Analyse in vivo des interactions protéine-protéine · Mutagénèse aléatoire parPCR: Dubuisson...
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1
Analyse in vivo des interactions protéine-protéine
Roland Lloubès LISM, IBSMhttp://lism.cnrs-mrs.fr
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Plan
Interactions « toxine-bactérie »définitions des colicinesmode d’action
Détection de complexe protéiqueLes interactions des colicines avec les protéines de l’enveloppe bactérienne:récepteurs systèmes de translocation
Interactions « protéine-protéine »Les interactions Tol-colicine suivies par plusieurs techniques immunologiques
Mutations suppressives Les complexes entre protéines solubles et entre protéines membranaires (au niveau des segments transmembranaires)
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Les colicines
Substances qui inhibent la croissance bactérienne
Substances non transmissibles
Substances insensibles aux nucléases
Substances résistantes à l’action des rayonnements UV
Substances détruites par l’action de protéases
______________________________________________________Frederick P. (1950); Jacob F. et al., (1952); Lwoff A. Et al., (1952)
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4
Les différentes colicines
colicine activité plasmide BRP
E2, E7, E8, E9 DNase BPM +
E3, E6 RNase BPM +
E5, E4 RNase BPM +
Cloacine DF13
(Enterobacter cloacae)RNase BPM +
A
(Citrobacter freundii)Pore BPM +
E1 Pore BPM +
N Pore BPM +
K Pore BPM +
U
(Shigella boydii)Pore chomosome ?
Col5 Pore BPM +
Col10 Pore BPM +
Ia, Ib Pore HPM -
B Pore HPM -
D RNase BPM +
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5
Les plasmides colicinogéniques
A, E1, K, N...
E2, E8, E9, D...
B, Ia, Ib...
L’organisation des opérons indique que la protéine d’immunité des colicines à activité nucléasique doit interagir avec la colicine elle même….
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Biosynthèse et mode d ’action des colicines
Bactérie productrice
Bactérie réceptrice
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7
Résistants et tolérants
Davies and Reeves (1975)
I
II
III
IV
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Récepteur etsystème de translocation
Colicines Activité Récepteur translocation
E2, E7, E8, E9 DNase BtuB TolAQRB
E3, E6 RNase BtuB TolAQRB
E5, E4 RNase BtuB TolABQR
Cloacine DF13
(Enterobacter cloacae)RNase IutA TolAQR
A
(Citrobacter freundii)Pore BtuB TolAQRB
E1 Pore BtuB TolAQ
N Pore OmpF TolAQR
K Pore Tsx TolAQRB
U
(Shigella boydii)Pore OmpA TolAQRB
S4 Pore OmpW ?
Col5 Pore Tsx TonB, ExbBD
Col10 Pore Tsx TonB, ExbBD
Ia, Ib Pore Cir TonB, ExbBD
B Pore FepA TonB, ExbBD
D RNase FepA TonB, ExbBD
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Mode d’action des différentes colicines
TonB-dépendantes
Tol-dépendantes
E5 E3E4E6
E2,E7E8,E9
Ionophoriques
EnzymatiquesD
M
B Ia, Ib5, 10 K N U S4 E1
A
BtuB
FepA
FepA
FhuA
Cir Tsx BtuB
ADN
ribosome
ARNt
Arrêt de la synthèse peptidique DNase
OmpF OmpA OmpW
Arrêt de lasynthèse du
peptidoglycane
OmpA OmpFOmpF
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Les 3 domaines de la colicine A
Baty et al. (1988)
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Les 3 domaines fonctionnels des colicines
T Colicin Ia Colicin Ia Colicin Ia
T R P
Colicin Ia
Colicin 10
Colicin E1
Colicin A
Colicin N
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Organisation des « clusters » tol-pal….
Sturgis 2001
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Localisation et topologie des protéines du système Tol-Pal
Lazdunski et al. 2000
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14
Phénotype des mutants tol-pal
Immunodétections de LamB et coloration négativede cellules tolA cultivées avec maltose (a) ouglucose (b) (Lloubès et al., 2001)
- altération de l’intégrité membranaire:
hypersensibilité aux agents toxiques
fuite des protéines périplasmiques
vésicularisation de la membrane externe
- tolérance vis à vis des colicines et
des phages filamenteux (tol)
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Co-localisation
fractionnement cellulaire
séparation membrane interneet membrane externe parultracentrifugation sur gradient de sucrose
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16Guihard et al. (1994)
Les protéines Tol et la colicine A sont co-localisées
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Suivi des interactions par la technique dite « overlay »
Bénédetti et al., 1991
Principe(marquage 35S des protéines)électrophorèse SDS-PAGEélectrotransfert sur nitrocelluloseincubation avec 100nM de colicine Aimmunodétection avec un anticorps dirigécontre la colicine A
Le domaine C-terminal de TolA est requis pour permettrel’interaction avec la colicine A
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Le domaine N-terminal de colA interagit avec TolA
Cette technique d ’overlay a été utile pour le complexe TolA-colicineAmais n’a pas pu être utilisée pour d’autres interactions du système.
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Immunoprécipitations
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Le domaine N-terminal de la colicine E3 interagit avec TolB
Technique pour analyser les complexes protéiquesdans le périplasme: Bouveret et al., 2002
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Modèle pour l’étape de translocation de la colicine A
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Pontage chimique et immunoprécipitations
Coimmunoprécipitation de Pal par les anticorps anti TolA(cellules préalablement traitées avec des agents de pontage)
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Cascales et al., 2000
La FPM et le domaine C-terminal de TolA permettent l’interaction
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Mutations suppressives dans la membrane interne
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25
Lazzaroni et al., 1995
Interaction entre les segments TM de TolQ3 et de TolR
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26
Mutation suppressive dans le périplasme
Dubuisson et al., 2002Mutagénèse aléatoire parPCR:
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27
Résultats des interactions suivies par le double hybride levure
Walburger et al., 2001
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28
TolA
Pal
TolQ TolR
I IIIII
ME
MI
PG
L’interaction TolA-Pal requiert les protéines TolQ-TolR et laforce proton motrice issue de la membrane interne
Journet et al., 1999; Cascales et al., 2001
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29
III
TolA
TolB Pal
I
TolQ TolR
I II IIII
ME
MI
PGII
II
III
Les interactions des protéines Tol-Pal dans le périplasme
OmpA
Bouveret et al., 1995; Bouveret et al., 1999; Cascales et al., 2002
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30
IM
OM
TolA
TolQ TolR
PalTolB
OmpA
Résumé