Analiza proteinelor prin eletroforeza in diagnosticul anemiilor hemolitice prin

defect de citoschelet

Clasificarea anemiilor hemolitice prin defect de membrana

A. Patologia scheletului de membrana (a retelei interne):

1. Anemii de tip hemolitic cronic: sferocitoza, ovalocitoza si piropoikilocitoza ereditara;

2. Anemii hemolitice intravasculare (brutale) anicterice: hemoglobinuria de mars

B. Patologia stratului (mediu) lipidic: 1. Tulburari ale structurii stratului lipidic bilaminat: acantocitoza

ereditara;2. Tulburari ale componentelor lipoproteinelor integrate in stratul

lipidic bilaminat: stomatocitoza si xantocitoza ereditara

C. Patologia stratului superficial:1. Anomalia ereditara numita boala grupului Rh nul;2. Anemii hemolitice autoimune (dobandite)

Componentele biochimice ale membranei eritrocitare

Spectrina - proteina fibrilara, flexibila, cea mai importanta proteina structurala din membrana eritrocitului (75%) - apare pe locurile 1 si 2 ale benzilor de migrare electroforetica - lungime 1000 A- alcatuita din 2 subunitati polipeptidice dispuse in dublu helix: monomerii alfa si beta care prin digestie triptica au fost fragmentati in 5 segmente si respectiv in 4 segmente si expuse la electroforeza bidimensionala s-au obtinut un numar mare de subunitati oligopeptidice Actina - proteina fibrilara, elastica, reprezinta 10% din proteinele citoscheletului membranar- asemanatoare cu actina musculara si cu trombostenina trombocitara- reprezinta banda 5 pe electroforezaProteina benzii 4.1 - rol cheie in mentinerea integritatii citoscheletice - modeleaza legaturile dintre dimerii de spectrina si filamentele de actina, fixand scheletul de stratul lipidic supraiacent - pe coloanele de electroforeza banda 4 apare formata din numeroase straturi (4.1.a, 4.1.b, 4.2, …4.9)Anchirina (proteina benzii 2.1) - proteina globuloasa de circa 20 nm - formeaza puncte de legatura pe orizontal cu spectrina iar pe vertical cu proteina benzii 3- pe benzile de migrare eletroforetica apare sub mai multe straturi, de la 2.1 la 2.6

Proteina benzii 3 - glicoproteina integrata, voluminoasa - face legatura intre dublul strat lipidic si scheletul subiacent- contine majoritatea determinantilor pentru sistemul Rh- este receptorul concanovalinei A, a lectinei- are rol in permeabilitatea anionilor (sulfati, fosfati), a glucozei si in miscarea apeiProteine-enzime:-Gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza – proteina benzii 6-ATP- aza membranei-AcetilcolinesterazaGlicoforinele – sunt 3- apar ca benzi pe DSS-GPAA numai in coloratia PASGlicoforina A – are 1 lant peptidic alcatuit din 131 de aminocizi- poarta antigene ale grupelor sanguine MN si receptori pentru mixovirusuri si lectine- capatul N terminal este legat in exterior de oligozaharide care au la capat acid sialic cu incarcare negativa ceea ce intarzie aglutinarea si sedimentarea eritrocitelor, acesta descreste odata cu imbatranirea eritrocitelor

Etiopatogenia anemiilor prin defect al retelei interne membranare1. Sferocitoza ereditara (Microsferocitoza sau Boala Minkowski-Chauffard) - mutatii la nivelul lanturilor alfa si beta ale spectrinei: la pacientii cu SE cu transmitere AD -deficitul de spectrina este de 30-50% (hemoliza moderata)la pacientii cu SE cu transmitere AR -deficitul de spectrina este de 70-90% (necesita transfuzii repetate)- s-au pus in evidenta spectrine instabile care nu au capacitatea de a lega proteina 4.1 si care se leaga slab de actina- forme recesive de SE asociate cu absenta proteinei 4.2- forme dominante de SE cu deficit partial al proteinei 3- forme atipice si severe de SE in care s-au evidentiat defecte ale anchirinei

2. Ovalocitoza (eliptocitoza) ereditara- transmitere AD si AR- deficit cantitativ de spectrina- tipuri de spectrina disfunctionale- defecte ale proteinei de legatura ale benzii 4.1- deficiente ale glicoforinei C- eliptocitoza Barcelona- mutatie localizata pe lantul alfa 1 50-469his->pro

3. Piropoikilocitoza ereditara- transmitere AR- reducerea sintezei lanturilor de spectrina (normal lanturile alfa sunt sintetizate de 2-3 ori mai mult decat lanturile beta)- alterarea calitativa a lantului de spectrina care face imposibila asamblarea cu celelalte proteine structurale

Electroforeza in gel de poliacrilamidaAcrilamida este un monomer sintetic care poate fi polimerizat in lanturi lungi cu ajutorul radicalilor liberi generati de persulfatul de amoniu si stabilizat de tetrametilen-diamina (TEMED). Prin legaturi incrucisate, lanturile polimerice formeaza un gel poros in prezenta metilen-bisacrilamidei.Mobilitatea electroforetica a proteinelor, bazata pe caracterul lor amfoter, este dependenta de mai multi factori, unii intrinseci (greutate moleculara si incarcare electrica), altii dependenti de tehnica de electroforeza utilizata (intensitatea campului electric, pH-ul si concentratia ionica a solutiei). Separarea electroforetica presupune migrarea spre anod a proteinelor utilizand un gel cu porii mici. Proteinele imobilizate in gel pot fi ulterior analizate printr-o colorare selectiva care permite detectia unor cantitati extrem de mici (<1ng) de proteina.Cea mai des folosita metoda de electroforeza a proteinelor este electroforeza in gel de poliacrilamida-SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) sau SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamide Gels), care permite estimarea greutatii moleculare a polipeptidelor si analiza unor amestecuri complexe de proteine.

Proteinele sunt denaturate in cursul electroforezei si formeaza cu SDS complexe ce mascheaza incarcarea electrica a proteinelor, separarea facandu-se exclusiv pe baza greutatii moleculare. Pentru a separa amestecurile de proteine se utilizeaza frecvent gradienti de poliacrilamida. Dupa electroforeza, gelul poate fi colorat pentru detectarea benzilor corespunzatoare proteinelor. Cea mai simpla metoda implica colorarea in solutie cu albastru Coomassie, ce contine metanol si acid acetic. O parte din colorantul cationic se leaga de proteina in solutia acida, iar cel ramas nelegat poate fi spalat cu solutie de metanol si acid acetic. Limita sensibilitatii acestei metode este de 200 ng de proteina. Cea mai sensibila metoda de colorare (poate detecta 0,21 ng de proteina) utilizeaza cationii de argint care se pot lega de grupurile NH2- si S- ale proteinelor. Complexele Ag-proteine pot fi reduse pentru a produce Ag metalic in gel, usor de vizualizat.

Pentru studierea compozitiei membranei eritrocitare, hematiile, golite de continutul lor (devenite “fantome eritrocitare”) sunt supuse actiunii unor detergenti care le separa in mai multe componente. Pe de o parte obtinem lipide solubilizate impreuna cu proteinele integrate si stratul superficial bogat in acid sialic, iar pe de alta parte obtinem o grupare de proteine care constituie stratul subiacent sau scheletul membranei.Metoda electroforetica cu dodecilsulfat de sodiu pe gel de poliacrilamida (DSS-PAGE) a pus in evidenta, in functie de viteza diferita de migrare a proteinelor, 10-15 benzi care corespund proteinelor majore de structura, dar exista si alte circa 200 de proteine minore. Numerotarea ca “benzi” a fost facuta in ordinea migrarii electroforetice. Prin perfectionarea acestei metode s-au obtinut si “subbenzi” (de exemplu: 2.1, 2.2,…2.6 sau 4.1a, 4.1b, 4.2,…4.9). O parte din subbenzi nu sunt proteine integre, ci fragmente de lanturi polipetidice.

Focalizare izoelectrica (IEF- isoelectric focusing) este o alta tehnica electroforetica ce permite separarea proteinelor in functie de incarcarea lor electrica. Metoda se bazeaza pe capacitatea proteinelor de a migra in camp electric, atata timp cat au incarcare electrica neta, pozitiva sau negativa. Moleculele neutre nu pot migra. In general, proteinele contin aminoacizi incarcati electric diferit, unii pozitivi, altii, negativi, ceea ce explica si caracterul lor amfoter. Valorile diferite ale pH-ului solutiilor de migrare determina care dintre incarcari, pozitiva sau negativa, va domina la nivelul unei molecule proteice. Pentru fiecare proteina se descrie o anumita valoare a pH-ului, la care proteina este neutra (incarcarea electrica pozitiva devine egala cu cea negativa), valoare particulara numita punct isoelectric. Tehnica IEF utilizeaza geluri ce contin niste substante numite carrier amfoliti care, sub influenta unui camp electric aplicat gelului, se ordoneaza intr-un gradient dependent de pH. Cand un amestec proteic este analizat, prin electroforeza, intr-un astfel de gel, fiecare proteina din amestec va migra, pana in zona caracterizata de acel pH particular numit punct isoelectric, unde se va opri.

Electroforeza bi-dimensionala in gel este o metoda ce combina tehnica DSS-PAGE cu avantajele IEF. Mai intai, amestecul proteic este supus unei electroforeze IEF, ce permite separarea componentelor in functie de punctul lor isoelectric (prima dimensiune), apoi, proteinele sunt tratate cu DSS, iar gelul IEF este pus in contact cu un gel DSS-PAGE. Reactia prealabila a proteinelor din amestec cu DSS permite acestora sa iasa din gelul IEF si sa migreze in gelul DSS in functie de greutatea lor moleculara (a doua dimensiune). Vizualizarea pozitiei unei anumite proteine dupa separare se poate realiza prin colorare cu albastru Coomassie, sau prin marcare prealabila cu o substanta radioactiva si autoradigrafie sau prin marcare cu argint, metoda ce se bazeaza pe capacitatea proteinelor de a reduce ionii de argint la argint metalic, ce poate fi detectat cu usurinta in gel.