Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 - ti · Anamorfismo e Telomorfismo delle diverse specie...
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Blanca M. Fernandez Rodriguez
Lavoro di diploma
Formazione Tecnico in Analisi Biomediche SSS
Scuola Superiore Medico Tecnica, Locarno
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2per l’identificazione di muffe di interesse clinico
Lavoro svolto presso Istituto Cantonale di Microbiologia, Bellinzona
2007
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 1
Indice
1. Riassunto, Abstract 3
2. Introduzione 4
3. I funghi 5
4. La classificazione 6
5. Gli aspetti clinici 7
6. Le regioni ITS1 e ITS2 8
7. Materiali e metodi
7.1. Campioni
7.2. Coltura
7.3. Estrazione
7.4. PCR
7.5. Seminested PCR
7.6. Controlli
7.7. Elettroforesi
7.8. Purificazione dei prodotti PCR
7.9. Reazione di sequenza
7.10. Purificazione dei prodotti della reazione di sequenza
7.11. Determinazione automatica della sequenza nucleotidica
7.12. Analisi delle sequenze
7.13. Costruzione dell’albero filogenetico
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8. Risultati
8.1. Confronto fra Metodica 1 e Metodica 2 per l’estrazione del DNA
8.2. Coltivazione su piastra
8.3. Estrazione e amplificazione
8.4. Sequenze
8.5. Confronto fra identificazione morfologica e identificazione mediante analisi
delle sequenze
8.6. Albero filogenetico
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9. Discussione 27
10. Bibliografia 28
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11. Allegati
11.1. Tavole illustrate delle caratteristiche morfologiche degli Ascomiceti,
Zigomiceti, e basidiomiceti
11.2. Lista dei campioni
11.3. Lista delle sequenze di riferimento
11.4. Anamorfismo e Telomorfismo delle diverse specie usate in questo lavoro
11.5. Albero filogenetico
11.6. Classificazione secondo .S. de Hoog, J. Guarro, J. Gené, M. J. Figueras,
delle specie usate in questo lavoro
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Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 3
1. Riassunto
Il numero delle micosi é in continuo aumento
soprattutto nei pazienti ospedalizzati ed
immunocompremessi. Una rapida ed accurata
diagnosi permette d’iniziare una terapia
antimicotica adeguata. Le tecniche
diagnostiche comunemente usate in
laboratorio per l’identificazione dei miceti
sono tecniche biochimiche , sierologiche e
fenotipiche. Purtroppo queste tecniche
prevedono tempi d’esecuzione lunghi e non
sempre forniscono risultati accurati
nell’identificazione della specie.
Per questo motivo l’Istituto Cantonale di
Microbiologia ha deciso di testare come
tecnica d’analisi per l’identificazione delle
muffe patogene l’utilizzo della polymerase
chain reaction (PCR). Una tecnica che si
presenta con un’alta sensibilità e specificità.
In questo lavoro abbiamo sfruttato la PCR per
ottenere le sequenze di una regione altamente
variabile presente nel DNA ribosomale, e
regioni ITS1 e ITS2, mediante l’utilizzo di
primers universali (ITS1, ITS4).Le sequenze
ottenute, appartenenti a 56 ceppi di 36 specie
diverse, sono state confrontate con le
sequenze presenti nella GenBank
(NCBI).L’identificazione genotipica che
questa ha fornito é stata confrontata con
l’identificazione morfologica.
Le due tecniche d’analisi mostrano
un’identificazione identica a livello di genere
per il 98,2% e a livello di specie per il 44,6% .
L’identificazione fenotipica é risultata più
specifica a livello di specie per il 21,4%.
Mentre l’identificazione genotipica é risultata
più discriminante solamente per il 7,14%. Il
12,5% dei ceppi analizzati ha mostrato dei
risultati discrepanti fra le due tecniche
d’identificazione. In conclusione si può dire
che l’analisi delle diverse specie di funghi
mediante l’utilizzo delle sequenze ITS non
può essere un valido sostitutivo
dell’identificazione morfologica .
Abstract
Invasive fungal diseases are increasing in
immunocompromised and hospitalized
patients. Early detection and accurate
identification of the fungi permits a rapid and
optimal initiation of antifungal therapy.
The diagnosis of mould is generally based on
biochemical, serological and phenotype
identification. However these methods take
time and do not always lead to a precise
identification of the microorganism. For this
reason, the Cantonal Institute of Microbiology
decided to test a molecular biological
technique, the polymerase chain reaction
(PCR), as identification procedure. In fact
PCR technology promises more rapid and
specific identification.
In this work we have evaluated the feasibility
of the sequence analysis of the internal
transcribed spacer regions (ITS) of the
ribosomal DNA for the identification of
pathological moulds.
The ITS sequences were obtained by
amplification of the ITS region (ITS1-5,8S-
ITS2) with universal fungal primers (ITS1,
ITS4). The sequence analyses of 56 strains for
a total of 36 different species were compared
to reference data available at the GenBank
database, and the genotypic identification was
compared with phenotype identification.
For 98,2% of the strains, both methods gave
concordant results at the genus level. Of
these, 44,6% were assigned to the identical
species. Phenotypic criteria were more
specific in 21,4% and genotypic criteria were
more discriminative for 7,14%. 12,5% of the
strains showed discrepant results. We can
therefore conclude that identification of
medically important moulds at the level of
species by ITS sequencing is not a viable
alternative to conventional identification
methods.
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 4
Figura 1. Tempi di crescita su piastra per
lieviti, muffe e funghi dimorfi [20]
2. Introduzione
Il numero delle infezioni fungine é in continuo aumento soprattutto nei pazienti
immunocompromess [1]. L’identificazione precisa delle diverse specie nella diagnostica delle
micosi gioca dunque un ruolo molto importante per l’orientamento del trattamento medico.
Prendiamo per esempio il genere Scedosporium dove il Scedosporium apiospermun é sensibile ad
una determinata gamma di antimicotici mentre ill Scedosporium prolificans si mostra resistente alla
maggior parte di essi [2]. Oppure consideriamo il genere degli Aspergillus che comprendente più di
180 specie diverse, ma la principale causa di problemi broncopolmonari, delle cheratiti, delle
sinusiti, sopratutto nei pazienti immunocompromessi, sono unicamente l’Aspergillus fumigatus, l’A.flavus e A. terreus [3, 4].
L’identificazione delle diverse specie fungine può essere effettuata con l’analisi diretta al
microscopio ottico del campione, mediante la
coltura su piastra e la differenziazione morfologica
delle diverse strutture, con test sierologici per la
ricerca di antigeni o anticorpi e test biochimici.
Oggi queste tecniche non sono più soddisfacenti
soprattutto a livello diagnostico poiché sono
tecniche laboriose, poco standardizzabili e con
tempi di esecuzione molto lunghi in particolar
modo per quanto riguarda la coltura su piastra i qui
tempi variano da specie a specie, ma richiedono un
minimo di 48h d’incubazione [2].
In oltre nella maggior parte dei casi queste tecniche
non forniscono risultati accurati poiché presentano
una bassa specificità nell’identificazione della
specie [2].
L’utilizzo di tecniche di biologiamolecolare
permette invece un’identificazione rapida e specifica
con una sensibilità maggiore.
Molte pubblicazioni propongono infatti varie tecniche
fra le quali troviamo la PCR, la Real-time PCR, la PCR-Elisa, la RFLP (Restriction Fragment
Polymorfism) ecc. [5, 6, 7, 8, 21].
In questo lavoro si é deciso di testate come tecnica d’analisi per l’identificazione delle diverse
specie di muffe l’amplificazione mediante la PCR della regione altamente variabile ITS1 e ITS2
presente nel DNA ribosomiale.
Studi precedenti propongono l’utilizzo dei geni ribosomali poiché si presentano in più copie
all’interno del genoma e mostrano regioni conservate, come per esempio i geni 18S, 28S e 5.8S
comuni a tutti i funghi, e delle regioni altamente variabili fra le differenti specie, come le regioni
ITS. Queste regioni variabili sono quindi sfruttabili per la classificazione filogenetica e dunque
anche per un’identificazione a livello di specie necessaria per la diagnostica.[1, 3, 9, 10, 11].
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3. I Funghi
Gli organismi che costituiscono il regno dei funghi sono organismi eucarioti, non fotosintetici,
aerobi o anaerobi, pluricellulari o unicellulari. Possono presentarsi come lieviti, muffe o funghi
dimorfi, essere saprofiti, parassiti oppure vivere in simbiosi con l’organismo ospite. Sono provvisti
di una parete cellulare rigida, che può essere pluristratificata, composta da cellulosa, emicellulosa o
chitina e presentano un citoplasma spesso multinucleato.
I lieviti sono organismi unicellulari ovali di 3-5 µm di diametro; si riproducono principalmente per
gemmazione e possono formare delle pseudoife.
Le muffe sono funghi pluricellulari caratterizzati da un elemento di crescita tubulare ramificato
detto ifa. L’ifa può essere suddivisa da setti parietali o no: ifa settata o cenocitica. Dal suo sviluppo
per estensione apicale e laterale viene a formarsi il micelio (o tallo). Il micelio viene detto
vegetativo se aderisce e penetra nel terreno di coltura o nel tessuto ospite, riproduttivo o aereo se le
sue ife si proiettano sulla superficie del terreno e portano le cellule riproduttive o spore.
I fungi dimorfi sono definiti come miceti in grado di presentarsi sotto forma di lieviti o muffe al
variare delle condizioni ambientali [4, 12].
I funghi si riproducono in maniera asessuata o in maniera sessuata attraverso la produzione di spore.
I due tipi di riproduzione possono alternasi durante il ciclo vitale. A dipendenza dello stadio in qui
si trova l’organismo, se nella forma telomorfa (riproduzione sessuata) o nella forma anamorfa
(riproduzione asessuata) possono prende una diversa nomenclatura. La specie Aspergillus nidulans,
per esempio, nella sua forma telomorfa prende il nome di Emericella nidulans (vedi allegato 11.4).
Se alla forma anamorfa é stata attribuita la stessa forma telomorfa allora si parla si sinamorfismo
[13].
Per molte specie e sconosciuta la forma telomorfa, perché l’organismo non é in grado di riprodursi
sessualmente oppure perché non é stata ancora identificata. Questi fungi vengono classificati in un
gruppo tassonomico artificiale: i Deuteromiceti o funghi imperfetti. Oggigiorno però, mediante
l’impiego di analisi molecolari la maggior parte dei Deuteromiceti é assegnata alla divisione degli
Ascomiceti ed una piccola parte ai Basidiomiceti [5].
La produzione assesuata avviene per scissione, gemmazione o formazione di spore. Queste a loro
volta possono essere prodotte per frammentazione e distacco di una parte della ifa oppure per
sporulazione. Le spore possono essere di tipo diverso, fra le più frequenti troviamo le tallospore,
formate per trasformazione di elementi preesistenti del tallo, oppure le conidiospore, prodotte da ife
specializzate.
La riproduzione sessuata prevede invece la plasmogamia e la cariogamia. Nei zigomiceti due ife
riproduttive si uniscono formando una zigospora all’interno della quale si formerà lo zigote che in
seguito a meiosi verrà liberato ed inizierà la fase asessuata.
Nei ascomiceti gli organi riproduttivi si uniscono formando l’asco contenente le ascospore. Nei
Basidiomiceti il corpo fruttifero produce numerosi basidi ciascuno dei quali svilluppa 4 spore [14].
(vedi tavole 11.1)
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 6
4. La classificazione
La classificazione odierna prevede quattro divisioni del regno dei funghi: Ascomycota,
Basidiomycota, Chytridiomycota e Zygomycota [13].
Le diverse specie sono state raggruppate in base alle caratteristiche morfologiche del tallo e delle
strutture riproduttive. Dal 1970, per ovviare alle differenti classificazioni presenti in letteratura
dovute soprattutto alle nomenclature diverse attribuite alla stessa specie, si é cercato d’introdurre fra
i criteri che definiscono una specie l’analisi del DNA. Il regno dei funghi é comunque in continua
evoluzione con ca. 20 nuove specie all’anno [5, 9, 15].
Tabella 1. Divisione del regno dei funghi con alcune classi ed ordini di intersesse medico [13]
Ascomicota
Archiascomycetes Pneumocystidiales
Hemiascomycetes Saccharomycetales
Euascomycetes Chaetothyriales Clavicipitales Dothideales Eurotiales Hypocreales Leotiales Microascales Onygenales Ophiostomatales Pezizales Phyllachorales Pleosporales Sordariales
Basidiomycota
Hymenomycetes Agaricales Stereales Tremellales
Urediniomycetes Sporidiales
Ustilaginomycetes Microstomatales Tilletiales Ustilaginales
Zygomicota
Zygomycetes Entomophthorales Mortierellales Mucorales
Chytridiomycota
Gli Ascomiceti rappresentano il più grande gruppo tassonomico del regno dei funghi. Raggruppano
il 50% di tutte le specie fungine e aprossimativamente l’80% dei funghi patogeni. Sono
caratterizzati da una riproduzione asessuata mediante la formazione di conidiospore e da una
riproduzione sessuata mediante la formazione di aschi contenenti le ascospore.
I Basisiomiceti comprendono circa 23'000 specie sopratutto funghi a cappello mangerecci. Sono
caratterizzati dalla formazione di copri fruttiferi contenenti numerosi basidi ciascuno dei quali
sviluppa 4 spore durante la riproduzione sessuata.
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Fra i Zigomiceti, caratterizzati dalla formazione di zigospore, troviamo 1% di tutte le specie del
regno dei funghi, molti dei quali responsabili di infezioni cutanee e gastrointestinali nell’uomo.
In fine i Chitridiomiceti rappresentano i funghi meno sviluppati, caratterizzati sopratutto da una
struttura unicellulare e da una riproduzione asessuata mediante la formazione di zoospore [ 4, 9].
(vedi tavole 11.1)
5. Gli aspetti clinici
Su più di 10'000 specie descritte all’incirca 100 sono coinvolte in micosi umane o animali. Le
micosi possono essere superficiali se colpiscono solo i peli e gli strati più esterni dell’epidermide
senza provocare dunque una risposta immunitaria [13]. Vengono comunemente denominate con il
nome di tigna o piedra [4].
Le micosi cutanee coinvolgono invece l’epidermide, i capelli, le unghie e le mucose esterne come
per esempio quelle dei genitali [13]. Queste micosi sono causate sopratutto dai generi
Epidermophyton, Microsporum e Trichophyton [4].
Le micosi sottocutanee interessano cute, sottocute, muscoli e ossa. La malattia si sviluppa
lentamente e può impiegare anche degli anni dopo la penetrazione per raggiungere il tessuto sotto
cutaneo [4].
Ci sono in fine le micosi profonde o sistemiche che colpiscono gli organi interni ed i visceri. Sono
causate sopratutto da funghi dimorfi penetrati all’interno dell’organismo per inalazione delle spore,
in seguito ad operazioni chirurgiche, tramite l’utilizzo di cateteri, ecc.. L’infezione nasce con una
lesione polmonare che può diventare cronica ed entrare nel sistema sanguineo fino a raggiungere
altri organi [4, 13,].
Tabella 2. Alcuni miceti d’importanza medica [4]
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 8
Troviamo poi le infezioni causate da fungi opportunisti come per esempio l’aspergillosi causate
soprattutto dall’ Aspergillus fumigatus, un fungo presente ovunque in natura che penetra all’interno
dell’organismo mediante l’inalazione delle spore causando problemi allergici e broncopolmonari.
Un’altro esempio di infezioni da funghi opportunisti sono le candidosi, causate dalla Candidaalbicans comunemente presente nella flora normale delle nostre mucose che prende il sopravvento
quando questa viene alterata. Queste micosi colpiscono sopratutto i neonati, i pazienti
immunocompromessi in seguito a neoplasie, leucemie, chemioterapie, AIDS oppure pazienti in cure
intensive, gli ustionati ed inseguito all’utilizzo prolungato di antibiotici [3,10,13].
6. Le regioni ITS1 e ITS2
I ribosomi degli organismi eucariotici sono formati da due subunità strutturali, 60S e 40S, costituite
da frammenti di rRNA e proteine che prendono il nome dalla misura della loro velocità di
sedimentazione, in seguito a centrifugazione, definita in unità di Svedberg (S).
La subunità 60S presenta i frammenti di rRNA 28S, chiamato anche LSU (large subunit), 5,8S e 5S
e circa 50 proteine. La subunità 40S presenta un unico frammento di RNA 18S, chiamato anche
SSU (small subunit) e circa 33 proteine.
Al momento della traduzione del mRNA queste subunità si uniranno per formare i ribosomi 80S
[16].
Tabella 3. Struttura dei ribosomi procarioti ed eucarioti [16]
Subunità rRNA Proteine
50S 23S + 5S ~ 31 PROCARIOTI 70 S
30S 16S ~ 21
60S 28S + 5,8S + 5S ~ 50 EUCARIOTI 80 S
40S 18S ~ 33
I geni che codificano per i diversi frammenti di rRNA sono geni ripetuti, costituenti
dell’organizzatore nucleolare, NOR (Nucleolus organizer region). All’interno del cromosoma sono
raggruppati in unità strutturali separate da sequenze spaziatrici non codificanti, NTS
(nontranscribed spacer) o IGS (intergenic spacer).
Ogni unità strutturale é costituita da un spaziatore trascritto esterno, ETS (external transcribed
spacer), situato all’estremità 3’ del gene 18S, due spaziatori trascritti interni, ITS (internal
transcribed spacer), situati rispettivamente: l’ITS1 fra il gene 18S ed il gene 5,8S, l’ITS2 tra il gene
5,8S e l’estremità 3’ del gene 28S ed in fine il gene 5S separato dal gene 28S da una sequenza
spaziatrice non codificante.
I geni 18S, 5,8S e 28S verranno trascritti dalla DNA polimerasi I in un pre-rRNA 45S che in
seguito a maturazione tramite eliminazione delle sequenze spaziatrici ETS ed ITS formerà i
rispettivi frammenti di rRNA. Il gene 5S verrà transcritto dalla DNA polimerasi III nel suo
corrispettivo rRNA.[6, 9, 17]
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 9
Figura 2. Struttura dei geni ribosomali degli organismi eucarioti
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7. Materiali e metodi
7.1. Campioni
I diversi ceppi di fungi usati per questo lavoro provengono da una raccolta interna all’ICM
effettuata dal 1995 al 2005. La raccolta comprende ceppi ottenuti da campioni clinici, ceppi
provenienti da corsi di aggiornamento effettuati presso la BioMérieux e ceppi provenienti da
controlli di qualità della NEQAS (National External Quality assesment Service, Regno Unito), tutti
identificati morfologicamente all’interno dell’istituto.
I campioni sono conservati a temperatura ambiente in acqua sterile.
7.2. Coltura
I ceppi sono stati coltivati su piastre di Petri, contenenti 25 ml di agar Sabouraud Cloramfenicolo
(SAB CHL-D, bioMérieux, Svizzera), ed incubati a 37°C.
7.3. Estrazione
Per l’estrazione del DNA sono state testate due metodiche differenti previste per il mini kit DNeasy
Plant (Metodica 1) e per il kit QIAamp DNA extraction della QIAGEN (QIAGEN, Svizzera)
(Metodica 2). Le due metodiche presentano una versione modificata dei processi di lisi previsti per i
protocolli originali.
Metodica 1
Prelevare una piccola quantità di micelio (ca. 1 cm2) dal terreno di coltura e depositarla in una
provetta Eppendorf. Aggiungere ca. 1,5 ml di azoto liquido ed attendere per ca. 30 s fino a completa
evaporazione dell’azoto. Mediante l’utilizzo di un pestello, schiacciare il micelio congelato fino a
ridurlo in una polvere fine.
Aggiungere 400 µl di tampone AP1 e 4µl di RNase A (DNeasy Plant Mini kit, QIAGEN, Svizzera
(vedi anche reagenti seguenti)) e vortexare vigorosamente. Incubare il tutto per 10 min a 65°C
miscelando 2 o tre volte durante l’incubazione. Aggiungere 130 µl di tampone AP2 ed incubare per
altri 5 min al freddo, immergendo le provette Eppendorf in un contenitore con ghiaccio.
Centrifugare il lisato per 5 min a 20'000 x g e trasferire il sovranatante in una QIAshedder Mini spin
column (DNeasy Plant Mini kit, QIAGEN, Svizzera). Centrifugare per 2 min a 20'000 x g e
aggiungere 795 µl di tampone AP3/E.
Pipettare 650 µl della soluzione in una DNeasy Mini spin column (DNeasy Plant Mini kit,
QIAGEN, Svizzera) e centrifugare per 1 min a 6'000 x g. Ripetere il passaggio precedente con la
rimanente quantità di soluzione.
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 11
Posizionare la colonnina in un nuovo tubo di raccolta, aggiungere 500 µl di soluzione di lavaggio
AW e centrifugare per 1 min a 6'000 x g . Ripetere l’operazione e centrifugare 2 min a 20'000 x g.
Eluire il DNA con 200 µl di tampone AE.
Metodica 2
Prelevare una piccola quantità di micelio (ca. 1 cm2) dal terreno di coltura ed incubarla per
10 min a 98°C in 200 µl di soluzione di lisi contenente 5 µl di NaOH 1M, 20 µl SDS al 5%, e 175µl
H2O. Neutralizzare la soluzione con 200 µl di HCl 25 mM. Aggiungere 400 µl di tampone di lisi
AL (QIAamp DNA Mini Kit, QIAGEN, Svizzera (vedi anche reagenti seguenti)) ed incubare per
altri 10 min a 98°C [7]. Aggiungere 400 µl di etanolo al 100% e centrifugare per 5 sec a 20'000 x g.
Caricare 600 µl del supernatante su una colonnina DNA Mini spin (QIAamp DNA Mini Kit,
QIAGEN, Svizzera) e centrifugare per 1 min a 6'000 x g.
Posizionare la colonnina in un nuovo tubo di raccolta ed aggiungere 500µl di soluzione di lavaggio
AW1. Centrifugare per 1 min a 6'000 x g. Riposizionare la colonnina in un nuovo tubo di raccolta
ed aggiungere 500 µl di soluzione di lavaggio AW2 . Centrifugare per 3 min a 20'000 x g.
Effettuare un’ulteriore centrifugazione per 1 min a 20'000 x g per asciugare completamente la
membrana della colonnina. Eluire il DNA con 200 µl di tampone di eluizione AE.
7.4. PCR
La PCR prevede l’amplificazione della regione ITS che comprende i geni spaziatori non codificanti
ITS1 e ITS2 ed il gene 5,8S, mediante l’utilizzo del forward primer ITS1 ed il revers primer ITS4
(Microsynth, CH) [3].
ITS1: 5’- TCC GTA GGT GAA CCT GCG G -3’ 19 bp ITS4: 5’- TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC -3’ 20 bp
Il mix di reazione per un campione contiene 28,65 µl H2O molecular grade (FLUKA, Svizzera),
5 µl di tampone di reazione 10x, 3 µl MgCl2 25 mM, 1 µl dNTP mix 10 mM (dUTP, dATP, dGTP,
dCTP), 0,25 µl DNA Taq polimerasi (5U/µl) (HotStarTaq Master Mix Kit, QUIAGEN, Svizzera),
1µl ITS1, 1µl ITS4 10 µM (Microsynth, Svizzera), 0,1 µl UNG (1U/µl)(Uracil DNA Glicosilasi,
Roche, Svizzera) e 10 µl di DNA estratto.
La reazione d’amplificazione é stata eseguita con un termociclatore (Applied Biosystems 2700,
USA) e prevede un ciclo di prePCR di 5 min a 37°C, per l’attivazione dell’UNG e 15 min a 95°C
seguito da 40 cicli suddivisi in: 30 sec a 95 °C, 1 min a 55°C e 1 min a 72°C per l’estensione del
frammento. Si conclude con un’estensione finale 72°C per 1 min.
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7.5. Seminested PCR
Per i campioni per i quali la PCR ha fornito scarse quantità di amplificato é stata eseguita una
reazione di seminested PCR mediante l’utilizzo del forward primer ITS86 ed il reverse primer ITS4
[18].
ITS86: 5’- GTG AAT CAT CGA ATC TTT GAA C -3’ 22 bp ITS4: 5’- TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC -3’ 20 bp
Il mix di reazione per un campione contiene 37, 75 µl H2O molecolar grade (FLUKA, Svizzera), 5
µl di tampone di reazione 10x, 3 µl MgCl2 25 mM, 1 µl dNTP mix 10 mM (dUTP, dATP, dGTP,
dCTP), 0,25 µl DNA Taq polimerasi (5U/µl) (HotStarTaq Master Mix Kit, QUIAGEN, Svizzera),
1µl ITS86, 1µl ITS4 10µM (Microsynth, Svizzera) e 1 µl di DNA amplificato.
I diversi passaggi della reazione d’amplificazione corrispondono a quelli visti per la PCR (vedi
paragrafo precedente).
7.6. Controlli
Per il controllo delle reazioni d’amplificazione sono stati usati 3 controlli positivi. Il BRF 15
Trichophyton rubrum, isolato da un campione clinico di pelle. Il BRF 24 Candida glabrata, isolato
da un espettorato e il BRF 32 Cladosporium sp. isolato da un campione clinico proveniente da
un’infezione batterica. La grandezza del loro prodotto di amplificazione con i primer ITS1 e ITS4
corrisponde rispettivamente a : Candida glabrata 820 bp, Cladosporium sp. 549 bp, Trichophytonrubrum 692 bp [6, 7].
Figura 3. Migrazione elettroforetica in
gel d’agarosio 1,5% dei controlli positivi.
1) DNA Molecular Weight Marker XIV
100 bp (Roche, Svizzera), 2) Controllo
negativo, 3) campione 135, 4) 46, 5) 27,
6) 79a, 7) 79b, 8) BFR 32 Cladosporium sp. 549 bp, 9) BFR 15 Trichophyton rubrum 692 bp, 10) BFR 24 Candida glabrata 820 bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
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7.7. Elettroforesi
I prodotti ottenuti dopo amplificazione sono stati fatti migrare mediante elettroforesi su gel di
agarosio al 1,5% in tampone TBE 1x a 10Volt/cm2
per circa 30 min. Per ogni campione sono stati
depositati 10µl dell’amplificato. Dopo elettroforesi il gel é stato immerso per circa 10 min in una
soluzione di bromuro di etidio (0,5-1.0 µg/ml), lavato in acqua e depositato in un transilluminatore
UV per la messa in evidenza dei frammenti di DNA.
7.8. Purificazione dei prodotti PCR
I campioni amplificati sono stati purificati mediante l’utilizzo di colonnine Montage PCR (Milliore,
Svizzera) sulle quali sono stati depositati 40 µl di amplificato. Dopo centrifugazione per 5 min a
1'020 x g, il DNA é stato eluato con 20 µl di tampone di eluizione AE (QIAamp DNA Mini Kit,
QIAGEN, Svizzera) e con sucessiva centrifugazione di 2 min a 1'020 x g.
7.9. Reazione di sequenza
Per ogni amplificato purificato sono state effettuate due reazione di sequenza usando separatamente
il primer ITS1 o il primer ITS86, per i campioni amplificati con la seminested PCR, e il primer
ITS4.
Il mix di reazione di sequenza contiene 2 µl di BigDye Reaction Mix, 3µl di tampone 5x Buffer
BigDye (ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing kit, Applied Biosystems, USA), 4µl di
H2O molecolar grade (FLUKA, Svizzera), 3µl di un primer 1µM(ITS1, ITS86 o ITS4) (Microsynth,
Svizzera) per mix di reazione e 3 µl di DNA purificato.
La reazione di sequenza é stata eseguita con un termociclatore (Applied Biosystems 2700, USA) e
prevede 25 cicli suddivisi in: 10 sec a 96 °C per la denaturazione del DNA, 5 sec a 50°C per
l’ibridazione del primer e 4 min a 60°C per l’estensione del frammento.
7.10. Purificazione dei prodotti della reazione di sequenza
I prodotti ottenuti dalla reazione di sequenza sono stati purificati mediante l’utilizzo di mini colonne
di Sephadex G50 (Sephadex G50 fine, Amersham Bioscences) ottenute mediante centrifugazione di
900µl della soluzione di Sephadex per 3 min a 770 x g. Sulle colonnine sono stati caricati e
centrifugati, per 3 min a 770 x g, i 15µl del prodotto della reazione di sequenza.
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 14
7.11. Determinazione automatica della sequenza nucleotidica
I prodotti purificati della reazione di sequenza sono stati sequenziati mediante l’utilizzo del
sequenziatore automatico ABI Prism 310 (Applied Biosystems, USA). Sul sequenziatore sono stati
caricati 5 µl di prodotto della reazione di sequenza e 15 µl di H2O molecular grade (FLUKA,
Svizzera).
7.12. Analisi delle sequenze
Le sequenze ottenute sono state corrette manualmente mediante la lettura dell’ettroferogramma e
mediante l’allineamento dei frammenti ottenuti con il forwar primer ed il revese primer.
L’allineamento delle sequenze é stato effettuato con il programma MEGA 3.0 (Molecular Evolution
Genetics Analysis).
Le sequenze consenso sono state confrontate con le sequenze presenti nella GenBank usando il
BLAST (Basic Local Alignement Search Tool) della NCBI (National Center for Biotecnology
Information, USA) per l’identificazione del frammento.
L’identificazione é stata fatta in base alla maggior percentuale di omologia della sequenza
analizzata rispetto alle sequenze presenti nella banca dati.
Le sequenze presenti nella GenBank con maggior omologia sono state prese come sequenze di
riferimento e sono state introdotte nel programma d’analisi MEGA 3.0. Queste sequenze sono state
in seguito utilizzate come riferimento per il taglio del frammento nella regione esatta ITS1 ed ITS2.
7.13. Costruzione dell’albero filogenetico
Le sequenze ottenute e le sequenze di riferimento prese dalla GenBank (NBCI) sono state allineate
mediante l’uso del programma MEGA 3.0. La costruzione dell’albero, che rappresenta le relazioni
esistenti tra le sequenze, é stata fatta in base al numero di differenze di nucleotidi utilizzando il
metodo matematico UPGMA (Unweighted pair group method using aricmetic averages).
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 15
8. Risultati
8.1. Confronto fra Metodica 1 e Metodica 2 per l’estrazione del DNA
L’ottenimento del DNA da amplificare inizia con la lisi cellulare, ma la struttura della parete
cellulare dei funghi composta da chitina, glucani, lipidi e peptidi presenti in forma variabile da
specie a specie, influisce con le diverse metodiche di estrazione che siano enzimatiche, chimiche o
fisiche. Trovare un metodo che sia adatto per tutte le diverse especie risulta dunque molto difficile
[5].
Per questo lavoro sono state testate due metodiche che si basano su due processi di lisi diversi. La
Metodica 1 prevede una lisi cellulare mediante reazione meccanica, chimica e termica, mentre la
Metodica 2 si basa su reazioni chimiche e termiche.
L’efficienza dell’estrazione del DNA delle due metodiche è stata verificata mediante l’utilizzo della
PCR con i primers ITS1 e ITS4 effettuata su 8 campioni appartenenti a 8 specie diverse aventi lo
stesso volume di eluizione pari a 200 µl di tampone AE (QIAamp DNA Mini Kit, DNeasy Plant
Mini Kit, QIAGEN, Svizzera).
Si è ottenuta un’amplificazione di 7/8 campioni con la Metodica 1 e di 8/8 campioni con la
Metodica 2.
Tabella 4. Campioni usati per il confronto delle 2 metodiche di estrazione
L’analisi dei diversi amplificati migrati mediante elettroforesi su gel di agarosio al 1,5% ed
evidenziati con bromuro di etidio non mostra differenze significative delle diverse bande di
migrazione.
I tempi di esecuzione per ambedue le metodiche si aggirano attorno ai 30 min ca..
Estrazione DNA SpecieIdentificazione fenotipica
Ceppo No. Micoteca Metodica 1 Metodica 2
Aspergillus candidus M6558/03 90 + +
Aspergillus flavus Neqas 6657/M19635 94 + +
Aspergillus fumigatus - 56 + +
Aspergillus nidulans R10937/03 91 + +
Aspergillus japonicus M9618/CQ015888 62 + +
Aspergillus ochraceus M45878/02 82 + +
Aspergillus versicolor Neqas 6406/M35301 83 + +
Malbranche sp. M42299 N.P. - +
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 16
Figura 4.Migrazione elettroforetica in gel d’agarosio 1,5% dei campioni estratti con la Metodica 1 (versione
modificata DNeasy Plant Mini Kit, QIAGEN, Svizzera) evidenziati con il bromuro d’etidio. 1) DNA
Molecular Weight Marker XIV 100 bp (Roche, Svizzera), 2) Controllo negativo, 3) campione 56, 4) 91, 5)
82, 6) 94, 7) 83, 8) 62, 9) M42299, 10) 90
Figura 5 Figura 6.Migrazione elettroforetica in gel d’agarosio 1,5% dei campioni estratti con la Metodica 2
(versione modificata QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN, Svizzera) evidenziati con il bromuro d’etidio.
1) DNA Molecular Weight Marker XIV 100 bp (Roche, Svizzera), 2) Controllo negativo, 3) campione 56, 4)
90, 5) M42299, 6) 94, 7) 62, 8) 83, 9) 82, 10) 91
Per lo svolgimento del lavoro si è così scelto l’utilizzo della Metodica 2, non solo per il maggior
numero di risultati positivi ma anche perché si presenta manualmente più facile da eseguire. Infatti,
questa metodica presenta un minor numero di passaggi riducendo dunque i rischi di contaminazione
e soprattutto non prevede l’utilizzo dell’azoto liquido; sostanza non facilmente maneggiabile.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 17
8.2. Coltivazione su piastra
Sono stati coltivati su piastra agar Sabouraud Cloramfenicolo a 37°C, 86 ceppi appartenenti a 49
specie diverse (vedi allegato 11.2) selezionati dalla micoteca in modo casuale. Si è riscontrata una
crescita per 77/86 campioni .
Tabella 5. Campioni non cresciuti
SpecieIdentificazione fenotipica
Ceppo No. Micoteca
Absidia corymbifera Neqas 5891/M9621 64
Acremonium sp. Neqas 6210/M7440 75
Alternaria alterneta Neqas 6325/M19931 78
Alterneria alternata CQ12.96 35
Aspergillus terreus CQ99/M14318 54
Aureobasidium sp. - 57
Cunninghamella berthalletiae CQ99/M28018 53
Geotrichum candidum ID ZH/95 1
Mucor sp. 48
8.3. Estrazione e amplificazione
Sono state eseguite 143 estrazioni, utilizzando la Metodica 2, per i 77 ceppi con un’amplificazione
positiva della regione ITS1-5,8S-ITS2 per 66/77 campioni.
Per i campioni Aspergillus glaucus 58, Aspergillus clavatus 109 e Trichophyton tonsurans 3, è stata
eseguita una seconda amplificazione di PCR seminested poiché la prima amplificazione a fornito
scarse quantità di amplificato.
Tabella 5 Estrazioni DNA non riuscite
SpecieIdentificazione fenotipica Ceppo No. Micoteca
Caldosporium cladosporioides M29240 71
Cladosporium sp. M753/97 41
Cladosporium sphaerospermum Neqas 7355/M5569 140
Cunninghamella bertholletiae Neqas 6659/M19638 96
Fusarium oxysporum R36234 119
Fusarium solani M35303/02 79
Hormographiella aspergillata R8459 139
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 18
Tabella 5. (Continuazione)
SpecieIdentificazione fenotipica Ceppo No. Micoteca
Malbranchea sp. Tbc22067 113
Microsporum persicolor corso 2004 BioMérieux 135
Monascus ruber CQ99 2
Trichoderma sp. M948 27
8.4. Sequenze
Sono state ottenute 56/66 sequenze della regione ITS1-5.8S-ITS2 di 56 ceppi differenti appartenenti
a 36 specie diverse (vedi allegato 11.2.) mediante l’amplificazione con i primer ITS1 e ITS4. Le
sequenze corrette (vedi.) presentano una lunghezza variabile fra 286-810 bp e un omologia
compresa fra il 90-100 % con le sequenze di riferimento prelevate dalla GenBank (NCBI).
Come sequenze di riferimento sono state prese dalla GenBank (NCBI) 80 sequenze che
presentavano la maggior percentuale di omologia per le rispettive sequenze analizzate. Queste
sequenze provengono dall’analisi di ceppi certificati e ceppi ottenuti da altri istituti di ricerca.
(vedi allegato 11.3)
Le sequenze dei campioni Aspergillus glaucus 58, Aspergillus clavatus 109 e Trichophytontonsurans 3, ottenute con la seminested PCR sono state escluse dal lavoro poiché non coprivano
l’intero gene.
8.5. Confronto fra identificazione morfologica e identificazione mediante l’analisi delle sequenze
Fra i campioni per i quali si é ottenuta la sequenza del frammento ITS1-5.8S-ITS2, l’identificazione
morfologica forniva un’identificazione a livello di specie per 44/56 ceppi. I restanti 12 ceppi erano
identificati a livello di specie.
L’identificazione mediante l’analisi delle sequenze ha fornito invece un’identificazione a livello di
specie per 36/56 ceppi, di genere 19/56 e di ordine 1/56.
Tabella 6. Confronto fra identificazione morfologica e genotipica
Identificazione morfologica Analisi della sequenza
Specie 78,6% (44/56) 64,3% (36/56)
Genere 21,4% (12/56) 33,9% (19/56)
Ordine - 1,8% (1/56)
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 19
Messe a confronto, le due tecniche presentano un’identificazione identica per 32/56 campioni di qui
25 campioni identificati a livello di specie e 7 a livello di genere con un’omologia con le sequenze
di riferimento che varia dal 90-100%.
Si può notare come per tre ceppi differenti di Aspergillus flavus la sequenza risulta identica alla
sequenza della specie Aspergillus oryzae.Il campione No. 98 Absidia corymbifera presenta un’omologia al 100% con l’Absidia corymbifera ATCC 46774. La sequenza di riferimento però, copre solamente la regione 5.8S-ITS2.
L’identificazione fenotipica a livello di specie risulta più discriminante per 12/56 campioni, mentre
a livello di genere per 1/56 campioni.
Al contrario l’identificazione a livello di specie effettuata mediante l’analisi delle sequenze risulta
più discriminante per 4/56 campioni le qui percentuali di omologia variano fra il 92-100%.
Infine per 7/56 campioni otteniamo delle identificazioni contrastanti. Di questi, 6 campioni sono
comunque classificati correttamente a livello di genere.
Dunque possiamo dire che l’identificazione mediante l’analisi delle sequenze fornisce
un’identificazione identica a l’identificazione fenotipica a livello di genere per 55/56 campioni.
Tabella 7. Confronto fra identificazione fenotipica ed identificazione mediante l’analisi delle sequenze a livello di
genere e specie
No. campioni Percentuale
Identificazione fenotipica a livello di genere identica
all’identificazione mediante sequenza
55/56 98,2%
Identificazione fenotipica a livello di specie identica
all’identificazione mediante sequenza
25/56 44,6%
Identificazione fenotipica a livello di specie più
discriminante
12/56 21,4%
Identificazione mediante sequenza a livello di specie
più discriminante
4/56 7,14%
Risultati discrepanti fra fenotipo e sequenza a livello
di specie
7/56 12,5%
8.6. Albero filogenetico
L’albero filogenetico é stato creato mediante il programma MEGA 3.0 introducendo 80 sequenze di
riferimento provenienti dalla GenBank (NCBI) e le 56 sequenze ottenute appartenenti a 36 specie
diverse. L’albero mostra un buon raggruppamento degli ordini e delle famiglie salvo per il
campione 55 Paecilomices lilacinus, appartenente all’ordine delle Eurotiales, e il campione 99
Geotricum candidum, appartenente appartenente all’ordine dei Saccharomycetales, i quali si
trovano raggruppati all’interno dell’ordine delle Hypocreales. (vedi allegato 11.5)
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 20
Tabella 8. Tabelle risultati
A. Identificazione fenotipica a livello di specie identica all’identificazione mediante sequenza della regione ITS1-5.8S-ITS2
No. MicotecaICM Ceppo
SpecieIdentificazione fenotipica
SpecieIdentificazione ITS
Percentuale di omologia con sequenze depositate nella GenBank (NCBI)
No. GenBank (NCBI)
98 Neqas 6758/M34707 Absidia corymbifera Absidia corymbifera 100% di omologia con Absidia corymbifera ATCC 46774 AF117937
90 M6558/03 Aspergillus candidus Aspergillus candidus 100% di omologia con Aspergillus candidus ATCC 1002 AY373842
18 DSM 816/95 Aspergillus clavatus Aspergillus clavatus 100% di omologia con Aspergillus clavatus ATCC 58869 AY373847
102 - Aspergillus clavatus Aspergillus clavatus 100% di omologia con Aspergillus clavatus ATCC 58869 AY373847
5 - Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus 100% di omologia con Aspergillus fumigatus ATCC 9197 AY939790
10 - Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus 100% di omologia con Aspergillus fumigatus ATCC 9197 AY939790
15 CQ99 Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus 100% di omologia con Aspergillus fumigatus ATCC 9197 AY939790
23 - Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus 100% di omologia con Aspergillus fumigatus ATCC 9197 AY939790
56 - Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus 100% di omologia con Aspergillus fumigatus ATCC 9197 AY939790
62 M9618/CQ015888 Aspergillus japonicus Aspergillus japonicus 100% di omologia con Aspergillus japonicus CBS 61178 AY585562
100% di omologia con Aspergillus aculeatus CBS 17266 AY585558
32 R5340 esp 96 Aspergillus niger Aspergillus niger 100% di omologia con Aspergillus niger ATCC 16888 AY373852
37 CQ97/M89 Aspergillus terreus Aspergillus terreus 100% di omologia con Aspergillus terreus ATCC 1012 AY373871
83 Neqas 6406/M35301 Aspergillus versicolor Aspergillus versicolor 100% di omologia con Aspergillus versicolor 2014 AM158229
99% di omologia con Aspergillus versicolor ATCC 9577 AY373880
138 Corso BioMérieux Epidermophyton floccosum Epidermophyton floccosum 100% di omologia con Epidermophyton floccosum ATCC 26072 AY213646
99 Neqas 6759/M34711 Geotrichum candidum Galactomyces geotrichum 99% di omologia con Galactomyces geotrichum YF01C DQ668351
76 M19220/02 Microsporum canis Microsporum canis 100% di omologia con Microsporum canis ATCC 23828 AY213657
100% di omologia con Microsporum distortum CBS 190.57 AJ252329
111 M21559 Microsporum canis Microsporum canis 100% di omologia con Microsporum canis ATCC 23828 AY213657
100% di omologia con Microsporum distortum CBS 190.57 AJ252329
11 VA2397/97 Microsporum gypseum Arthroderma gypseum 100% di omologia con Arthroderma gypseum CBS 258.61 AJ970141
117 M35037 Microsporum gypseum Arthroderma gypseum 99% di omologia con Arthroderma gypseum CBS 161.69 AJ000621
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 21
A. (continuazione)
No. Micoteca ICM Ceppo
SpecieIdentificazione fenotipica
SpecieIdentificazione ITS
Percentuale di omologia con sequenze depositate nella GenBank (NCBI)
No. GenBank (NCBI)
136 Corso BioMérieux Microsporum gypseum Arthroderma gypseum 100% di omologia con Arthroderma gypseum CBS 258.61 AJ970141
137 Corso BioMérieux Microsporum praecox Microsporum praecox 100% di omologia con Microsporum praecox CBS 468.74 AJ970148
55 CQ00/17436 Paecilomyces lilacinus Paecilomyces lilacinus 100% di omologia con Paecilomyces lilacinus ATCC 10114 AY213665
61 Neqas 5775/M38017 Paecilomyces variotii Paecilomyces variotii 99% di omologia con Paecilomyces variotii NRRL 1115 AF033395
Paecilomyces variotii 97% di omologia con Paecilomyces variotii ATCC 22319 AY373941
149 Neqas 7640/M36113 Paecilomyces variotii Paecilomyces variotii 99% di omologia con Paecylomices variotii NRRL 1115 AF033395
97% di omologia con Paecylomices variotii ATCC 22319 AY373941
N.P.1 VA460449 Schizophyllum comune Schizophyllum commune 100% di omologia con Schizophyllum commune HNO34 AF280758
1 N.P., campione non presente nella micoteca
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 22
B. Identificazione fenotipica a livello di genere identica all’identificazione mediante sequenza della regione ITS1-5.8S-ITS2
No. MicotecaICM Ceppo
SpecieIdentificazione fenotipica
SpecieIdentificazione ITS
Percentuale di omologia con sequenze depositate nella GenBank (NCBI)
No. GenBank (NCBI)
51 - Acremonium sp. Acremonium sp. 100% di omologia con Acremonium sp. KMU 4529 AB158290
100% di omologia con Acremonium strictum UW 836 AY138844
116 M25474 Acremonium sp. Hypocreales sp. 97% di omologia con Hypocreales sp. LM92 EF060464
68 Neqas 6019/M22420 Exophiala sp. Exophiala sp. 90% di omologia con Exophiala sp. CBS 115831 AY857539
90% di omologia con Exophiala xenobiotica CBS 117674 DQ182589
24 - Fusarium sp. Fusarium sp. 100% di omologia con Fusarium oxysporum Ppf15 EF495237
100% di omologia con Fusarium sp. 448 AY729069
100% di omologia con Fusarium subglutinans CNFM 960512 AY898246
72 M4938 Penicillium sp. Penicillium sp. 100% di omologia con Penicillium chrysogenum EPA 467 AY373903
100% di omologia con Penicillium commune wb153 AF455544
100% di omologia con Penicillium sp. PC6 EF105368
93 R13266/03 Penicillium sp. Penicillium sp. 100% di omologia con Penicillium citrinum WM 05.3 DQ249207
100% di omologia con Penicillium westlingii NRRL 800 AF033423
105 R5798 Trichoderma sp. Trichoderma sp. 100% di omologia con Hypocrea jecorina ATCC 24449 DQ000625
100% di omologia con Hypocrea schweinitzii ICMP 5426 X93966
100% di omologia con Trichoderma longibrachiatum ATCC52326 Z48935
147 M39284/05 Trichoderma sp. Trichoderma sp. 100% di omologia con Hypocrea koningii GJS 95-175 AF456923
100% di omologia con Hypocrea rufa GJS 96-47 AJ230685
100% di omologia con Trichoderma koningiopsis Dis326h DQ379015
100% di omologia con Trichoderma ovalisporum Dis 203c DQ315458
100% di omologia con Trichoderma sp. YM2 AB297794
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 23
C. Identificazione fenotipica a livello di specie più discriminante dell’identificazione mediante sequenza della regione ITS1-5.8S-ITS2
No. MicotecaICM Ceppo
SpecieIdentificazione fenotipica
SpecieIdentificazione ITS
Percentuale di omologia con sequenze depositate nella GenBank (NCBI)
No. GenBank(NCBI)
50 CQ98/9792 Aspergillus flavus Aspergillus sp. 100% di omologia con Aspergillus flavus ATCC 20043 AY939782
100% di omologia con Aspergillus oryzae SRRC 2103 AY373857
94 Neqas 6657/M19635 Aspergillus flavus Aspergillus sp. 100% di omologia con Aspergillus flavus ATCC 20043 AY939782
100% di omologia con Aspergillus oryzae SRRC 2103 AY373857
N.P. CQR5708 Aspergillus flavus Aspergillus sp. 100% di omologia con Aspergillus flavus ATCC 20043 AY939782
100% di omologia con Aspergillus oryzae SRRC 2103 AY373857
91 R10937/03 Aspergillus nidulans Aspergillus sp. 100% di omologia con Emericella nidulans NRRL 2395 AY373888
100% di omologia con Emericella dentata IFM 42021 AB249000
100% di omologia con Emericella quadrilineata UWFP 613 AY213644
100% di omologia con Emericella cleistominuta IFM 48170 AB248989
100% di omologia con Emericella rugulosa IFM 54242 AB249002
82 M45878/02 Aspergillus ochraceus Aspergillus sp. 99% di omologia con Aspergillus ochraceus ATCC 18412 AY373854
99% di omologia con Aspergillus westerdijkiae NRRL 35197 DQ250530
25 M1023/95 Aspergillus versicolor Aspergillus sp. 100% di omologia con Aspergillus versicolor NHRC-FE078 AJ937755
100% di omologia con Emericella nidulans 2172 AM158232
90% di omologia con Exophiala xenobiotica CBS 117674 DQ182589
86 M4859/03 Fusarium oxysporum Fusarium sp. 99% di omologia con Fusarium oxysporum 10L-201-Mexico AY904065
99% di omologia con Fusarium bulbicola NRRL 13618 U61676
99% di omologia con Gibberella sacchari wb 395 AF455450
99% di omologia con Fusarium lactis NRRL 25200 U61681
99% di omologia con Gibberella moniliformis FV 4773 AY428795
34 CQ12.96 Fusarium solanii Fusarium sp. 100% di omologia con Fusarium oxysporum FO-05 AY928412
100% di omologia con Fusarium solani WB 853 AY569560
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 24
C. ( Continuazione)
No. MicotecaICM Ceppo
SpecieIdentificazione fenotipica
SpecieIdentificazione ITS
Percentuale di omologia con sequenze depositate nella GenBank (NCBI)
No. GenBank(NCBI)
133 Corso BioMérieux Microsporum audouinii Microsporum sp. 99% di omologia con Microsporum audouinii CBS 344.50 AJ252333
100% di omologia con Microsporum rivalieri CBS 409.51 AJ000625
100% di omologia con Microsporum langeronii CBS 408.51 AJ252334
134 Corso BioMérieux Microsporum canis Microsporum sp. 99% di omologia con Microsporum canis ATCC 23828 AY213657
99% di omologia con Microsporum distortum CBS 190.57 AJ252329
99% di omologia con Microsporum ferrugineum CBS 426.63 AJ252338
143 Neqas 7432/M14243 Penicillium Chrysogenum Penicillium sp. 100% di omologia con Penicillium chrysogenum EPA 467 AY373903
100% di omologia con Penicillium commune wb153 AF455544
100% di omologia con Penicillium sp. PC6 EF105368
81 CQ5/02/M19992 Rhizopus oryzae Rhizopus sp. 100% di omologia con Rhizopus oryzae CBS 395.95 AY213684
100% di omologia con Rhizopus japonicus AHU6525 AB097347
100% di omologia con Rhizopus microsporus AHU6527 AB097348
100% di omologia con Amylomyces rouxii SDM34 AB181338
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 25
D. Identificazione a livello di specie mediante sequenza della regione ITS1-5.8S-ITS2 più discriminante dell’identificazione fenotipica
No. MicotecaICM Ceppo
SpecieIdentificazione fenotipica
SpecieIdentificazione ITS
Percentuale di omologia con sequenze depositate nella GenBank (NCBI)
No. GenBank(NCBI)
110 M21439 Chaetomium sp. Chaetomium funicola 92% di omologia con Chaetomium funicola CBS 141.50 AJ279450
20 M1292/97 Chrysosporium sp. Chrysosporium keratinophilum 100% di omologia con Chrysosporium keratinophilum IFO 7584 AJ131681
46 M19793/98 Penicillium sp. Penicillium nalgiovense 100% di omologia con Penicillium nalgiovense IBT 12108 AJ004895
N. P. M42299 Malbranchea sp. Auxarthron conjugatum 97% di omologia con Auxarthron conjugatum GFI 149 AJ608967
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 26
E. Risultati discrepanti fra identificazione fenotipica e identificazione mediante sequenza della regione ITS1-5.8S-ITS2 a livello di specie
No. MicotecaICM Ceppo
SpecieIdentificazione fenotipica
SpecieIdentificazione ITS
Percentuale di omologia con sequenze depositate nella GenBank (NCBI)
No. GenBank(NCBI)
13 M430/95 Aspergillus candidus Aspergillus fumigatus 100% di omologia con Aspergillus fumigatus ATCC 9197 AY939790
69 Neqas 6020/M22415 Aspergillus nidulans Emericella corrugata 100% di omologia con Emericella corrugata IFM 54743 AB264794
21 M41912/01 Chrysosporium keratinophilum Aphanoascus reticulisporus 100% di omologia con Aphanoascus reticulisporus AJ390381
Chrysosporium articulatum 100% di omologia con Chrysosporium articulatum UAMH 4320 AJ007841
95 Neqas 6658/M19637 Chrysosporium keratinophilum Aphanoascus fulvescens 100% di omologia con Aphanoascus fulvescens UAMH 5117 AF038357
40 M742/97 Curvularia lunata Curvularia trifolii 100% di omologia con Curvularia trifolii wb 403 AF455446
38 M1609/96 Exophiala spinifera Exophiala jeanselmei 100% di omologia con Exophiala jeanselmei CBS 463.80 AY163552
Exophiala oligosperma 100% di omologia con Exophiala oligosperma IP 2118.92 DQ836797
100 Neqas6760/M34712 Paecilomyces lilacinus Curvularia trifolii 100% di omologia con Curvularia trifolii wb 403 AF455446
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 27
9. Discussione
L’identificazione della specie nella diagnostica delle micosi gioca un ruolo fondamentale per lo
svolgimento del trattamento medico. Un’identificazione basata sulla morfologia delle ife o delle
spore non é purtroppo sempre facile da eseguire poiché specie molto vicine filogeneticamente
possono presentare tratti fenotipici uguali o difficilmente differenziabili.
Oltre alle difficoltà di identificazione morfologica dobbiamo prendere in considerazione i tempi che
la crescita su piastra prevede: tempi troppo lunghi per un tipo di diagnostica che vuole risultati
precisi in tempi sempre più brevi.
In questo lavoro si é voluto così testare una tecnica alternativa, che fosse più specifica rispetto alla
morfologia nella determinazione della specie, e che in un futuro potesse essere applicata ad una
determinazione direttamente dal campione.
Si é deciso quindi, di effettuare l’identificazione dei diversi funghi mediante analisi delle sequenze
dei geni ITS1-5.8S-ITS2.
Le sequenze di 56 ceppi appartenenti a 36 specie diverse ottenute tramite amplificazione del DNA
ribosomale, mediante l’impiego di primers specifici per i funghi, sono state confrontate con le
sequenze presenti nella GenBank (NCBI) ed i risultati ottenuti sono stati messi a confronto con
l’identificazione fornita dalla morfologia.
I risultati ottenuti mostrano un’alta specificità di questa tecnica nell’identificazione esatta a livello
di genere con un’identificazione corrispondente all’identificazione morfologica di 55/56 (98,2%)
ceppi.
A livello di specie purtroppo si é riscontrato che l’identificazione morfologia riesce ad essere più
discriminante con un’identificazione di specie di 44/56 ceppi (78,6%) rispetto all’identificazione
mediante l’analisi delle sequenze che posiziona a livello di specie 36/56 (64,3%) ceppi fra i quali
solamente 25 con un’identificazione identica all’identificazione fenotipica.
Da notare che per 4 campioni dove la morfologia forniva solo la classificazione a livello di genere
l’identificazione mediante la sequenza é risultata più discriminante.
Si può dunque concludere che l’identificazione dei diversi funghi mediante l’analisi dei geni ITS1-
5,8S-ITS2 non può sostituire un’identificazione morfologica bensì essere un appoggio in caso di
difficoltà nell’identificazione fenotipica.
Altre prospettive di analisi potrebbero contemplare invece l’utilizzo dell’amplificazione della
regione ITS accompagnata dall’amplificazione di un’altro gene ribosomiale come potrebbe essere il
28S o il 18S. Oppure ancora si potrebbe cercare di classificare le diverse specie mediante l’utilizzo
di geni codificanti per alcune proteine come l’actina, la chitina sintetasi, l’acetil coenzima sintetasi e
sopratutto l’Ŭ-tubulina e la ɓ-tubulina, due geni che si presentano altamente variabili fra le diverse
specie [9,19].
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 28
10. Bibliografia
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Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 29
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Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 30
11. Allegati
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 31
11.1. Tavole illustrate delle caratteristiche morfologiche degli Ascomiceti,Zigomiceti e Basidiomiceti
Tavola 1. Ascomiceti
J. Guarro, J. Gené, A. M. Stchigel; Developments in Fungal Taxonomy; Clinical Microbiology
Reviews, July, 454-500, 1999.
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 32
Tavola 2. Zigomiceti
J. Guarro, J. Gené, A. M. Stchigel; Developments in Fungal Taxonomy; Clinical Microbiology
Reviews, July, 454-500, 1999.
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 33
Tavola 3. Basidiomiceti
J. Guarro, J. Gené, A. M. Stchigel; Developments in Fungal Taxonomy; Clinical Microbiology
Reviews, July, 454-500, 1999.
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 34
11.2. Lista dei campioni
Specie Ceppo No. Micoteca No. Sequenza
Sequenza ITS1-5.8S-ITS2 Lunghezza frammento bp
Absidia corymbifera Neqas1 5891/M9621 64 -
Absidia corymbifera R12109/01 66 -
Absidia corymbifera Neqas 6758/M34707 98 810
Acremonium sp. CQ97/M89 39 -
Acremonium sp. M18768/98 45 -
Acremonium sp. - 51 492
Acremonium sp. Neqas 6210/M7440 75 -
Acremonium sp. M25474 116 488
Alternaria alterneta Neqas 6325/M19931 78 -
Alterneria alternata CQ12.96 35 -
Aphanoascus fulvescens M732/ZH96 31 -
Arthrinium phaeospermium M29513/05 146 -
Aspergillus candidus M430/95 13 512
Aspergillus candidus M6558/03 90 508
Aspergillus clavatus DSM 816/95 18 515
Aspergillus clavatus - 102 515
Aspergillus clavatus Neqas 7021/M19740 109 -
Aspergillus flavus CQR5708 N.P.2 / CQR5708 510
Aspergillus flavus CQ98/9792 50 510
Aspergillus flavus Neqas 6657/M19635 94 510
Aspergillus fumigatus - 5 512
Aspergillus fumigatus - 10 512
Aspergillus fumigatus CQ99 15 512
Aspergillus fumigatus - 23 512
Aspergillus fumigatus - 56 512
Aspergillus glaucus CQ00/M19448 58 -
Aspergillus japonicus M9618/CQ015888 62 490
Aspergillus nidulans Neqas 6020/M22415 69 481
Aspergillus nidulans R10937/03 91 481
Aspergillus niger R5340 esp 96 32 514
Aspergillus ochraceus M45878/02 82 504
Aspergillus terreus CQ97/M89 37 523
Aspergillus terreus CQ99/M14318 54 -
Aspergillus versicolor M1023/95 25 482
Aspergillus versicolor Neqas 6406/M35301 83 471
Aureobasidium sp. - 57 -
Bipolaris sp. M26530 115 -
Caldosporium cladosporioides M29240 71 -
Chaetamium sp. M21439 110 488
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 35
Specie Ceppo No. Micoteca No. Sequenza
Sequenza ITS1-5.8S-ITS2 Lunghezza frammento bp
Chrysosporium keratinophilum M41912/01 21 515
Chrysosporium keratinophilum Neqas 6658/M19637 95 516
Chrysosporium sp. M1292/97 20 520
Cladosporium sp. M753/97 41 -
Cladosporium sphaerospermum Neqas 7355/M5569 140 -
Cunninghamella berthalletiae CQ99/M28018 53 -
Cunninghamella bertholletiae Neqas 6659/M19638 96 -
Curvularia lunata M742/97 40 515
Epidermophyton floccosum corso 2004 BioMérieux 138 695
Exophiala sp. Neqas 6019/M22420 68 540
Exophiala spinifera M1609/96 38 541
Fusarium oxysporum M4859/03 86 461
Fusarium oxysporum R36234 119 -
Fusarium solani M35303/02 79 -
Fusarium solanii CQ12.96 34 489
Fusarium sp. - 24 459
Geotrichum candidum ID ZH/95 1 -
Geotrichum candidum Neqas 6759/M34711 99 286
Hormographiella aspergillata R8459 139 -
Malbranche sp. M42299 N.P. / M42299 492
Malbranchea sp. Tbc22067 113 -
Microsporum audouinii corso 2004 BioMérieux 133 649
Microsporum canis M19220/02 76 652
Microsporum canis M21559 111 652
Microsporum canis corso 2004 BioMérieux 134 652
Microsporum gypseum VA2397/97 11 581
Microsporum gypseum M35037 117 534
Microsporum gypseum corso 2004 BioMérieux 136 581
Microsporum persicolor corso 2004 BioMérieux 135 -
Microsporum praecox corso 2004 BioMérieux 137 555
Monascus ruber CQ99 2 -
Mucor sp. - 48 -
Ochroconis sp. M31577/01 70 -
Paecilomyces lilacinus CQ00/17436 55 511
Paecilomyces lilacinus Neqas6760/M34712 100 515
Paecilomyces variotii Neqas 5775/M38017 61 528
Paecylomices veriotii Neqas 7640/M36113 149 528
Penicillium Chrysogenum Neqas 7432/M14243 143 500
Penicillium sp. M19793/98 46 500
Penicillium sp. M4938 72 500
Penicillium sp. R13266/03 93 468
Rhizopus oryzae CQ5/02/M19992 81 562
Schizophyllum comune VA460449 N.P. / VA460449 549
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 36
Specie Ceppo No. Micoteca No. Sequenza
Sequenza ITS1-5.8S-ITS2 Lunghezza frammento bp
Trichoderma sp. M948 27 -
Trichoderma sp. R5798 105 552
Trichoderma sp. M39284/05 147 519
Trichophyton tonsurans CQ95/M106 3 -
1. National External Quality assesment service, UK
2. Non presente nella micoteca
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 37
11.3. Lista delle sequenze di riferimento
Specie Ceppo GenBank (NCBI) No. Referenza
Lunghezza sequenza bp ITS1-5.8S-ITS2
Absidia corymbifera ATCC1 46774 AF117937 420 sequenza parziale 5.8S-ITS2
Acremonium sp. KMU 4529 AB158290 492
Acremonium strictum UW 836 AY138844 492
Amylomyces rouxii SDM34 AB181338 562
Aphanoascus fulvescens UAMH 5117 AF038357 516
Aphanoascus reticulisporus - AJ390381 515
Arthroderma gypseum CBS2 258.61 AJ970141 581
Arthroderma gypseum CBS 161.69 AJ000621 534
Aspergillus aculeatus CBS 17266 AY585558 490
Aspergillus candidus ATCC 1002 AY373842 508
Aspergillus clavatus ATCC 58869 AY373847 515
Aspergillus flavus ATCC 20043 AY939782 510
Aspergillus fumigatus ATCC 9197 AY939790 512
Aspergillus japonicus CBS 61178 AY585562 490
Aspergillus niger ATCC 16888 AY373852 514
Aspergillus ochraceus ATCC 18412 AY373854 502
Aspergillus oryzae SRRC 2103 AY373857 510
aspergillus terreus ATCC 1012 AY373871 523
Aspergillus versicolor NHRC-FE078 AJ937755 482
Aspergillus versicolor ATCC 9577 AY373880 482
Aspergillus versicolor 2014 AM158229 471
Aspergillus westerdijkiae NRRL3 35197 DQ250530 501
Auxarthron conjugatum GFI 149 AJ608967 494
Chaetomium funicola CBS 141.50 AJ279450 494
Chrysosporium articulatum UAMH 4320 AJ007841 515
Chrysosporium keratinophilum IFO 7584 AJ131681 520
Curvularia trifolii wb 403 AF455446 515
Emericella cleistominuta IFM 48170 AB248989 481
Emericella corrugata IFM 54743 AB264794 481
Emericella dentata IFM 42021 AB249000 481
Emericella nidulans NRRL 2395 AY373888 481
Emericella nidulans 2172 AM158232 402
Emericella quadrilineata UWFP4 613 AY213644 481
Emericella rugulosa IFM 54242 AB249002 481
Epidermophyton floccosum ATCC 26072 AY213646 695
Exophiala jeanselmei CBS 463.80 AY163552 541
Exophiala oligosperma IP5 2118.92 DQ836797 541
Exophiala sp. CBS 115831 AY857539 520
Exophiala xenobiotica CBS 117674 DQ182589 519
Fusarium bulbicola NRRL 13618 U61676 461
Fusarium lactis NRRL 25200 U61681 461
Fusarium oxysporum Ppf15 EF495237 459
Fusarium oxysporum 10L-201-Mexico AY904065 461
Fusarium oxysporum FO-05 AY928412 494
Fusarium solani WB 853 AY569560 494
Fusarium sp. 448 AY729069 459
Fusarium subglutinans CNFM 960512 AY898246 459
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 38
Specie Ceppo GenBank (NCBI) No. Referenza
Lunghezza sequenza bp ITS1-5.8S-ITS2
Galactomyces geotrichum YF01C DQ668351 286
Gibberella moniliformis FV 4773 AY428795 461
Gibberella sacchari wb 395 AF455450 461
Hypocrea jecorina ATCC 24449 DQ000625 552
Hypocrea koningii GJS 95-175 AF456923 519
Hypocrea rufa GJS 96-47 AJ230685 519
Hypocrea schweinitzii ICMP 5426 X93966 552
Hypocreales sp. LM92 EF060464 487
Microsporum audouinii CBS 344.50 AJ252333 649
Microsporum canis ATCC 23828 AY213657 652
Microsporum distortum CBS 190.57 AJ252329 652
Microsporum ferrugineum CBS 426.63 AJ252338 652
Microsporum langeronii CBS 408.51 AJ252334 649
Microsporum praecox CBS 468.74 AJ970148 555
Microsporum rivalieri CBS 409.51 AJ000625 649
Paecilomyces lilacinus ATCC 10114 AY213665 511
Paecilomyces variotii NRRL 1115 AF033395 529
Paecilomyces variotii ATCC 22319 AY373941 514
Penicillium chrysogenum EPA 467 AY373903 500
Penicillium citrinum WM 05.3 DQ249207 468
Penicillium commune wb153 AF455544 500
Penicillium nalgiovense IBT 12108 AJ004895 500
Penicillium sp. PC6 EF105368 500
Penicillium sp. ZN 105 DQ810189 468
Penicillium westlingii NRRL 800 AF033423 468
Rhizopus japonicus AHU6525 AB097347 562
Rhizopus microsporus AHU6527 AB097348 562
Rhizopus oryzae CBS 395.95 AY213684 562
Schizophyllum commune HNO34 AF280758 549
Trichoderma koningiopsis Dis326h DQ379015 519
Trichoderma longibrachiatum ATCC 52326 Z48935 552
Trichoderma ovalisporum Dis 203c DQ315458 519
Trichoderma sp. YM2 AB297794 519
1. American Type Culture Collection, USA
2. Centraalbureau voor Schimmelcultures, Netherlands
3. Northen Regional Research Laboratory, USA
4. University of Washington Fungal Project, USA
5. Pasteur Institute Collection Fungi, France
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 39
11.4. Anamorfismo e Telomorfismo delle diverse specie usate in questo lavoro
Anamorfismo Telomormismo
Monascus ruber Absidia corymbifera Acremonium sp. Acremonium strictumAlternaria alternata Amylomyces rouxii (Mucor rouxii) Arthrinium phaeospermum Aspergillus candidus Aspergillus clavatus Aspergillus cleistominutus Emericella cleistominuta Aspergillus corrugatus Emericella corrugata Aspergillus flavus Aspergillus fumigatus Aspergillus glaucus Aspergillus japonicus (Aspergillus aculeatus) Aspergillus nidulans Emericella nidulans
Emericella quadrilineata Emericella dentata
Aspergillus niger Aspergillus ochraceus Aspergillus oryzaeAspergillus rugulosus Emericella rugulosa Aspergillus terreus Aspergillus versicolor Aspergillus westerdijkiae Aureobasidium sp. Discophaerina sp. Bipolaris sp. Cochliobolus sp. Caldosporium cladosporioides Chaetomium funicolaChaetomium sp. Chrysosporium articulatumChrysosporium keratinophilum Aphanoascus keratinophilusChrysosporium sp. Aphanoascus fulvescens Chrysosporium sp. Aphanoascus sp. Chysosporium sp. Aphanoascus reticulisporus Cladosporium sp. Cladosporium sphaerospermum
Amplificazione delle regioni ITS1 e ITS2 per l’identificazione di muffe di interesse clinico 40
Anamorfismo Telomormismo
Cunninghamella bertholletiae Curvularia lunata Cochliobolus lunatus Curvularia trifolii Cochliobolus sp. Epidermophyton floccosum Exophiala jeanselmeiExophiala oligosperma, ( Melanchlenus oligospermus, Rhinocladiella atrovirens) Exophiala sp. Exophiala spinifera Exophiala xenobioticaFusarium bulbicola (Fusarium sacchari)
Gibberella sacchari
Fusarium lactis (Fusarium Moniliforme) Fusarium oxysporum Fusarium solani Nectria haematococcaFusarium sp. Gibberella sp.
Nectria sp. Fusarium subglutinansFusarium verticillioides Gibberella moniliformis Geotrichum candidum Galactomyces geotrichumHormographiella aspergillata Coprinopsis cinerea Malbranchea sp. Auxarthron sp. Malbranchea sp. Auxarthron conjugatum Microsporum audouinii (Microsporum rivalieri) Microsporum canis (Microsporum distortum)
Arthroderma otae
Microsporum ferrugineumMicrosporum gypseum Arthroderma gypseum Microsporum langeroniiMicrosporum persicolor Arthroderma persicolor Microsporum praecox Mucor sp. Ochroconis sp. Paecilomyces lilacinus Paecilomyces variotii Penicillium Chrysogenum Penicillium citrinum Penicillium communePenicillium nalgiovense Penicillium sp.
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Anamorfismo Telomormismo
Penicillium westlingii Rhizopus microsporusRhizopus oryzae (Rhizopus arrhizus, Rhizopus japonicus) Schizophyllum commune Trichoderma citrinoviride Hypocrea schweinitzii Trichoderma koningii Hypocrea koningii Trichoderma koningiopsis Trichoderma longibrachiatum Hypocrea sp. Trichoderma ovalisporum Trichoderma reesei Hypocrea jecorina Trichoderma sp. Hypocrea sp. Trichophyton tonsurans Tricoderma viride Hypocrea rufa
Referenze
1. D. E. Ciardo; Molecular Identification of Fungal Pathogens using the ITS Region; Diss.
ETH 16410, 2006
2. G.S. de Hoog, J. Guarro, J. Gené, M. J. Figueras; Atlas of Clinical fungi; 2° ed., Universitat
Rovira i Virgili, 2000
3. NCBI, Taxonomy Browser. http://ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/taxonomyhome.html
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11.5. Albero
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11.6. Classificazione secondo .S. de Hoog, J. Guarro, J. Gené, M. J. Figueras, delle specie usate in questo lavoro
Ascomicota Euascomycetes Eurotiales Trichomaceae
Aspergillus candidus Aspergillus clavatus Aspergillus cleistominutus Aspergillus corrugatus Aspergillus flavus Aspergillus fumigatus Aspergillus glaucus Aspergillus japonicusAspergillus nidulans Aspergillus niger Aspergillus ochraceus Aspergillus oryzaeAspergillus rugulosus Aspergillus terreus Aspergillus versicolor Aspergillus westerdijkiae Paecilomyces lilacinus Paecilomyces variotii Penicillium Chrysogenum Penicillium citrinum Penicillium communePenicillium nalgiovense Penicillium sp. Penicillium westlingii Epidermophyton floccosum
Ascomicota Euascomycetes Onygenales Onygenaceae
Chrysosporium articulatumChrysosporium keratinophilum Chrysosporium sp. Chrysosporium sp. Chysosporium sp.
Malbranchea sp.
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Ascomicota Euascomycetes Onygenales Arthrodermataceae
Microsporum audouiniiMicrosporum canis Microsporum ferrugineumMicrosporum gypseum Microsporum langeroniiMicrosporum persicolor Microsporum praecox Epidermophyton floccosum
Ascomicota Euascomycetes Sordariales Chaetomiaceae
Chaetomium funicolaChaetomium sp.
Ascomicota Euascomycetes Hypocreales Hypocreaceae
Acremonium sp. Acremonium strictumTrichoderma citrinoviride Trichoderma koningii Trichoderma koningiopsis Trichoderma longibrachiatum Trichoderma ovalisporum Trichoderma reesei Trichoderma sp. Trichophyton tonsurans Tricoderma viride Fusarium bulbicolaFusarium lactis Fusarium oxysporum Fusarium solani
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Fusarium sp. Fusarium subglutinansFusarium verticillioides
Ascomicota Euascomycetes Chaetothyriales Herpotrichiellaceae
Exophiala jeanselmeiExophiala oligosperma, ( Melanchlenus oligospermus, Rhinocladiella atrovirens) Exophiala sp. Exophiala spinifera
Ascomicota Euascomycetes Pleosporales Pleosporaceae
Curvularia lunata Curvularia trifolii
Basidiomycota Hymenemycetes Stereales Schizophyllaceae
Schizophyllum commune
Zygomicota Mucorales Mucoraceae
Absidia corymbiferaRhizopus microsporusRhizopus oryzae Amylomyces rouxii Rhizopus microsporusRhizopus oryzae Schizophyllum commune
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Ringraziamenti
Ringrazio coloro che mi hanno aiutato in questo lavoro. In primo luogo ringrazio il direttore
dell’Intituto Cantonale di Microbiologia, il Dr. Orlando Petrini, per avermi concesso la possibilità di
svolgere il mio lavoro di diploma presso il loro laboratorio di sierologia.
Ringrazio la Dr.ssa Gladys martinetti per la fiducia che mi ha concesso in questi mesi e soprattutto
per la scelta dell’argomento del lavoro di diploma; un lavoro che mi ha coinvolto pienamente.
Ringrazio la Dr ssa Antonella Demarta Aeschbacher e la Dr.ssa. Simona Casati per avermi seguito
durante l’elaborazione dei dati
Non in minor modo rigrazio i tecnici in analisi biomediche Anna Paola Caminada, Marilena
Chiaravalloti, Karin Gervasoni-Bolgiani, Tecla Fondrini per il loro importante supporto tecnico
Ed in fine ringrazio il direttore della Scuola Medico Tecnica Andrea Boffini, le docenti Daniela
Marcacci, Sonja Marci e Susan Gilbert.