4. Principe van massaspectrometrie
MS is een analytische techniek die de massa van een molecule meet met hoge
sensitiviteit. Door de jaren heen heeft massaspectrometrie aan belang gewonnen om
biomoleculen met variërende complexiteit te analyseren en te karakteriseren. Per definitie
bestaat elke massaspectrometer uit 3 delen: een ionisatiebron, een massa-analysator en een
detector.
Om de massa of massa over lading (m/z) verhouding te bepalen in een
massaspectrometer moet het analiet eerst geïoniseerd worden. Er zijn 2 zachte
ionisatietechnieken, nl. electrospray ionization (ESI) en matrix-assisted laser desorption
ionization (MALDI), om biomoleculen te ioniseren (fig. 1.13). Bij MALDI wordt het staal
uitgekristalliseerd met een UV-absorberende matrix, opgebouwd uit zure fenolderivaten (bv.
dihydroxybenzoëzuur). Vervolgens wordt deze matrix bestraald met een laser waarbij de
matrixmoleculen de initiële energie van de laser opnemen en bij het terugvallen naar de
grondtoestand de energie overdragen aan de peptiden. Het resultaat is een wolk van
enkelvoudig geladen ionen. Bij ESI daarentegen wordt het analiet opgelost waarna het
1. INLEIDING
20
doorheen een capillair onder hoog voltage geloodst wordt. We krijgen verneveling van het staal
doordat gelijke krachten elkaar afstoten. Bij het overbruggen van de afstand naar de massa-
analysator verdampen de druppels verder en verkleint hun oppervlak, maar de lading blijft
behouden. Op die manier worden de coulombkrachten sterker en vallen de druppels uiteen tot
de watermantel finaal verdwijnt. Dit proces levert meervoudig geladen gasvormige ionen op. ESI
ioniseert analieten vanuit oplossing en kan daarom online gekoppeld worden aan vloeistof-
gebaseerde scheidingstechnieken (Aebersold & Mann, 2003).
(A) (B)
FIGUUR 1.12: (A) MATRIX-ASSISTED LASER DESORPTION IONIZATION (MALDI); (B)
ELECTROSPRAY IONIZATION (ESI)
(www.magnet.fsu.edu)
Na ionisatie worden de peptiden naar de massa-analysator geleid (Steen & Mann, 2004).
De meest gebruikte massa-analysatoren voor eiwitidentificatie zijn de quadrupool (Q) en Time
of Flight (TOF). Voor tandem MS worden 2 massa-analysatoren in serie gekoppeld, bv.
Quandrupool-Time of Flight (Q-TOF) en Time of Flight-Time of Flight (TOF-TOF). Bij tandem MS
worden ionen met een welbepaalde m/z waarde geselecteerd, gefragmenteerd in de collision
cel en de massa’s van de fragmentionen worden gescheiden door de 2e massa-analysator
(Aebersold & Mann, 2003; Nyman, 2001).
1. INLEIDING
21
Een quadrupool bestaat uit vier geleidende, evenwijdige staven op gelijke afstand van
elkaar binnen een paar isolerende ringen die gecoat zijn met een metaal of goud. De staven zijn
per paar elektrisch met elkaar verbonden en krijgen een gelijkspanning, waar bovenop nog een
wisselspanning wordt gesuperponeerd. Bij positieve gelijkspanning worden positieve ionen naar
het midden van de quadrupool gezogen. Bij negatieve gelijkspanning worden ze terug naar de
staven getrokken. Om te beletten dat de ionen niet geëlimineerd worden, moet een
wisselspanning aangelegd worden. De synergie tussen gelijkspanning en wisselspanning leidt
een smal venster van m/z waarden door de quadrupool. Door de frequentie van de
wisselspanning te variëren kan de massaspectrometer ingesteld worden om slechts bepaalde
peptiden met een bepaalde massa door te laten.
De Time of Flight (TOF) is een van de eenvoudigste massa-analysatoren. Hierbij worden
ionen versneld in een veldvrije buis alvorens bij de detector aan te komen. Alle ionen worden
met de zelfde energie versneld en de lengte van de buis blijft constant. Het is dus
vanzelfsprekend dat kleinere ionen sneller zullen aankomen dan zwaardere ionen. Op die
manier worden ze van elkaar gescheiden in de tijd. De tijd nodig voor een ion om de detector te
bereiken, kan dus geëxtrapoleerd worden naar zijn massa (Graham et al., 2007).
Door gebruik van 1 massa-analysator (MALDI-TOF) bekomen we de peptide mass
fingerprint van een eiwit, namelijk een scheiding op massa van de peptiden. Deze methode van
eiwitidentificatie biedt MS spectra aan met een lijst van proteolytische peptide fragment
massa’s. Deze kunnen we vergelijken met databanken waar via computerprogramma’s dezelfde
digestie werd uitgevoerd. Op die manier kunnen we het target proteïne identificeren. De
nauwkeurigheid van deze methode is afhankelijk van de specificiteit van het proteolytische
enzym, het aantal peptiden en de juistheid van de massaspectrometer (Patterson & Aebersold,
2003). Bij tandem MS wordt één bepaald peptide ion geïsoleerd en door botsingen met de
gasmoleculen in de collision cel wordt het peptide gefragmenteerd ter hoogte van de
amidebinding tussen aminozuren (Steen & Mann, 2004). Dochterionen die hieruit voortkomen,
worden ook wel eens b- of y-ionen genoemd (respectievelijk wanneer de lading op de
aminoterminus of carboxyterminus zit) (fig. 1.13). Op deze manier kan de aminozuursequentie
van het peptide bepaald worden en vervolgens het eiwit geïdentificeerd.
1. INLEIDING
22
FIGUUR 1.13: (A) FRAGMENTATIEPATROON VAN EEN PEPTIDE RESULTEREND IN DOCHTERIONEN
(B- OF Y-IONEN) WAARBIJ DE LADING RESPECTIEVELIJK OP DE N-TERMINUS OF C-TERMINUS ZIT;
(B) SCHEMATISCHE WEERGAVE VAN EEN MASSA-ANALYSATOR
(A) (B)
2. OBJECTIEVEN
23
2. OBJECTIEVEN
Deze onderzoekstage kadert in een functionele proteoomstudie waarbij het bestuderen
van eiwitprofielen, hun expressie, identificatie en kwantificatie, via de techniek van
proteoomanalyse centraal staat. Deze expressiepatronen van eiwitten bieden de mogelijkheid
om een vergelijking op te stellen enerzijds tussen inflammatoire pathologieën onderling en
anderzijds tussen inflammatoire en niet-inflammatoire aandoeningen.
We onderzoeken het membranair proteoom van geïnflammeerd synoviaal weefsel. Door
een analyse uit te voeren op een subset van klinisch goed gedocumenteerde stalen kunnen we
streven naar de ontdekking van een merker die los staat van inflammatie. In de literatuur zijn
reeds talrijke merkers geïdentificeerd die inflammatie-specifiek zijn, maar daarom niet zozeer
rechtstreeks gerelateerd zijn aan de ziekte. Net daarom voeren wij vooraf een scoring door op 3
parameters, nl. inflammatie, vascularisatie en infiltratie. Uiteraard kan dergelijk onderzoek, nl.
eiwitten identificeren en kwantificeren die een verschillende expressie vertonen tussen RA, SpA
en niet-inflammatoire artritis, ook bijdragen tot de kennis van de pathogenese achter de
verschillende reumatische pathologieën.
We maken hierbij gebruik van een gel-vrije proteomicstechniek gebaseerd op iTRAQ
labelling.
3. MATERIAAL EN METHODEN
24
Doel: lyse/opzuivering van eiwitten in een monster
3. MATERIAAL EN METHODEN
3.1. EIWIT-EXTRACTIE
3.1.1. Principe
De membranaire eiwitten worden geëxtraheerd door gebruik te maken van de
ReadyPrepTM Sequential Extraction Kit van Bio-Rad. Via deze kit kunnen eiwitten geëxtraheerd
worden uit cellysaten op basis van een verschillende oplosbaarheid.
De kit bestaat uit verschillende reagentia, nl. reagens 1, 2 en 3, die de extractie
bevorderen van respectievelijk goed oplosbare tot minder goed oplosbare eiwitten. Elk van de
reagentia lost een overlappende set van eiwitten op. Ze verschillen enkel in hun detergent en
chaotrope concentraties. Cytoplasmatische eiwitten zijn hydrofieler en dus beter oplosbaar dan
de hydrofobe membranaire proteïnen.
3.1.2. Materialen
ReadyPrepTM Sequential Extraction Kit Reagens 3 (Biorad, Hercules, CA, USA) -
Phosphatase inhibitor cocktail (I en II) (Sigma, Steinheim, Germany) - ReadyPrepTM TBP
Reducerend Reagens (Biorad, Hercules, CA, USA) - Benzonase® Nuclease (Sigma, Steinheim,
Germany) - Protease inhibitor cocktail tabletten (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany).
3.1.3. Methode
3.1.3.1. Detergent-gebaseerde methode
Reagens 3 wordt aangemaakt met 6,3 ml MQ water en bestaat uit 5M ureum, 2M
thioureum, 2%(w/v) CHAPS, 2%(w/v) SB 3-10, 40mM Tris en 0,2%(w/v) Bio-Lyte 3/10
ampholyte. Dit zijn detergenten en chaotropen die de niet-covalente bindingen breken,
hierdoor ontplooit de molecule en wordt het eiwit oplosbaar.
1ml Reagens 3 + 10 µl TBP (reducing agent)
10 µl PP I
3. MATERIAAL EN METHODEN
25
10 µl PP II
korreltje protease inhibitor
150 U endonuclease
Aan elk staal (een pellet bekomen na extractie met reagens 1) wordt 500 µl Reagens
3 toegevoegd.
3.1.3.2. Fysische lyse
Naast de detergent-gebaseerde methode volgt nog fysische lyse.
Dit hele mengsel wordt gevortext, gesoniceerd en gemixt;
Na 30 min. incubatie worden de stalen gecentrifugeerd gedurende 25 min. op 20000
xg;
De supernatanten worden overgepipetteerd in nieuwe vials waar dan een
eiwitbepaling op uitgevoerd wordt.
3.2. GELFILTRATIE
3.2.1. Principe
Aangezien bij de extractie gebruik gemaakt werd van een detergent-gebaseerde
methode bevat het staal detergenten die verwijderd dienen te worden. Later hebben ze een
vernietigend effect op het enzym trypsine. Dit enzym wordt gebruikt bij eiwitdigestie nodig om
de peptiden daarna te labelen via de iTRAQ methode. Om deze reden willen we de
interfererende substanties uit ons staal verwijderen. Dit is mogelijk door een gelfiltratie uit te
voeren (= bufferswitch).
Gelfiltratie is een scheidingstechniek op basis van een verschil in grootte. Wij gebruiken
een sephadex G-25 Medium kolom. Deze laat een snelle scheiding toe tussen hoog moleculaire
en laag moleculaire substanties. Sephadex bestaat uit polymeer materiaal met
dwarsverbindingen tussen de ketens waardoor een 3D-netwerk met poriënstructuur ontstaat.
Moleculen groter dan de grootste poriën van de sephadex matrix zullen eerst elueren. Terwijl
molecules die kleiner zijn dan de grootste poriën eerst in de poriën zullen penetreren en pas
Doel: scheiding eiwitten van onzuiverheden op basis van grootte
3. MATERIAAL EN METHODEN
26
later zullen elueren. Eiwitten zijn hoogmoleculaire verbindingen en komen bijgevolg eerst van
de kolom. Zouten en andere onzuiverheden elueren laatst van de kolom.
3.2.2. Materialen
PD-10 Ontzouting Kolom bestaande uit Sephadex G-25 Medium (GE Healthcare,
Buckinghamshire, UK) - 96 microtiter well plaat: UV star (Greiner Bio-one, Frickenhausen,
Germany).
3.2.3. Methode
Verwijder het bovenste deksel van de kolom en giet de bewaarvloeistof af;
Snij de onderkant van de kolom af;
Spoel de kolom met 25 ml MQ water;
Pipetteer het staal (+/- 500µl van vooraf bekomen supernatans), aangelengd met
MQ water tot een volume van 2,5 ml bekomen wordt;
Vang het eluent op in een UV 96 well plaat per 5 druppels;
Laat 10 ml MQ water elueren en vang ook dit op per 5 druppels;
Analyse via absorptiemeting bij 280 nm.
3.3. EIWIT-BEPALING
3.3.1. Coomassie protein assay
Doel: Totale quantificatie van de eiwitten.
3.3.1.1. Principe
Na gelfiltratie worden de stalen aan een eiwitbepaling onderworpen. Het Coomassie
reagens bestaat uit Coomassie Blue G-250 Dye, methanol en fosforzuur in water. Bij binding van
het eiwit aan de Coomassie Dye in dit zure medium, zal een onmiddellijke kleurverandering van
bruin naar blauw plaatsvinden. Deze kleurverandering komt overeen met een stijging van het
absorptiemaximum van 465 nm naar 595 nm (fig. 3.1). Het is dus noodzakelijk per assay een
standaardcurve mee te runnen, aangezien de intensiteit van kleuromslag niet-lineair is met de
eiwitconcentratie. Een 4-parameter curve zal dan ook meer accurate resultaten opleveren.
Doel: totale kwantificatie van de eiwitten
3. MATERIAAL EN METHODEN
27
FIGUUR 3.1: PRINCIPE COOMASSIE BEPALING
3.3.1.2. Materialen
Coomassie® Proteïn Assay Reagent Kit (Pierce, Rockford, IL, USA) - 96 microtiter well plaat
(Greiner Bio-one, Frickenhausen, Germany).
3.3.1.3. Methode
TABEL 3.1: CONCENTRATIES STANDAARDREEKS COOMASSIE-BEPALING
Voeg 250 µl Coomassie reagens toe aan lege vials;
Pipetteer hierbij 5 µl staal (uit de gepoolde vials en standaarden). Goed vortexen;
Pipetteer 120 µl van dit mengsel in de 96 wellplaat;
Absorptiemeting bij 595 nm.
STANDAARD CONCENTRATIE BSA-STOCK (2 mg/ml)
standaard A 2000 µg/ml
standaard B 1500 µg/ml
standaard C 1000 µg/ml
standaard D 750 µg/ml
standaard E 500 µg/ml
standaard F 250 µg/ml
standaard G 125 µg/ml
standaard H 25 µg/ml
standaard I 0 µg/ml
3. MATERIAAL EN METHODEN
28
3.4. SODIUM DODECYL SULFAAT POLYACRYLAMIDE GELELEKTROFORESE (PAGE)
3.4.1. Principe
3.4.1. Principe
SDS denatureert eiwitten zodat de secundaire, tertiaire en quaternaire structuur
verloren gaat. Het eindresultaat zijn eiwitten met enkel nog hun primaire structuur. SDS geeft
aan de eiwitten een negatieve lading in verhouding met hun lengte. Wanneer deze eiwitten in
een elektrisch veld worden geplaatst, migreren ze naar de positieve pool. Dit gebeurt voor alle
moleculen met dezelfde snelheid. Echter als we via MG willen scheiden, moeten we de
proteïnen in een omgeving brengen waar de geladen moleculen met verschillende snelheden
migreren. Polyacrylamide is hiervoor geschikt. Het is een polymeer dat omgevormd wordt tot
een gel met tunnels van verschillende diameters. Al naargelang de MG van het te scheiden
monster kunnen deze diameters kleiner of groter gemaakt worden. De kleinere eiwitten zullen
sneller en verder migreren in de gel dan de grotere.
3.4.2. Materialen
Laemmli Resolving Gel: Acrylamide/Bis (Biorad, Hercules, CA, USA) - Tris HCl pH 6,8 (MP
Biomedicals, Solon, Ohio) - Sodium Dodecyl Sulfaat (SDS) (MP Biomedicals, Solon, Ohio) -
N,N,N,N-Tetramethylethylenediamine (TEMED) (Sigma, Steinheim, Germany) - Ammonium
persulfaat (APS) (Sigma, Steinheim, Germany) - Milli-Q water (MQ) (Millipore).
Laemmli Stacking Gel: Acrylamide/Bis (Biorad, Hercules, CA, USA) - Tris HCl pH 8,8 (MP
Biomedicals, Solon, Ohio) - Sodium Dodecyl Sulfaat (SDS) (MP Biomedicals, Solon, Ohio) - Milli-Q
water (MQ) (Millipore) - N,N,N,N-Tetramethylethylenediamine (TEMED) (Sigma, Steinheim,
Germany) - Ammonium persulfaat (APS) (Sigma, Steinheim, Germany).
CriterionTM Cell (Biorad, Hercules, CA, USA) - Laemmli sample buffer (Pierce, Rockford, IL,
USA) - B-mercapto ethanol (Merck, Hohenbrunn, Germany) - Sypro Ruby protein gel stain
(Invitrogen, Eugene, Oregon, USA) - Methanol (Merck, Hohenbrunn, Germany) - Azijnzuur
(Merck, Hohenbrunn, Germany).
Doel: scheiding van eiwitten op basis van moleculair gewicht (MG)
3. MATERIAAL EN METHODEN
29
3.4.3. Methode
Giet de gel in de cassette;
De gel is opgebouwd uit 2 delen, nl. Laemmli Resolving gel en Stacking gel.
TABEL 3.2: SAMENSTELLING LAEMMLI RESOLVING EN STACKING GEL
Bereken het volume (per fractie) dat geladen moet worden per laantje op de gel, d.i.
het volume dat overeenkomt met 20 µg staal (dit weten we door de vooraf
uitgevoerde Coomassie bepaling) en pipetteer dit volume over in nieuwe vials;
Droog deze vials in de Speedvac;
Resuspendeer in 20 µl Laemmli sample buffer + 1 µl β-mercapto ethanol;
TABEL 3.3: SAMENSTELLING LAEMMLI SAMPLE BUFFER
Plaats de vials gedurende 5 min. in de thermomixer op 95 °C;
Centrifugeer 5 min. 10000xg;
Detectie van de eiwitten gebeurt door kleuring met SYPRO Ruby; dit is een fluorescente
kleuring.
Gel 30 min. in fixatie-oplossing brengen: 10 % methanol, 7 % azijnzuur;
RESOLVING GEL 10 %
40 % Acrylamide/bis 25 ml
1,5 M Tris HCl (pH 8,8) 25 ml
10 % SDS 1 ml
MQ 48,5 ml
TEMED 50 µl
10 % APS 500 µl
STACKING GEL 4 %
40 % Acrylamide/bis 2,5 ml
0,5 M Tris HCl (pH 6,8) 6,3 ml
10 % SDS 250 µl
MQ 15,9 ml
TEMED 25 µl
10 % APS 125 µl
LAEMMLI SAMPLE BUFFER
50 mM Tris HCl (pH 6,8)
2 % SDS
5 % β-mercapto ethanol
10 % glycerol
BFB
3. MATERIAAL EN METHODEN
30
Laten schudden op schudder;
Verwijder de fixatie-oplossing;
Breng de gel in SYPRO Ruby proteïn gel kleuring-oplossing; verhinder lichtinval!
Incubeer 3u;
2 x 15 min. wassen in fixatie-oplossing;
Visualisatie van de fluorescente kleuring m.b.v. Versadoc.
3.5. iTRAQ ANALYSE
3.5.1. Opstelling van de analyse
Bij RA en SpA, twee vormen van inflammatoire artritis is synoviale hyperplasie een
belangrijk kenmerk. Dit is te wijten aan 3 grote processen, nl. inflammatie, infiltratie en
vascularisatie. Aangezien we de verschillen tussen RA en SpA willen onderzoeken,
randomniseren we de stalen aan de hand van deze 3 parameters, nl. inflammatie, vascularisatie
en infiltratie; deze mogen immers niet doorslaggevend zijn in onze conclusie. Meer specifiek
betekent dit dat differentieel verschillende eiwitten niet mogen gelinkt worden aan een
verhoorde inflammatie-, vascularisatie- of infiltratiegraad. Daarnaast nemen we ook nog een
aantal controlegroepen mee, deze zijn zowel van inflammatoire (RA acpa-, PsA) als van niet-
inflammatoire (OA) aard.
TABEL 3.4: OPSTELLING iTRAQ-ANALYSE
We poolen 60 µg staal per label en splitsen finaal in 2, op die manier kunnen duplicaten gerund
worden. Aangezien we beschikken over 8 labels, moeten we de analyse opsplitsen in 2.
PATHOLOGIE STAAL N°
RA ACPA- 208 234
OA 162 315 377 768
Psa 1137 1136 1129
RA inflammatie (RA A) 130 947 1145
SpA inflammatie (SpA A) 1085 524 350
RA vascularisatie (RA B) 262 1111 1145
SpA vascularisatie (SpA B) 1128 720 142
RA infiltratie (RA C) 882 969 482
SpA infiltratie (SpA C) 1185 1128 350
3. MATERIAAL EN METHODEN
31
TABEL 3.5: OPSPLITSING iTRAQ-ANALYSE: RUN A EN RUN B
3.5.2. Opzuivering en aanconcentrering met vivaspin
3.5.2.1. Materialen
Vivaspin kolom (Santorius, Goettingen, Germany) - Sodium Dodecyl Sulfaat ( SDS) (MP
Biomedicals, Solon, Ohio).
We maken gebruik van Vivaspin 2000 Da cut off hydrosart membraan ultrafiltratie kolommen.
3.5.2.2. Methode
Laad de gepoolde stalen op de concentrator;
Was 3x met 2ml MQ;
Centrifugeer telkens 15 min op 3000 xg;
Voeg 200 µl 0,01 % SDS toe;
Vortex goed en soniceer;
Reverse spin gedurende 5 min op 4000 xg;
Vloeistof overpipetteren in de originele vials;
Drogen in Speedvac.
run A run B
RA ACPA- RA ACPA-
OA OA
Psa Psa
RA inflammatie (RA A) RA vascularisatie (RA B)
SpA inflammatie (SpA A) SpA vascularisatie (SpA B)
RA infiltratie (RA C)
SpA infiltratie (SpA C)
Doel: opzuivering en aanconcentreren van het staal
3. MATERIAAL EN METHODEN
32
3.5.3. Digestie met trypsine en labelling van de stalen
3.5.3.1. Materialen
3.5.3.1. Materialen
Trypsine (Promega, Madison, WI, USA) - iTRAQ Dissolutie buffer: Triethylammonium
bicarbonaat (TEABC) (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) - Denaturant: Sodium Dodecyl
Sulfaat (SDS) (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) - Reducerend reagens: tris(2-
carboxyethyl)phosphine (TCEP) (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) - Cysteïne blocking: S-
Methyl methanethiosulfonate (MMTS) in isopropanol (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)
- Ethanol (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) - iTRAQ Reagent 8 Plex Multi-Plex Kit
(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
3.5.3.2. Principe
De proteïne inhoud van elk gepoold staal wordt na aanconcentratie met Vivaspin
kolommen behandeld met trypsine. Trypsine is een proteolytisch enzym dat het eiwit klieft aan
het carboxy-terminaal uiteinde van arginine of lysine. Dit levert peptide fragmenten op met
minstens één van deze basische aminozuur residues (voordelig aangezien MS enkel geladen
fragmenten meet).
3.5.3.3. Methode
Voeg aan elk staal 19 µl dissolutie buffer (5M Triethylammonium bicarbonaat
(TEABC) buffer)+ 1 µl denaturant (2% SDS) toe;
Voeg 2 µl reducerend reagens (50 mM TCEP of 10 mM DTT) toe;
Incubeer 1u op 60 °C;
Voeg 1 µl cysteine blocking (200 mM MMTS in isopropanol) toe;
Meng een trypsine glazen vial samen met 40 µl TEABC buffer;
Voeg 10 µl hiervan bij elk staal.
Doel: Eiwitten verknippen tot peptiden en labellen van
peptiden ter identificatie en kwantificatie
peptiden ter identificatie en quantificatie
3. MATERIAAL EN METHODEN
33
PROTOCOL LABELLING:
Kies per staal een label;
Voeg aan elk label-vial 70 µl EtOH toe;
Voeg elk label bij het staal;
Vortex + centrifugeer kort;
Incubeer 2u;
100 µl MQ bij elk staal;
Voeg alle stalen bijeen;
Droog dit gepooled staal in de Speedvac.
3.6. OPZUIVERING
3.6.1. Strong cation exchange cartridge (SCX-cartridge)
3.6.1.1. Materialen
De cartridge is opgebouwd uit POROS® 50 HS kolom met 50 µm partikel grootte.
De ICATTM CATION EXCHANGE BUFFER PACK bestaat uit verschillende buffers
(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA);
Load buffer: 10 mM KH2PO4, 25 % ACN, pH 3.0;
Elute buffer: 10 mM KH2PO4, 500 mM KCl, 25 % ACN, pH 3.0;
Clean buffer: 10 mM KH2PO4, 1M KCl, 25 % ACN, pH 3.0.
3.6.1.2. Principe
We gebruiken RP chromatografie om het iTRAQ Reagent-labeled staal te zuiveren van
interfererende substanties en overmaat label. De peptiden worden door ionische interacties op
de kolom gehouden, terwijl de zouten en het ongereageerd label geen affiniteit vertonen voor
de kolom en elueren. Door vervolgens de zoutconcentratie te verhogen, worden de peptiden
geëlueerd.
Doel: Verwijderen overmaat label
3. MATERIAAL EN METHODEN
34
3.6.1.3. Methode
Loop steeds 2 blanco runs alvorens het staal te laden.
1 ml clean buffer;
2 ml load buffer;
1 ml load buffer;
1 ml load buffer;
500 µl elute buffer;
1 ml clean buffer.
Na de 2 blanco runs, kan het staal gerund worden.
Voeg bij aan het staal 1 ml load buffer toe;
1 ml clean buffer;
2 ml load buffer;
Injecteer traag het staal (1 druppel/sec), vang eluens op + drogen;
1 ml load buffer (1 druppel/sec), vang eluens op + drogen;
500 ul elute buffer (1 druppel/sec), vang eluens op + drogen;
1 ml clean buffer.
3.6.2. C18-opzuivering
3.6.2.1. Materialen
Atlantis dC18 trap Column 5/pack (Waters, Milford, MA, USA)
5µm x 0.18mm x 23.5mm;
Buffer A: 0,1 % FA (Biosolve, ULC-MS grade);
Buffer B: 80 % ACN/0,1 % FA (Biosolve, ULC-MS grade).
3.6.2.2. Principe
Bij de SCX-cartridge worden de peptiden geëlueerd met een hoge zoutconcentratie.
Deze zoutconcentratie moet terug naar 0 % gereduceerd worden, als we ons staal willen
fractioneren. We gaan dus opnieuw een opzuivering doen, maar deze keer gebaseerd op
hydrofobiciteit. De kolom wordt geconditioneerd met 0,1 % FA. Zouten zijn hydrofiel en
vertonen bijgevolg geen affiniteit voor deze kolom. Peptiden bevatten aminozuren met
3. MATERIAAL EN METHODEN
35
hydrofoob karakter, die blijven hangen aan de C18 kolom. We elueren de peptiden met 80 %
ACN/0,1 % FA.
We gebruiken 2 C18-kolommen om voldoende trapping vermogen te hebben. Het trap
vermogen van 1 kolom bedraagt 1mg.
3.6.2.3. Methode
FIGUUR 3.2: ELUTIE PEPTIDEN ZONDER GRADIËNT
Voeg aan de gedroogde stalen 60 µl 0,1 % FA toe;
Vang het eluens op gedurende 20 min.;
Droog staal in speedvac.
3.7. TWEE-DIMENSIONELE VLOEISTOF CHROMATOGRAFIE
3.7.1. Fractionatie door scheiding op SCX
3.7.1.1. Materialen
Poros 10S SCX Column (LC-Packings, Sunnyvale, CA, USA)
300µm i.d. x 10 cm;
Buffer A: 5mM KH2PO4; 15 % ACN; pH 2,7;
3. MATERIAAL EN METHODEN
36
Buffer B: 5mM KH2PO4; 500 mM KCl; 15 % ACN; pH 2,7;
Buffer C: 5mM KH2PO4; 500 mM KCl; 25 % ACN; pH 2,7.
3.7.1.2. Principe
Het staal bestaat uit verscheidene peptiden afkomstig van verscheidene eiwitten. Om
de complexiteit van het staal te reduceren, doen we nog een 2-dimensionele LC, maar met
gradiëntelutie. We vangen het eluens op in 15 fracties.
3.7.1.3. Methode
Gedroogd staal oplossen in 40 µl 0,1 % FA;
Staal in 2 delen: 2 x 20 µl in 500 µl epjes;
FIGUUR 3.3: ELUTIE PEPTIDEN MET OPBOUW GRADIËNT
3. MATERIAAL EN METHODEN
37
3.7.2. Identificatie en kwantificatie dmv Online HPLC-ESI-QTOF-MS/MS
3.7.2.1. Materialen
C18 Trapkolom (LC-Packings, Sunnyvale, CA, USA) - NAN 75-15-03 C18 PM (LC-
Packings, Sunnyvale, CA, USA);
Stationaire fase: C18 pepMAP100
3µm x 30 cm x 75 µm.
3.7.2.2. Principe
De 15 fracties worden online geïnjecteerd op een RP-HPLC kolom en één voor één
gerund via LC-MS/MS. De peptiden worden eerst over een C18 trapkolom gebracht. Dit dient
om het staal aan te concentreren en te ontzouten, alsook om de levensduur van de analytische
kolom te verhogen. De loading pomp voert eluens A (0,1 % FA) over de trapkolom. Hierdoor
zullen alle zouten en andere onzuiverheden van de kolom lopen. Echter de peptiden blijven op
de kolom plakken. Bij switchen van richting van de loading pomp is het de bedoeling de
peptiden te elueren in de richting van de analytische kolom. Dit doen we door een gradiënt op
te bouwen van eluens B (80 % ACN + 0,1 % FA). Zo krijgen we een scheiding van peptiden op de
analytische kolom. Het chromatogram geeft ons een idee of deze scheiding correct verlopen is.
We gebruiken Glufib ter controle van de gevoeligheid en massa-accuraatheid van de
massaspectrometer.
Processing van de data gebeurt aan de hand van het software programma Mascot
Distiller, waarna gebruik gemaakt wordt van een in-house Mascot server om de eiwitten te
identificeren en te kwantificeren.
4. RESULTATEN
38
4. RESULTATEN
4.1. OPZUIVERING MET GELFILTRATIE EN ANALYSE MET GELELEKTROFORESE
Als voorbereidend werk werd eerst een gelfiltratie uitgevoerd op al de stalen, met als
doel de eiwitten te scheiden van onzuiverheden. In figuur 4.1 worden de resultaten van de
gelfiltraties van stalen PsA 1136, PsA 1129, RA 130 en RA 234 weergegeven. Bij elk staal is er
een stijging in optische densiteit (OD) van fractie 11 21 en van fractie 35 63 zichtbaar. Deze
pieken noemden we respectievelijk piek 2 en 4 (aangeduid met pijltje). De fracties voor piek 2
en voor piek 4 vertoonden geen stijging in OD en noemden we respectievelijk piek 1 en 3.
We illustreren dit voor 4 stalen, nl. staal PsA 1136, PsA 1129, RA 130, RA 234.
FIGUUR 4.1: ABSORPTIE METINGEN BIJ 280NM VAN DE VERSCHILLENDE FRACTIES
Bij een volgende stap werden alle fracties per piek samen gepooled, zodat per staal de 4
pieken apart konden onderworpen worden aan een eiwitbepaling. Dit om een ruwe schatting te
krijgen van de concentratie eiwit aanwezig in de stalen (tabel 4.1). Let wel, niet alle fracties in
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 63
SpA 1136
2
31
4
Fractie
OD
(2
80
nm
)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61
Spa 1129
2
3
1
4
Fractie
OD
(2
80
nm
)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 63 65 67
RA 130
2
3
1
4
OD
(2
80
nm
)
Fractie
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59
RA 234
3
1
4
Fractie
OD
(2
80
nm
)
2
PsA
PsA
4. RESULTATEN
39
piek 1, 3 en 4 werden meegenomen voor een concentratiemeting. Er is dus een verschil in
volume tussen de pieken.
TABEL 4.1: RESULTAAT COOMASSIE EIWITBEPALING PER PIEK VOOR DE 4 STALEN
Uit de eiwitbepalingen werd duidelijk dat de hoogste concentratie aan eiwitten in de
fracties afkomstig was van piek 2. Bij staal PsA 1129 bijvoorbeeld, was de eiwitconcentratie in
piek 2 442,76 µg/ml. Het materiaal uit de pieken werd geanalyseerd met gelelektroforese
waarna een totale eiwitkleuring uitgevoerd werd (fig 4.2). Fluorescente kleuring van de eiwitten
met SYPRO Ruby® toonde aan dat de eiwitten voornamelijk in piek 2 voorkwamen. Anderszijds
toonde de gel eveneens aan dat er eiwitten in piek 3 aanwezig waren. Er was echter nooit een
significante kleuring van piek 1 en piek 4 te zien. Hieruit kon met zekerheid besloten worden dat
de eiwitten zich situeerden in piek 2 en 3, meer bepaald van fractie 11 37. Deze fracties
werden dan ook afgezonderd en verder geprocessed voor iTRAQ analyse.
FIGUUR 4.2: RESULTAAT GELELEKTROFORESE VOOR DE 4 STALEN
STAAL
piek 1 piek 2 piek 3 piek 4
Psa 1136 18,61 162,30 14,58 /
Psa 1129 46,06 442,76 82,57 35,00
RA 130 55,27 165,75 80,34 35,31
RA 234 17,18 132,92 46,32 32,20
COOMASSIE (µg/ml)
STAAL 1136 STAAL 1129 STAAL 130 STAAL 234 merker
Piek 2
Piek 2
Piek 2
Piek 1
Piek 3
Piek 3
Piek 3
Piek 3
Piek 1
Piek 1 Piek 4
Piek 1 Piek 4
Piek 4Piek 2
4. RESULTATEN
40
Gebaseerd op het resultaat van de 4 besproken stalen, werd besloten om bij de
volgende stalen de fracties van piek 2 en 3 onmiddellijk samen te poolen in één epje en hiermee
verder te werken. Met de fracties van piek 1 en 4 werd aldus niet meer verder gewerkt.
4.2 EIWITBEPALING VAN ALLE PATIËNTEN
Tabel 4.2 geeft de resultaten weer van de eiwitbepalingen van al de stalen. Zoals reeds
eerder gezegd, zijn dit de concentraties van piek 2 en 3 samen verwerkt tot 1 geheel.
TABEL 4.2: RESULTAAT COOMASSIE EIWITBEPALING VOOR ALLE PATIËNTEN
4.3 OPZET iTRAQ ANALYSE
Gezien we in de 8-plex-MultiPlex Kit slechts over 8 labels beschikken, diende de analyse
in 2 opgesplitst te worden. Run A bevat de RA en SpA stalen die gescoord werden op
inflammatie, en bestaat bijgevolg uit 5 labels. RA en SpA stalen die gescoord werden op
vascularisatie en infiltratie behoren tot run B, en deze bestaat uit 7 labels.
STAAL COOMASSIE (µg/ml) STAAL COOMASSIE (µg/ml)
RA 130 275,83 PsA 1137 168,03
RA 947 455,12 PsA 1136 320,31
RA 1145 313,06 PsA 1129 658,17
RA 262 410,87 RA acpa - 234 264,90
RA 1111 249,71 RA acpa - 208 303,65
RA 882 442,05 OA 162 292,90
RA 969 421,04 OA 315 344,85
RA 482 381,87 OA 768 234,88
Spa 1085 430,58 OA 377 248,39
Spa 524 459,32
Spa 350 183,57
Spa 1128 553,14
Spa 720 325,77
Spa 142 513,03
4. RESULTATEN
41
TABEL 4.3: INDELING iTRAQ ANALYSE + TOEKENNING LABELS PER STAAL
4.4 RESULTATEN iTRAQ ANALYSE
Ruwe data uit de Masslynx werden geprocessed via de Mascot Distiller en werden samen
met de Database Search verwerkt door Mascot Daemon software.
Bij run A is er een probleem opgetreden te wijten aan een verlies van staal, waardoor te
weinig eiwitten konden identificeerd worden. Deze run zal in de toekomst opnieuw
geanalyseerd worden. De onderstaande resultaten zijn bijgevolg enkel afkomstig van run B.
In deze analyse is het de bedoeling om biomerkers te identificeren die los staan van de
parameters vascularisatie (= B) en infiltratie (= C). Daarom zijn we enkel geïnteresseerd in
eiwitten die eenzelfde ratio bezitten ongeacht of ze gescoord werden op vascularisatie of
infiltratie. Het belangrijkste verschil dat bekeken werd, is de ratio RA/SpA. De andere stalen die
meegenomen werden ter controle (OA, PsA, RA ACPA-), waren potentieel belangrijk omdat er
andere verschillen naar boven konden komen. Echter deze stalen werden niet gescoord op
vascularisatie of infiltratie omdat dit de enige stalen in onze cohorte waren. Ze zijn dus klinisch
niet goed gedefinieerd waardoor mogelijke verschillen, die niet consistent zijn, te verklaren zijn.
Voor de bespreking van de resultaten in deze thesis beperken we ons tot de RA/SpA ratio.
Wij zochten in de Uniprot databank (www.uniprot.org), meer specifiek nog in de humane
databank waarin enkel humane eiwitten met gekende functionaliteit terug te vinden zijn. Op
deze manier konden 43 eiwitten geïdentificeerd worden. Hieruit wordt 1 voorbeeld in detail
besproken, nl. fibrinogeen alfa (FIBA_HUMAN).
STAAL iTRAQ-LABEL STAAL iTRAQ-LABEL
RA A 113 RA B 118
SpA A 114 RA C 119
OA 115 SpA B 121
Psa 116 SpA C 113
RA acpa- 117 OA 114
Psa 115
RA acpa- 116
Run A Run B
4. RESULTATEN
42
TABEL 4.4: EIWITRATIO VAN FIBA_HUMAN
Gezien de peptidesequentie van een eiwit uniek is, kon fibrinogeen alfa, een eiwit met
massa 108897 en pI van 5.7, geïdentificeerd worden aan de hand van 21 peptiden. De eiwit
‘coverage’ bedraagt 12,2 %. ‘N’ betekent hier het aantal peptiden waarop de kwantificatie voor
de gegeven ratio gebaseerd is en ‘weighted’ is de manier waarop de ratio’s bepaald worden.
Wanneer we kijken naar de ratio’s weergegeven in tabel 4.4, dan zien we dat de eiwitratio’s van
fibrinogeen alfa, ongeacht ze gescoord werden op vascularisatie of infiltratie, dezelfde trend
volgen, nl. verhoogd aanwezig in SpA in vergelijking met RA.
4. RESULTATEN
43
TABEL 4.5: LIJST 21 PEPTIDEN WAARMEE FIBA_HUMAN GEÏDENTIFICEERD WERD
De finale eiwitratio (tabel 4.4) wordt berekend uit de ratio van de geïdentificeerde
peptiden (tabel 4.5). Eenentwintig peptiden werden geïdentificeerd (weergegeven in tabel 4.5)
waarvan het merendeel 3-waardig geladen is. ‘exp_mz’ is de gemeten m/z waarde; ‘exp_mr’ is
de omgerekende massa van het peptide; ‘exp_z’ is de experimentele lading van het peptide;
‘calc_mz’ is de theoretische massa van het peptide; ‘delta’ is het verschil tussen de
experimentele en de theoretische massa van het peptide; ‘miss’ duidt aan hoeveel keer het
protease niet geknipt heeft in het geïdentificeerde peptide; ‘expect’ is de expectancy waarde,
nl. een maat voor de kwaliteit van het MS/MS spectrum en drukt de kans uit hoeveel keer je
deze score of een betere score voor identificatie zou hebben voor dit fragmentatiespectrum.
Met andere woorden, hoe lager deze kans, hoe robuuster de identificatie van het peptide; ‘seq’
geeft de sequenctie weer van het peptide en tenslotte ‘var_mod’ geeft de geïdentificeerde
modificaties aan voor het peptide.
Tabel 4.6 geeft de individuele peptide ratio’s weer voor elk peptide en hun gegeven
ratio. Het peptide met massa 727,6823 werd niet meegenomen in de kwantificatie (---)
aangezien het iTRAQ label gebonden zat op het tyrosine residue. Wanneer een peptide met een
‘(-)ratio’ bekomen werd, werd deze eveneens niet geïncludeerd in de kwantificatie van het
eiwit. De ratio werd hier echter wel berekend; dit is het getal weergegeven na de (-). Het
exp_mz exp_mr exp_z calc_mr delta miss expect seq var_mod747,8207 1493,6269 2 1493,7417 -0,1148 0 0,061 QFTSSTSYNR768,9249 1535,8353 2 1535,9496 -0,1143 0 0,0089 QLEQVIAK818,926 1635,8375 2 1635,9082 -0,0707 0 0,017 NSLFEYQK
858,0983 1714,1821 2 1714,0715 0,1106 0 0,013 VQHIQLLQK583,6255 1747,8547 3 1747,9566 -0,1019 0 0,013 GSESGIFTNTK912,9215 1823,8284 2 1823,932 -0,1036 0 6,50E-05 GLIDEVNQDFTNR608,9636 1823,8691 3 1823,932 -0,063 0 0,00099 GLIDEVNQDFTNR938,8895 1875,7645 2 1875,8753 -0,1108 0 1,10E-06 GGSTSYGTGSETESPR938,8945 1875,7744 2 1875,8753 -0,1009 0 5,60E-05 GGSTSYGTGSETESPR626,2706 1875,7899 3 1875,8753 -0,0855 0 6,80E-07 GGSTSYGTGSETESPR626,2803 1875,819 3 1875,8753 -0,0563 0 0,00019 GGSTSYGTGSETESPR938,9394 1875,8642 2 1875,8753 -0,0111 0 1,20E-06 GGSTSYGTGSETESPR727,6823 2180,025 3 2180,0807 -0,0556 0 0,013 GGSTSYGTGSETESPR iTRAQ8plex (Y)756,6496 2266,927 3 2267,047 -0,1199 0 4,60E-08 NPSSAGSWNSGSSGPGSTGNR756,6663 2266,977 3 2267,047 -0,07 0 9,50E-08 NPSSAGSWNSGSSGPGSTGNR756,6893 2267,0461 3 2267,047 -0,0009 0 3,10E-08 NPSSAGSWNSGSSGPGSTGNR756,9797 2267,9172 3 2268,031 -0,1138 0 3,90E-09 NPSSAGSWNSGSSGPGSTGNR Deamidated (NQ)756,985 2267,9331 3 2268,031 -0,0979 0 9,80E-10 NPSSAGSWNSGSSGPGSTGNR Deamidated (NQ)
756,9954 2267,9644 3 2268,031 -0,0666 0 8,80E-09 NPSSAGSWNSGSSGPGSTGNR Deamidated (NQ)757,0167 2268,0282 3 2268,031 -0,0028 0 4,90E-09 NPSSAGSWNSGSSGPGSTGNR Deamidated (NQ)785,5206 2353,54 3 2353,396 0,144 0 0,035 MKPVPDLVPGNFK
4. RESULTATEN
44
algoritme plaatst er een (-) voor omdat of het verschil te groot is en biologisch mogelijks niet
verklaard kan worden, of omdat de kwantificatie van de piek niet goed kon uitgevoerd worden
door een slechte piekvorm of afwezigheid van de piek.
TABEL 4.6: INDIVIDUELE PEPTIDENRATIO’S VOOR FIBRIOGEEN ALFA
Een overzichtstabel van alle geïdentificeerde eiwitten wordt weergegeven in tabel 4.7.
Hierbij zijn de eiwitten, die eenzelfde ratio in RA B/SpA B en RA C/SpA C vertoonden, aangeduid
in grijswaarden. De functie van de eiwitten werd opgezocht in de uniprot database
(www.uniprot.org).
In deze tabel betekent ‘accession’ de identificatiecode uit de uniprot databank; ‘eiwit’
naam van het eiwit; ‘RA B/SpA B’ staat voor de ratio wanneer de stalen gescoord werden op
vascularisatie, net zoals ‘RA C/ SpA C’ staat voor de ratio wanneer gescoord werd op infiltratie
en ‘functie’ is een korte beschrijving van het eiwit.
exp_mz RA B/SpA B RA C/ SpA C RA B/ OA RA C/ OA RA B / Psa RA C/ Psa RA B/ acpa- RA C/ acpa- SpA B/ OA SpA C/ OA SpA B/ Psa SpA C/ Psa SpA B/ acpa- SpA C/ acpa-
747,8207 0,524 1,212 1,595 4,326 0,559 1,462 1,498 3,879 3,326 4,323 0,999 1,304 3,004 4,186768,9249 0,287 0,349 2,927 1,761 0,94 0,545 2,883 1,656 11,126 6,101 3,063 1,686 10,536 6,196818,926 0,317 0,468 -4,809 -3,559 1,084 0,774 5,772 4,079 -16,581 -9,209 3,205 1,787 19,132 11,396
858,0983 0,688 0,466 -3,106 -4,061 2,592 3,267 -26,257 -32,776 -4,931 -10,558 3,527 7,582 -40,072 -92,017583,6255 0,656 1,994 2,04 5,372 0,668 1,695 2,28 5,731 3,399 3,262 0,954 0,919 3,652 3,758912,9215 0,306 0,317 -4,472 -2,388 0,966 0,498 3,571 1,821 -15,977 -9,126 2,96 1,698 12,266 7,515608,9636 0,442 0,338 1,832 0,927 0,848 0,414 1,222 0,59 4,533 3,315 1,8 1,321 2,908 2,28938,8895 0,278 1,103 -3,299 -7,768 0,544 1,234 2,338 5,257 -12,951 -8,528 1,829 1,209 8,825 6,232938,8945 0,242 0,933 -2,775 -6,668 0,478 1,108 -5,397 -12,382 -12,509 -8,651 1,848 1,283 -23,391 -17,349626,2706 0,202 0,769 -1,806 -5,248 0,269 0,755 0,973 2,698 -9,792 -8,262 1,252 1,061 5,068 4,586626,2803 0,416 0,581 2,575 3,991 0,495 0,74 -4,76 -7,045 6,767 8,31 1,116 1,376 -12,028 -15,842938,9394 0,26 1,101 -3,329 -7,72 0,537 1,201 -6,059 -13,413 -14,003 -8,487 1,937 1,179 -24,497 -15,924727,6823 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---756,6496 0,287 1,18 -2,43 -8,568 0,445 1,511 -4,369 -14,705 -9,263 -8,789 1,452 1,384 -16,007 -16,29756,6663 0,33 1,235 -3,999 -8,374 0,588 1,186 1,406 2,811 -13,253 -8,212 1,669 1,039 4,479 2,977756,6893 0,248 1,082 -2,487 -7,9 0,465 1,424 -4,459 -13,519 -10,959 -8,839 1,757 1,423 -18,884 -16,334756,9797 0,338 1,196 -3,227 -8,394 0,523 1,312 -5,152 -12,793 -10,422 -8,498 1,448 1,185 -15,994 -13,986756,985 0,367 0,657 -2,905 -4,891 0,588 0,955 -5,884 -9,459 -8,655 -9,009 1,503 1,571 -16,855 -18,816
756,9954 0,446 0,946 -3,679 -6,314 0,513 0,849 -5,792 -9,49 -9,012 -8,084 1,077 0,97 -13,639 -13,121757,0167 0,39 0,972 -3,295 -6,873 0,548 1,102 -5,458 -10,868 -9,224 -8,564 1,315 1,226 -14,685 -14,623785,5206 0,558 0,565 -43,571 -88,31 1,853 3,62 -19,649 -38,021 -85,388 -189,166 3,112 6,923 -37,017 -87,952
4. RESULTATEN
45
TABEL 4.7: OVERZICHT VAN ALLE GEÏDENTIFICEERDE EIWITTEN
ACCESION EIWIT RA B/SpA B RA C/SpA C FUNCTIE
RA < SpA FIBA_HUMAN fibrinogen alpha chain precursor 0,323 0,760
RA < SpA LUM_HUMAN lumican precursor 0,816 0,837 Binds lamin.
RA < SpA FIBG_HUMAN fibrinogen gamma chain precursor 0,284 0,496
RA < SpA CO6A3_HUMAN collagen alpha-3(VI) chain precursor 0,824 0,771Collagen VI acts as a cell-
binding protein.
RA < SpA FIBB_HUMAN fibrinogen beta chain precursor 0,298 0,410
RA > SpA H2B1A_HUMAN Histone H2B type 1-A 11,200 2,878
RA > SpA LMNA_HUMAN lamin-A/C 1,259 2,200
RA > SpA KAC_HUMAN Ig kappa chain C region 1,267 2,027 immunoglobulin C region, has an immunologic role.
RA > SpA VIME_HUMAN vimentin 1,994 1,485
RA > SpA PDIA1_HUMAN protein disulfide isomerase precursor 2,603 1,835
CO1A1_HUMAN collagen alpha-1(I) chain precursor 1,482 0,606
HBB_HUMAN hemoglobin subunit beta 0,898 2,864
CO3A1_HUMAN collagen alpha-1(III) chain precursor 1,544 0,443
CO1A2_HUMAN collagen alpha-2(I) chain precursor 1,165 0,685
MLE3_HUMAN myosin light chain 3 0,117 55,171
ACTB_HUMAN actin, cytoplasmic 1 (beta-actin) 0,549 4,303
ACTC_HUMAN actin, cardiac muscle 1 (alpha-cardiac-actin)0,390 4,525
FINC_HUMAN fibronectin precursor 0,809 1,332
ALBU_HUMAN serum albumin precursor 0,565 1,303
PRELP_HUMAN prolargine precursor 0,710 1,098
CO6A1_HUMAN collagen alpha-1(VI) chain precursor 1,068 0,774 Collagen VI acts as a cell-binding protein.
HBA_HUMAN hemoglobin subunit alpha 0,740 2,602
H2A1B_HUMAN histone H2A type 1-B 6,986 0,886
Zie HBB_HUMAN
Core component of nucleosome. Nucleosomes wrap and compact DNA into
chromatin, limiting DNA accessibility to the cellular machineries which require
DNA as a template. Histones thereby play a central role in transcription
regulation, DNA repair, DNA replication and chromosomal stability.
May anchor basement membranes to the underlying connective tissue.
Serum albumin, the main protein of plasma, Its main function is the
regulation of the colloidal osmotic pressure of blood.
Fibrinogen has a double function: yielding monomers that polymerize into
fibrin and acting as a cofactor in platelet aggregation.
Involved in oxygen transport
Actins are highly conserved proteins that are involved in various types of cell
motility and are ubiquitously expressed in all eukaryotic cells.
Zie ACTB_HUMAN
Zie FIBA_HUMAN
Zie FIBA_HUMAN
Zie H2A1B_HUMAN
Lamins are components of the nuclear lamina, a fibrous layer on the
nucleoplasmic side of the inner nuclear membrane, which is thought to
provide a framework for the nuclear envelope and may also interact with
chromatin.
This multifunctional protein catalyzes the formation, breakage and
rearrangement of disulfide bonds. At the cell surface, seems to act as a
reductase that cleaves disulfide bonds of proteins attached to the cell. May
therefore cause structural modifications of exofacial proteins. Inside the cell,
seems to form/rearrange disulfide bonds of nascent proteins. At high
concentrations, functions as a chaperone that inhibits aggregation of
misfolded proteins. At low concentrations, facilitates aggregation (anti-
chaperone activity). Also acts a structural subunit of various enzymes such
as prolyl 4-hydroxylase.
Vimentins are class-III intermediate filaments found in various non-epithelial
cells, especially mesenchymal cells.
Type I collagen is a member of group I collagen (fibrillar forming collagen).
Collagen type III occurs in most soft connective tissues along with type I
collagen.
Zie CO1A1_HUMAN
Regulatory light chain of myosin. Does not bind calcium.
Fibronectins bind cell surfaces and various compounds including collagen,
fibrin, heparin, DNA, and actin. Fibronectins are involved in cell adhesion, cell
motility, opsonization, wound healing, and maintenance of cell shape.
4. RESULTATEN
46
TABEL 4.7: OVERZICHT VAN ALLE GEÏDENTIFICEERDE EIWITTEN (VERVOLG)
TPM1_HUMAN tropomyosin-1 alpha chain 0,111 26,194
PGS2_HUMAN decorin precursor 1,694 0,610 May affect the rate of fibrils formation.
H4_HUMAN histone H4 4,240 0,965 Zie H2A1B_HUMAN
CO6A2_HUMAN collagen alpha-2(VI) chain precursor 0,845 1,034 Collagen VI acts as a cell-binding protein.
A1AT_HUMAN alpha-1-antitrypsine precursor 1,263 1,104
CO5A2_HUMAN collagen alpha-2(V) chain precursor 2,432 1,050
MIME_HUMAN mimecan precursor 1,002 0,918
TTHY_HUMAN transthyretin precursor 3,534 0,833
G3P_HUMAN glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase0,902 3,825
PRTN3_HUMAN myeloblastin precursor 0,228 1,000
MYG_HUMAN myoglobin 0,238 2,790
ATPA_HUMAN ATP synthase subunit alpha 0,125 3,417
PGBM_HUMAN
basement membrane-specific heparan
sulfate proteoglycan core protein
precursor
1,505 0,702
TPIS_HUMAN triosephosphate isomerase 0,195 6,797
IGHG1_HUMAN Ig gamma-1 chain C region 0,854 1,258
ASPN_HUMAN asporin precursor 0,043 1,023
ANXA2_HUMAN annexin A2 1,092 3,118
TLN1_HUMAN Talin-1 1,861 0,736
MLRV_HUMAN Myosin regulatory light chain 2 0,080 6,262
K2C1_HUMAN keratin, type II cytoskeletal 1 0,541 1,570
Binds to actin filaments in muscle and non-muscle cells. Plays a central role,
in association with the troponin complex, in the calcium dependent regulation
of vertebrate striated muscle contraction. Smooth muscle contraction is
regulated by interaction with caldesmon. In non-muscle cells is implicated in
stabilizing cytoskeleton actin filaments.
Inhibitor of serine proteases. Its primary target is elastase, but it also has a
moderate affinity for plasmin and thrombin. Irreversibly inhibits trypsin,
chymotrypsin and plasminogen activator. The aberrant form inhibits insulin-
induced NO synthesis in platelets, decreases coagulation time and has
proteolytic activity against insulin and plasmin.
Type V collagen is a member of group I collagen (fibrillar forming collagen). It
is a minor connective tissue component of nearly ubiquitous distribution. Type
V collagen binds to DNA, heparan sulfate, thrombospondin, heparin, and
insulin. Type V collagen is a key determinant in the assembly of tissue-
specific matrices.
Induces bone formation in conjunction with TGF-beta-1 or TGF-beta-2.
Thyroid hormone-binding protein. Probably transports thyroxine from the
bloodstream to the brain.
Independent of its glycolytic activity it is also involved in membrane trafficking
in the early secretory pathway.
Polymorphonuclear leukocyte serine protease that degrades elastin,
fibronectin, laminin, vitronectin, and collagen types I, III, and IV (in vitro) and
causes emphysema when administered by tracheal insufflation to hamsters.
Probably involved in connections of major cytoskeletal structures to the
plasma membrane. High molecular weight cytoskeletal protein concentrated
at regions of cell-substratum contact and, in lymphocytes, at cell-cell
contacts.
May regulate the activity of kinases such as PKC and SRC via binding to
integrin beta-1 (ITB1) and the receptor of activated protein kinase C.
Serves as a reserve supply of oxygen and facilitates the movement of oxygen
within muscles.
Mitochondrial membrane ATP synthase (F1F0 ATP synthase or Complex V)
produces ATP from ADP in the presence of a proton gradient across the
membrane which is generated by electron transport complexes of the
respiratory chain.
This protein is an integral component of basement membranes. It is
responsible for the fixed negative electrostatic charge and is involved in the
charge-selective ultrafiltration properties. It serves as an attachment
substrate for cells.
Has an immunologic role.
Calcium-regulated membrane-binding protein whose affinity for calcium is
greatly enhanced by anionic phospholipids. It binds two calcium ions with
high affinity. May be involved in heat-stress response.
Triosphosphate is the glytolytic enzyme that catalyses the reversible
interconversion of glyceraldehyde-3-phosphaat and dihydroxyacetone
phosphaat. Plays also an important role in several metabolic pathways and is
efficient for energy production.
Binds TGF-β, a key cytokine in OA pathogenes and inhibits TGF-β induced
chondrogenesis.
Moves alang with actine filaments, while hydrolysing ATP.
4. RESULTATEN
47
Eiwitten die verlaagd aanwezig waren bij RA ten opzichte van SpA zijn de subunits van
fibrinogeen (alfa, beta en gamma), lumican en de collageen alfa-3(VI) keten.
A) Fibrinogeen RA < SpA
Fibrinogeen, een 340 kDa glycoproteïne gecodeerd op chromosoom 4 en tevens
precursor van fibrine, bleek uit de bekomen data een hogere expressie te hebben in SpA dan in
RA. Dit acute-fase reactant wordt vrijgesteld als antwoord op inflammatie, infectie of auto-
immuniteit. Het is gekend dat fibrinogeen gamma net als de alfa en de beta keten een belangrijk
gecitrullineerd auto-antigen vormt in RA (Matsuo et al., 2006). De immuuncomplexen gevormd
met gecitrullineerd fibrinogeen spelen eveneens een rol bij synovitis en de vorming van
pannusweefsel. Het is zelfs zo dat als hypothese genomen wordt dat auto-antilichamen tegen
gecitrullineerd fibrinogeen bijdragen aan het onevenwicht tussen coagulatie en fibrinolyse. Dit
door structurele en functionele veranderingen aan te brengen aan het eiwit (Zhao et al., 2008).
Fibrinogeen is dus voornamelijk gekend in de reumatologische wereld als antigen, althans zijn
gecitrullineerde vorm. De studie van Chapuy-Regaud et al. (2005) toont aan dat fibrinogeen en
gecitrullineerd fibrinogeen in eiwitextracten van synoviaal weefsel aanwezig zijn. Deze studie
heeft tot doel het bestuderen van gecitrullineerd fibrinogeen en de antilichaamrespons ertegen
in verschillende reumatologische aandoeningen. In hun analyse wordt echter niet gekeken naar
de totale eiwitexpressie van fibrinogeen. Toch is het eiwit in alle pathologieën aantoonbaar (6 x
RA, 2 x AS, 2 x PsA, 1 x OA) en is de hoeveelheid ervan is sterk patiëntafhankelijk. De resultaten
uit de iTRAQ analyse tonen duidelijk aan dat alle subunits waaruit fibrinogeen bestaat
verminderd aanwezig zijn in RA tov SpA. Over de citrullinatiestatus van dit eiwit kunnen we uit
de bekomen data geen conclusies trekken. Alhoewel citrullinatie als variabele modificatie werd
aangeduid, werden geen peptiden geïdentificeerd met een citrullineresidue.
B) Lumican precursor RA < SpA
Lumican behoort tot de familie van de smal leucine rich proteins (SLRP) en wordt
hoofdzakelijk teruggevonden in de extracellulaire matrix van het kraakbeen. Dit eiwit bindt aan
fibrillair collageen en belemmert zo hun groei en werking. Neerwaartse regulatie van lumican
leidt tot een verhoogde accumulatie van type II-collageen in synthetisch kraakbeen. Meer
4. RESULTATEN
48
collageen maakt het kraakbeen sterker. Uit de resultaten bleek lumican meer voor te komen bij
SpA dan bij RA. Nochtans wordt SpA eerder gekenmerkt door botopbouw, maar het zou best
kunnen dat de verhoogde lumican waarden geproduceerd worden in het erosieve stadium
(Kafienah et al., 2008). Het is gerapporteerd dat lumican gesynthetiseerd wordt door in vitro
gecultiveerde synoviale fibroblasten (Seiki et al., 1998). Verder is er geen additionele
functionele informatie over dit eiwit te vinden specifiek voor inflammatoire artritis. De meeste
reumatologische studies linken dit eiwit met OA en degeneratieve artritis. Dit SLRP zou wel eens
een rol kunnen spelen in de proliferatie en differentiatie van het synovium tot invaderend
pannusweefsel. Het wordt nl. geassocieerd met heel wat vormen van agressieve kanker
(Ishiwata et al., 2007; Matsuda et al., 2008). De manier waarop lumican proliferatie of
metastase van cellen zou beïnvloeden, ligt in zijn effect op het cytoskelet van de cellen
(Radwanska et al., 2008).
C) Collageen (VI) RA < SpA
Collageen type VI is exclusief aanwezig in de pericellulaire matrix van chondrocyten. In
normaal kraakbeen, zijn chondrocyten omkapseld door een dun weefsel dat uitsluitend bestaat
uit deze vorm van collageen. Aangezien deze pericellulaire matrix elke chondrocyt omgeeft,
wordt het gezien als een filter of omzetter voor biochemische signalen ofwel van het kraakbeen
ofwel van de extracellulaire matrix. Knock-out muizen voor dit type collageen vertoonden een
structureel normaal uitziende pericellulaire matrix, maar ze vertoonden wel een versnelde
degeneratieve artritis (alexopoulus et al., 2009). Verder wordt collageen type A3 geassocieerd
met een diffuus type van tenosynoviale giant cell tumor. Dit is een goedaardige, maar
agressieve proliferatie van de synoviale mononucleaire cellen met inflammatoire infiltraten
(Möller et al., 2008).
4. RESULTATEN
49
Eiwitten die verhoogd aanwezig waren in RA ten opzichte van SpA zijn het vimentine en
lamin A/C, histone H2B, IgG kappa chain en proteïne disulfide isomerase.
A) Vimentine RA > SpA
Vimentine, een intermediair filament dat tot expressie komt in synoviale fibroblasten,
werd bij ons hoger geëxpresseerd in RA dan in SpA. Zheng et al. (2009) bewees dit recent met
zijn studie van het humaan plasma proteoom bij RA. Deze structurele eiwitten zijn van groot
belang bij de opbouw van het cytoskelet en de integriteit van de cel (Wilke et al., 1995). In 2003
werd door een studie van Mor-Vaknin aangetoond dat fragmenten van vimentine gesecreteerd
werden door geactiveerde macrofagen tijdens inflammatie. Eveneens bleken antilichamen
tegen vimentine een merker te zijn voor de inflammatoire activiteit bij patiënten met
inflammatoire gewrichtsaandoeningen (Mayet et al., 1990). Dit alles wijst erop dat vimentine
mogelijks een rol speelt in het inflammatoir proces. Daarbij komt nog dat vimentine werd
aangeduid als potentieel auto-antigen, nl. het Sa antigen, dat zeer specifiek is voor RA
(Vossenaar et al., 2004). Uit voorgaand onderzoek in het laboratorium is gebleken dat
gecitrullineerd vimentine meer aanwezig is in RA dan is SpA (Tilleman et al., 2008b).
B) Lamine RA > SpA
Lamine-A/C maakt, net zoals vimentine, deel uit van de groep van intermediaire
filamenten maar deze keer van de nucleaire lamina. Uit onze resultaten bleek dat dit lamine-A/C
meer voorkomt bij RA dan bij SpA. Lamine-A/C is verlaagd aanwezig in osteoblasten van oudere
muizen in vergelijking met jonge muizen. Duque en Rivas (2006) concludeerden dat er een
reductie in lamine-A/C expressie was naargelang de leeftijd. Dit heeft uiteraard gevolgen voor
de functie van de osteoarticulaire cellen (Duque & Rivas, 2006). Verder is er weinig informatie te
vinden over dit eiwit in relatie met inflammatoire artritis.
C) Ig kappa chain C region RA > SpA
Ig kappa is het constante deel van de lichte keten van de immunoglobuline molecule. De
verhoogde aanwezigheid van dit eiwit werd eveneens gerapporteerd door Chang X et al. (2009)
in een klassieke proteoom analyse van synvoiaal weefsel afkomstig van RA, AS en OA.
4. RESULTATEN
50
D) protein disulfide isomerase RA > SpA
Protein disulfide isomerase of kortweg PDI is een enzyme van het endoplasmatisch
reticulum. Bij laag zuurstofgehalte verhoogt de aanmaak van procollageen hydroxylasen, oa.
ook de prolyl-4-hydroxylasen. Deze enzymen katalyseren de vorming van 4-hydroxyproline wat
nodig is voor de stabiele triple-helix vorming van collageen. Het protein disulfide isomerase doet
dienst als beta subunit van dit enzym prolyl-4-hydroxylase (Grimmer et al., 2006). Zo kunnen we
stellen dat PDI ook onrechtstreeks meebouwt aan de vorming van collageen, dat op zijn beurt
bijdraagt aan de sterkte van de kraakbeenmatrix.
5. DISCUSSIE
51
5. DISCUSSIE
Proteomics is een techniek met veel toekomst op gebied van reumatologie. Met deze
techniek streven we er naar eiwitten te ontdekken die een specifiek expressiepatroon volgen in
RA of SpA en zo een sprong vooruit te maken in de kennis van de pathogenese van RA en SpA.
Dit kan dan op zijn beurt resulteren in nieuwe therapeutische targets.
Het gebruik van de high-throughput gel-vrije iTRAQ approach was dan ook onontbeerlijk
in dit onderzoek. Tandem MS, in combinatie met iTRAQ labelling, werd toegepast om het
membranair proteoom van het synovium te identificeren en te kwantificeren.
Uit bovenstaande resultaten bleek dat de membranaire eiwitprofielen van RA duidelijk
verschilden van deze van SpA. Omdat eventuele verschillen niet mochten toegeschreven
worden aan verschillen in synoviale microarchitectuur, werden de patiënten gestratificeerd over
3 groepen. Groep A werd gescoord op gelijke inflammatiegraad, groep B op gelijke
vascularisatie en groep C had dezelfde infiltratiegraad. Scoring op synoviale lining kan in de
toekomst ook nuttig zijn. Uit een totaal van 43 geïdentificeerde eiwitten selecteerden we enkel
die eiwitten welke eenzelfde expressieprofiel vertoonden, ongeacht vascularisatie en infiltratie.
Zo reduceerden we de resultaten tot een tiental eiwitten.
De bekomen data waren afkomstig uit een run die gemerged werd, nl. run B werd in
duplo gerund. Dit houdt in dat er 2 technische replicaten van run B samen geanalyseerd
werden. Hierdoor is de identificatie en kwanitificatie van de eiwitten robuuster omdat ze
gebaseerd zijn op een groter aantal peptiden. Dit was echter niet het geval voor de Ig Kappa
chain C region en histone H2B type 1-A die op basis van 1 peptide geïdentificeerd en
gekwanitificeerd werden. Deze peptiden haalden weliswaar een zeer lage expectancy ( 0,00056
en 0,0038 respectievelijk) wat wijst op een kwalitatief hoog MS/MS spectrum. Eveneens kon de
differentiële aanwezigheid van eiwitten in RA en SpA niet worden toegeschreven aan
histologische parameters, zoals vascularisatie en infiltratie, gezien hiervoor gestratificeerd werd.
Met andere woorden wil dit zeggen dat deze 10 eiwitten geen merkers waren voor
vascularisatie en infiltratie.
5. DISCUSSIE
52
Zoals eerder gezegd, moet run A worden herhaald in de toekomst. We moeten de
resultaten hiervan nog afwachten. Pas dan kunnen we met zekerheid ons besluit doortrekken
over de hele lijn, nl. dat de geïdentificeerde eiwitten geen merkers zijn voor inflammatie,
vascularisatie en infiltratie, maar gewoon zuivere merkers zijn voor RA of SpA.
De andere helft van de stalen zal eveneens later geanalyseerd worden. Deze keer zal een
RP/RP-HPLC techniek toegepast worden. Deze toepassing biedt voldoende hoge scheiding van
zowel kleine als hydrofobe peptiden. Dit maximaliseert bijgevolg de sensitiviteit van de MS
analyse (Rogatsky & Stein, 2006). Bij RP/RP zullen de peptiden zowel in 1e als in 2e dimensie
gescheiden worden op basis van hun hydrofobiciteit. Lui et al. toonde in 2007 aan dat de RP/RP
methode te verkiezen is boven de conventionele SCX/RP methode, gezien de hogere
fractionatiekwaliteit (Lui et al., 2007).
Echter, wanneer we zochten in de literatuur, vonden we slechts 1 recente studie met als
doel eiwitprofielen van inflammatoire pathologieën te vergelijken/correleren. De studie van
Chang et al. (2009) gebruikte een klassieke proteomicsapproach en een totaal eiwit extract van
synoviaal weefsel. In deze analyse werden dan ook veelal andere eiwitten differentieel terug
gevonden. Bij de meeste onderzoeken wordt echter steeds gezocht naar inflammatiemerkers
door RA te vergelijken met een niet-inflammatoire aandoening zoals OA. In dit opzicht is de
opzet beschreven in deze thesis uniek.
Bij een korte literatuurzoektocht over de geselecteerde eiwitten werd geconstateerd dat
er weinig informatie te vinden is over eiwit expressiepatronen in biologische stalen van SpA
patiënten. Toch wijzen onze data op een mogelijks verschil tussen deze twee inflammatoire
artritis vormen.
6. CONCLUSIE
53
6. CONCLUSIE
In deze studie voerden we een screening uit naar het synoviaal membranair eiwit
expressiepatroon bij patiënten met RA en SpA. Hierbij maakten we gebruik van de iTRAQ
proteomicstechniek, die reeds enkele jaren geleden werd geïntroduceerd in het labo
Farmaceutische Biotechnologie.
Met onze proteoomstudie hebben we een totaal van 43 eiwitten kunnen identificeren.
Hiervan vertoonden slechts 10 eiwitten een significante kwantificatie-ratio, d.w.z. een ratio die
zowel bij vascularisatie als bij infiltratie in dezelfde lijn ligt. Vergeleken met SpA vertoonden de
eiwitten, H2B1A, LMNA, KAC, VIME en PDIA1 een hogere expressie in het synoviaal weefsel van
RA. FIBA, FIBB, FIBG, LUM en CO6A3 daarentegen kwamen meer voor bij SpA.
Ter conclusie kunnen we stellen dat het expressieniveau van bepaalde eiwitten bijdraagt
tot de differentiatie van inflammatoire pathologieën onderling. Mede hierdoor kunnen we de
moleculaire biologie van artritis beter begrijpen om zo op zoek te gaan naar biomerkers en
nieuwe therapeutica.
7. LITERATUURLIJST
54
7. LITERATUURLIJST
Artikels en boeken
Alexopoulos, L. G.; Youn, I.; Bonaldo, P.; Guilak, F. (2009). Developmental and osteoarthritic
changes in Col6a1-knockout mice: biomechanics of type VI collagen in the cartilage pericellular
matrix. Arthritis Rheum, 60(3), 771-9
Arden, N. and Nevitt, M. C. (2006). Osteoarthritis: epidemiology. Best Pract. Res. Clin.
Rheumatol., 20, 3-25
Aebersold, R. and Mann, M. (2003). Mass spectrometry-based proteomics. Nature, 422, 198-
207
Baeten, D. and De Keyser, F. (2004a). The histopathology of Spondyloarthropathy, Current
Molecular Medicine, 4, 1-12
Baeten, D.; Kruithof, E.; De Rycke, L.; Boots, A. M.; Mielants, H.; Veys, E. M.; De Keyser, F.
(2004b). Infiltration of the synovial membrane with macrophage subsets and
polymorphonuclear cells reflects global disease activity in spondyloarthropathy. Arthritis
Research & Therapy, 7(2), 359-369
Chang, X.; Cui, Y.; Zong, M.; Zhao, Y.; Yan, X.; Chen, Y.; Han, J. (2009). Identification of proteins
with increased expression in rheumatoid arthritis synovial tissues. J Rheumatol., 36(5), 872-80
Chapuy-Regaud, S.; Sebbag, M.; Baeten, D.; Clavel, C.; Foulquier, C.; De Keyser, F.; Serre, G.
(2005). Fibrin deimination in synovial tissue is not specific for rheumatoid arthritis but
commonly occurs during synovitides. J Immunol., 174(8), 5057-64
Dhaouadi, T., Sfar, I., Abelmoula, L., Jendoubi-Ayed, S., Aouadi, H., Ben Abdellah, T., Ayed, K.,
Zouari, R., Gorgi, Y. (2007). Role of immune system, apoptosis and angiogenesis in pathogenesis
of rheumatoid arthritis and joint destruction, a systematic review. Tunis Med., 85(12), 991-8
Duque, G.; Rivas, D. (2006). Age-related changes in lamin A/C expression in the osteoarticular
system: laminopathies as a potential new aging mechanism. Mech Ageing Dev., 127(4), 378-83
7. LITERATUURLIJST
55
Edwards, J. C., Wilkinson, L. S., Pitsillides, A. A. (1993). Palisading cells of rheumatoid nodules:
comparison with synovial intimal cells. Ann Rheum Dis., 52(11), 801-5
Edwards, J. C. (1994). The nature and origins of synovium: experimental approaches to the study
of synoviocyte differentiation. J. Anat., 184, 493-501
Edwards, J. C. (2000). Fibroblast biology: development and differentiation of synovial fibroblasts
in arthritis. Arthritis Res., 2, 344-347
Firestein, G. S. (1997). Rheumatoid synovitis and pannus. Mosby, Londen, pp. 13.11- 13.15
Firestein, G. S. (2003). Evolving concepts of rheumatoid arthritis. Nature, 423, 356-361
FitzGerald, O.; Bresnihan, B. (1995). Synovial membrane cellularity and vascularity. Ann Rheum
Dis., 54(6), 511-515
Gaston, H. (2006). Mechanisms of disease: the immunopathogenesis of spondyloarthropathies.
Nature Clinical Practice, 2, 383-392
Gevaert, K.; Van Damme, P.; Ghesquière, B.; Impens, F.; Martens, L.; Helsens, K.;
Vandekerckhove, J. (2007). A la carte proteomics with an emphasis on gel-free techniques.
Proteomics, 7, 2698-2718
Gevaert, K. and Vandekerckhove, J. (2004). COFRADIC™: the Hubble telescope of proteomics.
Drug Discovery Today, 3, 16-22
Grimmer, C.; Balbus, N.; Lang, U.; Aigner, T.; Cramer, T.; Müller, L.; Swoboda, B.; Pfander, D.
(2006). Regulation of type II collagen synthesis during osteoarthritis by prolyl-4-hydroxylases:
possible influence of low oxygen levels. Am J Pathol., 169(2), 491-502
Görg, A.; Weiss, W.; Dunn, M. J. (2004). Current two-dimensional electrophoresis technology for
proteomics. Proteomics, 4, 3665-3685
Graham, R. L-J.; Graham, C.; McMullan, G. (2007). Microbial proteomics: a mass spectrometry
primer for biologists. Microbial Cell Factories, 6, 26
7. LITERATUURLIJST
56
György, B.; Tóth, E.; Tarcsa, E.; Falus, A.; Buzás EI. (2006). Citrullination: a posttranslational
modification in health and disease. Int J Biochem Cell Biol, 38, 1662-77
Harris, E. D. (1997). Rheumatoid Arthritis. W.B. Saunders Company, Philadelphia
Ishiwata, T.; Cho, K.; Kawahara, K.; Yamamoto, T.; Fujiwara, Y.; Uchida, E.; Tajiri, T.; Naito, Z.
(2007). Role of lumican in cancer cells and adjacent stromal tissues in human pancreatic cancer.
Oncol Rep, 18(3), 537-43
Kafienah, W.; Cheung, F. L.; Sims, T.; Martin, I.; Miot, S.; Von Ruhland, C.; Roughley, P. J.;
Hollander, A. P. ( 2008). Lumican inhibits collagen deposition in tissue engineered cartilage.
Matrix Biology, 27, 526- 534
Khan, M. A. (2002). Update on spondyloarthropathies. Annals of Internal Medicine, 136, 896-
907
Korb, A.; Pavenstädt, H.; Pap, T. (2009). Cell death in rheumatoid arthritis. Apoptosis., 14(4),
447-454
Lainer-Carr, D. and Brahn, E. (2007) Angiogenesis inhibition as a therapeutic approach for
inflammatory synovitis. Nature Clinical Practice, 3, 434-442
Lambrecht, S.; Tilleman, K.; Elewaut D.; Deforce, D. (2008). Proteomics in rheumatology: the
beginning of a fairy tale? Proteomics Clin. Appl., 2, 1-9
Lisse, J. R. (1993). Does rheumatoid factor always mean arthritis. Postgrad Med, 94, 133-134,
139
Matsuda, Y.; Yamamoto, T.; Kudo, M.; Kawahara, K.; Kawamoto, M.; Nakajima, Y.; Koizumi, K.;
Nakazawa, N.; Ishiwata, T.; Naito, Z. (2008). Expression and roles of lumican in lung
adenocarcinoma and squamous cell carcinoma. Int J. Oncol., 33(6), 1177-85
Matsuo, K.; Xiang, Y.; Nakamura, H.; Masuko, K.; Yudoh, K.; Noyori, K.; Nishioka, K.; Saito, T.;
Kato, T. (2006). Identification of novel citrullinated autoantigens of synovium in rheumatoid
arthritis using a proteomic approach. Arthritis Res Ther, 8(6), R175
7. LITERATUURLIJST
57
Mayet, W. J.; Hermann, E.; Bachmann, M.; Manns, M.; Meyer zum Büschenfelde, K. H. ( 1990).
Correlation of anti-cytoskeleton antibody activities in synovial fluid with interleukin-6 in patients
with osteoarthritis and inflammatory joint disease. Klin Wochenschr., 68(13), 685-91
McMichael, A. and Bowness, P. (2002). HLA-B27: natural function and pathogenic role in
spondyloarthritis. Arthritis Res, 4, 153-158
Miller, M-C.; Manning, H. B.; Jain, A.; Troeberg, L.; Dudhia, J.; Essex, D.; Sandison, A.; Seiki, M.;
Nanchahal, J.; Nagase, H.; Itoh, Y. (2009). Membrane Type 1 Matrix Metalloproteinase is a
crucial promotor of synovial invasion in human rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatism,
60, 686-697
Möller, E.; Mandahl, N.; Mertens, F.; Panagopoulos, I. (2008). Molecular identification of
COL6A3-CSF1 fusion transcripts in tenosynovial giant cell tumors. Genes Chromosomes Cancer,
47(1), 21-5
Mor-Vaknin, N.; Punturieri, A.; Sitwala, K.; Markovitz,,D. M. (2003). Vimentin is secreted by
activated macrophages. Nat Cell Biol., 5(1), 59-63
Nyman, T. A. (2001). The role of mass spectrometry in proteome studies. Biomolecular
engeneering, 18, 221-227
Patterson, S. D. & Aebersold, R. H. (2003). Proteomics: the first decade and beyond. Nature
genetics supplement, 33, 311-323
Patton, W. F.; Schulenberg, B.; Steinberg, T. H. (2002). Two-dimensional gel electrophoresis;
better than a poke in the ICAT?. Current Opinion in Biotechnology, 13, 321-328
Poole, A. R. and Dieppe, P. (1994). Biological markers in rheumatoid arthritis. Semin Arthritis
Rheum, 23, 17-31
Pratt, A. G., Isaacs, J.D., Mattey, D.L. (2009). Current concepts in the pathogenesis of early
rheumatoid arthritis. Best Pract Res Clin Rheumatol., 23(1), 37-48
7. LITERATUURLIJST
58
Radwanska, A.; Baczynska, D.; Nowak, D.; Brézillon, S.; Popow, A.; Maquart, F. X.; Wegrowski, Y.;
Malicka-Blaszkiewicz, M. (2008). Lumican affects actin cytoskeletal organization in human
melanoma A375 cells. Life sci, 83(19-20), 651-60
Reveille, J. D. and Arnett, F. C. (2005). Spondyloarthritis: update on pathogenesis and
management. The American Journal of Medicine, 118, 592-603
Ross, P. L.; Huang, Y. N.; Marchese, J. N.; Williamson, B.; Parker, K.; Hattan, S.; Khainovski, N.;
Pillai, S.; Dey, S.; Daniels, S.; Purkayastha, S.; Juhasz, P.; Martin, S.; Bartlet, M.; He, F.; Jacobson,
A.; Pappin, D. J. (2004). Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using
amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & Cellular Proteomics, 3.12, 1154-1169
Schett, G. (2006). Rheumatoid arthritis: inflammation and bone loss. Wien Med Wochenschr,
156/1-2, 34-41
Seki, T.; Selby, J.; Häupl, T.; Winchester, R. (1998). Use of differential subtraction method to
identify genes that characterize the phenotype of cultured rheumatoid arthritis synoviocytes.
Arthritis Rheum., 41(8), 1356-64
Smith, J. B.; Haynes, M. K. (2002). Rheumatoid Arthritis- A molecular understanding. Ann Intern
Med., 136, 908-922
Shao-En Ong, Leonard J. Foster and Mann, M. (2003). Mass spectrometric-based approaches in
quantitative proteomics. 39, 124-130
Smolen, J. S.; Aletaha, D.; Steiner, G. (2009) Does damage cause inflammation? Revisiting the
link between joint damage and inflammation. Ann Rheum Dis, 68, 159-162
Steen, H. and Mann, M. (2004). The ABC’s (and XYZ’s) of peptide sequencing. Nature reviews, 5,
699-711
Tilleman, K.; Deforce, D.; Elewaut, D. (2005). Rheumatology: a close encounter with proteomics.
Rheumatology, vol, 1-10
7. LITERATUURLIJST
59
Tilleman, K.; Van Beneden, K.; Dhondt, A.; Hoffman, I.; De Keyser, F.; Veys, E.; Elewaut, D.;
Deforce, D. (2005). Chronically inflamed synovium from spondyloarthropathy and rheumatoid
arthritis investigated by protein expression profiling followed by tandem mass spectrometry.
Proteomics, 5, 2247-2257
Tilleman, K. and Deforce, D. (2008a). Proteomics in rheumatology. Expert Rev. Proteomics, 5(6),
1-5
Tilleman, K.; Van Steendam, K.; Cantaert, T.; De Keyser, F.; Elewaut, D.; Deforce, D. (2008b).
Synovial detection and autoantibody reactivity of processed citrullinated isoforms of Vimentin
in inflammatory arthritides. Rheumatology, 47(5), 597-604
Vossenaar, E. R.; Després, N.; Lapointe, E.; van der Heijden, A.; Lora, M.; Senshu, T.; van
Venrooij, W. J.; Ménard, H. A. (2004). Rheumatoid arthritis specific anti-Sa antibodies target
citrullinated vimentin. Arthritis Res Ther., 6(2), R142-50
Wilke, A.; Schönian, U.; Herzum, M.; Hengstenberg, C.; Hufnagel, G.; Brilla, C. G.; Maisch, B.
(1995). The extracellular matrix and cytoskeleton of the myocardium in cardiac inflammatory
reaction. Herz., 20(2), 95-108
Wilkins, M.R.; Sanchez, J.C.; Gooley, A.A.; Appel, R.D.; Humphery-Smith, I.; Hochstrasser, D.F.;
Williams, K.L. (1996). Progress with proteome projects: why all proteins expressed by a genome
should be identified and how to do it. Biotechnol Genet Eng Rev., 13, 19-50
Zhao, X.; Okeke, N. L.; Sharpe, O.; Batliwalla, F. M.; Lee, A. T.; Ho, P. P.; Tomooka, B. H.;
Gregersen, P. K.; Robinson, W. H. (2008). Circulating immune complexes contain citrullinated
fibrinogen in rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther, 10(4), R94
Zheng, X.; Wu, S. L., Hincapie, M.; Hancock, W. S. (2009). Study of the human plasma proteome
of rheumatoid arthritis. J Chromatogr A., 1216(16), 3538-45
7. LITERATUURLIJST
60
Websites
http://boneandspine.com/wp-content/uploads/2007/10/clip_image002.jpg
(FIGUUR 1.1)
http://www.hopkins-arthritis.org/arthritis-info/rheumatoidarthritis/images/clinical/ex-
artdis1.jpg
(FIGUUR 1.2)
http://www.nature.com/nrrheum/journal/v3/n8/images/ncprheum0559-f1.jpg
(FIGUUR 1.3)
http://www.nature.com/nrd/journal/v2/n6/images/nrd1109-f2.gif
(FIGUUR 1.4)
http://edoc.hu-berlin.de/dissertationen/xie-jing-2003-12-15/HTML/xie_html_12a07b27.png
(FIGUUR 1.7)
http://www.magnet.fsu.edu/education/tutorials/tools/images/ionization-maldi.jpg
http://www.magnet.fsu.edu/education/tutorials/tools/images/ionization_esi.jpg
(FIGUUR 1.12)
http://www.uniprot.org