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Analyse d’échantillons alimentaires pour la présence d’organismes génétiquement modifiés

Module 6

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR)

M. Somma, M. Querci

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 2

Analyse d’échantillons alimentaires pour la présence d’organismes génétiquement modifiés Module 6

Table des matières

Module 6

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR)

INTRODUCTION 3

CONSTITUANTS, STRUCTURE ET REPLICATION DE L’ADN 3 PRINCIPES DE LA PCR 8 INSTRUMENTATION ET COMPOSANTS POUR LA PCR 12 CONCEPTION DES AMORCES POUR LA PCR 17 PCR SPECIALISEE 22 LA PCR DANS LA PRATIQUE 23

REFERENCES 30 BIBLIOGRAPHIE COMPLEMENTAIRE 32



Introduction

La mise au point de la technique de réaction de polymérisation en chaîne (PCR) par

K. Mullis et ses collaborateurs en 1985 a révolutionné la biologie moléculaire et la

médecine moléculaire (Saiki et al., 1985). La réaction de polymérisation en chaîne

est une technique in vitro utilisée pour amplifier à l’aide d’enzymes une région

déterminée de l’ADN qui se trouve entre deux régions de séquence ADN connue.

Alors qu’autrefois seules de très petites quantités d’un gène spécifique pouvaient

être obtenues, la PCR permet maintenant d’amplifier même une seule copie de gène

à un million d’exemplaires en quelques heures.

Les techniques PCR sont devenues essentielles pour beaucoup de procédures

communes, telles que le clonage de fragments d’ADN spécifiques, la détection et

l’identification de gènes à des fins de diagnostic et en médecine légale ainsi que

dans la recherche sur les modes d’expression génique. Plus récemment, la PCR a

permis l’exploration de nouveaux domaines, tels que le contrôle de l’authenticité de

denrées alimentaires, la présence d’ADN génétiquement modifié et la contamination

microbiologique. Pour comprendre les principes de la PCR et de ses applications, il

faut examiner d’abord la nature de la molécule d’ADN. C’est pourquoi la structure et

la réplication de l’ADN sont décrites dans la section suivante.

Constituants, structure et réplication de l’ADN

Constituants. Une molécule d’ADN est constituée de deux brins complémentaires

enroulés sous forme d’hélice et composés alternativement d’acide phosphorique et

de désoxyribose, reliés transversalement par des bases (purines et pyrimidines),

prenant la forme d’une structure hélicoïdale droite qui porte des informations

génétiques encodées dans la séquence des bases. Dans les cellules eucaryotes, la

majeure partie de l’ADN est contenue dans le noyau et est appelée ADN

chromosomique. Il est séparé du reste de la cellule (cytoplasme) par une double

membrane (l’enveloppe nucléaire). D’autre part, les mitochondries et les

chloroplastes contiennent de l’ADN extrachromosomique.

Les éléments constitutifs de l’ADN, appelés nucléotides, sont les suivants:

• dATP, désoxyadénosine triphosphate;

• dGTP, désoxyguanosine triphosphate;

• dTTP, désoxythymidine triphosphate;

• dCTP, désoxycytidine triphosphate.



Par commodité, ces quatre nucléotides sont appelés dNTP (désoxynucléoside

triphosphates). Un nucléotide comporte essentiellement les trois parties suivantes:

une base purine (adénine, A, et/ou guanine, G) ou une base de pyrimidine (cytosine,

C, et/ou thymine, T), une molécule de sucre pentose (désoxyribose) et un groupe

triphosphate. Comme le montre la Figure 1, une base purine ou pyrimidine est liée à

un cycle pentose par une liaison N-glucosidique et un groupe phosphate est lié à

l’atome de carbone 5 du sucre par une liaison diester. Dans l’acide ribonucléique,

ARN, la thymine est remplacée par l’uracile (U) et la molécule de désoxyribose est

remplacée par le ribose.

Figure 1. Les composants des nucléotides (image: Andy Vierstraete, 1999)

Structure. La Figure 2 montre comment les nucléotides forment une chaîne d’ADN.

L’ADN se forme par le couplage des nucléotides entre le groupe phosphate d’un

nucléotide (qui est situé sur le cinquième atome C de la molécule de sucre) avec

l’hydroxyle sur le troisième atome C de la molécule de sucre du nucléotide

précédent. À cet effet, un groupe diphosphate se détache (avec libération d’énergie).

Cela signifie que de nouveaux nucléotides sont toujours ajoutés du côté 3' de la

chaîne. La Figure 3 montre que l’ADN est bicaténaire (sauf dans certains virus) et

que les deux brins s’apparient de manière très précise. Chaque base dans un brin



s’appariera avec un seul type de base dans le brin opposé pour former une paire de

bases (pb): A est toujours apparié à T par deux liaisons hydrogène; C est toujours

apparié à G par trois liaisons hydrogène. De cette façon, les deux chaînes sont

complémentaires entre elles et une chaîne peut servir de modèle pour la production

de l’autre.

Figure 2. Formation d’une chaîne d’ADN à partir des nucléotides (image: Andy Vierstraete, 1999)

Les bases forment un noyau hydrophobe à l’intérieur de la double hélice. Les sucres

et les groupes phosphate (sous leur forme anionique) constituent la couche

hydrophile externe de la molécule. Dans les conditions physiologiques, l’hélice

d’ADN bicaténaire est plus stable qu’une hélice d’ADN monocaténaire.

Réplication. L’ADN contient l’information génétique complète qui définit la structure

et la fonction d’un organisme. Trois processus différents sont responsables de la

transmission de l’information génétique:

• la réplication;

• la transcription;

• la traduction.



Figure 3. Structure de l’ADN dans une cellule (image: Andy Vierstraete, 1999)

Au cours de la réplication, un acide nucléique bicaténaire est dupliqué pour donner

des copies identiques. Ce processus perpétue l’information génétique. Lors de la

transcription, un segment d’ADN constituant un gène est lu et transcrit en une



séquence monocaténaire d’ARN. L’ARN se déplace du noyau vers le cytoplasme.

Enfin, pendant la traduction, la séquence d’ARN est traduite en séquence d’acides

aminés lors de la formation de la protéine (Alberts et al., 1983).

La réplication de l’ADN est le processus sur lequel la PCR est basée, et est décrite

en détail ci-après.

Pendant la réplication, la molécule d’ADN se déroule, chaque brin devenant un

modèle (matrice) pour la synthèse d’un nouveau brin complémentaire. Chaque

molécule fille, consistant en un ancien et un nouveau brin d’ADN, est une copie

exacte de la molécule parent.

Figure 4. La fourche de réplication

Plusieurs enzymes sont nécessaires pour dérouler la double hélice et pour

synthétiser un nouveau brin d’ADN. La topoisomérase et l’hélicase sont

responsables du déroulement de l’ADN par rupture de la structure superenroulée et

coupure d’un seul brin de l’ADN. Ensuite, la primase (une partie d’un agrégat de

protéines appelé primosome) fixe une petite amorce d’ARN sur l’ADN

monocaténaire, pour servir d’extrémité 3’OH à partir de laquelle l’ADN polymérase

commence la synthèse. Cette amorce d’ARN est finalement enlevée par la RNase H

et la brèche est comblée par l’ADN polymérase I. À ce stade, l’ADN

polymérase progresse le long d’une molécule monocaténaire d’ADN, incorporant des

dNTP libres pour les lier par liaison hydrogène à leur dNTP complémentaire

approprié sur le brin solitaire (A avec T et G avec C), formant une liaison

phosphodiester covalente avec le nucléotide précédent du même brin. L’énergie

stockée dans le triphosphate est utilisée pour lier de manière covalente chaque



nouveau nucléotide au deuxième brin en cours de formation. Il y a différentes formes

d’ADN polymérase, mais c’est l’ADN polymérase III qui est responsable de la

synthèse progressive de nouveaux brins d’ADN. L’ADN polymérase n’agit que de 5'

vers 3'. Comme un brin de la double hélice est de sens 5'-3' et l’autre de sens 3'-5',

l’ADN polymérase synthétise une deuxième copie du brin 5'-3' (brin retardé) par

petits fragments (fragments d’Okazaki) (Ogawa et Okazaki, 1980). La synthèse des

nouvelles copies du brin 5'-3' est montrée à la Figure 4. L’autre brin (brin avancé)

peut procéder à la synthèse directement, de 5' vers 3', à mesure que l’hélice se

déroule. L’ADN polymérase ne peut pas commencer à synthétiser ex novo sur un

brin unique nu, mais a besoin d’une amorce avec un groupe 3’OH libre sur lequel il

peut fixer un dNTP.

Une ligase catalyse la formation d’une liaison phosphodiester entre l’hydroxyle en 3’

et le phosphate en 5’. Le trou qui se forme lorsque l’amorce d’ARN est éliminée peut

ainsi être comblé. Il convient de noter que les protéines de liaison monocaténaires

sont importantes pour maintenir la stabilité de la fourche de réplication. Comme

l’ADN monocaténaire est très labile, c’est-à-dire instable, ces protéines s’y

fixent alors qu’il reste monocaténaire, le protégeant ainsi contre la dégradation.

Principes de la PCR

La PCR est basée sur le mécanisme de la réplication de l’ADN in vivo: l’ADN

bicaténaire est déroulé en ADN monocaténaire, puis dupliqué et «réenroulé». Cette

technique comprend les cycles répétitifs suivants:

• dénaturation de l’ADN par fusion à haute température pour convertir l’ADN

bicaténaire en ADN monocaténaire;

• hybridation à l’ADN cible de deux oligonucléotides utilisés comme amorces;

• extension de la chaîne d’ADN par addition de nucléotides à partir des

amorces en utilisant l’ADN polymérase comme catalyseur en présence d’ions

Mg2+.



Les oligonucléotides consistent généralement en séquences relativement courtes qui

sont différentes les unes des autres et complémentaires des sites de

reconnaissance flanquant le segment d’ADN cible à amplifier. Les étapes de

dénaturation de la matrice, d’hybridation des amorces et d’extension des amorces

constituent un «cycle» dans la méthode de réaction de polymérisation en chaîne. La

Figure 5 illustre les trois étapes principales du processus d’amplification PCR.

Figure 5. Les étapes de l’amplification PCR (image: Andy Vierstraete, 1999)

Après chaque cycle, les brins d’ADN nouvellement synthétisés peuvent servir de

matrices dans le cycle suivant. Comme le montre la Figure 6, le principal produit de

cette réaction exponentielle est un segment d’ADN bicaténaire dont les extrémités

sont définies par les extrémités 5' des amorces d’oligonucléotides et dont la longueur

est définie par la distance entre les amorces. Les produits d’un premier cycle

d’amplification réussi sont des molécules d’ADN de taille hétérogène dont la

longueur peut dépasser la distance entre les sites de fixation des deux amorces.

Dans le deuxième cycle, ces molécules produisent des brins d’ADN de longueur

définie qui s’accumuleront de façon exponentielle lors de cycles d’amplification

ultérieurs et formeront les produits dominants de la réaction. Ainsi, l’amplification, en

tant que nombre final de copies de la séquence cible, est exprimée par l’équation

suivante:

(2n-2n)x (1)



où n est le nombre de cycles, 2n est le premier produit obtenu après le premier cycle

et le deuxième produit obtenu après le deuxième cycle avec une longueur indéfinie,

et x est le nombre de copies de la matrice originelle. Potentiellement, après 20 cycles

de PCR, il y aura une amplification d’un facteur de 220, en supposant une efficacité

de 100 % pendant chaque cycle. L’efficacité d’une PCR variera d’une matrice à

l’autre et selon le degré d’optimisation atteint.

Une description détaillée des trois étapes de l’amplification PCR (dénaturation de la

matrice, hybridation des amorces et extension) est donnée dans les paragraphes ci-

après (Sambrook et al., 1989).

Figure 6. L’amplification exponentielle de l’ADN dans la PCR

Dénaturation de la matrice

Au cours de la dénaturation, le double brin s’ouvre pour donner de l’ADN

monocaténaire, et toutes les réactions enzymatiques s’arrêtent (c’est-à-dire

l’extension d’un cycle précédent). Les deux chaînes complémentaires sont séparées

par une augmentation de température. C’est ce qu’on appelle la dénaturation. Pour

obtenir la dénaturation de l’ADN, on augmente généralement la température à

environ 93 – 96 °C. De cette façon, les fortes liaisons H sont rompues et le nombre

de bases non appariées augmente. La réaction est complète lorsque tout l’ADN

bicaténaire est devenu de l’ADN monocaténaire. La température à laquelle la moitié

de l’ADN bicaténaire devient monocatenaire est appelée température de fusion, Tf.

Le type de solvant, la concentration de sel et le pH utilisés influencent le processus



de dénaturation. Par exemple, à faible concentration de sel, à pH élevé et en

présence de solvants organiques tels que le formaldéhyde, la température de fusion

Tf diminue. La concentration de G/C et T/A peut également influencer la valeur de la

Tf. La Tf de la structure de l’ADN contenant une quantité élevée de G/C est

supérieure à celle de l’ADN riche en T/A. Par exemple, Serratia marecescens a une

concentration de G/C approximativement d’environ 60 % et une Tf d’environ 94 °C,

tandis que Pneumococcus a approximativement 40 % de G/C et une Tf d’environ

85 °C.

Hybridation des amorces

L’hybridation, ou réhybridation, des brins d’ADN a lieu à une température plus basse

(généralement 55 – 65 °C). Une fois que la température est abaissée, les deux

chaînes complémentaires d’ADN monocaténaire se reformeront en une molécule

d’ADN bicaténaire. Au cours de cette phase, les amorces se déplacent librement et

des liaisons ioniques sont constamment formées et rompues entre l’amorce

monocaténaire et la matrice monocaténaire. Les liaisons plus stables durent un peu

plus longtemps (amorces qui correspondent exactement à l’ADN matrice) et sur ce

petit morceau d’ADN bicaténaire (matrice et amorce), la polymérase peut se fixer et

commencer à copier la matrice. Une fois que quelques bases sont incorporées, la

liaison ionique est si forte entre la matrice et l’amorce qu’elle ne se rompra pas.

Extension des amorces

Au cours de cette étape, les amorces sont étendues sur la séquence cible en

utilisant une ADN polymérase thermostable (souvent l’ADN polymérase Taq) en

présence de dNTP, ce qui aboutit à une duplication du matériel cible de départ. La

température de travail idéale pour l’ADN polymérase Taq est 72 °C. Lorsque les

amorces ont été étendues de quelques bases, elles possèdent une plus forte

attraction ionique pour la matrice, ce qui réduit la probabilité de survenue du

processus inverse. Les amorces qui ne correspondent pas exactement se détachent

de nouveau (en raison de la température plus élevée) et n’entraînent pas une

extension du fragment. Les bases (complémentaires de la matrice) sont couplées à

l’amorce du côté 3’ (la polymérase ajoute des dNTP de 5’ vers 3’ en lisant la matrice

de 3’ vers 5’). La durée des étapes d’extension des amorces peut être augmentée si

la région de l’ADN à amplifier est longue; cependant, pour la majorité des réactions

PCR, une durée d’extension de 1 minute est suffisante pour obtenir une extension

complète.



Instrumentation et composants pour la PCR

Instruments

Deux progrès majeurs ont permis d’automatiser le processus de la PCR:

a. L’utilisation d’ADN polymérases thermostables, qui résistent à l’inactivation aux

hautes températures. Ainsi, une partie aliquote initiale de polymérase peut durer

pendant un grand nombre de cycles du protocole.

b. Le développement des bains de température, qui peuvent augmenter et abaisser

rapidement leur température de manière automatisée et programmée. On les

appelle des thermocycleurs ou machines PCR.

Plusieurs types de dispositifs de variation de la température sont utilisés. Par

exemple: chauffage et refroidissement par des fluides, chauffage par résistance

électrique et refroidissement par un fluide, chauffage par résistance électrique et

refroidissement par semi-conducteurs. La Figure 7 montre un profil typique de cycles

de température pour un protocole en trois étapes.

Figure 7. Profil de cycles de température PCR

Les paramètres des cycles de température, comme la dénaturation, l’hybridation des

amorces et l’extension des amorces, déjà mentionnés, ainsi que les composants

utilisés et le nombre de cycles, décrits dans les paragraphes ci-dessous, sont

essentiels pour le succès de la PCR.



ADN cible

En principe, la PCR peut être effectuée si au moins une copie intacte du gène cible

est présente. Un plus grand nombre de copies cibles améliore la probabilité de

succès l’amplification de l’ADN. Tout dommage, tel qu’une entaille dans l’ADN cible,

bloquera la PCR. La taille de la séquence cible peut se situer entre moins de 0,1 et

quelques kilobases. La quantité totale d’ADN généralement utilisée pour la PCR est

de 0,05 à 1,0 µg, ce qui permet la détection de copies uniques de la séquence cible.

Même si un échantillon ne doit pas être hautement purifié, certains contaminants,

tels que l’héparine, des hèmes, le formol, des chélateurs Mg2+, ainsi que des

détergents, doivent être éliminés pour éviter l’inhibition du processus d’amplification.

Amorces

D’une façon générale, les amorces utilisées ont une longueur de 16–30 nucléotides,

ce qui autorise une température d’hybridation raisonnablement élevée. Les amorces

doivent être exemptes de suites de séquences de polybases (poly-dG, par exemple)

ou de motifs répétitifs, ceux-ci pouvant s’hybrider de manière inadéquate avec la

matrice. Il convient d’éviter les séquences répétées inversées afin d’empêcher la

formation de structures secondaires dans l’amorce, ce qui empêcherait l’hybridation

avec la matrice. Les séquences complémentaires d’autres amorces utilisées dans la

PCR devraient également être évitées afin d’empêcher l’hybridation entre amorces

ou la formation de dimères d’amorce (particulièrement important pour l’extrémité 3’

de l’amorce). Si possible, l’extrémité 3’ de l’amorce devrait être riche en bases de G

et C pour une meilleure hybridation de l’extrémité qui sera étendue. La distance entre

les amorces devrait être inférieure à 10 Kb. En général, on observe une réduction

substantielle du rendement lorsque les amorces sont distantes de plus de 3 Kb

environ. Des oligonucléotides sont généralement utilisés à la concentration de 1 µM

dans la PCR, ce qui est suffisant pour au moins 30 cycles d’amplification. Une

concentration plus élevée d’oligonucléotides peut entraîner l’amplification de

séquences non cibles indésirables. Inversement, la PCR est inefficace lorsque la

concentration d’amorce est trop faible.

ADN polymérase

La méthode PCR originelle utilisait le fragment Klenow de l’ADN polymérase d’E. coli

(Saiki et al., 1985). Toutefois, cette enzyme se dénature à des températures plus



basses que celle requise pour la dénaturation de la plupart des matrices

bicaténaires. Ainsi, dans les premières expériences, de l’enzyme fraîche devait être

ajoutée à la réaction après chaque cycle. En outre, les échantillons devaient être

déplacés d’un bain de température à un autre pour permettre les différentes étapes

de dénaturation, d’hybridation et de polymérisation. Il est évident que l’utilisation

d’ADN polymérase thermorésistante a facilité le processus, car l’ajout d’enzymes

après chaque étape de dénaturation n’est plus nécessaire. En général, les ADN

polymérases ne peuvent incorporer que des nucléotides de l’extrémité 3’ d’un

polynucléotide. La première ADN polymérase thermostable utilisée était l’ADN

polymérase Taq, isolée dans la bactérie Thermus aquaticus (Saiki et al., 1988). Bien

que cette enzyme soit probablement celle qui est la plus largement utilisée dans les

applications de la PCR, plusieurs autres ADN polymérases sont commercialisées. Le

Tableau 1 indique les propriétés de certains ADN polymérases thermostables

actuellement utilisées pour la PCR (Newton et Graham, 1994).

Tableau 1. Caractéristiques de certaines ADN polymérases utilisées pour la PCR

Taq/ AmpliTaq® Vent™ Deep-

Vent™ Pfu Tth UITma™

Source Thermus aquaticus

Thermo-coccus litoralis

Pyrococcus GB-D

Pyrococcus Furiosus

Thermus thermophilus

Thermotoga maritima

Application

Taq: AmpliTaq naturelle: pour génie génétique

Pour génie génétique

Pour génie génétique Naturelle Pour génie

génétique Pour génie génétique

T½ d’activité à 95 ºC (mn) 40 1380 400 >120 20 >50a

Activité exonucléase 5’ 3’

Oui

Non

Non

Non

Oui

Non

Activité exonucléase 3’ 5’

Non

Oui

Oui

Oui

Non

Oui

Processivité 50-60 ? 7 ? 30-40 ? Vitesse d’extension (nt/s)

75 ? >80 60 >33 ?

Extrémités d’ADN résultantes

3’A >95 % franches

>95 % franches ? 3'A franches

PM en kDa 94 ? ? 92 94 70



ADN polymérase Taq/AmpliTaq®. Comme indiqué plus haut, cette enzyme a été

isolée chez la bactérie Thermus aquaticus, qui vit dans une source thermale dans le

parc national Yellowstone aux États-Unis, à des températures proches de 85 °C. La

température de travail optimale de cette enzyme est de 70–80 °C. À cette

température, la bactérie synthétise l’ADN à une vitesse de 35–100

nucléotides/seconde. Le nombre moyen de nucléotides qu’une enzyme incorpore

dans l’ADN avant de se détacher de la matrice est appelé processivité. L’ADN

polymérase AmpliTaq® est une enzyme génétiquement modifiée exprimée par E.

coli. Comme AmpliTaq® est recombinante, la pureté et la reproductibilité de cette

enzyme sont plus élevées que celles du type sauvage. Toutefois, une contamination

potentielle peut se produire pendant l’amplification de l’ADN avec certaines

séquences homologues d’E. coli. Dans ce cas, il est recommandé d’utiliser une ADN

polymérase qui n’a pas été exprimée, avec E. coli comme organisme hôte. Les ADN

polymérases tant Taq qu’AmpliTaq® possèdent une activité exonucléase 5’ 3’, qui

élimine les nucléotides en avant de la chaîne en progression.

ADN polymérases Vent™, DeepVent™, Pfu et UITma™. Ces enzymes ont une

activité exonucléase 3’ 5’ qui permet l’élimination des résidus mésappariés jusqu’à

ce qu’il se forme un terminus à bases correctement appariées. Cependant, l’activité

exonucléase 3’ 5’ peut causer une dégradation des amorces. Par conséquent, il

convient de n’ajouter l’enzyme qu’après que la réaction a commencé ou d’utiliser des

amorces chimiquement modifiées.

ADN polymérase AmpliTaqGold™. Cette enzyme consiste en une ADN

polymérase AmpliTaq inactive à la température ambiante et ne peut être activée

qu’au cours d’une période d’incubation à 94 °C. Dans ce cas, le programme du

thermocycleur devrait comprendre une période de pré-incubation à une température

de 92–95 °C. Pour la PCR « à libération contrôlée », la pré-incubation peut être

éliminée, mais au moins 10 cycles de plus que dans la PCR classique doivent être

exécutés.

Tampons de réaction et MgCl2 dans les réactions PCR

Outre les réactifs qui interviennent directement dans la réaction, la PCR requiert un

tampon approprié. La composition du tampon dépend du type et des caractéristiques



de l’enzyme utilisée et la plupart des fournisseurs fournissent généralement un

tampon 10x pour utilisation avec l’enzyme respective. Le tampon de réaction le plus

couramment utilisé avec l’ADN polymérase Taq/AmpliTaq® contient:

• 10 mM de Tris, pH 8,3

• 50 mM de KCl

• 1,5-2,5 mM de MgCl2

La présence de cations bivalents dans la PCR est essentielle. La concentration de

MgCl2 dans le mélange de réaction final est généralement de 0,5 à 5,0 mM, et la

concentration optimale est déterminée empiriquement (Innis et Gelfand, 1990).

Les ions Mg2+:

• forment un complexe soluble avec les dNTP, ce qui est essentiel pour

l’incorporation des dNTP,

• stimulent l’activité polymérase,

• augmentent la Tf de l’interaction amorce/matrice (et stabilisent par conséquent

l’interaction entre les deux chaînes).

En général, une faible concentration de Mg2+ conduit à un faible rendement (ou à une

production nulle), alors qu’une concentration de Mg2+ élevée entraîne une

accumulation de produits non spécifiques («mésamorçage»). Il est important d’éviter

la présence, dans la solution d’ADN matrice, d’une concentration élevée de

chélateurs tels que l’EDTA ou de groupes ioniques à charge négative tels que le

phosphate. On trouve dans la littérature actuelle des discussions sur différents

tampons et suppléments PCR, tels que le DMSO, le PEG 6000, le formamide, le

glycérol, la spermidine et des détergents non ioniques, utilisés pour accroître la

spécificité ou l’efficacité de la réaction (Roux, 1995). Certaines ADN polymérases

atteindront en effet leur niveau d’activité optimal (Rolfs et al., 1992) seulement en

présence de ces suppléments.

Désoxyribonucléoside triphosphates

Des désoxyribonucléoside triphosphates libres (dNTP) sont nécessaires pour la

synthèse de l’ADN. Les concentrations de dNTP pour la PCR devraient être de 20 à

200 µM pour chaque dNTP et les quatre dNTP devraient être utilisés à des

concentrations équivalentes pour réduire au minimum les erreurs de

mésincorporation (Innis et al., 1988). Des dNTP de grande pureté sont fournis par

plusieurs fabricants sous forme soit de quatre stocks individuels, soit de mélange des



quatre dNTP. Les solutions de stock de dNTP (généralement 100 mM) devraient être

ajustés à un pH de 7,0–7,5 avec 1 M de NaOH pour que le pH de la réaction finale

ne tombe pas au-dessous de 7,1 (Sambrook et al., 1989); cependant, beaucoup de

solutions de stock de dNTP sont maintenant fournies avec un pH déjà ajusté.

Nombre de cycles et effet plateau

Le nombre de cycles d’amplification nécessaires pour produire une bande visible sur

un gel dépend en grande partie de la concentration initiale d’ADN cible. Pour

amplifier 50 molécules cibles, 40–45 cycles sont recommandés, tandis que 25–30

cycles sont suffisants pour amplifier 3x105 molécules de la même concentration

(Innis et Gelfand, 1990). Cette non-proportionnalité est due à l’effet plateau, qui est

l’atténuation du taux exponentiel d’accumulation de produit dans les dernières étapes

d’une PCR, lorsque le produit atteint 0,3–1,0 nM. Cela peut être dû à la dégradation

des réactifs (dNTP, enzyme), à l’épuisement de réactifs (amorces – problème avec

les produits courts, dNTP – problème avec les produits longs), à l’inhibition du

produit final (formation de pyrophosphate), à la compétition pour les réactifs par les

produits non spécifiques, compétition pour la liaison avec les amorces par

réhybridation du produit concentré (10 nM) (Innis et Gelfand, 1990). Si le produit

désiré n’est pas obtenu en 30 cycles, un petit échantillon (1 µl) du produit amplifié

devra être prélevé, mélangé et ré-amplifié en 20–30 cycles dans un nouveau

mélange réactif, plutôt que d’augmenter le nombre de cycles. Dans certains cas où la

concentration de matrice est faible, cette ré-amplification peut produire un bon

produit, contrairement à la prolongation à 40 cycles ou plus.

Conception des amorces pour la PCR

La conception des amorces est sans doute le paramètre le plus important pour le

succès de la PCR. Toutes choses égales par ailleurs, une amorce mal conçue peut

empêcher le fonctionnement de la réaction PCR. La séquence d’amorce détermine

plusieurs choses, telles que la position et la longueur du produit, sa température de

fusion et finalement le rendement (Innis et Gelfand, 1994). Une amorce mal conçue

peut conduire à une production faible, voire nulle, en raison d’une amplification non

spécifique et/ou à la formation de dimères d’amorce, qui peuvent devenir

suffisamment compétitifs pour inhiber la formation de produit. Cette note

d’application a pour but d’établir des règles dont il convient de tenir compte lors de la



conception d’amorces pour la PCR. Ce sujet est traité plus en détail dans d’autres

publications (Dieffenbach et al., 1995).

Sélection des amorces

Plusieurs variables doivent être prises en considération lors de la conception des

amorces pour la PCR. En voici quelques-unes des plus importantes:

• longueur de l’amorce,

• température de fusion (Tf),

• spécificité,

• séquences d’amorce complémentaires

• teneur en G/C et suites polypyrimidine (T, C) ou polypurine (A, G),

• séquence à l’extrémité 3’.

Chacun de ces éléments essentiels est examiné dans les sections suivantes.

Longueur de l’amorce

Comme la spécificité, la température et le temps d’hybridation dépendent en partie

de la longueur de l’amorce, ce paramètre est essentiel pour le succès de la PCR. En

général, les oligonucléotides entre 18 et 24 bases sont extrêmement spécifiques de

la séquence, à condition que la température d’hybridation soit optimale. La longueur

de l’amorce est également proportionnelle à l’efficacité de l’hybridation. En général,

plus l’amorce est longue, moins l’hybridation est efficace. Le nombre de matrices

amorcées diminuant à chaque étape, cela peut aboutir à une diminution sensible de

produit amplifié. Les amorces ne devraient toutefois pas être trop courtes, à moins

que l’application l’exige spécifiquement. Comme indiqué ci-dessous, l’objectif est de

concevoir une amorce dont la température d’hybridation est d’au moins 50 °C.

La relation entre la température d’hybridation et la température de fusion est l’une

des «boîtes noires» de la PCR. Une règle générale est d’utiliser une température

d’hybridation qui est 5 °C plus basse que la température de fusion. Souvent, la

température d’hybridation déterminée de cette façon ne sera pas optimale et il faudra

procéder empiriquement pour déterminer la température optimale. À cet effet, le plus

facile est d’utiliser un thermocycleur à gradient.



Température de fusion (Tf)

Il est important de se rappeler que deux amorces sont ajoutées à une PCR dirigée

sur un site ou une cible. Les deux amorces d’oligonucléotides doivent être conçues

de sorte qu’elles aient des températures de fusion semblables. Si les amorces ne

concordent pas en termes de Tf, l’amplification sera moins efficace ou peut ne pas

fonctionner du tout, car l’amorce avec la Tf la plus élevée haut va mésamorcer aux

basses températures et l’amorce avec la Tf plus basse peut ne pas fonctionner aux

hautes températures. Les températures de fusion des oligonucléotides sont

déterminées le plus exactement à l’aide de calculs thermodynamiques du type «plus

proches voisins» avec la formule suivante:

Tfamorce = ∆H [∆S+ R ln (c/4)] -273.15°C + 16.6 log 10 [K+] (2)

où H est l’enthalpie et S est l’entropie pour la formation de l’hélice, R est la constante

molaire des gaz et c est la concentration d’amorces.

Le plus simple est d’utiliser les logiciels de conception d’amorces déjà disponibles

sur le marché (Sharrocks, 1994). Heureusement, une bonne approximation de cette

valeur (généralement valide pour les oligonucléotides de 18–24 bases) peut être

obtenue à l’aide de la formule suivante:

Tf = 2(A+T) + 4(G+C) (3)

où A, T, G et C sont les bases purine et pyrimidine.

Au Tableau 2 figurent des valeurs calculées pour des amorces de différentes

longueurs à l’aide de cette équation (appelée formule de Wallace) et en supposant

une teneur en GC de 50 % (Suggs et al., 1981).



Tableau 2. Calcul de la température de fusion des amorces avec l’équation de Wallace


Tf = 2 (A+T) + 4(G+C)


Tf = 2 (A+T) + 4(G+C)

4 12 °C 22 66 °C

6 18 °C 24 72 °C

8 24 °C 26 78 °C

10 30 °C 28 84 °C

12 36 °C 30 90 °C

14 42 °C 32 96 °C

16 48 °C 34 102 °C

18 54 °C 36 108 °C

20 66 °C 38 114 °C

Les températures calculées à l’aide de la règle de Wallace sont imprécises pour les

valeurs extrêmes de ce Tableau. Lors du calcul des températures de fusion des

amorces, il convient de veiller à ce que la température de fusion du produit est

suffisamment basse pour obtenir une fusion de 100 % à 92 °C. Bien que ce

paramètre contribue à assurer une PCR plus efficace, il n’est pas toujours

nécessaire pour le succès de la PCR. En général, les produits entre 100 et 600

paires de base sont efficacement amplifiés dans de nombreuses réactions PCR. En

cas de doute, la Tf du produit peut être calculée à l’aide de la formule suivante:

Tf =81.5 + 16.6 (log10[K+] + 0.41 (%G+C)-675/longueur (4)

Spécificité

Comme mentionné plus haut, la spécificité de l’amorce dépend au moins

partiellement de la longueur de l’amorce. Il est évident qu’il y a beaucoup plus

d’oligonucléotides uniques à 24 paires de bases qu’à 15 paires de bases. Ceci dit,

les amorces doivent être choisies de telle sorte qu’elles aient une séquence unique

dans l’ADN matrice qui doit être amplifié. Une amorce conçue avec une séquence

hautement répétitive conduira à une traînée lors de l’amplification d’ADN génomique.



Toutefois, la même amorce peut donner une bande unique si un clone unique d’une

bibliothèque génomique est amplifié. Comme l’ADN polymérase Taq est active dans

une large gamme de températures, l’extension de l’amorce se produira aux basses

températures d’hybridation. Si la température est trop basse, un amorçage non

spécifique peut se produire, qui peut être étendu par la polymérase s’il y a

une homologie courte à l’extrémité 3’. En général, une température de fusion de 55–

72 °C donne les meilleurs résultats (à noter que cela correspond à une longueur

d’amorce de 18–24 bases avec la règle de Wallace).

Séquences d’amorce complémentaires

Les amorces doivent être conçues absolument sans aucune homologie intra-amorce

au-delà de 3 paires de bases. Si une amorce possède une telle région d’auto-

homologie, des structures partiellement doubles brin en «épingles à cheveux»

peuvent se former, qui perturberont l’hybridation avec la matrice. Un autre risque

connexe est l’homologie inter-amorce. L’homologie partielle dans les régions

centrales de deux amorces peut interférer avec l’hybridation. Si l’homologie se situe

à l’extrémité 3’ de l’une ou de l’autre amorce, la formation de dimères d’amorce se

produira, ce qui, par compétition, empêchera le plus souvent la formation du produit

désiré.

Teneur en G/C et suites polypyrimidine (T, C) ou polypurine (A, G)

Les amorces devraient être composées à 45-55 % de GC. La séquence d’amorce

doit être choisie de telle sorte qu’il n’y ait aucune suite poly-G ou poly-C pouvant

promouvoir une hybridation non spécifique. Les suites poly-A and poly-T doivent

également être évitées, car elles «respireront» et ouvriront des parties du complexe

amorce-matrice. Cela peut réduire l’efficacité de l’amplification. Les suites

polypyrimidine (T, C) et polypurine (A, G) devraient également être évitées.

Idéalement, l’amorce présentera un mélange presque aléatoire de nucléotides, une

teneur de 50 % en GC et une longueur d’environ 20 bases. La Tf se situera alors

entre 56 et 62 °C (Dieffenbach et al., 1995).



Séquence à l’extrémité 3’

Il est établi que la position terminale 3’ dans les amorces PCR est essentielle pour

empêcher le mésamorçage. Le problème des homologies d’amorce se produisant

dans ces régions a déjà été examiné. Une autre variable à considérer est l’inclusion

d’un résidu G ou C à l’extrémité 3’ des amorces. Ce « crampon GC » contribue à la

fixation correcte à l’extrémité 3’ en raison de la liaison hydrogène plus forte des

résidus G/C. Cela contribue également à une plus grande efficacité de la réaction en

réduisant au minimum la «respiration» qui pourrait se produire.

PCR spécialisée

Outre l’amplification d’une séquence d’ADN cible par les procédures PCR habituelles

déjà décrites, plusieurs types spécialisés de PCR ont été mis au point pour des

applications spécifiques.

PCR nichée

Des séries d’amorces successives peuvent être utilisées pour améliorer le

rendement PCR de la séquence d’ADN cible (Newton et Graham, 1994). La PCR

nichée est effectuée en 15 à 30 cycles avec une série d’amorces, puis en 15 à 30

cycles supplémentaires avec une deuxième série d’amorces, pour une région interne

du premier produit ADN amplifié. Ainsi, le plus grand fragment produit lors des

premiers cycles de la PCR est utilisé comme matrice pour la seconde PCR. La PCR

nichée peut augmenter considérablement la sensibilité et la spécificité de

l’amplification de l’ADN. La spécificité est particulièrement améliorée parce que cette

technique élimine presque toujours tout faux produit d’amplification non spécifique.

Cela est dû au fait qu’après la première PCR il est peu probable que les produits non

spécifiques soient suffisamment complémentaires des amorces successives pour

pouvoir servir de matrice pour une amplification supplémentaire, la séquence cible

désirée étant dès lors amplifiée préférentiellement. Toutefois, le risque accru de

contamination est un inconvénient de cette sensibilité extrême et l’exécution de ces

PCR doit avoir lieu avec le plus grand soin, particulièrement en laboratoire

diagnostique.



PCR multiplex

Alors que la PCR standard utilise généralement une paire d’amorces pour amplifier

une séquence spécifique, la PCR multiplex utilise des paires multiples d’amorces

pour amplifier simultanément un grand nombre de séquences. La présence de

nombreuses amorces PCR dans un seul tube pourrait poser beaucoup de

problèmes, tels que la formation accrue de produits PCR mésamorcés, de dimères

d’amorce et la discrimination d’amplification de fragments d’ADN plus longs (Atlas et

Bey, 1994).

Pour ce type d’amplification PCR, on choisit des amorces ayant des températures

d’hybridation semblables. Les longueurs des produits amplifiés devraient être

semblables; de grandes différences de longueur des ADN cibles favoriseront

l’amplification de la cible courte par rapport à la cible longue, ce qui aboutit à des

différences de rendement de produits amplifiés. En outre, les tampons utilisés pour la

PCR multiplex contiennent la polymérase Taq, qui diminue la compétition entre les

amplicons et la discrimination de fragments d’ADN plus longs pendant la PCR

multiplex.

Les produits de la PCR multiplex peuvent subir une hybridation supplémentaire avec

une sonde spécifique du gène pour vérification.

La PCR dans la pratique

Comme déjà indiqué dans les sections précédentes, la PCR est une puissante

technique analytique et préparatoire qui est largement utilisée. Cependant, en raison

de la nature de cette procédure, des traces de contaminants de l’ADN pourraient

servir de matrices, ce qui conduirait à l’amplification du mauvais acide nucléique

cible (faux positifs). Par conséquent, il est essentiel d’effectuer l’amplification PCR

dans un environnement exempt d’ADN. Les zones de travail physiquement séparées

et dotées d’équipements spécialisés réduisent le risque de contamination. Le respect

strict des exigences en matière de décontamination (décontamination des acides

nucléiques, prévention des aérosols, etc.) est la condition préalable la plus

importante pour réduire au maximum le taux de faux positifs. La contamination PCR

peut provenir de plusieurs sources:

• paillasses de laboratoire, équipements et dispositifs de pipetage, qui peuvent

être contaminés par des préparations ADN précédentes ou par des fragments

de restriction épurés,



• contamination croisée entre échantillons,

• produits d’amplifications PCR précédentes.

Cette section contient un certain nombre de recommandations, le but étant de définir

les exigences habituelles pour l’établissement et l’entretien d’un environnement

propre pour tout système de dosage basé sur la PCR, indépendamment du nombre

d’échantillons traités (Roth et al., 1997).

Méthodes physiques de prévention

Équipements de laboratoire. Afin d’éviter une contamination, des zones de travail

physiquement séparées devront être établies de la manière suivante.

1. Zone de préparation des échantillons

Cette pièce consiste en une zone où ont lieu toutes les étapes précédant

l’amplification de l’ADN matrice (par exemple, isolement et purification de l’ADN).

2. Zone de préparation de la PCR

Cette pièce «propre» est consacrée aux procédures de préparation de la PCR

(par exemple, mastermix, dilution des amorces, etc.).

3. Zone post-PCR

La zone est consacrée à l’amplification de la séquence d’ADN cible ainsi qu’à la

détection et à l’analyse des produits PCR.

En outre, il convient de respecter les règles générales suivantes.

• Toutes les pièces doivent contenir des équipements spécialisés (tabliers, gants,

réactifs et fournitures).

• Les réactifs et appareils doivent être étiquetés avec indication du contenu et de la

date de préparation.

• Utiliser un système de flux unidirectionnel, c’est-à-dire ne jamais transférer des

matières, des échantillons ou des équipements des zones post-PCR vers les

zones pré-PCR.

• Utiliser des tubes PCR jetables qui sont exempts de DNase et de RNase.

• Utiliser des embouts de pipette spéciaux résistants aux aérosols et un ensemble

de pipettes réservé exclusivement à la PCR, de préférence des pipettes à

déplacement positif.

• Si possible, préparer la PCR sous une hotte d’aspiration équipée d’un éclairage

UV. Sous la hotte d’aspiration, placer une microcentrifugeuse et des gants

jetables utilisés uniquement pour la PCR.



• Laver périodiquement les paillasses et les étagères à l’eau de Javel à 10 %, puis

à l’éthanol à 70 %.

Manipulation des échantillons

• Toujours utiliser des techniques stériles et porter des gants neufs lors du travail

dans les zones décrites précédemment. Changer les gants fréquemment,

particulièrement si on suspecte qu’ils ont été contaminés par des solutions

contenant l’ADN matrice.

• Toujours utiliser des ustensiles en verre/plastique et des pipettes neufs ou

stérilisés pour la préparation des réactifs PCR et de l’ADN matrice.

• Stériliser à l’autoclave tous les réactifs et solutions qui peuvent subir ce

traitement sans problème pour leur performance. Bien sûr, les amorces, les

dNTP et l’ADN polymérase Taq ne devront pas être stérilisés à l’autoclave.

• Avoir à disposition son propre ensemble de réactifs et de solutions PCR qui ne

sont utilisés que pour la PCR, et stocker ces réactifs en petites parties aliquotes.

• Lors du pipetage d’ADN, éviter de créer des aérosols qui peuvent transporter des

contaminants.

• Toujours prévoir des réactions de contrôle, par exemple un contrôle négatif («pas

d’ADN») qui contient tous les composants de la réaction sauf l’ADN matrice, et

un contrôle positif qui a été utilisé avec succès dans des PCR antérieures.

Méthodes biochimiques de prévention

Uracile-ADN glycosylase. La PCR peut amplifier un milliard de fois une seule

molécule. Par conséquent, même des quantités infimes d’un contaminant peuvent

être amplifiées et conduire à un faux positif. Ces contaminants sont souvent des

produits d’amplifications PCR antérieures (contamination par transfert). C’est

pourquoi des méthodes permettant d’éviter cette contamination ont été mises au

point.



Une méthode couramment utilisée consiste à substituer le dUTP au dTTP pendant

l’amplification PCR pour produire de l’ADN contenant de l’uracile (U-ADN) (Longo et

al., 1990). Le traitement des mélanges PCR par l’uracile-ADN glycosylase (UNG)

avant l’amplification PCR, suivi du clivage des polynucléotides pyrimidine à haute

température (95 °C) dans des conditions alcalines (pendant l’étape de dénaturation

initiale) débarrassera l’échantillon de l’U-ADN contaminant (voir Figure 8).

Figure 8. Réaction à l’uracile-ADN glycosylase

Cette méthode exige bien sûr que toutes les PCR dans le laboratoire soient

effectuées avec le dUTP au lieu du dTTP.

Remarques concernant l’utilisation de produits PCR contenant du dUTP dans les

applications en aval:

• les performances des produits PCR contenant du dUTP sont aussi bonnes que

celles des produits contenant du dTTP lorsqu’ils sont utilisés comme cibles

d’hybridation ou comme matrices pour le séquençage didésoxy;

• les produits PCR contenant du dUTP peuvent être clonés directement s’ils sont

transformés en hôtes bactériens reconnaissant l’UNG;

• un substrat contenant du dUTP est aisément digéré par certaines enzymes de

restriction courantes (EcoR I et BamH I, par exemple), tandis que d’autres

présentent une activité réduite (Hpa I, Hind II, Hind III, par exemple) sur ces

substrats;

• l’utilisation d’ADN contenant du dUTP n’est pas recommandée pour les études

sur la fixation des protéines ou les interactions ADN-protéines.



DNase I, exonucléase III. D’autres méthodes biochimiques sont basées sur le

traitement de l’ADN contaminé par la DNase I, l’exonucléase III ou par une enzyme

de restriction contenant une séquence de reconnaissance dans l’ADN cible.

Cependant, en raison des strictes conditions de réaction exigées, ces enzymes

présentent l’inconvénient de réduire l’efficacité de l’amplification PCR.

Préparation du mélange pour la réaction PCR (mastermix)

Les composants réactifs essentiels pour la PCR sont l’eau, le tampon de réaction,

une ADN polymérase thermostable, des amorces d’oligonucléotides, des

désoxynucléotides (dNTP), de l’ADN matrice (cible) et des ions magnésium (Mg2+).

En général, tous les réactifs (sauf l’ADN matrice) sont mélangés dans un seul tube

en quantités suffisantes pour le nombre de réactions à effectuer (mastermix). Le

mastermix est ensuite réparti en parties aliquotes dans plusieurs tubes et l’ADN

matrice est ajouté. L’utilisation d’une solution mastermix réduit le risque de

contamination et améliore la performance de la réaction PCR pour les raisons

suivantes:

• une qualité uniforme de la solution est garantie pour tous les réactifs pour une

série d’analyses,

• le risque de contamination du parent et des solutions résultantes est réduit,

• de plus grands volumes peuvent être prélevés par pipette,

• les pipetages sont moins nombreux, ce qui fait gagner du temps.

Le succès de l’amplification de la région d’intérêt dépend de la quantité et de la

qualité de l’ADN matrice. La quantité de matrice nécessaire dépend de la complexité

de l’échantillon d’ADN. Étant donné que la taille du génome nucléaire varie d’un

organisme à l’autre, la concentration en ADN doit être maintenue constante

(généralement 10 ng/µl). Au Tableau 3 figure une comparaison de la taille du

génome d’espèces végétales fréquemment utilisées dans la transformation de

plantes et du nombre correspondant de copies du génome dans une quantité définie

d’ADN.

Par exemple, dans un plasmide de 4 kb contenant un insert de 1 kb, 25 % de l’ADN

de départ constituent la cible d’intérêt. Inversement, un gène de 1 kb dans le génome

du maïs (5 x 109 pb) représente approximativement 0,00002 % de l’ADN de départ.

Environ 1 000 000 plus d’ADN génomique de maïs est nécessaire pour maintenir le

même nombre de copies cibles par réaction. Pour des résultats optimisés, plus de



104 copies de la séquence cible doivent être utilisées comme matrice initiale pour

obtenir un signal en 25–30 cycles.

Tableau 3. Comparaison de la taille du génome de certaines espèces végétales et copies correspondantes du génome dans une quantité définie d’ADN

Échantillon Taille du

génome

Copies du génome dans

1 µg d’ADN

Copies du génome dans

1 ng d’ADN

Maïs 5 x 109 pb 1,85 x 105 185

Soja 1,55 x 109 pb 5,98 x 105 598

Tabac 3,8 x 109 pb 2,43 x 105 245

Riz 4 x 108 pb 2,31 x 106 2 310

Même si, dans la pratique, moins de 10 copies d’une séquence cible peuvent être

amplifiées, dans ce cas davantage de cycles PCR peuvent être nécessaires pour

détecter un signal par électrophorèse sur gel. Les protocoles généraux couramment

appliqués considèrent un certain nombre de cycles de 30 à 40. Il convient d’être

prudent lorsqu’on augmente encore le nombre de cycles, car cela peut accroître

l’amplification non spécifique.

Contrôles

Comme indiqué dans la section précédente, on trouve des sources potentielles de

contamination partout dans le laboratoire. Les échantillons, le personnel du

laboratoire, la climatisation, les équipements et les réactifs peuvent tous être une

source de contamination. Parmi les agents contaminants, on peut citer les suivants:

1. contamination par transfert d’ADN cible amplifié lors de PCR antérieures;

2. contamination croisée entre échantillons, ce qui conduit au transfert d’ADN cible

d’un échantillon à l’autre;

3. ADN génomique de préparations d’échantillons antérieures;

4. produits de dégradation de réactions de décontamination.

Alors que les trois premières formes de contamination produisent des faux positifs, le

dernier type conduit à des faux négatifs. Cette forme de contamination, observée

pour la première fois par Niederhauser et collaborateurs en 1994, provoque

l’inhibition des réactions PCR (Niederhauser et al., 1994). En fait, la décontamination

selon la méthode UNG favorise la formation de complexes avec les amorces.



Pour obtenir des résultats fiables, des contrôles tant positifs que négatifs doivent

toujours être utilisés pendant une réaction PCR. Le Tableau 4 indique quelques-uns

des contrôles les plus couramment utilisés pour assurer la performance des

procédures d’amplification d’acide nucléique.

Tableau 4. Contrôles à introduire dans les tests basés sur la PCR

Contrôle Méthode

Contamination des réactifs par l’ADN cible

Contrôle négatif sans ADN matrice (seulement mastermix)

Spécificité de la réaction Contrôles pour trouver les produits secondaires et non spécifiques

Développement et sensibilité de la réaction

Contrôles positifs/négatifs pour vérifier que les conditions et les rendements désirés sont obtenus

Intégrité du mélange PCR Contrôle positif pour l’ADN

Contrôles positifs

L’efficacité de l’extraction de l’ADN et de son amplification doit être vérifiée au moyen

de contrôles positifs. Idéalement, les limites de détection devraient être données en

tant qu’équivalents génomiques, ce qui permettrait la production de contrôles à

sensibilité définie, avec de petits nombres de copies. En règle générale, il faut

disposer d’une préparation de référence contenant une concentration connue de

l’ADN cible à l’étude.

Contrôles négatifs

Une contamination (transfert de produits ou acides nucléiques amplifiés) peut se

produire pendant l’isolement et la purification de l’ADN cible, ainsi que pendant la

préparation du mélange de la réaction d’amplification. Il est donc nécessaire

d’ajouter un contrôle négatif au mélange de la réaction d’amplification.



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