Analisi quantitativa delle immagini per applicazioni in ... Analisi quantitativa delle immagini I...

download Analisi quantitativa delle immagini per applicazioni in ... Analisi quantitativa delle immagini I danni

of 103

  • date post

    23-Jun-2020
  • Category

    Documents

  • view

    1
  • download

    0

Embed Size (px)

Transcript of Analisi quantitativa delle immagini per applicazioni in ... Analisi quantitativa delle immagini I...

  • Analisi quantitativa delle immagini

    per applicazioni in Life Science

    Immagini & Computer S.n.c. Via Don Carlo Riva 4 20010 Bareggio (Mi)

    15 Aprile 2011

  • “L’analisi quantitativa delle immagini rappresenta l’arte di trasformare una sensazione visiva nella sua forma schematica e discreta consentendone la descrizione, la classificazione e l’interpretazione matematica e logica univoca delle sue componenti spaziali e temporali.”

    Analisi quantitativa delle immagini

  • Analisi quantitativa delle immagini

    Premesse

  • Analisi quantitativa delle immagini

    L‟analisi delle immagini è una disciplina il cui scopo principale è estrarre informazioni quantitative a partire dalla rappresentazione digitale del nostro evento biologico

    Tali informazioni devono essere presenti in quantità e qualità sufficienti alla loro valutazione all‟interno della nostra immagine digitale.

    Abbiamo quindi bisogno di una rappresentazione digitale quanto più fedele possibile all‟originale da cui è stata generata.

    La fedeltà e la presenza delle informazioni è funzione diretta dei limiti di risoluzione e contrasto imposti dal sistema.

  • Analisi quantitativa delle immagini

    I limiti di risoluzione e contrato

    Limiti fisici derivanti dalla costruzione dell’immagine ottica

    Limiti derivanti dalla trasformazione dell’immagine ottica in digitale

    Limiti derivanti dalla errata manipolazione dell’immagine digitale

    Risultato

  • Analisi quantitativa delle immagini

    Risoluzione & Contrasto

  • Piano di fuoco del campione

    Lunghezza di camera  18 - 25 cm

    Il piano di fuoco selezionato viene, attraverso il sistema ottico (obiettivo), proiettato su un piano focale secondario (posteriore). Quello che noi osserviamo attraverso gli oculari non è il campione originale ma la sua trasposizione ottica generata attraverso il processo di convoluzione.

    Obiettivo Oculare

    Piano di Fuoco posteriore

    Piano di Fuoco Oculare

    Piano di Fuoco osservato

    Come si forma una immagine ottica

    Analisi quantitativa delle immagini

  • Considerate il campione come un insieme di infiniti punti di emissione luminosa con dimensioni inferiori al limite di risoluzione ottica

    Come si forma una immagine ottica

    Quando la luce che arriva dai vari punti che compongono il campione attraversa il sistema ottico essi appaiono come piccole strutture (Airy pattern) e non come punti nell‟immagine ricostruita .

    La parte centrale del pattern è conosciuta come Airy Disk e contiene + dell‟80% della intensità totale del punto.

    Analisi quantitativa delle immagini

  • Analisi quantitativa delle immagini

    Definizione di risoluzione ottica

    La risoluzione ottica è definita come la distanza minima che separa 2 oggetti puntiformi presenti sul piano focale affinché essi possano essere visualizzati come entità separate.

    Il limite di risoluzione si raggiunge quando il primo anello periferico del pattern di Airy di un punto si sovrappone al punto di massima del disco principale del punto contiguo.

    Si consideri che: Più il picco centrale del pattern di Airy è sottile più è elevato il potere risolutivo del sistema ottico. L’ampiezze del picco è determinata sia dall’angolo solido con il quale l’ottica è in grado di raccogliere la luce (Apertura Numerica), sia dalla lunghezza d’onda della luce raccolta.

    La risoluzione laterale ed assiale di un sistema ottico si calcola utilizzando la formula di Abbe (dove N.A.= n sen a )

    R laterale WF = 0,61 λem/ N.A. R assiale WF= 2 λem * n / N.A

    Il criterio di Rayleigh propone come limite di risoluzione la distanza minima tra 2 punti tale che il contrasto ottenuto rappresenti il 26.5% del totale.

  • Analisi quantitativa delle immagini

    Definizione di risoluzione ottica

    Il concetto di risoluzione ottica è indissolubilmente associato al concetto di contrasto

    Il contrasto è espresso come la differenza tra il valore massimo e minimo di intensità presente nell‟immagine.

    C = (Max – Min) / Med

    Con riferimento ai pattern di Airy il contrasto è dato dalla differenza tra il picco di massima (disco centrale) ed il valore di intensità più prossimo.

    Minore la distanza tra gli oggetti minore il contrasto esistente tra i due.

    Il criterio di Sparrow definisce la risoluzione di un sistema come la distanza di Cut-Off calcolata.

    La Cut-Off distance determina le distanza esistente tra due punti (massimo dei picchi di Airy) a partire dalla quale il valore di contrasto viene azzerato.

  • Analisi quantitativa delle immagini

    Principali sorgenti di degrado della risoluzione (contrasto)

  • Analisi quantitativa delle immagini

    Principali sorgenti di degrado della risoluzione (contrasto)

    Rumore

    Causa una variazione (fluttuazione) del segnale intorno al suo valore reale. Il segnale deve risultare significativamente più elevato del rumore.

    •Rumore Poisson (campione) •Rumore ottico

    Sistema Ottico

    Degrado delle caratteristiche dell’immagine originale. Introduzione di aberrazioni ottiche e di fenomeni di diffrazione.

    •Diffrazione Luce •Aberrazioni sferiche e cromatiche •Fuori fuoco. •Artefatti

    Preparazione del campioneMarcatura adeguata delle strutture

    Background

    Si aggiunge al reale segnale e ne compromette la quantificazione. Deve essere sottratto al valore del segnale.

    •Autofluorescenza. •Disomogeneità luce •Luce estranea

  • Analisi quantitativa delle immagini

    Disallineamento cromatico

    Errore sistematico caratteristico dei sistemi ottici (obiettivi).

    La luce monocromatica viene focalizzata su piani diversi in funzione della sua lunghezza d’onda. Errore più consistente lungo asse Z. Risente delle condizioni meccaniche ed ambientali (temperatura)

    Utilizzo di obiettivi corretti cromaticamente.

    Misura sperimentale del disallineamento attraverso sfere fluorescenti.

    Correzione con ricalcolo dello stack

  • Errata localizzazione della luce

    A causa della profondità di campo dell‟obiettivo utilizzato, la luce proveniente dai piani di fuoco adiacenti a quello principale fornisce il proprio contributo nella formazione dell‟immagine.

    La profondità di campo identifica la porzione (o spessore) del campione i cui estremi rimangono simultaneamente a fuoco all‟interno della stessa immagine.

    La profondità di campo è funzione principalmente della apertura numerica della lente e della lunghezza d‟onda di emissione della luce utilizzata.

    Profondità di campo = R assiale/2

    Analisi quantitativa delle immagini

  • Il processo fisico che rappresenta il modello di diffusione della luce è descritto dalla funzione che prende il nome di PSF (Point Spread Function)

    Errata localizzazione della luce

    Campione PSF Proiezione ottica

    La Point Spread Function (PSF) rappresenta “il mattone” sul quale l‟immagine viene costruita.

    Analisi quantitativa delle immagini

  • L’aberrazione sferica rappresenta una distorsione ottica generata dalla differente posizione di focalizzazione dei raggi oblicui (periferici) rispetto ai raggi centrali che attraversano la lente. L’aberrazione sferica introduce asimmetria nella distribuzione della luce, aggiunge componenti fuori fuoco e riduce il livello del segnale.

    L’aberrazione sferica è generata da una imperfezione del percorso ottico. La causa può essere identificata sia nella qualità costruttiva dell’obiettivo, sia nelle differenze esistenti tra gli indici di riflessione dei media utilizzati per interfacciare gli obiettivi (aria, olio, acqua, ect) e quelli dei media utilizzati per fissare il campione. Lo spessore del campione stesso può contribuire alla sua generazione.

    Aberrazione Sferica

    Analisi quantitativa delle immagini

  • Analisi quantitativa delle immagini

    Background

    Si aggiunge come costante al segnale Disomogeneità di illuminazione

    Tipica dei sistemi Widefield Si risolve calibrando il sistema di illuminazione (centratura lampada e regolazione del Koeler). Correggendo attraverso immagine del background.

    Regolando l’offset del sistema si acquisizione Valutando il valore del background con immagini di riferimento

  • Analisi quantitativa delle immagini

    La trasformazione digitale dell’immagine

  • Analisi quantitativa delle immagini

     Rispetto dei principi di campionatura X, Y, Z  Adeguata considerazione della dinamica del segnale (rappresentazione dell‟evento)  Ottimizzazione del rapporto Segnale/Rumore (SNR)  Corretta definizione dei parametri operativi (potenza del laser, esposizione della

    telecamera, impostazione PMT, livello di illuminazione del campione)  Corretta (e strutturata) memorizzazione delle immagini

    Trasformazione dell’immagine ottica in digitale

    Limiti di risoluzione e contrasto derivanti dalla trasformazione dell’immagine ottica in digitale

  • Analisi quantitativa delle immagini

    La densità di campionamento stabilisce il numero di unità digitali di base (pixel o voxel) chedevono es