AML 中的微小残留白血病

Steven M. Kornblau, M.D.Department of Leukemia

Department of Stem Cell Transplantation and Cellular Therapy

现状• 多数患者获得缓解– 80% < 60 岁 , 无既往血液病– 50% >60 岁或有既往血液病

• 多数复发– 治愈率 20-25% ， 2/3rd 复发

• 我们能早期检测残留疾病吗 ?• 如是 , 这些信息有助于我们处理患者吗 ?

微小残留白血病诊断时

LeukemiaChemo

Resistant?

Normal

Leukemia

Chemo Sensitive

诱导后 14 天

LeukemiaChemo-R

Normal

LeukemiaChemo-S

Primary Refra

ctory

Leukemia Chemo-R

Normal

CR

Relapse

NormalCure

后期某个时间

Is MRD present?

Can we Detect it?

Can we use this information

MRD 目标• 某个时间点残留疾病的测定– 何时 ?– 哪种标志 ?

• MRD 检测提供的特征可以增加预后信息– 诊断时不能忽视

• 预测复发 vs. CCR 的阈值可被定义– 什么水平是可以被警告的 ?

• 治疗反应的依据– 检测到 MRD 更多或不同的治疗– 检测不到 需要较少的治疗 , 较少的毒性 .

• 作为一种有效性的替代指标 ?

AML 中 MRD 的障碍• 定义追踪的标志不总是存在– 细胞遗传学– 突变– 流式

• 没有标准化的方法• 标准化的阈值没有界定– 测量到的连续变量 , 对分的期待终点 .

• 一种可以改善结果的治疗尚不存在 .

Co-occurrence is frequent creates added complexity When multiple events are present which do you follow?Are effects: Additive, cancel each other out, synergistic?

何时监测 MRD?• 一个时间– 何时 ?

• 诱导后立即 • CR1 时 , 3 个月时 ? ….

• 连续地– 何时开始 ? – 频率 ?

– 约 2 周重复• 相同或升高 认为分子学复发 处理 ?• 下降或持平 , 2 周后重复

针对 MRD 如何反应 ( 变换 )?

Hokland Blood 2011; 117:2577-84

MRD 检测的方法• 多参数流式

– 检测限度 1:10-4

– 更快

• RT-PCR• 分析的局限性 , 靶基因等 .

– 细胞系的实验 “ spiked” 1:10-3 to 10-7 – 操作患者标本 1:10-4 to 10-5

• 耗时• 好标致 PML-RARα, NPM1, MLL, CEPBA, WT1 EVI1(Mecom) PRAME

• 正常骨髓所有的突变在某些水平可提供阳性信号• 再生骨髓与 “正常 l” 骨髓不同 • 文献常错误地将 “检测的限度” 或 “最低可能阈值”冠以 “敏感性”

Hokland Blood 2011; 117:2577-84

多少次是检测的时间 ? 有关系吗 ?– AML N=79, 中位年龄 42.5 (20-67)– RQ-PCR 的频率

• 中位 n 74 每例患者标本 , 范围 10-237 • 但未设立计划 6-60 个月 .

– 标准方案治疗 , 如果 MRD+ 可做 SCT• CR: 23 / 24, 分子学 CR (PCR-) ： 11/24• 17 例 33 次复发

– PB 和 BM- 强相关性 (R= 0.8)– 全 BM 合 CD34+ 和 CD34- 强相关性 (R=.9)– 中位时间为 25.5 天 , 范围 8 to 79 天– 中位 MRD+ PFS 治疗是 119 天– 抢先治疗延迟但没能防止复发 .

• Doubek (ExpHem2009;37:659-672)

Fusion N MRD+ Time to Relapse-days

Outcome

TX at MRD TX at Rel

RUNX1 12 8 26 35 60 77 79 6 Alive 1 D 1 A 1 D

CBFB/MYH11 6 3 19 25 1A 1D 1A

MLL 6 6 8 19 21 24 61 3A 1D 2D

CR1 早期干预有益吗 ?• 化疗 . 延迟但不能防止复发

– Platzbecker Leukemia 2012;26:381-89

• 很多试验在进行中– Pedi- Clofarabine + ara-C for MRD >0.1%– Adults

» Ceplene + low dose IL2» Anti CD33-gemtuzumab» Dendritic cell vaccination» Azacitidine or Decitabine

• Allo SCT- 有争议的好处– 成人

• Walter JCO 2011; 29:1190-97

– 儿童• Rubnitz. Lancet Oncology 2010;11:534-552• WT1 Jacobson Br J Haem 2009:146:2709-16• Leung Blood 2012; 120:468-72

PCR

采用突变的问题

• 突变部位变化 , 插入部位 , 长度• 诊断或复发时是多克隆• 小克隆扩增• 诊断和复发时突变状态可改变– 突变飘移 如 . FLT3-ITD– 丢失或获得突变

• 不稳定性影响了这些标志作为监测 MRD 的应用• 应用 下一代测序追踪随着时间延长发生的克隆演变

可能有用但昂贵 .

复发的动力学影响监测的频率和标本来源

较慢的 较快的

NPM1-mut & FLT3-ITD NPM1-WT & FLT3-ITD

PML-RARα

RUNX1CBFB-MYH11

NPM1

WT1

外周血 骨髓监测标本 :

• PML/RARα 以定量 RT-PCR 是标准方法– 所有还是高危患者 ?

• 诱导后– ATRA & 蒽环类 –无用，因为残留的凋亡和分化细胞– ATO – 任何阳性都是坏的

• 巩固后明确是坏的 – 转为阳性预示复发 . 假阳性少见– PCR 每月升高 1 log 预示复发 .

• 如果转为阳性后治疗而非等待复发结果更好– ATRA + 化疗的时代 : PETHEMA Leukemia 2007, 21:446-52– 砷剂时代 : Grimwade , JCO 2009, 27:3650-8 & Leuk Res 2011;35:3-7– 如果 MRD 阳性时不做移植将影响自体移植质量 (GIMEMA)

– 持续阳性可用异体移植挽救 .• 连续监测 .

– 跟随欧洲癌症项目 (Leukemia 2003, 14:2318-57)

– 骨髓较外周血更敏感 . 1.5 Log.– 巩固后， Q 3 个月共 36 个月

• 经济益处 $4-11K/QALY

APL 的 MRD

APL 单用 ATO 治疗

Chendamarai Blood v119:3143 2012

151 例单用砷剂治疗 .2 步巢式 Q-PCR, 以 BIOMED-1 方法 , 定性研究欧洲癌症项目Sensitivity 10-3 after 1st round, 10-4 after 2nd round Ct = PML-RARα/ABL * 100 Negative if beyond 4020.5% relapsed, median 15 mo

%+ 100 63% 18% 0%RR 4.8 NSSensitivity 86.7%Specificity 42.3%

Good RiskWBC<5, PLT >20

High RiskWBC >5, or PLT <20

% + after induction 69% 62%

Relapse in Neg 0% 10%

Relapse in Pos 22% 32%

Lead time provided by detection of conversion31 relapses15 > 4 months10 never pos6 not done

False Positive conversion4.6% (8/151)

CBFβ AML• inversion 16 假阳性很少见• qRT-PCR – 标准化的欧洲癌症项目比值 w.r.t. β2M • 53 例 伴 inversion 16, 年龄 16-60• 13 个标本 / 患者 , blood vs. BM,

– Diagnosis, Induction cycle #1 and #2, – Consolidation #1,2,3,– Follow up 3 6 9 12 15 18 24 36 72 mo

• 骨髓更敏感• 治疗前与骨髓原始细胞 % 相关 , 与其他临床特征无关• 巩固后下降的动力学与结果无关 • 巩固后 59% 阴性 , 2 年 RFS 阴性者 70% vs. 阳性者 54%

– 14 例阳性 , 10 r 复发 - 从未获得阴性 (Median 1190) – 35 例阴性 , 3 复发 , 2 转为 >10 copies

• 追踪 - 29 阴性在某些治疗点 , 10 转化 , 6 例复发 . 3 例时间点为 3, 5 , 6个月 , 但 3 例在复发时 .

Corbaciaglu JCO 28:3724-3729 2010

Wilms Tumor 1• 90% AML过表达 , 突变 ~ 10%

– Phase I- tested 9 RQ-PCR protocols in 11 labs, cut 3– Phase II tested 6 in 11 labs, selected best 3– Phase III tested 3 protocols on several standards, picked the best

• 正常人作为参比 - 常用表达– 118 PB, 61 BM , 25 G-CSF stim PB

• 检测 – Diagnosis 238 PB, 382 BM, 15 with WT1 mutation– After Anthra+ ara-C therapy N=129, 16 repetitively

• 结果– Blood = BM at Dx and MRD– Mutant = wild type– High levels in Inv16, FLT3itd, NPM1

Cilloni JCO 2009;27:5195-5201

诱导后下降有意义 , >2 log

巩固后水平也有意义

NPM1• 潜在的巨大靶点，约 30% 有突变• 以 PCR 检测，有 17 种不同的突变 .

– Type A= 80%, B ,D = 6% each– Limit of detection 1:10,000 to 1:100,000

• 追踪 252 NPM1 突变的 AML ， 84 例复发– 47 MRD+ 15-221 days (median 62) before relapse– 15 never MRD- Failure to get 3 log reduction = relapse– 31 MRD not + before relapse– All relapses had the same NPM1 mutation– Sensitivity = 62/93 =66%,– Specificity? Not stated.

• 许多时间点有意义• Allo SCT 后有预示意义

Schnittger Blood 2009;114:2220-31

ALLO SCT 后的 MRD • MRD 升高预示复发– 如果存在可以分子学标志– 嵌合体 :

• 受 - 供者比例 , 特别是在 CD34+ 细胞 – Verneris Curr Het Malig Rep 2010;5:157-162

• 快速的复发动力学导致 MRD 应用困难• 根据的 MRD 反应干预显示延迟但不能阻止复

发– Azacitadine. Platzbecker Leukemia 2012;26:381-89

MPFC

多参数流式细胞仪• 仅 50% 的患者有 PCR 适合的标志予以追踪• 80-94% 有流式组合

– Leukemia Associated ImmunoPhenotype, 诊断时定义– 诊断时定义“与正常不同”

• 给予定量结果– 何时评估 ?– 应用何种阈值 ?

• 范围 0.035 to 1% • 常用 0.1%. • 应用 0.01% 无预测价值 (Leung Blood 2012;120:468-472)

– 分析多少细胞 ?• 如 20 个细胞为一簇可定义为 MRD

– 200,000 events 1:10:000 = 20 cells

• 推荐 1 million 因非所有的原始细胞都表达这个组合 .

• 几乎所有的研究应用的水平源于回顾性的并缺乏 确认的群体 .

• See Ossenkoppele Br J Haem 2011;153:421-436 for review of literature

• 必须在诊断时检测 LAIP 并追踪• 可以多于一种 LAIP

• Must follow all of them to pick out minor clones that expand.

• 与正常不同 – 应用一个组合并寻找特征性组合 .– 不同步表达非常有用 . 如 CD34+ 和 CD123+– 系列不忠有用 . 如 . CD7 (淋系 ) 在 AML 原始细胞的表达– 异常表达相关伴有细胞遗传学异常

• AML1-ETO : CD19+, CD11a- CD56+/- cCD79a = poor prognosis• CBFβ –MYH11: CD2+• T(15:17) : CD56 in 20%= bad• NPM1: CD13, CD117 CD110 CD123• CEBPA: 7+

• S&S 最好用 6 种以上颜色流式 , LSC 抗体 & 多重髓系抗原

• 白血病干细胞频率– CD34+ CD38- CD123 CLL-1 CD44 CD47 CD96 & 相同的异常标志 .– 低频不利

白血病相关没有表型 Vs. “ 与正常不同” 方法

• 背景 = 正常细胞表达的– 限制了敏感性和特异性 , – 可提高检测的限度 0.1% to 1%– 背景在 PB 比 . BM 低

• 非所有细胞表达异常标志– 降低敏感性

• 免疫表型漂移可高达 91%– 多数病例有多种 LAIPs 降低了假阴性率 .– 但寻找诊断时的组合将丢失新出现的组合

• 流式需要专业人员操作– 标准化的流程和自动分析将有助

• Schuurheis Expert Rev Hem 2010;3:1-5)

多参数流式细胞仪潜在的问题

MPFC 在 AML 的预后价值研究汇总

Ossenkoppele Gr J Haem 2011:153;421-436

作为 MRD 通过流式监测 LSC • CD34+CD38- & – Positive for CD123 CD117 CD25 – Negative for HLA-DR

• 诊断时的频率预测复发• 治疗后持续阳性预示复发• BM 优于 blood罕见• 降低敏感性罕见• 标志变化存在– C-type lectin like (CLL-1), 不见于正常

MRD 在 儿童 AML- AML02 研究• Induction 1 with high vs. low dose ara-C + Dauno and etoposide• MRD#1 on day 22, if >1% positive then immediately to induction 2, otherwise wait

for recovery of counts then to induction 2 • Induction 2 ADE +/- Gemtuzumab-ozogamicin• MRD#2 by Flow measurement after 2nd indution

– Low HDAC x 3. Good cyto more often negative– High Allo (n =59). Bad cyto more often positive

• 216 AML enrolled 202 evaluable for MRD #1, 193 for MRD#2• Use of high dose ara-C no effect. Use of GO increased conversion to MRD-

MRD#1 # % Relapse 3yr EFS

Positive (>1) 50 49% 43%

Positive (>0.1) 24 17%

Negative 128 17% 74

MRD#2 # % Relapse 3yr EFS

Positive (>1) 17 65% 36%

Positive (>0.1) 21 49

Negative 155 17% 71%

MRD most powerful in multivariateCBF, 11q23 and FLT3 stay in the model

Triage to ALLO didn’t seem to help the high risk group

通过流式加细胞遗传学监测 MRD

• Favorable & Intermediate cytogenetics

• But not to unfavorable or FLT3-ITD

• FLT3 WT– MRD+ adds

• FLT3-ITD– Doesn’t add

Buccisano Blood 2012;119(2);332-341

MRD -

MRD +

MRD -

MRD +

Survival % in Remission

在成人 AML 以流式监测 MRD• 233 consecutive Adults

– Median age 42+ 18– Cytogenetics

• Fav n=49 (Includes 43 APL) Int = 35 Unfav =10 Unk=32

• 3 color + FSC, SSC at diagnosis and remission. – 15K event followed by live gate on larger # of cells – Looked for SAME phenotype as at diagnosis

175 aberrant IP 126 CR with 3+7 x 2 + HDAC+ anthra x 216 to Auto SCT 12 to Allo

# MRD N 3 yr relapse

Median Survival

Low Risk <0.1% 45 14% Not reached

Intermediate Risk >0.1% 64 45% 79 mo

High Risk >1% 17 85% 20 mo

>1%

>0.1%

>0.01%

<0.01%

>1%

>0.1%

>0.01%

San Miguel Blood 2001;98;1746-51

MRD- 需要什么• 标准化分析和界值• 前瞻性研究以评估– 多中心– 多中心实验室

• 临床研究证实 MRD 指导下的治疗改善结果• 预后良好组结果好 , PML-RARα, CBFB-

MYH11, NPM1 • 预后不良 AML 需要标志• 有效的新治疗