Amplificación de ácidos nucleicos in vitro. · • Sistemas de amplificación de la sonda, ......

Amplificación de ácidos nucleicos in vitro. El principal objetivo de las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos in vitro, es mejorar la sensibilidad de los test basados en ácidos nucleicos y simplificarlos mediante el uso de la automatización y la incorporación de sistemas de detección no radiactivos.

La tecnología subyacente a las técnicas de amplificación es diversa y en continua transición, por lo que se hace necesario una clasificación de las mismas; una de esas clasificaciones divide los métodos de amplificación de los ácidos nucleicos en tres grandes categorías:

• sistemas de amplificación de la diana, que incluye la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la autorreplicación de la secuencia (3SR) y la amplificación por desplazamiento de la hebra (SDA)

• Sistemas de amplificación de la sonda, que incluye la replicasa Qß o la reacción en cadena de la ligasa (LCR)

• Sistemas de amplificación de la señal, en los cuales la señal generada por cada sonda es aumentada.

Métodos de Amplificación de la Diana. Son métodos in vitro que amplifican enzimáticamente una molécula diana hasta niveles a los cuales pueden ser fácilmente detectados. Mediante estos métodos se puede realizar la identificación de un patógeno al mismo tiempo que se obtiene una réplica exacta de la secuencia diana que posteriormente podrá ser caracterizada y secuenciada; esta es la propiedad que diferencia estos métodos de otros métodos de amplificación.

• Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Desde 1983, año en el que se describió por primera vez la técnica por científicos de la empresa Cetus Corporation, la PCR se ha convertido en una técnica fundamental en la mayoría de los laboratorios de Biología Molecular.

La técnica se basa en la repetición de ciclos de síntesis de DNA dirigida por oligonucleótidos para realizar la replicación in vitro de secuencias diana de ácidos nucleicos (figura 1). Estos oligonucleótidos, cuya secuencia viene determinada por el ácido nucleico diana, se sintetizan para ser complementarios de sus zonas de annealing dentro de las dos diferentes hebras (hebra + y -) de la secuencia diana. La distancia entre los primers se determina empíricamente y depende de numerosos factores; el intervalo habitual entre primers para ensayos diagnósticos es entre 50 y 1.500 bases.

En su forma más básica, cada ciclo de PCR consta de tres pasos:

Etapa de desnaturalización. En ella, el DNA diana se incuba a elevada temperatura (± 94°C) de tal manera que las hebras se separan quedando accesibles a la hibridación de los primers.

Etapa de annealing. En ella, la mezcla de reacción se enfría (± 55 – 65°C) para permitir que los primers hibriden con la secuencia complementaria.

Etapa de extensión. Se suele realizar a ± 72°C y en ella los primers se extienden mediante una DNA polimerasa, utilizando el DNA diana como molde, realizándose entre 30 y 50 ciclos en cada reacción.

Durante todos los ciclos de amplificación, las reacciones de extensión de los primers finalizan a diferentes distancias de los primers, originando productos de amplificación de diferentes longitudes. No obstante, después del segundo ciclo de amplificación, los "productos cortos" empiezan a acumularse y rápidamente se convierte en el producto predominante.

El punto de partida óptimo del proceso de identificación de una secuencia diana para la detección de un determinado patógeno o agente infeccioso es la literatura. La relativa facilidad con la que actualmente se puede clonar y secuenciar los ácidos nucleicos ha originado una explosión de información de secuencias disponibles y la tendencia de depositar dicha información de las secuencias directamente en bancos de datos de ácidos nucleicos como el GenBank (Los Álamos, N.M.) y el European Molecular Biology Laboratories - EMBL (Heielberg, Alemania).

Fig. 1. En el primer ciclo, se utiliza como molde una secuencia de dsDNA. Las dos hebras se desnaturalizan por calor (± 94°C) y los dos oligonucleótidos sintéticos (primers) hibridan con sus respectivas secuencias en dirección 5' 3' (los extremos 3' de ambos primers quedan enfrentados). La Taq DNA polimerasa inicia la síntesis en el extremo 3' de cada primer (por lo tanto, en dirección 5' 3') originando nuevos sitios de unión para los primers. El resultado neto después del primer ciclo de amplificación es dos copias "degeneradas" (de diferente longitud) del DNA original, de tal forma que al final de todos los ciclos, se obtiene una acumulación de dichos "productos cortos".

Aplicacion PCR Amplificación de ácidos nucleicos in vitro. Cultek

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La elección de los primers es un elemento crítico para el desarrollo de los sistemas de detección basados en la amplificación de ácidos nucleicos y hay que tener en cuenta muchas consideraciones para diseñarlos:

Longitud del primer. Viene determinada por la conservación de la secuencia, tamaño y composición de la secuencia diana. Si se elige una secuencia altamente conservada, el tamaño de la sonda es menos restrictiva; por el contrario, si se elige para la amplificación una secuencia muy polimórfica, las zonas que muestren suficiente conservación limitaran el tamaño de la sonda o la región de la secuencia entre la que se puede seleccionar la sonda.

Para la PCR, los primers usados para la reacción de amplificación varían entre 15 y 30pb; los primers más cortos pueden no proporcionar la adecuada especificidad y los más largos no incrementan la especificidad y son más caros de sintetizar. La longitud del primer también influye en la capacidad del sistema para tolerar errores. La longitud total del primer es la suma de la región específica de la diana más la de los nucleótidos no específicos de la diana, como por ejemplo, zonas de reconocimiento para endonucleasas de restricción, que se añaden al extremo 5'. La adición de nucleótidos sin diana al extremo 5' de la sonda puede alterar significativamente las características de hibridación del primer y, por lo tanto, el rendimiento. Durante los primeros ciclos de amplificación, los primers complejos hibridan con la diana por la mayoría del extremo 3', mientras que la cola 5' no participa en la hibridación. Sin embargo, en los posteriores ciclos de amplificación se acumulan los productos cortos, lo que permite que se una el primer entero; el efecto neto es una elevación en la temperatura de melting del primer. Por lo tanto, para primers con extensiones en el extremo 5', un incremento de la temperatura de annealing después de los primeros 5-10 ciclos pueden resultar en un mayor rendimiento de la reacción de amplificación.

Temperatura de melting del primer. Se define la temperatura de melting (Tm) de un primer unido a su ácido nucleico diana como la temperatura a la cual el 50% de los primers están unidos y el 50% están en solución. La Tm es dependiente de la concentración de primer, la composición de la secuencia y de la composición del solvente y es diferente de la temperatura de disociación. Los primers pequeños tienen una Tm inferior que los grandes aun teniendo la misma composición; sin embargo, cuando el tamaño de los primers se aproxima a las 20-25pb el efecto de la longitud sobre la Tm disminuye, por lo que en los primers normalmente utilizados en la amplificación, el principal efecto sobre la Tm viene dado por la composición del primer.

Existen en la literatura numerosas fórmulas para el cálculo de la Tm. El método más simple y más ampliamente utilizado se basa en asignar 2°C por cada A o T y 4°C por cada G o C y, aunque se consiguen buenas aproximaciones con él, la precisión disminuye bastante cuando se incrementa la longitud del primer (por ejemplo, la Tm para un 20mer con igual contenido en A+T y G+C sería de 60°C, que se aproxima bastante a la realidad; sin embargo, para un 40mer de la misma composición, la Tm sería un valor totalmente absurdo de 120°C).

( ) ( )[ ] 5CG4TA2Tm −+⋅++⋅= Los métodos más precisos para el cálculo de la Tm se basan en el estudio de las interacciones con los "vecinos" dentro de la doble hebra de DNA; este análisis asigna un peso de la temperatura a diferentes combinaciones de pares de bases y la media de pesos de la temperatura es lo que determina la Tm, por lo que al basarse en una media en lugar de una suma, el análisis no se ve sesgado por la

longitud del primer. Una fórmula útil para calcular la temperatura de annealing óptima ( ) y que se basa en estudios empíricos de

primers es la siguiente:

optaT

⎪⎩

⎪⎨⎧

−⋅+⋅=PCR de producto del T :T

estable menos template"-primer"par del calculada T :T9,14T7,0T3,0T

mproductom

mprimermproducto

mprimerm

opta

Los valores de Tm calculados para los dos primers usados en la amplificación deberían ser lo más próximos posible, para evitar la "unión asimétrica" de los mismos, es decir, que una de los primers se una a su secuencia diana con mayor afinidad que el otro bajo las mismas condiciones de hibridación. La unión asimétrica se observa cuando la temperatura de annealing se encuentra entre las Tm de dos primers con muy diferentes Tm.

Para la PCR, generalmente es aconsejable escoger primers con temperaturas óptimas de annealing entre 55°C y 65°C, ya que temperaturas inferiores pueden ocasionar una baja especificidad y sensibilidad de la diana por competición entre productos específicos e inespecíficos.

Secuencia. La composición de nucleótidos de los primers utilizados en el protocolo de amplificación determina directamente la temperatura de annealing a usar en el mismo. Para ello hay que tener en consideración algunos puntos importantes:

Deben evitarse las repeticiones largas del mismo nucleótido, ya que pueden disminuir la especificidad de la diana.

El contenido G+C de los primers debe aproximarse o superar ligeramente al contenido de G+C de la diana, ya que los primers deficientes en G+C que flanquean dianas ricas en G+C pueden no competir efectivamente por la unión, lo que origina una baja eficiencia de amplificación.

Hay que tener en consideración muy especialmente el extremo 3' de los primers, ya que es el extremo que reconocen las polimerasas. Una elevada proporción de residuos G+C en el extremo 3' puede originar una baja especificidad por la diana debido a la tendencia de estas regiones a proporcionar uniones muy estables con secuencias inespecíficas (no pertenecientes a la diana). También se ha demostrado en la literatura que los primers que terminan en un residuo de T3' son mas tolerantes a la incorporación de errores que otros nucleótidos.

Para regiones codificadoras de proteínas, hay que tener en cuenta la posición del extremo 3' del primer con respecto al origen de replicación (Open Reading Frame; ORF) de la diana (ver el apartado de la localización de la secuencia diana).

En la tabla I se muestran los parámetros que favorecen las uniones específicas e inespecíficas de los primers a sus respectiva dianas:

Tabla I. Parámetros de tolerancia de las sondas. Probabilidad de uniones inespecíficas Probabilidad de uniones específicas

Longitud de la sonda entre 25 y 35pb Longitud de la sonda entre 14 y 18pb Elevada [dNTP] (0,8 – 4,0mM) Baja [dNTP] (≤ 50µM) Baja temperatura de annealing Elevada temperatura de annealing Elevado número de ciclos Bajo número de ciclos Mal apareamiento en o próximo al extremo 5' Mal apareamiento en o próximo al extremo 3' Residuo de T en el extremo 3' Residuo de A, G ó C en el extremo 3'



Características físicas. Debe evitarse el auto-annealing (formación de horquillas o lazos) ya que reduce la concentración efectiva de los primers al producirse una competencia entre la unión de los primers entre sí y a la diana. Además, debe evitarse muy especialmente la complementariedad en el extremo 3' del primer, ya que reduce drásticamente la concentración efectiva del mismo.

Interacciones primer-primer. El término "primer–dimer" o “dímeros de primers” se refiere a la acumulación de productos pequeños de PCR y que miden aproximadamente igual que dos primers unidos uno a continuación de otro. Incluso en reacciones muy optimizadas, se pueden obtener pequeñas cantidades de estos artefactos, pero en elevadas cantidades pueden disminuir la sensibilidad de la reacción al competir por los componentes de la misma.

Normalmente, estos artefactos se pueden evitar eliminando la complementariedad en los extremos 3' (aunque sea en un solo nucleótido) de los dos primers utilizados para la amplificación (especialmente si son residuos G-C).

Localización en la secuencia diana. Como se ha comentado anteriormente, cuando se va a amplificar secuencias codificadoras, hay que tener especial consideración con la posición del extremo 3' de la sonda en relación al ORF (origen de replicación). La presión de selección por mantener la secuencia dentro del ORF se refiere generalmente al aminoácido y debido a la degeneración del código genético, hay varios codones que pueden codificar el mismo aminoácido, lo que permite variar la secuencia de nucleótidos manteniendo la presión de selección a nivel de las proteínas.

En el codón, la posición con mayor variabilidad (o bamboleo) es la tercera, por lo que una aproximación bastante adecuada es diseñar las sondas de tal forma que los nucleótidos del extremo 3' se apoyen en la primera o segunda base de un codón conservado.

Para dianas que no codifiquen proteínas (regiones reguladoras o rRNA) la presión de selección hacia la conservación de la secuencia es a nivel de secuencia de nucleótidos, por lo que a la hora de diseñar primers para detectar estas dianas no se debe tener en cuenta su posición con respecto al ORF.

Todas las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos, independientemente del tipo que sea, necesitan elevadas concentraciones de primers específicos de la diana. En los últimos años se han desarrollado numerosos instrumentos para automatizar la compleja química de síntesis de estos oligonucleótidos y producir grandes cantidades de oligonucleótidos relativamente puros.

La química de la síntesis de DNA es relativamente sencilla: un PP

3' de un nucleósido se une químicamente al extremo hidroxilo 5' de otro nucleósido unido a un soporte sólido. A partir de este momento se necesitan otras tres reacciones químicas para preparar el nucleótido para el siguiente ciclo de unión: "sellado" (capping), oxidación y desbloqueo (detritilación); en la actualidad, el rendimiento de dicha unión es mayor del 99% en cada ciclo, por lo que la pureza del producto final es dependiente del número de ciclos de síntesis (cuanto más largo sea el primer, menor rendimiento).

Después de la elección de los primers, el siguiente paso para incrementar la sensibilidad y especificidad de la reacción es la optimización de todos los parámetros de la misma; dichos parámetros no tienen la misma importancia ni peso sobre la reacción de amplificación, pero puesto que la variación de cada uno de ellos influye en el resto, no hay acuerdo en la literatura sobre qué parámetros deben optimizarse primero y cuales después:

Temperatura de annealing. Como se ha comentado anteriormente, la temperatura de annealing de los primers se puede calcular con diferentes fórmulas, pero la temperatura óptima debería determinarse empíricamente.

La optimización de la temperatura de annealing es particularmente importante según aumenta la complejidad genética de la muestra. Una mayor complejidad favorece el annealing inespecífico y bajo condiciones no muy estrictas la baja especificidad puede provocar la amplificación de productos inespecíficos que se observan en los geles como bandas de pesos moleculares superiores o inferiores a los esperados.

La temperatura óptima de annealing para un determinado protocolo a menudo es superior que la predicha por las fórmulas matemáticas. Como regla general, conviene empezar por la temperatura obtenida de dichas fórmulas e irla incrementando varios grados; a la primera señal de pérdida de sensibilidad se debe elegir la temperatura inmediatamente inferior.

Concentración de Mg2+. El aumento de la [Mg2+] tiene el efecto neto de disminuir la severidad de la unión de los primers y, por lo tanto, una baja especificidad de la reacción; las bajas [Mg2+] pueden originar una pobre eficiencia de la reacción.

La [Mg2+] debe calcularse como función de la concentración de nucleótidos; para la mayoría de protocolos, debe probarse un rango de [Mg2+] entre 0,5 y 3,0mM por encima de la concentración de nucleótidos. Puesto que las soluciones de MgCl2 tienden a precipitar después de los ciclos de congelación-descongelación, la solución stock de MgCl2 debe mantenerse a 4°C y añadirse a la master mix justo antes de la amplificación.

Desoxinucleótidos Trifosfato (dNTPs). La concentración óptima de dNTPs debe determinarse empíricamente y conjuntamente con la [Mg2+]. De forma general, la [dNTPs] varía entre 20 y 200mM, teniendo en cuenta que concentraciones demasiado elevadas pueden originar una menor especificidad y concentraciones demasiado bajas pueden provocar un bajo rendimiento de los productos de amplificación.

Elección y concentración de la enzima. Las concentraciones de las diferentes polimerasas utilizadas en la PCR varían significativamente, pero para la Taq polimerasa varía entre 1,0 y 2,5U por cada 100µL de reacción. Para optimizar la concentración de enzima, se debe testar empíricamente el protocolo variando la concentración entre 0,5 y 5,0U por cada 100µL de reacción.

Cuando la concentración de enzima es muy elevada se produce la unión inespecífica de los primers y cuando es demasiado baja se obtiene una baja eficiencia de amplificación. En los últimos años han aparecido una elevada cantidad de polimerasa comerciales que se diferencian en diversos parámetros como son la estabilidad térmica, actividad exonucleasa, procesividad, tasa de incorporación de errores y actividad transcriptasa inversa.

Concentración de los primers. Si la concentración de primers es baja puede ocasionar un pobre rendimiento de la reacción. Si es demasiado alta puede ocasionar una disminución de la especificidad que se manifiesta por un incremento en los productos de amplificación inespecíficos; además, puede favorecer la formación de dímeros de primers.

Aditivos. La formamida y el dimetil sulfóxido son tolerados a bajas concentraciones en la reacción de PCR y pueden ayudar a amplificar dianas ricas en G+C, ya que, probablemente, facilitan la separación de las hebras y, por lo tanto, mejoran la accesibilidad del template a las sondas y la polimerasa.



El efecto del glicerol en la mejora del rendimiento de los productos de PCR no se conoce con exactitud, pero, presumiblemente, ayuda a estabilizar la Taq polimerasa. La adición de glicerol puede ser necesaria si se está utilizando el método de inactivación fotoquímica con isopsoralen1, ya que la inhibición de la PCR por elevadas concentraciones de isopsoralen puede ser solventada por la adición de un 10% de glicerol. 1 Tanto los psoralens como los isopsoralens y sus derivados son reactivos tricíclicos planos que se intercalan entre los pares de bases de los ácidos nucleicos; contienen dos dobles enlaces reactivos que, cuando son excitados, se unen covalentemente a los ácidos nucleicos formando aductos de ciclobutano con las bases pirimidínicas. Los amplicones modificados son refractarios a nuevos ciclos de amplificación ya que los aductos bloquean la reacción de extensión dependiente de template llevada a cabo por la Taq polimerasa. Las longitudes de onda utilizadas para el proceso de inactivación varían entre 300 y 400nm ya que minimizan el daño a los nucleótidos de los amplicones.

Fig. 2. Estructura del psoralen y del isopsoralen.

En el momento de la preparación, se colocan el ácido nucleico diana y los reactivos de PCR en un tubo de microcentrífuga junto con el reactivo fotoquímico; se cierra el tubo y se realiza la amplificación. Después de la misma, pero antes de abrir nuevamente el tubo y que los productos de amplificación entren en contacto con el aire, se activa el reactivo fotoquímico exponiéndolo a la luz entre 300 y 400nm (los tubos de polipropileno utilizados normalmente en las reacciones de PCR son transparentes a estas longitudes de onda y permiten la fotoactivación). Después de completar el proceso fotoquímico, se abre el tubo y se detectan los productos de PCR modificados de forma habitual (en geles de agarosa para dsDNA o mediante hibridación con sondas complementarias para ssDNA).

La inactivación fotoquímica puede diseñarse de forma que virtualmente todos los amplicones sean inactivados. Sin embargo, dicho proceso de inactivación es estadístico y se puede dar la inactivación parcial. El número absoluto de aductos por amplicón no es constante y la fracción de amplicones que escapan de la modificación fotoquímica y, por lo tanto, no son inactivados, viene determinado por la longitud y secuencia del amplicón y por la concentración del reactivo de inactivación: un producto de PCR de 115 nucleótidos es mucho más difícil de inactivar que uno de 500 nucleótidos bajo las mismas condiciones. Debido a que las secuencias ricas en A+T son más reactivas con los psoralens, la elección de primers que generen productos grandes (mayores de 200-300pb dependiendo del contenido en G+C) o ricos en A+T facilitarán el proceso de inactivación. La eficiencia de inactivación también se puede incrementar aumentando la concentración de isopsoralen (la concentración más efectiva está entre 25 y 200µg/mL).

Fig. 3. Pasos del método de inactivación fotoquímica

Recientemente, se ha observado que la adición de proteínas de unión a DNA monocatenario (Single Strand Binding Proteins; SSBs) puede reducir las amplificaciones inespecíficas, mejorar el rendimiento de los productos de reacción y ayuda a solventar las inhibiciones; se cree que el mecanismo es porque secuestran los primers durante el periodo de organización de la reacción, evitando las uniones inespecíficas de éstos.

Protocolos "Hot Start". En una reacción típica de PCR, todos los componentes de la reacción se mezclan en la llamada "master mix" y se mantienen a 4 – 25°C antes de dispensarlos en los tubos de reacción. En ese momento, se añade el DNA diana a la mezcla de reacción y se colocan en el termociclador.

Durante el tiempo que se tarda en preparar la reacción antes de poner los tubos en el termociclador y durante el primer ciclo de calentamiento, la Taq polimerasa es capaz de elongar los complejos sonda–template formados bajo condiciones de hibridación poco estrictas. Aunque las posteriores temperaturas de annealing no caigan nunca por debajo de los 55–60°C los productos inespecíficos originados durante ese periodo pueden afectar a la sensibilidad y especificidad de la reacción.

La técnica del "hot start" evita la formación de estos productos inespecíficos manteniendo un componente esencial de la reacción (los nucleótidos, el Mg2+, los primers o la polimerasa) separado de la diana durante los momentos en los que las condiciones son muy poco estrictas y añadiéndolo a la mezcla de reacción una vez se hayan alcanzado temperaturas elevadas (± 95°C). En ese momento la mezcla de reacción se enfría a la temperatura adecuada de annealing, permitiendo la unión específica de la sonda a su diana para iniciar la síntesis.

Entre los diferentes métodos existentes para realizar una hot start, están la utilización de bolas de cera que contienen uno de los componentes de la reacción y que no se derriten hasta alcanzar los 95°C, retener la adición de la Taq polimerasa hasta que los tubos estén en el termociclador, la utilización del método de la UNG2 o la utilización de anticuerpos monoclonales contra la Taq que inhiben su actividad hasta alcanzar temperaturas que desnaturalizan el anticuerpo dejando libre la enzima. 2 La Uracil-N-glicosilasa (UNG) es una enzima reparadora del DNA que se encuentra en una amplia variedad de especies bacterianas. La función normal de esta enzima es eliminar los residuos de uracilo (desoxiuracilo) que se crean por la desaminación espontánea de los residuos de citosina en el dsDNA (figura 4). Un fallo en la capacidad del microorganismo de reconocer y eliminar los residuos de uracilo, origina una elevada frecuencia de mutaciones por cambios C-T al incorporarse residuos de adenina en los templates.

Fig. 4. Inactivación de productos de PCR inespecíficos (amplificados previamente) mediante el método de la UNG.



En 1990, Longo et al. publicaron un método que utilizaba la UNG para inactivar los productos de amplificación por PCR. Durante la amplificación, los TTPs son sustituidos por dUTPs que sirven como substrato para la Taq polimerasa en lugar de los TTPs, por lo que los productos de amplificación contienen residuos de desoxiuracilo; esto sirve para distinguir químicamente los productos de PCR del template original, ya que sólo los productos sintetizados contendrán desoxiuracilo. Si en la mezcla de reacción existen productos de PCR con dUTP como contaminantes, la adición de UNG a la mezcla provocará la eliminación de los mismos del DNA y el producto de reacción es entonces susceptible de hidrólisis alcalina a elevadas temperaturas.

La UNG se añade a la mezcla de reacción antes de la amplificación; durante una corta incubación previa a la amplificación, los productos de PCR inespecíficos con dUTP que puedan haberse formado son rotos por la UNG, inactivándolos como templates, por lo que en los ciclos iniciales de PCR, la síntesis de DNA ocurre exclusivamente sobre el template original que se encuentra a salvo de la acción de la UNG (fig. 5).

Fig. 5. Protocolo del método de inactivación por UNG.

Otra consideración a tener en cuenta es que si se va a utilizar el método de inactivación de la Uracil-N-glicosilasa (UNG), las temperaturas de annealing de los primers no deben estar por debajo de los 55°C ya que la UNG puede reactivarse a bajas temperaturas, lo que origina una menor eficiencia de amplificación por la degradación de los productos de amplificación según se van sintetizando.

• Multiplex PCR. En esta modificación de la PCR se incluyen dentro de la misma reacción de amplificación múltiples pares de primers específicos para diferentes dianas, por lo que se produce una coamplificación de diferentes dianas; esta modificación tiene las siguientes ventajas:

se pueden testar grandes regiones de la secuencia del DNA en busca de alteraciones o modificaciones.

se pueden testar segmentos no relacionados del genoma diana.

se pueden incluir controles internos de amplificación de la muestra.

se puede testar una misma muestra contra diferentes patógenos.

• Detección de Mutaciones Puntuales. El ARMS (Amplification Refractory Mutation System) utiliza primers de PCR con errores en el extremo 3' y una polimerasa que carece de la actividad exonucleasa 3' 5' para detectar errores específicos en la secuencia de nucleótidos. Como se sabe, la elongación de una sonda depende del apareamiento estable del extremo 3' del primer; cuando se produce un mal apareamiento, la elongación y, por consiguiente, el proceso de PCR, a menudo se ve imposibilitado.

El ARMS utiliza la amplificación selectiva basada en malos apareamientos en el extremo 3' para identificar mutaciones específicas, demostrando la presencia de una secuencia de nucleótidos que no puede ser amplificada con los primers "salvajes", pero que sí puede serlo con primers que contienen la mutación esperada.

• Determinación de la Secuencia. La determinación directa de la secuencia de nucleótidos es especialmente útil para identificar la composición de secuencias diana con alta variabilidad y que son amplificadas mediante primers de "amplio espectro". Para facilitar la secuenciación por el método de terminación dideoxi de la cadena, se pueden generar templates de cadena sencilla mediante la amplificación asimétrica o mediante la captura de afinidad de ssDNA utilizando primers biotinilados y bolas magnéticas recubiertas de avidina.

Recientemente se ha descrito la técnica de la secuenciación cíclica en la cual, la Taq polimerasa se utiliza para realizar la amplificación y la secuenciación simultáneamente; una reacción de secuenciación cíclica necesita solamente femtomoles de diana para la determinación de cadenas de cientos de bases de longitud.

• Nested Amplification. En esta modificación de la PCR se utilizan sets de primers anidados, de tal forma que se realiza una primera ronda de amplificación con uno de los pares de primers (15-30 ciclos) obteniéndose el producto habitual de amplificación, el cual se transfiere a un segundo tubo para una segunda ronda de amplificación (otros 15-30 ciclos) con el segundo par de primers específicos para una secuencia interna amplificada por el primer par de primers; después de la segunda amplificación, los productos amplificados se detectan de forma habitual mediante electroforesis.

Esta modificación de la PCR posee bastantes ventajas:



la sensibilidad es extremadamente alta ya que habitualmente se puede detectar una sola copia de la diana sin necesidad de hibridar con sondas marcadas.

la reamplificación con el segundo par de primers internos sirve para verificar la especificidad de la primera ronda de amplificación.

la transferencia de los productos de reacción a un segundo tubo sirve para diluir los posibles inhibidores que puedan estar presentes en inicialmente en la muestra.

También hay alguna desventaja, ya que no es muy recomendable la apertura del primer tubo de amplificación (sobre todo en laboratorios de diagnóstico clínico), ya que durante la transferencia se produce, inevitablemente, la contaminación de la muestra con aerosoles y el producto de la primera amplificación no puede ser inactivado por métodos convencionales ya que tiene que servir de molde para la segunda amplificación.

Para solucionar estas desventajas, se han desarrollado algunas alternativas al método original para realizar la Nested sin transferir la muestra de un tubo a otro tras la primera amplificación:

colocar el segundo par de primers (los internos) en buffer en la parte inferior del tubo y justamente encima, separado por una fina capa de aceite mineral la mezcla de reacción con el primero de las sondas. Después de la primera ronda de amplificación, se saca el tubo del termociclador y se le da un pulso de centrífuga, de forma que se mezclan la capa superior (ya amplificada) y la inferior (que posee los primers internos), al mismo tiempo que se diluyen los componentes de la primera ronda de amplificación; de esta forma se puede realizar la segunda ronda de amplificación.

la segunda alternativa se basa en las diferentes temperaturas de annealing del primer y segundo set de primers (los internos) y las diferentes temperaturas de desnaturalización de los productos de amplificación grandes y pequeños; la temperatura de annealing del primer set de primers es inferior que el del segundo, ya que ésta contiene colas ricas en G+C.



Según esto, la primera ronda de amplificación de realiza a una temperatura de annealing inferior lo que favorece la unión de la primera de las sondas y, posteriormente, se eleva la temperatura de annealing, con lo que se favorece la unión de la sonda interna y se realiza la segunda ronda de amplificación.

• Detección y amplificación de dianas de RNA. Algunas dianas genómicas están presentes sólo como RNA (virus de la Hepatitis C, de la Influenza, Picornavirus, etc.) y no sufren transcripción inversa a un intermediario de DNA durante su ciclo de vida. La detección del RNA puede ser también útil para la identificación de microorganismos superiores como bacterias y hongos, ya que contienen miles de moléculas de mRNA o tRNA. Incluso, la detección específica del RNA se ha demostrado útil para la monitorización de algunas terapias antimicrobianas, debido a la mayor producción de RNAs o para el estudio de determinados estados patogénicos asociados con la expresión génica.

Se pueden detectar los templates de RNA por PCR, si el RNA extraído es copiado previamente a cDNA mediante la utilización de una transcriptasa inversa retroviral, inicialmente aislada del virus de la mieloblastosis aviar. No obstante, esta enzima presentaba una serie de dificultades entre las que destacan el ser térmicamente lábiles, por lo que no podían usarse a temperaturas superiores a 42°C.

Posteriormente, se describió la actividad transcriptasa inversa dependiente de Mn2+ en la DNA polimerasa termoestable de Thermus thermophilus, lo que implica que esta enzima es capaz de copiar RNA a DNA a 72°C en presencia de Mn2+. Una vez se ha realizado la copia de RNA a DNA (cDNA), la adición de Mg2+ y EGTA [ácido etilen glicol-bis(ß-aminoetil eter)-N,N,N',N' tetraacético] como quelante de los cationes Mn2+ a la mezcla de reacción, hace que la DNA polimerasa de T.thermophilus cambie su especificidad de RNA a DNA, es decir, utilice como template DNA en lugar de RNA. Gracias a esta doble actividad, una sola enzima es capaz de copiar RNA en cDNA y amplificarlo mediante PCR mediante un simple cambio en el buffer de reacción.

Fig. 6. Esquema general de la amplificación de una RNA mediante transcripción inversa del RNA a cDNA y posterior PCR con la DNA polimerasa de Thermus thermophilus.

• TAS (Transcripcion-based Amplification System). El primer sistema de amplificación no basado en la PCR fue descrito en 1989 por Kwoh et al. y se basa en la amplificación mediante transcripción in vivo. Cada ciclo de TAS consiste en dos partes:

síntesis de una molécula de DNA que es complementaria del ácido nucleico diana.

transcripción in vivo utilizando el cDNA recién sintetizado como molde.



La síntesis del cDNA se realiza mediante primers especialmente diseñados: un extremo del primer consiste en una secuencia específica de la diana y el otro extremo contiene un promotor para la RNA polimerasa del fago T7. En el primer paso, se produce una molécula de ssDNA a partir de cada molde de DNA o RNA por la acción de la transcriptasa inversa. Después de la desnaturalización térmica de las dobles hebras de RNA-DNA o DNA-DNA se sintetiza una segunda hebra mediante la transcriptasa inversa, de tal forma que el dsDNA resultante contiene el promotor de T7 en uno de ambos extremos.

A continuación, se añade la RNA polimerasa del fago T7 a la mezcla con el cDNA, produciéndose hasta 40 moléculas de RNA a partir de cada molécula de cDNA template, es decir, la acción de la T7 polimerasa proporciona el paso de amplificación. La doble hebra de cDNA sirve de molde para la síntesis de una gran cantidad de moles de RNA, las cuales pueden ser nuevamente utilizadas como substrato para el próximo ciclo de TAS. Con este método, puede detectarse hasta una célula infectada por HIV-1 en una población de 106 células sin infectar.

Uno de los inconvenientes de esta técnica es la necesidad de desnaturalizar térmicamente los híbridos RNA-DNA durante cada ciclo de amplificación, porque ninguna de las enzimas utilizadas en la TAS son termofílicas y deben ser reemplazadas al final de cada ciclo.

• 3SR (Self-sustaining Sequence Replication) NASBA (Nucleic Acid Sequence-based Amplification). Una alternativa para solventar los inconvenientes de la TAS es la utilización de la RNasa H de E.coli en lugar de la desnaturalización térmica del híbrido RNA-DNA para obtener el molde de ssDNA. Esto dio lugar a una técnica de amplificación isotérmica (no requiere cambios en la temperatura de incubación) que se basa en las actividades enzimáticas simultáneas de tres enzimas: RNasa H de E.coli, transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar y la RNA polimerasa del fago T7.

Inicialmente, con la 3SR se consiguió una amplificación de 10 veces cada 2,5min durante los primeros 15min, por lo que después de 1h se consiguió una amplificación del RNA diana de 107 veces. Posteriormente, la optimización de la concentración de substratos, fuerza iónica, pH, temperatura y la adición de cosolventes (dimetil sulfóxido y sorbitol) ha permitido conseguir amplificaciones de 108 veces en tan solo 30min.

Fig. 7. Esquema de amplificación de ácidos nucleicos mediante 3SR.



• Strand Displacement Amplification (SDA). Esta técnica se basa en la capacidad de las DNA polimerasas de iniciar la síntesis de DNA a partir de una mella en la dsDNA y de desplazar la hebra mellada durante la síntesis de DNA. De esta forma, las moléculas de hebra sencilla desplazadas sirven de molde para la siguiente ronda de corte y desplazamiento, lo que origina una acumulación geométrica isotérmica de copias de cadena doble y sencilla de la secuencia diana.

Fig. 8. Esquema de la reacción SDA.

La tecnología en la que se basa el SDA es la generación de cortes específicos por la endonucleasa de restricción; estas enzimas normalmente producen el corte en las dos hebras del DNA (lo cual no proporcionaría un molde adecuado para el SDA). Sin embargo, si se utilizan nucleótidos α-tio-substituidos para la síntesis del dsDNA, la hebra recién sintetizada estará hemifosforotiolada y la endonucleasa de restricción cortará una sola hebra.

Los primers utilizados en el SDA constan de dos regiones funcionales:

una región complementaria de la diana de aproximadamente 15-20pb.

otra región que incorpora la diana de restricción.

Después de la incubación con el DNA diana, se añade la polimerasa deficiente en la actividad exonucleasa 3' 5' y los nucleótidos dGTP, dCTP, dTTP y desoxiadenosina 5'-(α-tio)-trifosfato. La elongación del primer por la polimerasa, resulta en la síntesis de una hebra α-tiolada. Una vez que se ha formado la mella por la acción de la endonucleasa de restricción, el extremo 3' originado en el punto de corte inicia la síntesis de DNA al mismo tiempo que desplaza la hebra recién sintetizada. La hebra desplazada participa en una nueva ronda de corte, polimerización y desplazamiento lo que origina, teoréticamente, el doble de secuencias diana después de cada ronda de síntesis.

Como en la 3SR, las reacciones en el SDA son isotermas y simultáneas. No son necesarios los ciclos de amplificación porque las dos hebras de DNA se desnaturalizan enzimáticamente. No obstante, el SDA tiene desventajas:

el tamaño de las dianas que se pueden amplificar es limitado, ya que la procesividad de la mayoría de las DNA polimerasas es menor para moldes de dsDNA (en los que se requiere el desplazamiento de una de las hebras) que para moldes de ssDNA (en los que no se requiere es desplazamiento de una de las hebras).

la necesidad de cortar con una endonucleasa de restricción el DNA genómico antes de la amplificación para dejar libre el extremo 3' de la secuencia diana y poder iniciar la síntesis. Si se pierde una de las dos dianas de restricción que flanquean el DNA diana por alguna



mutación, se obtendrá una acumulación lineal y no geométrica de productos amplificados. Esto ocasiona la necesidad de seleccionar cuidadosamente las secuencias diana ya que deben ser regiones altamente conservadas.

la secuencia diana no debe contener dianas de restricción para la endonucleasa utilizada en el SDA.

Métodos de Amplificación de la Sonda. Una alternativa para detectar dianas muy raras es amplificar la sonda misma. La amplificación de la sonda no origina la incorporación de la información de la diana, aparte de la que esta presente al iniciarse la reacción. En lugar de ello, el producto final de la reacción es una versión amplificada de los componentes originales utilizados para detectar la diana. Estos métodos pueden ser útiles en escenarios en los cuales la información de la secuencia derivada de la diana no es necesaria, tales como la detección de la secuencia nucleotídica característica dentro del genoma de un patógeno.

• Amplificación de sondas de RNA con la Qß replicasa. La Qß replicasa es una RNA polimerasa de 215kD que replica el RNA genómico del fago Qß; está formada por varias subunidades y reconoce específicamente la estructura secundaria del RNA formada por el apareamiento de bases intramolecular del genoma de RNA del fago.

La técnica se basa en que después de que la sonda se haya unido específicamente a su diana y la sonda no unida y unida inespecíficamente haya sido lavada, la sonda es enzimáticamente replicada in vitro hasta niveles que pueden ser fácilmente detectados. Uno de los principales problemas de esta técnica es el background provocado por la hibridación inespecífica de la sonda a secuencias diferentes de la diana o por el fallo en la eliminación completa de la sonda no unida.

Las sondas de RNA se producen por transcripción in vitro de DNA recombinantes; la sonda posee una estructura secundaria similar al substrato silvestre, excepto que porta extensiones específicas de la diana en uno de los lazos de la estructura o en los extremos 5' ó 3'. Las moléculas se incuban con la replicasa Qß purificada; la replicación de las moléculas quiméricas puede aproximarse a 109 veces en una incubación de 30min.

Fig. 9. Esquema de la amplificación de sondas de RNA con la Qß replicasa.

Después de que se ha alcanzado un cierto nivel de amplificación (aproximadamente 107 copias), la Qß replicasa se satura y la cinética logarítmica de la reacción se transforma en lineal y la acumulación del RNA replicado se hace estrictamente dependiente del tiempo. Esta propiedad permite ampliar el rango dinámico cuantitativo del ensayo porque permite establecer una relación lineal entre el número de sondas introducidas en el sistema y el producto amplificado.

El principal obstáculo para conseguir un ensayo sensible es la disminución del background; una posibilidad para intentar conseguirlo es hacer la sonda amplificable dependiente de la conformación, es decir, que sólo las sondas unidas a la diana sean reconocidas por la polimerasa. Una posibilidad es incluir en la sonda una diana para la RNasa III dependiente de hibridación, es decir, que cuando la sonda se encuentre unida a su diana no sea reconocida por la RNasa III porque no se forma el substrato de dsRNA de reconocimiento de la enzima. En ausencia de unión a la diana, la sonda forma estructuras secundarias de dsRNA y pueden ser eliminados por la RNasa III selectivamente.

• Reacción en Cadena de la Ligasa (LCR). Esta técnica alternativa a las técnicas de amplificación dependientes de polimerasa, fue descrita por primera vez en 1989 por Wu y Wallace (Genomics 4: 560-569). El método utiliza la DNA ligasa para unir dos pares de sondas complementarias después de que éstas se hayan unido a la secuencia diana in vitro. El éxito de dicha ligación depende del posicionamiento contiguo y perfecto apareamiento de bases en los extremos 3' y 5' de las sondas en el DNA diana.

Una vez que las sondas se han ligado, el producto de ligación mimetiza perfectamente la doble hebra original, puede servir de molde para la ligación de sondas complementarias. Los componentes se desnaturalizan por calor y se permite que nuevas sondas complementarias hibriden con ambas hebras.

Uno de los principales problemas de esta técnica es el background ocasionado por la ligación por los extremos romos de las propias sondas, el relativamente largo tiempo de reacción, la probabilidad bastante elevada de carryover y la poca relativa severidad de las condiciones de annealing.

Recientemente, se ha descrito una modificación de esta técnica que utiliza una DNA ligasa termofílica aislada de Thermus aquaticus y que, por lo tanto, permanece activa durante los ciclos de desnaturalización térmica y que permite incrementar la temperatura de annealing, lo cual evita, a su vez, los problemas de autoligación de las sondas.



Fig. 10. Esquema de la reacción en cadena de la ligasa (LCR)

Este método, ya sea sólo o en combinación con diferentes métodos de amplificación de la diana, son potencialmente muy útiles para la detección de mutaciones puntuales, ya que las sondas pueden ser diseñadas para que el punto de ligación caiga justamente sobre un nucleótido del que se sabe que puede estar mutado. De esta forma, la ligación efectiva y posterior detección del producto de ligación sólo ocurre cuando los extremos de las sondas son perfectamente complementarios a la secuencia diana.

Métodos de Amplificación de la Señal. Una alternativa a la duplicación o ligación enzimática de los ácidos nucleicos para incrementar la sensibilidad de las técnicas basadas en la hibridación es incrementar la propia señal originada por la sonda. Teoréticamente, es posible incrementar la señal generada por la sonda si el grupo indicador se puede unir en gran número a la sonda o si se puede incrementar la señal generada por cada grupo indicador.

Los métodos de amplificación de la señal no originan un producto replicable, por lo que son menos propensos a la contaminación, pero la sensibilidad que se puede conseguir (entre 104 y 105) generalmente es menor que con los métodos de amplificación enzimática.

• Sondas compuestas. La técnica de las sondas compuestas consta de dos componentes funcionales:

una sonda primaria que reconoce la secuencia diana y contiene múltiples sitios de unión para la sonda secundaria.

las sondas secundarias, cada una de las cuales contiene un grupo indicador.

La incubación de estos componentes con la secuencia del DNA diana ocasiona la formación de una red de compuestos en los que la sonda primaria está unida al DNA diana por la región complementaria específica, quedando una parte de su secuencia libre para unir la sonda secundaria. El árbol de sondas que se genera puede tener diferentes formas lineales o circulares aunque el resultado en todos los casos es el mismo: la capacidad de generar señal de la sonda se incrementa significativamente.

El principal problema de esta técnica es que también se incrementa la señal de las sondas unidas inespecíficamente, originando unos elevados niveles de background.

• Sondas ramificadas (Branched DNA; bDNA). Esta modalidad de amplificación fue desarrollado por la empresa Chiron Corporation y utiliza DNAs ramificados para proporcionar múltiples sitios de hibridación para una molécula indicadora unida a una enzima. Las moléculas precursoras de estos multímeros de amplificación se sintetizan químicamente; la columna vertebral de la estructura en peine se construye con análogos de nucleósidos ramificados que pueden incorporarse a intervalos regulares durante la síntesis del oligonucleótido. Cada sitio ramificado es entonces alargado con un pequeño fragmento oligonucleotídico al cual se puede unir una región específica de la diana.

La amplificación de la señal mediante bDNA incorpora muchos pasos de hibridación simultáneos. Después de la lisis del organismo diana, se utilizan las sondas complementarias de la diana para capturar el ácido nucleico diana a un soporte sólido (sondas de captura). Un segundo set de sondas específicas (sondas de extensión) hibrida con secuencias contiguas y, al mismo tiempo, sirven como sitio de unión (mediante extensiones en el extremo 5') para el multímero de amplificación ramificado. Dichas ramas dirigen la unión de múltiples oligonucleótidos marcados con fosfatasa alcalina (se pueden incorporar hasta 3.000 moléculas de fosfatasa alcalina por cada DNA diana).

La especificidad de esta técnica es muy elevada, ya que es muy rara la hibridación inespecífica de ambas sondas (la de captura y la de extensión). Además el bDNA posibilita una detección cuantitativa a lo largo de varios órdenes de magnitud, por lo que puede utilizarse para monitorizar, por ejemplo, la respuesta terapéutica al �-interferón en el caso de infecciones por Hepatitis B o C, a la azidotimidina en el caso de infección por HIV o al ganciclovir en el caso de infección por Citomegalovirus.



Fig. 11. Esquema de la amplificación de la señal mediante la técnica de branched DNA (bDNA)



Amplificación de ácidos nucleicos in vitro. · • Sistemas de amplificación de la sonda, ......

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