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Master 2 Expression Génique et Protéines Recombinantes

Analyse des modifications post- traductionnelles par

spectrométrie de masse

Promo 16 – 2015/2016

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Table des matières

I. INTRODUCTION 5

II. METHODES DE FRAGMENTATION 5

1. COLLISION INDUCED DISSOCIATION – CID 5

2. HIGHER-ENERGY COLLISIONAL DISSOCIATION – HCD 7

3. ELECTRON TRANSFERT DISSOCIATION – ETD 7

III. MODIFICATIONS POST-TRADUCTIONNELLES 9

1. GLYCOSYLATIONS 9

N-GLYCOSYLATION 9 O-GLYCOSYLATION 21

2. MODIFICATIONS LIPIDIQUES. 25

GLYPIATION 25 MYRISTYOLATION ET PALMITOYLATION 25 PRENYLATION 27

3. MODIFICATIONS PEPTIDIQUES 31

PHOSPHORYLATION 31 METHYLATION 33 ACETYLATION 33 SUMOYLATION 35 UBIQUITINYLATION 35 S-NITROSYLATION 37 CITRULLINATION 37

IV. CONCLUSION. 39

V. BIBLIOGRAPHIE 41

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I. Introduction

Les protéines subissent de nombreuses modifications covalentes pendant et après

leurs synthèses, celles-ci étant regroupées sous le nom de modifications post-traductionnelles

(MPT). Ces MPT ont des rôles dans la régulation de l’activité protéique, l’adressage à différents

compartiments, l’ancrage aux membranes, dans certaines cascades de signalisation et dans la

reconnaissance par les systèmes de dégradation protéique. Parmi les MPT que l’on peut

retrouver dans une protéine, nous retrouvons les glycosylations, les glypiations, les

myristoylations et palmitoylations, les prénylations, les phosphorylations, les méthylations,

les acétylations, les S-nitrosylations, la citrullination, la SUMOylations et l’ubiquitinylation. La

méthode de choix pour la détection de ces modifications est la spectrométrie de masse (Doll

et Burlingame 2015). En effet, cette méthode permet la détection de façon spécifique,

sensible et hautement résolutive de ces structures mais aussi la quantification relative ou

absolue de celle-ci (les techniques de quantification ne seront pas décrites ici). Il est

fréquemment nécessaire d’enrichir l’échantillon en protéine portant des MTP pour l’analyse

en spectrométrie de masse. Ces études sont donc directement corrélées aux méthodes de

séparation et d’enrichissement existantes.

Cette revue établie par la promotion 16 du Master EGPR, s’applique à regrouper différentes

publications et différentes stratégies pour l’étude de modifications post-traductionnelles.

Nous retrouverons dans un premier les différentes méthodes fragmentation en MS/MS

permettant l’élucidation de la composition en MPT puis dans une deuxième partie nous avons

rassemblé les différentes publications et résumé leur méthode pour l’étude de chacune des

MPT listées précédemment.

II. Méthodes de fragmentation

1. Collision induced dissociation – CID

Le CID (collision-induced dissociation) est une technique de spectrométrie de masse

pour induire la fragmentation d’un ion moléculaire tel que des peptides en phase gazeuse.

Dans la source, cet ion moléculaire est généralement accéléré par un potentiel électrique pour

acquérir une haute énergie cinétique. Sa collision avec un gaz neutre (tel qu’hélium, azote ou

argon) va provoquer la fragmentation de l’ion moléculaire précurseur en ions fils qui seront

analysés en spectrométrie de masse en tandem (MS/MS).

Les ions fils obtenus sont des ions b (b = ΣR + 1 où R = résidu) ou des ions y (y = ΣR + 19). La

collision entraîne aussi une fragmentation des modifications post-traductionnelles telles que

les O- et N-glycosylations.

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2. Higher-energy Collisional Dissociation – HCD

Le HCD (Higher-energy Collisional Dissociation) est un mode de fragmentation

initialement décrit par Olsen sur un appareil LTQ Orbitrap (Olsen et al. 2007). Ce mode de

fragmentation est très proche du CID. En effet, comme en CID, la dissociation des ions parents

se fait par collision avec un gaz inerte, et donne des ions fragments b et y.

Cependant, contrairement au CID qui a lieu dans un piège à ion linéaire, la fragmentation HCD

se déroule dans une cellule de collision octopôlaire spécialement conçue, permettant

d’augmenter l’énergie de fragmentation. Cela entraîne deux conséquences principales.

Premièrement, par rapport au CID, on observe au total moins d’ions fragments sur le spectre.

Deuxièmement, on s’affranchit d’une limite inhérente au CID: le « low-mass cutoff ». Ce

phénomène consiste en l’absence des fragments de basse masse (inférieurs à un tiers de l’ion

précurseur) sur les spectres CID classiques. Contrairement au CID, le HCD permet d’observer

ces fragments.

3. Electron transfert dissociation – ETD

Le mécanisme de l’electron capture dissociation ou electron transfert dissociation (ETD)

permet une fragmentation en phase gazeuse d’ions protéiques ou peptidiques généralement

multi chargés après la capture d’un électron de faible énergie (<1eV) ou un transfert

électronique, toujours en phase gazeuse. Les espèces portant un ou plusieurs électrons

supplémentaires vont subir un réarrangement avec clivage possible de la liaison N-C du

squelette peptidique. Ces fragmentations induisent une très grande majorité d’ions c et z, sans

perte de l’information massique apporté par les MPTs potentiellement présentent. Cette

approche présente l’avantage de pouvoir sélectionner comme ions parents le peptide

complet, de le fragmenter et d’accéder au site de la MPTs, ainsi que d’approfondir sa

caractérisation.

Ce mode de fragmentation est particulièrement utile dans l’étude des phosphorylations, O et

N-glycosylation, nitrosylation, formation de ponts disulfures et sulfonation.

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III. Modifications post-traductionnelles

1. Glycosylations

La glycosylation correspond à un ajout d’oses au cours de la biosynthèse de protéines.

Cette addition d’oligosaccharides a un rôle primordial dans la maturation des protéines et

dans leurs fonctions. On distinguera ici les N-glycosylations, impliquant des asparagines, des

O-glycosylations sur sérines et thréonines.

N-glycosylation

Les N-glycosylations sont des modifications co- et post-traductionnelles. Elles ont lieu

pendant la traduction dans le réticulum endoplasmique puis continuent dans l’appareil de

Golgi. Ce motif commence généralement par une N-acétylglucosamine et est lié aux protéines

par le biais d’une asparagine. Une séquence consensus du type N-X-S/T (où X peut-être

n’importe quel acide aminé sauf une proline) est admise. Les N-glycosylations possèdent une

plus grande variabilité c’est pourquoi leur étude est parfois complexe et nécessite l’utilisation

de méthodes d’enrichissements couplée à différentes méthodes de fragmentation.

► Méthode d’enrichissement et détermination des sites de N-glycosylations

La publication que nous allons présenter propose une méthode d’enrichissement de

peptides N-glycosylée permettant l’étude de cette glycosylation et notamment l’identification

des sites de glycosylations (Asperger et al. 2015). La protéine étudiée est le lysozyme de blanc

d’œuf de poule, largement utilisée lors de production de protéines recombinantes chez E.coli.

Une des formes minoritaires de cette protéine a été décrite comme étant N-glycosylée,

malgré le fait que cette protéine ne présente pas de séquence consensus N-X-S/T. D’anciennes

recherches avaient été effectuées sur cette protéine mais la limitation principale qui

apparaissait était la faible abondance de cette forme (Trudel et Asselin 1995). Une colonne de

phase directe, la ZIC-HILIC (Zwitterionic Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography),

permet un enrichissement en peptides glycosylés. C’est une colonne qui utilise l’eau et de

l’acétonitrile comme solvant, pour enrichir les composés polaires, dans notre cas les peptides

glycosylés issus d’une digestion trypsique. (Di Palma et al. 2011)

Deux types de fragmentations ont été utilisés, le CID, permettant la fragmentation de

ses parties osidique et peptidique et l’ETD, permettant uniquement la fragmentation de la

partie peptidique. Ces deux fragmentations et leurs couplages à différentes protéases les

PNGase F et endoglycosidases F1-3 et l’endoglycosidase H ont permis la détermination des

sites de glycosylations qui demeuraient pour l’instant purement spéculatives.

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Figure 1 Spectres MALDI-TOF issus de la digestion

trypsique du HEL avant et après séparation via colonne

ZIC-HILIC.

Figure 2 Spectre MALDI-MS/MS du

peptide N-glycosylé à 3051,2 après

enrichissement via la colonne ZIC-HILIC.

Le panel droit représente un zoom du

spectre au niveau de la région 1400 et

1650 m/z, laissant apparaître trois pics

correspondant (i) au peptide ; m/z =

1428,7 (ii) au peptide avec le premier

ose fragmenté en X0,21 ; m/z = 1511,8 (iii)

au peptide avec le premier ose, un N-acétylhexosamine (HexNAc) ; m/z = 1631,8.

Figure 3 Détermination

de la position de N

glycosylation par UPLC-

ESI-ETD-MS/MS après

digestion à

l’endoglycosidase F1-F3

et H : (A)

chromatogramme et

spectres MS des peptides

(1) et (2) après

enrichissement en

peptide N-glycosylés et

digestion enzymatique.

Les carrés noirs

représentent les positions

des N-Glycosylation. (B)

schéma de la digestion

par les endoglycosidases

F1-F3 et H. (C) Portions

des tableaux des masses

théoriques issues des spectres de masse des peptides (1) (spectre 1) et (2) (spectre 2). Les N oranges

correspondent aux asparagines portant les N-Glycosylations. La présence de la modification est identifiable

par l’incrément de masse égale à la masse d’un résidu asparagine (114) et d’un N-acétylhexosamine (203).

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Après la digestion trypsique du lysozyme, une étude comparative avant et après l’utilisation

de la colonne ZIC-HILIC. Cette colonne est composée d’une sulfobétaïne greffée sur une

colonne de silice. Elle permet ainsi des interactions hydrophiles et polaires, séparant les

peptides N-glycosylées de ceux qui ne le sont pas. Après l’utilisation de la colonne ZIC-HILIC

couplé à l’analyse en MALDI-TOF, on observe l‘apparition de peptides à un m/z plus élevé, qui

correspondent aux peptides portant des N-glycosylations (Fig. 1). Il n’était pas possible

d’observer ces peptides avant leurs enrichissements à cause du phénomène de suppression

d’ions, dû à la compétition entre les peptides abondants non glycosylés et peu abondants,

glycosylés. Le peptide le plus abondant observé après colonne ZIC-HILIC pour un m/z de

3051,3 a ensuite été analysé en MALDI-MS/MS-TOF-TOF (Fig. 2). Les ions y et b issus de la

fragmentation CID permettent de déterminer la séquence du peptide portant des N-

glycosylations FESNFNTQATNR. Un zoom du spectre laisse apparaître trois pics particuliers

à 1428,7, 1511,8 et 1631,8. Le premier correspond au peptide entier, le dernier correspond

au peptide et au premier sucre (HexNac) de la N-glycosylation. Le pic pour le m/z de 1511, 8

correspond à une fragmentation X0,21.interne de HexNac associée au peptide.

L’hétérogénéité des N-glycosylations a été étudiée à partir du spectre MALDI-TOF

après séparation sur colonne ZIC-HILIC. Les auteurs ont pu déterminer quelle était

l’abondance relative des différents motifs osidiques, avec le nombre d’hexoses et de N-

acétylhexosamines qui les composent. Les deux motifs les plus abondants sont ceux composés

de (Hex)5(HexNAc)4 et dans une moindre mesure le (Hex)4(HexNAc)4.

Afin de déterminer le(s) site(s) de glycosylation(s), deux méthodes de dé-glycosylations

couplées à deux techniques de fragmentation ont été étudiées. Une première méthode de dé-

glycosylations a été utilisée avec les endoglycosidases F1, F2, F3 et H permettant une

hydrolyse de la liaison entre le motif osidique et le premier sucre (Fig. 3). Cette méthode

couplée à une fragmentation ETD permet la conservation du premier sucre et donc l’obtention

d’un incrément de masse de 203 correspondant au résidu osidique du N-acétylglucosamine.

Une deuxième méthode utilise la PNGase F hydrolysant la liaison entre le motif osidique et

l’asparagine, transformant cet acide aminé en aspartate Les auteurs ont réalisé cette

expérience en présence 18O, permettant d’augmenter l’incrément de masse de la modification

de l’asparagine en aspartate, de 1 à 3. Ces deux méthodes ont permis de déterminer la

présence de deux sites de glycosylations sur les asparagines N44 et N39. Ces deux asparagines

font partis de sites NXN et NXQ, identifiées à ce jour comme des sites non consensus de N-

glycosylations.

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Figure 4 Stratégie et caractérisation des deux isoformes de la glycoprotéine CLEC-2 recombinant. (A) Présentation de la stratégie utilisé. (B) Résultat de la migration sur gel SDS-PAGE de CLEC-2 recombinant, ayant subi (piste +) ou non (piste -) une digestion à la PNGase F. La bande 1 correspond à la forme HMW, la bande 2 à la forme LMW et la bande entourée en rouge correspond au peptide sans le glycane. (C) LC-MS-MALDI-QIT-TOF du lysat glycopeptidique, pour la forme HMW (panel de gauche, temps de rétention à 21.83 min) et pour la forme LMW (panel de droite, temps de rétention à 23.98 min). Les encadrés rouges indiquent les résultats de la LC pour les deux formes (courbe noire = HMW et courbe violette = LMW). Pour HMW, des fragments de grande intensité sortent dans la zone des hautes masses (3549.4, 3794.5, 3956.5 et 4077.3 m/z) tandis que pour LMW des fragments de grandes intensités sortent dans la zone des basses masses (1440.4 et 1457.4 m/z). (D) LC-MS/MS (CID)-MALDI-QIT-TOF de l’ion parents à 3954.4 (à gauche) et 1457.4 m/z (à droite). Pour le spectre de gauche, on remarque la présence d’un fragment représentant le peptide complet sans sa part ie glycanique (en bleu) et les pertes des monosaccharides du glycane (en vert). Le spectre de droite montre que la forme LMW n’est pas glycosylé au niveau de l’asparagine 134.

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► Caractérisation de fragments glycaniques et élucidation structurale en un run de

MS/MS

Notre premier exemple s’applique à la caractérisation d’un récepteur plaquettaire humain, le

C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2), retrouvé sous deux formes de poids moléculaire

différents (HMW et LMW) divergeant seulement au niveau de leurs fragments glycaniques

(Zhou et al. 2015). Le second exemple étudie l’impact de trois différents modes de

fragmentation couramment utilisés lors d’approches de glycoprotéomique pour l’élucidation

structurale d’une protéine, l’Irregular Xyleme 9 (AoIRX9) de l’asperge (Ford et al. 2015).

Le récepteur CLEC-2 a été décrit dans les années 2000 comme étant exprimé à la surface des

plaquettes et pouvant reconnaitre différents ligands comme des toxines de serpents. Il est

impliqué dans une multitude de fonctions : les mécanismes d’agrégations plaquettaires,

l’invasion métastatique ou encore dans les infections par le HIV. Ces études mettent en avant

le fait que ce récepteur natif, purifié et analysé par SDS-PAGE, est retrouvé sous deux formes

de poids moléculaires distincts alors que le squelette peptidique reste inchangé (229 résidus

d’AA, 27kDa). L’enjeu de la publication de L. Zhou et al et de caractériser simplement avec une

bonne sensibilité les deux formes du récepteur CLEC-2 afin de comprendre plus en détail les

mécanismes biologiques et fonctionnelles qui n’ont pas été clairement défini.

La stratégie choisie de glycoprotéomique combine une chromatographie en phase liquide

(nano LC) avec une analyse par MALDI-QIT-TOF MS/MS (CID) (Fig. 4A) pour déterminer

directement les différences entre les formes HMW et LMW de CLEC-2. Dans un premier

temps, les auteurs ont vérifié la présence de ces deux formes par digestion ou non à la PNGase

F de CLEC-2 recombinant suivi d’une migration sur SDS-PAGE coloré au bleu de Coomassie. Ils

ont pu déterminer que la différence de masse provenait bien d’un profil glycanique différent.

Sans digestion à la PNGase F, deux bandes sont retrouvées (27kDa et 35kDa) tandis qu’après

digestion, un seul bande (22kDa) est majoritairement présente (Fig. 4B). Après avoir récupéré

les bandes d’intérêts du gel SDS-PAGE qui n’ont pas subi le traitement à la PNGase F, les

auteurs les digèrent par la trypsine puis séparent le lysat glycopeptidique par nano-LC (C18).

La détection se fait par UV (214nm et 280nm). Ils mettent en évidence deux temps de

rétentions au niveau de deux pics chromatographiques distincts : à 21.83 minutes pour la

forme HMW et à 23.98 minutes pour la forme LMW. Ces deux fractions sont récupérées pour

une analyse par MALDI-QIT-TOF MS (Fig. 4C) et MS/MS (CID) (l’argon est utilisé pour

fragmenter).

Pour la forme HMW, le MALDI-QIT-TOF MS révèle trois pics de forte intensité (m/z 3549.4,

m/z 3956.5 et m/z 4077.3) absent au niveau de la même analyse faite sur la forme LMW. Cette

dernière montre des signaux intenses dans des zones de bas poids moléculaire (m/z 1440.4 et

m/z 1457.4) absents au niveau de HMW (Fig. 4C).

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Dans le cadre d’une étude par MS/MS, pour gagner en informations structurales, les

auteurs ont choisi les ions parents sortant à m/z 3549.4, m/z 3956.5 et m/z 4077.3 pour la

forme HMW et à m/z 1440.4 pour la forme LMW. Seuls les spectres pour les ions parents à

m/z 3549.4 et à m/z 1440.4 sont présentés (Fig. 4D). Premièrement, lorsque l’ion m/z 3956.5

est pris comme précurseurs, le spectre montre des incréments de masses caractéristiques de

fractions osidiques (146, 162 ou 203 Da) dans les zones de hautes masses ainsi que la

génération d’un ion fils à 1643.4 m/z qui correspond à la masse du peptide total lié à un résidu

d’HexNAc (1440.3 + 203 = 1643.3 m/z). Ces résultats indiquent que l’ion parent est un

glycopeptide. Par interprétation manuel du spectre MS/MS combiné à divers outils de calcul

de masse (GlycoWorkbench et GlycoModtool), la structure du peptide, QYCTDMNATLLK et du

glycane (tétra antenne, HexNAc6 Hex7 Fuc1) sont déterminées (Fig. 4D, gauche).

Deuxièmement, les mêmes analyses sont réalisées sur les ions à m/z 3956.5 et m/z 4077.3 et

donnent des résultats identiques pour la séquence peptidique. En revanche, ces ions

montrent une « micro-hétérogénéité » de leurs parties saccharidiques, l’ion à m/z 4077.3

présente une tri antenne glycanique (HexNAc5 Hex9 Fuc1) et l’ion à m/z 3549.4 présente un

bi antenne glycanique (HexNAc4 Hex7 Fuc1). L’ion a m/z 1457.5, provenant de la forme LMW,

et supposé non glyqué (par le calcul), montre aucuns ions fils pouvant être attribué à une

partie glycanique ou glycopeptidique. La séquence peptique est donc la même que celle les

trois ions précédemment analysés (Fig. 4D, droite).

Mises en commun, ces analyses comparatives en MALDI-QIT-TOF MS/MS ont permis de

déterminer précisément les différences structurales existantes entre les formes HMW et LMW

de CLEC-2. Après avoir déterminé que les deux formes avaient la même séquence peptidique,

les auteurs remarquent que la forme HMW porte au niveau de l’Asparagine 134 trois motifs

glycaniques distincts absent de la forme LMW. En résumé, l’utilisation d’un seul run de nano

LC- MALDI-QIT-TOF MS/MS (CID), sans étapes préalables d’enrichissements ou de digestion

aux PNGases, a permis l’obtention de données structurales de la partie glycanique et

peptidiques des deux isoformes de CLEC-2, à condition de posséder des informations

préliminaires (position de la glycosylation, choix de l’ion parent pour la CID).

Tout n’est pas si simple, c’est pourquoi nous avons décidé de vous présenter les avantages

qu’apportent les trois modes de fragmentation les plus couramment utilisé dans le cadre

d’étude de glycoprotéomique, nous permettrons d’aborder d’autres solutions

dedétermination structurale.

Dans le cadre de cette étude, les auteurs comparent trois modes de fragmentations,

CID, HCD et ETD, en LC-MS/MS pour la détermination structurale d’une glycoprotéine

végétale : AoIRX9, soupçonnée de porter une glycosylation (Ford et al. 2015).

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Figure 5 Analyse comparative des spectres MS/MS obtenus par CID (A), HCD (B) et ETD (C) d’un glycopeptide provenant du lysat trypsique d’AoIRX9 recombinante.(B) Le spectre obtenu par HCD porte deux informations primordiales : la signature glycanique, figuré par les cercles bleus. L’ion à 204.09 m/z est significatif d’un résidu HexosamineN-Acétylé+H+ et l’ion à 366.14 m/z correspond à une hexosamine N-Acétylé lié à un résidu d’hexosamine + H+. L’ion di-chargé à 1137.54 m/z (entouré en rouge) correspond au peptide entier sans sa partie glycanique et a permis de déterminer la masse de ce dernier à 1576.6 Da.(C) Par ETD, seul le peptide est fragmenté en ions c et z majoritairement. Les ions c7

2+ et c6+ (entouré en jaune) ont permis la détermination du site de N-glycosylation. L’analyse

par MS3 de l’ion penta-chargé à 770.94 m/z, correspondant au glycopeptide entier, a permis la détermination complète de la séquence peptidique.

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La protéine AoIRX9 est clonée dans une construction plasmidique (fusionnée à la protéine

fluorescente vénus). Ce vecteur est utilisé pour transformer une souche d’Agrobacterium

compétente qui sera injecté dans les feuilles de Nicotiana benthamiana. Ainsi ils se servent de

cette plante pour exprimer transitoirement la protéine. Quatre jours après l’infection, les

feuilles sont récupérées et les protéines microsomales sont isolées. Avant les analyses en MS

et dans le but d’enrichir leurs extraits en protéines AoIRX9, les auteurs réalisent une

immunoprécipitation avec le kit GFP-Trap, suivant les indications du fournisseur. Après

digestion trypsique de l’extrait enrichit, les premières analyses en LC-MS indiquent que la

protéine AoIRX9 se retrouve considérablement enrichie dans le lysat.

Le premier type de fragmentation étudié est le CID, il permet de mettre en évidence très peu

de fragments peptidiques, seules les ions y6 et b2 sont retrouvées sur le spectre et des

fragments glycopeptidiques multichargés (Fig. 5A). A ce niveau, aucune structure complète

n’a pu être déterminée, la nécessité d’utiliser des techniques complémentaires est bien

présente. Par HCD, deux informations capitales apparaissent. Cette méthode permet de

mettre en évidence une signature glycanique comme l’ion retrouvé à 204.09 m/z

(caractéristique d’une HexNAc) ou à 366.14 m/z (HexNAc – Hex) et un ion di-chargé à 1137.54

m/z, représentant le peptide sans son glycane. Cette valeur de m/z a permis le calcul de la

masse du glycane, établit à 1576.6 Da et correspondant à un HexNAc4 Pent1 Fuc1 Hex3. En

revanche, comme pour la fragmentation par CID, peu de fragments peptidiques sont obtenus

(b2, y3 et y9)(Fig. 5B). Il est important de noter que pour avoir une meilleure détermination

structurale du glycane, il est nécessaire de coupler un séquençage enzymatique (par des

exoglycosidases par exemple) avec une analyse plus détaillée des fragments obtenus par

MS/MS (Harvey 2005).L’ETD est particulièrement décrite comme ayant la capacité de fournir

des ions c et z provenant du peptide uniquement, laissant la partie glycanique intacte. Ce

mode de fragmentation permet la détermination du site de N-glycosylation en comparant les

ions c6 et c7, le septième résidu étant l’asparagine qui porte le glycane (Fig. 5C) (c72+

(M+2H)2+ = 1240.56 m/z (M+H)+ = 2480.12 m/z et c6+ = 789.52 m/z. c72+ - c6+ - Masse résidu

Asn = 1576.6 Da). De plus, en analysant par MS3 (ETD/ETD) l’ion à 770.94 m/z (penta-chargé),

les auteurs ont pu déterminer précisément la séquence du peptide : HLTYKENFTDAKAEADHQR

(data not shown).Il est intéressant de noter que d’autres équipes de recherche (Catalina et al.

2007)ont pu produire des informations de séquences et structurales très précises en utilisant

seulement une MS3 (ETD combiné avec une CID).

En conclusion, pour l’étude de la protéine AoIXR9, les modes de fragmentations HCD et ETD

se sont révélés les plus efficaces dans la détermination structurale du peptide et du glycane.

La HCD pour la signature glycanique et l’obtention de la masse du peptide seul et l’ETD pour

la détermination de la séquence peptidique et du site de N-glycosylation. L’utilisation du CID

n’a pas été d’une grande aide, mais peut cependant apporter des informations

complémentaires de séquence du glycane.

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Figure 6 Spectres MS/MS d’un peptide N-glycosylé de la fétuine, par las fragmentations CID (A) et HCD (B). (A) En CID, les fragments de rapport m/z inférieurs au tiers de la masse de l’ion parent ne sont pas détectés. Les nombreuses fragmentations du glycopeptide permettent de remonter à la structure du glycane. (B) En HCD, les fragments observés sont moins nombreux qu’en CID. Les fragments B de basse masse, caractéristiques de la partie osidique du glycopeptide sont détectés. Le fragment Y1 provenant du glycopeptide est le plus abondant dans la région des hautes masses (m/z > 800).

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► L’application de la méthode de fragmentation HCD pour l’identification de N-

glycosylation

Segu Z.M. et Mechref Y. se sont intéressés à l’application des fragmentations CID et

HCD à l’étude des N-glycosylations (Segu et Mechref 2010). D’une part, les auteurs ont

comparé les spectres MS/MS obtenus par les deux types de fragmentation. L’accent a été mis

sur les spécificités du HCD. D’autre part les auteurs ont proposé une stratégie automatisable,

permettant l’identification des peptides N-glycosylés et la détermination de leurs structures

par l’utilisation conjointe du CID et du HCD.

La fétuine, une protéine N-glycosylée connue, a été digérée par la trypsine et les cystéines ont

été alkylées. Les peptides obtenus ont été séparés par la chromatographie liquide (nano-LC),

ionisés par la technique d’électrospray et soumis à la spectrométrie de masse en tandem

(MS/MS).

Les spectres MS/MS sont obtenus par les fragmentations CID et HCD d’un glycopeptide parent

trichargé (Fig. 6). Ils montrent des fragments glycopeptidiques Y dichargés et des fragments

glycaniques B monochargés.

Premièrement, sur le spectre CID on observe davantage d’ions fragments que sur le spectre

HCD. En CID, les nombreux fragments glycopeptidiques permettent de remonter à la

composition osidique de l’ion parent. Ceci n’est pas possible en analysant le spectre HCD, où

seuls trois fragments glycopeptidiques sont attribués. Cette propriété est décrite par les

auteurs comme une faiblesse de la fragmentation HCD.

Deuxièmement, sur le spectre CID, dans la région des m/z inférieurs à un tiers du m/z de l’ion

parent, on ne détecte aucun fragment significativement abondant. Ceci constitue une limite

de la fragmentation CID. Au contraire, sur le spectre HCD dans la région des basses masses,

on détecte les fragments B provenant des oses du glycopeptide. Ces fragments ont des

rapports m/z caractéristiques : 204,1 pour la N-acétylhexosamine (HexNAc) ; 292,1 pour

l’acide sialique (NeuNAc) ; 366,1 pour le fragment HexNac-Hex et 657,2 pour le fragment

NeuNAc-Hex-HexNAc. Ces rapports m/z constituent la « signature glycanique » du spectre, et

permettent d’identifier l’ion parent en tant que glycopeptide. La présence systématique de

ces fragments glycaniques caractéristiques sur les spectres MS/MS HCD est considérée

comme un atout de cette technique de fragmentation. Enfin, on remarque que l’ion Y1 du

glycopeptide constitue l’ion le plus abondant. L’abondance systématique de l’ion Y1 dans les

hautes masses (ion le plus intense à m/z > 800) est un autre avantage du HCD. En effet, sur les

spectres CID ce n’est pas toujours le cas. De ce fait, et contrairement au HCD, l’attribution de

l’ion Y1 sur les spectres CID est souvent difficile et ne peut pas être automatisée.

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Les auteurs font les mêmes observations sur les spectres CID et HCD provenant de protéines

différentes, ce qui les conduit à proposer une stratégie d’identification et de caractérisation

des glycopeptides. Les peptides provenant d’une protéine N-glycosylée inconnue sont soumis

à la MS/MS HCD. Les peptides N-glycosylés sont identifiés par la présence des fragments

caractéristiques du glycane, et le rapport m/z le plus abondant dans les hautes masses est

attribué au fragment Y1. D’une part, le fragment Y1 est analysé en MS3. Le spectre MS3 du

fragment Y1 permet de séquencer le peptide et de confirmer la position de la glycosylation.

D’autre part, le glycopeptide parent identifié par le HCD est soumis à fragmentation en CID

afin de déterminer la composition en oses du glycane. Ainsi, le glycopeptide est entièrement

caractérisée par l’utilisation conjointe des deux techniques de fragmentation.

O-glycosylation

L’O-glycosylation est une modification post-traductionnelle qui s’effectue

spécifiquement dans l’appareil de Golgi. Les vésicules apportant les protéines au Golgi

proviennent en général du réticulum endoplasmique et leur maturation se continue dans cet

autre organite cellulaire. Elle contribue ainsi aux différents rôles biologiques des

glycosylations comme l’adhésion et la communication cellulaire, le repliement de protéines

ou encore l’interaction avec le système immunitaire. La modification est réalisée par une

oligosaccharyl-transférase et consiste en l’ajout, sur des résidus thréonine ou serine de la

protéine, d’un motif osidique plus ou moins complexe. Il est à noter que, contrairement à la

N-glycosylation, il n’y a pas de motifs consensus permettant de prédire la position d’une O-

glycosylation, ce qui constitue une difficulté majeure dans son analyse. De plus, il n’existe pas

d’enzymes capables d’enlever le motif osidique lié au peptide dans le cas d’une O-

glycosylation, contrairement à la PNGase qui permet de retirer les N-glycanes intégralement.

Nous allons vous présenter ici deux articles, le premier traitant d’une méthode

d’enrichissement des peptides O-glycosylés, ainsi que différentes dé-glycosylations

permettant la détermination des sites de O-glycosylation. La seconde publication présente

une stratégie de détermination du motif osidique par l’utilisation de fragmentation ETD.

► Détermination des sites de O-glycosylation.

Bai et ses collaborateurs ont voulu mettre en place un protocole permettant de

déterminer les sites de O-glycosylations dans un échantillon complexe tel que le plasma

humain(Bai et al. 2015). À partir d’échantillon de plasma humain, les auteurs ont tout d’abord,

grâce à un kit, éliminé l’albumine sur colonne de chromatographie d’affinité. Étant la protéine

majoritaire du plasma, son élimination permet d’augmenter la sensibilité et la qualité de

l’analyse en spectrométrie de masse. Le mélange protéique déplété de l’albumine est réduit

au DTT et dérivé à l’iodoacétamide. Cette dérivation entraîne un incrément de masse sur les

cystéines de 57 et permet un accès facilité pour la trypsine à ses sites de coupures (K, R).

22

Figure 7. Localisation du site de O-

glycosylation après purification Jacalin

et Nano-LC-CID-LTQ-Orbitrap

MS/MS (A) spectre représentant la

fragmentation du peptide

TPIVGQPSIPGGPVR, le carré jaune

montrant les ions portant la O-

glycosylation. (B) Tableau comparatif

montrant les masses théoriques des

ions b et y mono- et dichargés sans la O-

glycosylation avec les masses mesurées

par les auteurs. Les cases jaunes

montrent les incréments de masse de

203m/z correspondant au GalNAc fixé

sur la sérine (site de O-glycosylation).

Figure 8. Détermination de la

composition du motif osidique en

ETD (A) Spectre représentant la

fragmentation du peptide

ETGATEKPTVIDSTIQSEFPTY. (B)

Tableau comparatif montrant les

masses théoriques des ions c et z mono-

, di-, et trichargés sans la O-

glycosylation avec les masses mesurées

par les auteurs. Les cases bleues

représentent les incréments de masse

de la première O-glycosylation sur les

ions C. Les cases jaunes représentent

les incréments de masse la première O-

glycosylation sur les ions Z. les cases

vertes représentent les incréments de

masse des 2 O-glycosylations sur les

ions C et Z. L’incrément de masse sur un

ion monochargé correspond à

947.49m/z, le dichargé correspond à

473.75m/z et le trichargé correspond à 315.83m/z.

23

L’apport de la méthode proposée par les auteurs se démarque par la N-déglycosylation totale

et une O-glycosylation partielle par digestion enzymatique (PNGase F, β(1-3,4)galactosidase,

β-N-acetylglucosaminidase, sialidase A). Le premier sucre établissant la liaison entre la

protéine et le reste du motif osidique a été décrit comme étant un N-acétylgalactosamide. La

digestion partielle permet de conserver uniquement ce premier sucre sur les sérines ou les

thréonines qu’ils le portent. Les peptides O-glycosylés, purifiés par chromatographie d’affinité

Jacalin (composée de lectines), sont analysés par Nano-LC-CID-LTQ-Orbitrap. L’incrément de

masse de Ser ou Thr lors de la perte du résidu osidique de N-acétylgalactosamide sur le résidu

d’acide aminé est alors de 203 (Fig. 7).

► Détermination du motif osidique

Dans une deuxième publication, les auteurs ont utilisé des analyses en MS/MS via une

fragmentation ETD pour l’étude du motif osidique d’O-glycosylations. La fragmentation de la

partie peptidique en ETD produit des ions c et z qui permettent de localiser le site de

glycosylation et d’étudier cette dernière. Ainsi l’écart de masse observé (Fig.8) entre le

peptide portant la modification post-traductionnelle et le peptide libre conduit à la

composition en oses du motif. La composition de ce motif est déterminée par comparaison

de l’incrément de masse obtenu avec une table de motifs de O-glycosylation, c’est-à-dire une

table regroupant les combinaisons possibles en oses (Windwarder et al. 2015). Cependant,

ces méthodes de fragmentation ne permettent pas de connaître l’enchaînement des oses les

uns avec les autres. Pour cela, il faut avoir recours à l’analyse des acétates d’alditol

partiellement méthylés qui reste à ce jour la seule méthode permettant d’accéder à ces

informations.

24

Figure 9 Différentes modifications de protéines par des lipides(A) Les protéines peuvent être glypiées, myristoylées, palmitoylées et isoprénylées de façon co- ou post-traductionnelle afin de pouvoir s’ancrer à la membrane et intervenir dans la signalisation cellulaire (B) Protéine à ancre GPI (glycosylphosphatidylinositol), ayant subi une glypiation. Les sites d’hydrolyse et de clivage sont respectivement effectués par la phosphatidylinositol phospholipase C (PI-PLC) et le fluoride d’hydrogène (HF). (C) Protéine myristoylée sur un résidu glycine en N-terminale par une myristoyltransférase. (D) Protéine palmitoylée sur une cystéine par une palmitoylacétyl transférase.

25

2. Modifications lipidiques.

Les protéines subissent de nombreuses modifications co et post traductionnelles qui

peuvent impliquer des acides gras (Fig. 9A). Ces lipoprotéines se décomposent en trois

familles : les protéines à ancre GPI (glypiation) (Fig. 9B), les protéines myristoylées(Fig. 9C) ou

palmitoylées(Fig. 9D) et les protéines prénylées qui peuvent être farnésylées ou géranyl-

géranylées (prénylation : farnésylation et géranylgéranylation).

Glypiation

Les protéines à ancre GPI (glycosylphosphatidylinositol) (GPI-AP) sont retrouvées au

niveau des rafts lipidiques des membranes cellulaires. Après traduction des précurseurs des

GPI-APs, ces derniers sont clivés au niveau d’une séquence de clivage qui permet de libérer la

partie C-terminale protéique qui possède un caractère hydrophobe. Une ancre GPI est alors

ajoutée à la partie C-terminale par le complexe transamidase. Le groupement lié à la protéine

est composé d’une éthanolamine suivie d’un phosphate, de trois mannoses, d’une

glucosamine et d’un phosphatidylinositol, lui-même lié au lipide ancré à la membrane (Fig.

9B). La partie C-terminale hydrophobe contient entre 20 et 30 résidus d’acides aminés et est

appelée le site ω. Afin d’identifier de nouvelles protéines à ancre GPI, la séquence en acides

aminés de ce site peut être déterminée par spectrométrie de masse. Des étapes d’extraction

aux détergents (Triton X-100 et X-114) sont nécessaires pour récupérer les GPI-APs. Suite à

cela, les GPI-APs sont hydrolysés par l’enzyme PI-PLC (phosphatidylinositol phospholipase C)

et une digestion par différentes endoprotéinases est effectuée (trypsine, Glu-C, Lys-C, Asp-N,

chymotrypsine). Les peptides sont enfin traités à l’acide fluoridrique HF qui clive le

groupement GPI de la protéine. La séparation des peptides s’effectue par nano-LC (colonne

C18 et gradient d’acétonitrile) puis l’analyse de leur composition par spectrométrie de

masse(Masuishiet al. 2013).

Myristyolation et palmitoylation

La myristoylation est une modification protéique co-traductionnelle qui consiste à

ajouter un acide myristique (C14 :0) sous la forme de myristoyl-CoA à une glycine N-terminale

via une liaison amide (Fig. 9C). La réaction est catalysée par une myristoyltransférase. La

palmitoylation est une modification protéique post-traductionnelle qui résulte de

l’attachement d’un groupe palmitoyl (C16 :0) sur l’atome de soufre de 1 à 4 résidus cystéine

via une liaison thioester (Fig. 9D). Cette réaction est catalysée par des palmitoylacétyl

transférases. On parle de S-palmitoylation lorsque des cystéines internes sont liées à un acide

palmitique via une liaison thioester. On parle de N-palmitoylation lorsque la cystéine N-

terminale est liée à un acide palmitique via une liaison amide.

Pour l’analyse de protéines acylés en général, l’utilisation d’un agent réducteur neutre tel que

le TCEP (tris (2-carboxyethyl)phosphine) est préféré à l’utilisation du dithiothréitol DTT pour

éviter les pertes d’acylations (Ji et al. 2013).

26

27

Pour l’analyse en MALDI-TOF de peptides myristoylés ou faiblement palmitoylés, il est

souhaitable d’utiliser une matrice HCCA (acide α-cyano-4-hydroxy cinnamic) en présence de

OG (détergent non ionique n-octylglucoside) pour augmenter l’intensité des pics sur le spectre

(Jagannadham et Nagaraj 2005). Par contre pour des peptides multipalmitoylés, employer une

matrice DHB (acide 2,5-dihydroxy benzoique) en présence de OG est préférable afin de

permettre une déacylation et donc une fragmentation plus facile(Jagannadham et Nagaraj

2005). De plus, la dérivatisation des cystéines libres avec une étiquette perfluoalkyle permet

l’analyse en simultané de peptides palmitoylés ou non-plamitoylés et ainsi permet de

quantifier les palmitoylations en LC-MS. Et l’ETD semble être la méthode de fragmentation la

plus adaptée pour des analyses de peptides palmitoylés en MS en tandem car cette méthode

produit de nombreuses fragmentations avec un minimum de perte de la palmitoylation(Ji et

al. 2013).

Prénylation

La fixation d’une protéine sur la face interne d’une membrane plasmique cellulaire

joue un rôle important par la suite dans la régulation de la voie de transduction du signal

cellulaire. Ce processus nécessite une modification post-traductionnelle, la prénylation, qui

ajoute un lipide isoprénoïdefarnésyl (15 carbones) ou géranylgéranyl (20 carbones), via une

liaison thio-éther, sur une cystéine dans la partie C-terminale. Les groupements farnésyl et

géranylgéranyl sont des poly-isoprènes insaturés qui augmentent l’hydrophobicité des

protéines et par conséquent leur affinité pour les membranes cellulaires. Les séquences

consensus de prénylation en C-terminale sont « CAAX », où C est une cystéine, A un acide

aminé aliphatique et X un acide aminé (souvent sérine, thréonine, glutamine, alanine ou

méthionine), « CXC » et enfin « CC ». L’attachement du lipide isoprénoïde a toujours lieu sur

une des cystéines en C-terminal. Chez l’Homme, la réaction de prénylation fait intervenir trois

protéines prényltransférases : la farnésyl-transférase (FT) et les géranylgéranyl-transférase 1

et 2 (GGT1 et GGT2).

Dans le passé, les différentes méthodes utilisées pour étudier les peptides prénylés étaient

l’utilisation d’un précurseur radioactif, l’acide mévalonique marqué ([3H]-mévalonique), de

sondes chimiques, de biotines ou fluorophores conjugués aux prénylations. Cependant ces

méthodes se révélaient longues, fastidieuses et présentaient un faible rendement. Le MALDI-

TOF-MS ou encore la LC-MS sont utilisées pour identifier des protéines prénylées mais du fait

de leur hydrophobicité et de leur faible abondance, leur analyse dans des échantillons

complexes reste difficile. De plus, une étude récente(Wotskeet al. 2012) s’est penchée sur

l’identification et la séparation des peptides farnesylés par ESI-MS/MS en s’aidant d’une étape

préalable de « Multidimensional Protein Identification Technology » (MudPIT). Cependant,

aucune de ces méthodes ne permet l’étude à grande échelle de peptides prénylés ni la

différentiation entre les peptides farnésylés et géranygéranylés en une seule étape.

28

Figure 10. Schéma de la stratégie mise en place par les auteurs pour l’identification des peptides prénylés. (A) Oxydation des groupements thio-éther au peroxyde d’hydrogène H2O2 et analyse après fragmentation des peptides prénylés par MS3. (B)Epoxydation des groupements thio-éther et des groupements farnésyl ou géranylgéranyl à l’acide m-chloroperoxybenzoïque (m-CPBA) et analyse après fragmentation des peptides prénylés par MS3.

Figure 11. Analyse en MALDI-QTrap-TOF des peptides farnésylés et géranylgéranylés chimiquement. (A) RGDC farnésylé. L’ion 654,19 est refragmenté pour donner les fragments [M+H]+- NH3 à 637, [M+H]+- farnésylation de m/z 450, le fragment b3 à 330,14 et b2 –NH3 à 198,09. L’ion de m/z 679,18 correspond à un adduit de Na+ (22 Da) (B) RGDC géranylgéranylé. L’ion 721.86 est refragmenté en b3 et b2-NH3 qui sont retrouvés chez le RGDC farnésylé. L’ion de m/z 743,51 correspond à un adduit de Na+ (22 Da) (C)REKKFFC(far)AIM. L’ion 1476,22 est refragmenté pour donner les ions y10-NH3 de m/z 1459, b9 de m/z 1328, y8 de m/z 1189, b5-H2O de m/z 690, b4 de m/z 543, b3 de m/z 415 (D) REKKFFC(ger)AIM. L’ion 1544,41 est refragmenté pour donner les ions y10-NH3 de m/z 1527, b9 de m/z 1396, y8 de m/z 1257, y7 de m/z de 1129, et de b5-H2O de m/z 690, b4 de m/z 543, b3 de m/z 415 (E) m/z théoriques et expérimentales des peptides prénylés.

Figure 12. Analyse en MALDI-QTrap-TOF-MS/MS du peptide REKKFFC(far)AIM époxydé.(A) Spectre MS/MS du peptide REKKFFCAIM farnésylé (m/z 1476.22) époxydé. Les produits d’époxydation ont un delta de masse de 15.99 Da correspondant aux atomes d’oxygène. (B) Spectre MS3 qui met en évidence des différences de masse en fonction du nombre d’oxygène impliqué dans l’époxydation. Le fragment de m/z 1257,45 est présent quel que soit l’époxydation, il correspond au peptide REKKFFCAIM non farnésylé et ayant perdu l’atome de soufre de la cystéine. (Ba)) Les ions 1524,24, 1540,27, 1556,23 du spectre A sont respectivement refragmentés (Ba)), (Bb)), (Bc)).

29

Pour remédier à cela, une étude de 2015 (Bhawal et al. 2015)développe une approche de

spectrométrie de masse clivable. Les résultats sont analysés en LC-MS/MS, MALDI-QTrap-TOF

ou nano ESI-Trap-TOF-MS.

La stratégie des auteurs (Fig. 10) consiste à mettre au point leur analyse à partir de peptides

trypsiques prénylés chimiquement sur des cystéines en C-terminal (peptides utilisés :

RGDC(far/ger), REKKFFC(far/ger)AIM, REKKFFC(far/ger)AIL, KHSSGC(far/ger)AFL et

DAEFRHDSGYEVC(far/ger)). Dans un premier temps, les auteurs utilisent le peroxyde

d’hydrogène (H2O2) pour oxyder les atomes de soufre impliqués dans la liaison thio-éther des

farnésylations et géranygéranylations, dans le but d’instaurer un site de clivage sélectif qui

permettra la coupure de la prénylation lors de la fragmentation. En plus des cystéines, les

méthionines peuvent également être oxydées sur leur atome de soufre. Leur fragmentation

engendrera la perte de –SOHCH3 (64 Da) alors que pour la cystéine, elle sera de -SOH (sans

prénylation) (49Da) ou R-SOH avec prénylation (R+49 Da).

Les auteurs ont analysés dans un premier temps les peptides oxydés RGDC(far ou ger)

et REKKFFC(far ou ger)AIM en MALDI-QTrap-TOF-MS (Fig.11). Par rapport à la masse

monoisotopique du peptide RGDC, un incrément de masse de 204 Da correspondant à la

farnésylation est observé (Fig. 11E). Concernant la géranylgéranylation, l’incrément de masse

est de 272 Da. Le spectre permet de montrer que les peptides synthétisés ont bien été

prénylés.

L’étude de ces peptides par spectrométrie de masse étant longue et fastidieuse du fait

de la forte hydrophobicité des peptides prénylés, les peptides sont oxydés au mCPBA (acide

m-chloroperoxybenzoïque), les doubles liaisons étant époxydés et les soufres étant oxydés.

L’époxydation permet de diminuer leur hydrophobicité et ainsi diminuer les temps d’élution

de ces peptides prénylés. Cela permet également d’instaurer le site de clivage (S=O)

permettant de séparer la partie protéique de la partie lipidique lors de la fragmentation en

MS. La masse perdue lors de la fragmentation correspondant au « -RSOH » (R=

prénylationépoxydé/non époxydé) permet d’identifier le type de prénylation.

Les peptides prénylés sont époxydés et analysés en MALDI-QTrap-TOF-MS/MS. Après

fragmentation, les peptides générés ont un incrément de masse de 16 Da en fonction du

nombre d’atome d’oxygène présents sur les groupements isoprénoïdes. Le peptide

REKKFFC(far)AIM de masse m/z expérimentale 1476.22 (Fig. 11C) a une masse m/z de 1524.24

après une triple époxydation(Fig. 12A). En effet, ce peptide a trois atomes d’oxygène :

[M+H++far+3O]+ = 1476.22 + 3*16 = 1524.22 m/z. Tous les produits époxydes génèrent le

même fragment de 1254.45 m/z qui correspond au peptide REKKFFCAIM non farnésylé et

ayant perdu l’atome de soufre de la cystéine (Fig. 12B).

30

Figure 13. Vérification de la méthode d’époxydation dans un mélange peptidique complexe en MALDI-QTRAP-TOF.(A) Spectre de masse du mélange peptidique BSA + peptides prénylés, avant époxydation(B) Spectre de masse du mélange peptidique BSA + peptides prénylés, après époxydation(C) Spectres MS/MS des peptides RGDC(époxy-far) où le fragment de m/z 416,38 correspond au peptide RGDC sans l’atome de soufre a) Fragmentation de l’ion 702,19 [M+H+Far+3O]+ b) et de l’ion 718,46 [M+H+Far+4O]+ du spectre B. (D) Spectres MS/MS des peptides REKKFFC(époxy-far)AIL où le fragment de m/z 1220 correspond au peptide REKKFFCAIL sans l’atome de soufre. a) Fragmentation de l’ion 1490,96 [M+H+Far+2O]+ b) de l’ion 1506,96 [M+H+Far+3O]+ c) et de l’ion 1522,95 [M+H+Far+4O]+ du spectre B. (E) Spectres MS/MS des peptides REKKFFC(époxy-far)AIM où le fragment de m/z 1270 correspond au peptide REKKFFCAIM sans l’atome de soufre a) Fragmentation de l’ion 1556,89 [M+H+Far+5O]+ b) et de l’ion 1572,92 [M+H+Far+6O]+ du spectre B.

Figure 14. Spectre de MS/MS d'un peptide phosphorylé ((M+H+)+ m/z=722.3) issu de la digestion trypsique du VEGFR. Le spectre est réalisé en ESI-CID avec un LTQ-Orbitrap-XL de résolution 60000.

31

Pour vérifier que la méthode d’identification des peptides prénylés est applicable à un

échantillon complexe, les auteurs ont réalisé un mélange des peptides précédemment étudiés

avec de la BSA (ratio 1 :100), digérée au préalable à la trypsine. Le mélange est époxydé et

analysé en MALDI-QTRAP-TOF MS/MS (Fig.13). Les spectres A et B montrent respectivement

la fragmentation du mélange avant et après époxydation. Suite à cela, les fragments sont de

nouveau fragmentés (spectre C,D,E). Les résultats montrent qu’il est possible dans un mélange

complexe d’identifier des peptides qui ont été farnésylés puisqu’une perte de la farnésylation

époxydée est observée ainsi qu’un fragment correspondant au peptide sans le soufre des

cystéines et sans la farnésylation.

Les auteurs voulaient identifier les peptides farnésylés ou géranylgéranylés dans un mélange

complexe cependant ils n’ont testé que des peptides farnésylés alors qu’ils auraient dû réaliser

un mélange de peptides farnésylés et géranylgéranylés pour pouvoir les différencier et ainsi

valider leur méthode. Les auteurs auraient pu effectuer également une simple oxydation et

en LC-MS utiliser une colonne C4 pour diminuer les temps d’élution plutôt que d’effectuer

une époxydation.

3. Modifications peptidiques

D’autres modifications post-traductionnelles existent et ont une importance

biologique particulièrement grande.

Phosphorylation

Les récepteurs membranaires (VEGFR et FPR1) ont des domaines conservés. On

retrouve notamment dans ces domaines des sites de phosphorylations sur les tyrosines (Y),

les sérines (S) et les thréonines (T) (Maaty et al. 2013). La phosphorylation S/T est souvent

issue de la fixation de ligand sur ces récepteurs, qui entrainent une voie de signalisation

spécifique. Dans le VEGFR, la phosphorylation des Y se fait en amont de celle des résidus S/T

puisque ce sont ces tyrosines qui transmettent le groupement phosphate (Rahimi et Costello

2015). Pour les récepteurs, ce genre de MPT est régulé dans le temps et dans l’espace.

La fixation du groupement phosphate se fait par l’action d’une kinase spécifique de l’acide

aminé en question et en présence d’ATP. Le groupement hydroxyl OH des acides aminés va

être remplacé par un groupement phosphate PO4H2. Un peptide qui sera phosphorylé aura

un incrément de masse Δ=79.9663Da (Fig. 14). Cet incrément de masse permet de discriminer

les phosphorylations des sulfatations si la résolution est suffisamment haute.

Les protéines cibles sont séparées par une colonne d’affinité (immunoprécipitation). L’éluat

est séparé en gel SDS-PAGE et la bande d’intérêt est prélevée pour être digérée à la trypsine

avant l’analyse en LC-MS/MS (Maaty et al. 2013; Rahimi et Costello 2015)

32

Figure 15. Stratégie de détection des méthylations dans une souche de levure auxotrophe pour SAM. Les levures auxotrophiques sont incubées avec SAM ou [CD3]SAM pendant 24h, puis les cellules sont récupérée et lysées. Les lysats cellulaires sont mélangés et les protéines sont extraites, digérées à la trypsine et analysées par µHPLC-MS/MS.

Figure 16. Spectre de MS/MS d'un peptide acétylé (en vert) (ion parent (M+2H+-64)2+ m/z=347.8) issu de la digestion trypsique du p53. Le spectre est réalisé en ESI-CID avec un LTQ-Orbitrap-Velos de résolution 100000 après séparation en UPLC en phase inverse. La méthionine oxydée est marquée en marron.

33

Méthylation

La méthylation est une modification post-traductionnelle qui consiste à l’ajout d’un ou

plusieurs (jusqu’à trois) groupement méthyle sur les extrémités N- et C-terminale des

protéines ou sur les chaînes latérales des acides aminés portant des fonctions amine (K, R, H),

amide (N, Q), acide (D, E) ou thiol (C). L’ajout du groupement méthyle se fait par des méthyl-

transférases sur l’azote des protéines durant l’incorporation des acides aminés dans la chaîne

polypeptidique. Cette MPT a un rôle dans les processus d’interaction protéine-protéine, la

localisation cellulaire, la transduction du signal, la régulation et la transcription des gènes via

la modification des histones (Wang et al. 2015).

La S-adenosyl-L-méthionine (SAM) est un groupement donneur de méthyl activé qui provient

de l’activation de la méthionine par l’ATP. SAM va permettre la méthylation de la protéine

cible via l’activité catalytique de la méthyl-transférase dépendante des SAM. Le rajout d’un,

deux et trois groupements méthyls sur une protéine entraîne un incrément de masse ∆

respectivement de 14.0157, 28.0314 et 42.0471Da (Wang et al. 2015).

Une nouvelle stratégie pour confirmer les sites de méthylation des protéines consiste à faire

des cellules ne produisant pas SAM de façon endogène pour rajouter SAM couplée à un CH3

ou un CD3 avant l’analyse en MS. Avec [CD3]SAM, on observe un incrément de masse de 3n

(n=1,2 ou 3 méthylations) comparé au spectres obtenus avec [CH3]SAM (Fig. 15) (Wang et al.

2015).

Acétylation

L’acétylation peut se faire sur l’extrémité N-terminale des protéines par des N-terminal

acétyl-transférases (NAT) mais peut également se faire sur les lysines (K). Les acétylations sont

des facteurs de régulation de l’activité des protéines ciblées. Pour p53, l’acétylation des lysines

présentes dans le domaine C-terminal est connue pour moduler l’apoptose et l’arrêt du cycle

cellulaire induits par p53 (DeHart et al. 2014).

La fixation de l’acétyle sur l’azote se fait par l’action d’acétyl-transférases spécifiques à la

protéine ciblée et en présence d’acétyl-coA. Le groupement amine NH2 va être remplacé par

un groupement amide NH-CO-CH3. L’acide aminé qui sera acétylé aura un incrément de masse

de Δ=42,010565Da (Fig. 16). Cet incrément de masse permet de discriminer les triples

méthylations des acétylations si la résolution est là aussi suffisamment haute.

La stratégie d’enrichissement des protéines acétylées se fait souvent par l’immuno-

précipitation de la protéine ciblée ou par immuno-précipitation de toutes les protéines

portant des lysines acétylées. Cette étape peut être suivie d’une migration sur gel SDS-PAGE

dans le but de récupérer un moins grand nombre de protéines, avant d’être analysées par

UPLC-MS/MS (LTQ orbitrap) (DeHart et al. 2014).

34

Figure 17 Identification de la SUMOylationde EGFR sur la lysine 37 en Mascot. Les spectres des peptides issus de la digestion trypsiquede EGFR natif ou sumoylé ont été analysés en LC-MS/MS. Les peptides natifs (M+2H+)+ 952.99m/z ont gardé leur site de clivage à la trypsique sur la lysine37 et sont donc plus petits que les peptides sumoylés. Le peptide sumoylé a un incrément de masse de 137.1 par rapport à la masse théorique du peptide 30-53.

Figure 18 Spectre de MS/MS d'un peptide ubiquitinylé (en violet) (ion parent (M+H+)+ m/z=932.5) issu de la digestion trypsique du p53. Le spectre est réalisé en ESI-CID avec un LTQ-Orbitrap-Velos de résolution 100000 après séparation en UPLC en phase inverse.

35

Sumoylation

La sumoylation est une MPT semblable à l’ubiquitination et consiste en la fixation de

la protéine SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier) sur les lysines des protéines cibles. Cette

MPT permet la stabilité des protéines, la localisation subcellulaire, les interactions protéine-

protéine, la réparation ADN et la transcription de gène (Packham et al. 2015).

Après digestion trypsique, il reste un ou deux résidus de la protéine SUMO sur la lysine

modifiée. Le peptide modifié présente donc un incrément de masse ∆ de 57,05 ou 114,04Da

et ne sera plus sensible à la trypsine (Fig. 19).

L’analyse de cette MPT se fait par la purification en chromatographie d’affinité avec un

anticorps anti-SUMO suivi de la digestion à la trypsine de la protéine. Les peptides sumoylés

sont analysés en LC-MS/MS en HCD (similaire au CID) ou en ETD et identifiés avec une matrice

Mascott(Packham et al. 2015).

Ubiquitinylation

L’ubiquitination est une MPT hautement sélective et régulée chez les eucaryotes, les

archées et certaines bactéries. Cette MPT se déroule aussi bien dans le noyau que dans le

cytoplasme et nécessite de l’énergie fournie par hydrolyse de l’ATP. L’ubiquitination est la

liaison de l’ubiquitine en C-term (≈ 8800 Da) sur la protéine cible et induit la dégradation de

la protéine par le protéasome. La fixation peut se faire sur le N-term de la protéine ou la chaine

latérale d’acides aminés portant une fonction amine (K), alcool (S, T) ou thiol (C).

L’ubiquitination joue un rôle important dans l’homéostasie cellulaire (transduction du signal,

trafic et localisation intracellulaire, division, apoptose…) et les processus nucléaires

(remodelage de la chromatine, réparation de l’ADN…) (Parker et al. 2005).

Le signal de l’ubiquitination dépend du contexte du signal, des enzymes impliquées et des

protéines cibles qui peuvent être mono ou poly-ubiquitinylées. L’ubiquitination fait intervenir

trois grandes classes d’enzymes : E1 qui active l’ubiquitine, E2 qui amène l’ubiquitine à la

protéine cible et E3-ligase qui lie l’ubiquitine à la protéine cible.

L’analyse de cette MPT se fait par digestion trypsique qui clive la chaîne d’ubiquitine en

laissant une étiquette de deux résidus glycine (clivage complet) ou en laissant une étiquette

LRGG (clivage incomplet) sur le peptide ubiquitinylé. Le clivage complet de la chaine

d’ubiquitine entraîne un incrément de masse de 114.04Da (Fig. 20)(DeHart et al. 2014). Il

est nécessaire d’avoir beaucoup de matériel de départ pour faciliter l’analyse à cause de la

nature transitoire des protéines ubiquitinylées.

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Figure 19 Les S-nitrosylations sont modifiées avec un groupement biotine pour les rendre plus stable pour l’analyse en MS/MS.(A) Stratégie du traitement chimique des S-nitrosylations pour couplé les cystéines modifiées à la biotine. Le delta de masse permettant la détection de ces cystéines S-biotinylées est de 428 unités de masse (uma). (B) Spectre MS/MS d’un peptide S-nitrosylé issu de la digestion trypsique de AHP1. Le spectre est réalisé en LC-MS/MS. Les paramètres de recherche de modification sont réglés sur 428 uma.

Figure 20 Spectre de MS/MS d'un peptide citrulliné ((M+H+)+ m/z=1747.9) issu de la digestion trypsique du GFAP. Le spectre est réalisé en AXIMA MALDI-QIT-TOF.

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S-nitrosylation

La S-nitrosylation est la fixation d’un oxyde nitrique (NO) sur la fonction thiol d’une

cystéine réduite, c'est-à-dire qui n’est pas impliquée dans un pont disulfure. Le NO est une

molécule de signal du stress cellulaire et la médiation de ce signal se fait par l’oxydation des

protéines. Cette MPT permet la régulation de protéines et ne peut se faire uniquement quand

les concentrations de NO sont importantes dans la cellule. Cette modification a été montrée

comme étant impliquée dans la régulation de la croissance des plantes mais également dans

la régulation du stress oxydatif au sein des muscles squelettiques.

La fixation du NO sur la cystéine peut se faire in vitro par l’action de S-glutathione NO

transférase. L’oxydation des cystéines peut être réversible. La cystéine qui portera cette

modification aura un incrément de masse de Δ=28,990154Da mais l’analyse de ce genre de

MPT se fait généralement par une dérivatisation à la biotine.

Les protéines d’un extrait total ou partiel sont traitées par le MMTS qui permet de rendre

inactif les groupements thiols libres par S-méthylation. Les protéines sont ensuite

débarrassées du MMTS présent, par un passage sur colonne ou par précipitation à l’acétone,

et sont traitées à l’ascorbate qui permet la réduction des cystéines S-nitrosylées. Enfin les

groupements thiols libres sont oxydés par la biotine-HPDP. L’incrément de masse dû à la

biotine est plus élevé (Δ=428,191585) et donc plus facilement analysable (Fig. 17) (Feng et al.

2013).

Citrullination

La citrullination est la déimination d’une arginine par les peptidylarginine deiminases

(PAD). Ce genre de MPT induit la perte de charges positives et influe sur la structure et la

fonction des protéines cibles. Il a récemment été montré que les PADs et les protéines

citrullinées sont impliquées dans l’inflammation et les maladies neurodégénératives(Ishigami

et al. 2015). Certaines PADs sont aussi capables de citrulliner les histones changeant la stabilité

de la chromatine (décondensation) et donc la transcription.

La réaction catalysée par les PADs nécessite la présence d’O2 et de NADPH et Ca2+ en

cofacteur. La réduction de l’imine en urée se traduit par un incrément de masse ∆ de +1Da sur

le peptide modifié. De plus le remplacement de l’arginine par une citrulline induit la perte d’un

potentiel site de clivage à la trypsine (Ishigami et al. 2015).

Les protéines recombinantes citrullinées sont clivées à la trypsine et les peptides sont purifiés

par chromatographie d’affinité avec un anticorps anti-citrulline. Après élution, ces peptides

sont purifiés sur colonne en phase inverse (C18) pour éliminer les sels du tampon d’élution et

éluées avec un mélange d’acide 2,5-dihydroxybenzoic (10mg/ml)/0.1% d’acide

trifluoroacetique/40% acétonitrile. Les peptides sont analysés en MALDI-QIT-TOF et identifiés

par Mascot (Fig. 18).

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39

IV. Conclusion.

Les différentes publications présentées ont permis de mettre en évidence différentes

méthodes d’analyse des modifications post-traductionnelles. Le CID permet de déterminer la

séquence peptidique, glucidique et lipidique. Cependant, les modifications glucidiques sont

plus facilement déterminées quand la fragmentation est faite à haute énergie (HCD). L’ETD

quant à lui, permet de déterminer certains sites d’attachement des modifications post-

traductionnelles aux protéines en les laissant intactes et en fragmentant la séquence

peptidique.

Les méthodes d’enrichissement sont primordiales pour l’analyse en spectrométrie de masse.

En effet, les protéines modifiées sont présentes en plus faible concentration par rapport aux

protéines totales. Généralement, une chromatographie (en phase inverse, directe et

d’affinité) permet de réaliser cet enrichissement.

On peut résumer les différentes modifications post-traductionnelles dans le tableau suivant.

Modification Incrément de masse Glycosylations Masse de résidu osidique

→ HexNAc → Hex → Pentose → Fucose → NeuNAc

203,089935 162,063385 132,052826 146,156480

291,2699

Modifications lipidiques Masse du résidu lipidique → Farnesylation → Géranylation

205 273

Modifications peptidiques Phosphorylation 79,966333

Méthylation 14,0157

→ Mono- → Di- → Tri-

14,0157

28,0314

42,0471

Acétylation 42,010565

S-nitrosylation 28,990154

→ Biotinylée 428

Citullination 0,984016

Sumoylation 57,05 ou 114,1

Ubiquitination 114,1

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