Alice Fulgido & Giuseppe Cazzato. Concetti base Mutazioni e riarrangiamenti Processi di riparazione...
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Alice Fulgido & Giuseppe Cazzato
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Concetti base Mutazioni e riarrangiamenti Processi di riparazione del DNA Metodi di studio dei cariotipi Allineamenti genomici Analisi delle regioni di breakpoint
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Concetti baseGENOMA: Intero patrimonio genetico di una specie. Esso però
non comprende solo l’insieme di tutti i geni necessari alla vita di un organismo, ma anche tutto il DNA “non genico”
CROMOSOMI: molecole di DNA organizzate in unità strutturali e
funzionali in cui è suddiviso il genoma
GENE: unità ereditaria fondamentale degli organismi viventi contiene le informazioni genetiche che codificano per
funzioni specifiche all’interno della cellula
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Relazione DNA-gene-cromosoma
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Confronto tra sequenze genomiche METODI: - Mapping, determinare la posizione dei geni su
un cromosoma e la distanza che li separa- Sequencing , identificare l’ordine delle unità chimiche base del Dna (sequenze nucleotidiche)
BENEFICI:- diagnosi e cura di malattie oggi incurabili- migliori selezioni di prodotti di agricoltura e allevamento- miglioramento nelle tecniche di investigazione criminale
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Riproduzione del DNAProcesso molecolare di REPLICAZIONE DEL
DNA comprende: - formazione di legami idrogeno fra le basi
complementari (A, T, C, G) - formazione di un legame covalente
fosfodiesterico
Processo di RIPARTIZIONE DEI CROMOSOMI nelle cellule figlie
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Replicazione del DNA
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Concetti base Mutazioni e riarrangiamenti Processi di riparazione del DNA Metodi di studio dei cariotipi Allineamenti genomici Analisi delle regioni di breakpoint
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Cos’è una mutazione?Il risultato del cambiamento di una o più basi
del DNA
Cause :- Cambiamenti accidentali(durante i processi di
replicazione e ricombinazione)
- Mutageni (fisici o chimici)
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Mutazioni GENICHE: interessano un singolo
gene(consistono in sottrazione, aggiunta o sostituzione di uno o più nucleotidi)
CROMOSOMICHE: estese della struttura dei cromosomi, dipendono da una rottura e da una ristrutturazione anomala degli stessi cromosomi.
GENOMICHE: consistono in alterazioni non
della struttura ma del numero dei cromosomi.
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Conseguenze delle mutazioni
perdita di funzione del gene
Misappaiamenti (appaiamenti errati)se non rimossi rapidamente si propagheranno nelle duplicazioni successive
Ma anche“Differenze migliorative”
(che permettono l’evoluzione della specie)
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Riarrangiamenti Modifiche della disposizione dei geni sui
cromosomi.
Svolgono un ruolo molto importante nell’evoluzione della specie
Hanno origine da uno o più DSBAvvengono quando i meccanismi di riparazione
falliscono o quando si presentano errori
Tipi: delezione, inserzione, inversione, traslocazione, etc…
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Tipi di riarrangiamento
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Concetti base Mutazioni e riarrangiamenti Processi di riparazione del DNA Metodi di studio dei cariotipi Allineamenti genomici Analisi delle regioni di breakpoint
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Double Strand Break (DSB)Più frequenti rotture del DNAInteressa entrambi i filamenti complementari
di DNAConseguenza dell'esposizione del DNA ad
agenti genotossici o di normali processi cellulari
Se non riparata prontamente dalla cellula può causare gravi problemi di instabilità genomica
Strategie: HR (SSA), NHEJ, NAHR
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Homologous Recombination (HR) Ricombinazione omologaCromosoma omologo al danneggiato è usato come
stampo per la riparazione (error free)Conservativo
Single Strand Annealing (SSA): variante di HR. - Si attiva se il DSB si realizza tra sequenze
ripetute - Eliminazione di estremità non omologhe e
allineamento di sequenze omologhe
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Non-Homologous End Joining (NHEJ)
Ricongiungimento delle estremità non omologhe
Non considera l’informazione iniziale del DNA
Può portare a delezioni o mutazioni
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NHEJ vs HR
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Non-Allelic Homologous Recombination (NAHR)
Responsabile di parecchi disordini genomici umani
Comporta il cosiddetto riarrangiamento non equilibrato: acquisizione o perdita di DNA
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Fasi della ricombinazione Rottura e successiva riunione di due cromatidi
(M e F) Produzione di due cromatidi riarrangiati (C1 e
C2)
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Ricombinazione: CROSSING-OVERMeccanismo di ricombinazione
del materiale geneticoproveniente dai duegenitori
Risutato: il figlio eredita una mescolanza casuale degli alleli dei due genitori per i diversi caratteri.
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Concetti base Mutazioni e riarrangiamenti Processi di riparazione del DNA Metodi di studio dei cariotipi Allineamenti genomici Analisi delle regioni di breakpoint
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Cariotipo Costituzione del patrimonio cromosomico di
una specie dal punto di vista morfologicoAnalisi del cariotipo: rappresentazione ordinata
del corredo cromosomico di un individuo
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Studio di cariotipi
Confronto fra cariotipiBandeggio cromosomico (1970)FISH (1990)CGH-arrayMappa genetica
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Bandeggio cromosomico Tecnica di colorazione con sostanze fluorescenti
Vantaggi: ricostruzione della mappa di tutti i cromosomi
(morfologia) e messa in evidenza di eventuali mutazioni
confronto fra cariotipi di differenti specie basandosi su tali modelli
rilevazione di molteplici patologie pre e post-natali
Limitazione: bassa sensibilità diagnostica
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Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)Ibridazione: processo molecolare che unisce due
singoli filamenti complementari di molecole di DNA per formare molecole con doppio filamento di DNA
Utilizza sonde a fluorescenza che si legano in modo estremamente selettivo ad alcune specifiche regioni del cromosoma
Possibili usi:mappare la sequenze di uno specifico cromosomacolorare i cromosomi per raffrontare due specie o
varietà utilizzando il DNA di interi cromosomiscoprire se un paziente è stato infettato da un
agente patogeno (studi clinici)
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Esempio applicazione FISH
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Comparative Genomic Hybridization (CGH)Strumento diagnostico per la rilevazione di
sbilanciamenti cromosomici
Principio della tecnica: si basa su una competizione per il legame di 2 DNA genomici (marcati con fluorocromi diversi) a cromosomi in metafase (non marcati e provenienti da un soggetto sano).
Risultato: rapporto delle 2 fluorescenze. In caso di numero di copie normali avrò 2 copie di DNA da testare e 2 copie del DNA di controllo genomico, per cui il rapporto tra i 2 fluorocromi 2/2 è pari a 1.
Limite: la variabilità della morfologia dei cromosomi che ne limitano la risoluzione a circa 3-7 Mb per le delezioni e 2 Mb per le amplificazioni
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Array-CGHIl principio: coibridazione del DNA in esame e del
DNA di controllo, marcati con fluorocromi diversi, su un microarray di cloni genomici.
Sostituzione cromosomi delle metafasi di riferimento con una matrice su cui sono spottati cloni YAC, BAC o PAC corrispondenti a loci specifici del cromosoma.
Vantaggi: -immediata correlazione tra l’eventuale
alterazione e una precisa posizione nel genoma -standardizzazione della tecnica, ripetibilità e
affidabilità del risultato
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CGH vs Array-CGH
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Mappa GeneticaBasata sui dati di ricombinazione geneticaProcesso che determina la posizione relativa dei
geni sui cromosomi a partire da un loco preso come riferimento
Realizzata per mezzo di due tecniche principali: - Analisi di linkage (analisi degli alleli di diversi
marcatori all’interno di una famiglia di individui)
- Mappa di radiazione ibrida (l’irradiazione di cellule umane con dosi elevate di raggi X e la successiva fusione delle cellule irradiate con cellule di Hamster, consente di ottenere linee cellulari nelle quali frammenti di cromosomi umani risultano integrati nel genoma di Hamster)
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Concetti base Mutazioni e riarrangiamenti Processi di riparazione del DNA Metodi di studio dei cariotipi Allineamenti genomici Analisi delle regioni di breakpoint
![Page 33: Alice Fulgido & Giuseppe Cazzato. Concetti base Mutazioni e riarrangiamenti Processi di riparazione del DNA Metodi di studio dei cariotipi Allineamenti.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062418/5542eb5d497959361e8cc036/html5/thumbnails/33.jpg)
Allineamento genomicoScopo: mettere a confronto sequenze di
genomi della stessa specie o di specie differenti, con l’intento di trovare la percentuale di DNA comune(=conservato), rispetto alla percentuale di DNA che ha subito modificazioni(riarrangiamenti) nel corso dell’evoluzione o a causa di errori all’interno dell’organismo.
Tipi di algoritmi di allineamento: locali e globali
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Esempio di allineamento genomico Date due sequenze nucleotidiche,determinare se
sono sufficientemente simili da farci ritenere che siano derivate da un progenitore comune attraverso processi di mutazione.
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Quale è l’allineamento (statisticamente) migliore ?
Per confrontare quantitativamente gli allineamenti è necessario definire uno score:
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Possibili allineamenti
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Algoritmi globali e localiGlobali: - gestiscono l’allineamento di sequenze intere -svantaggio: i segmenti delle sequenze devono
essere ordinati e non presentare cambiamenti.
Locali: -si allineano sottosequenze delle sequenze di
partenza (ad esempio l’algoritmo di Smith-Waterman) -privilegiati rispetto a quelli globali
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Risultato di una procedura di allineamento
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Metodo seed-extend
Strategia di allineamento
Si basa su: - trovare la parte di segmenti
conservati(definiti “ancore”) - allineare attorno alle ancore i segmenti
riarrangiati
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Step
ANCHORING: Individuare le potenziali regioni di omologhi (ancore)
Filtrarle (ossia eliminare i falsi positivi e fare una scelta fra le differenti copie di elementi duplicati)
Allineare le regioni omologhe identificate (tenendo conto di eventuali gap)
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Concetti base Mutazioni e riarrangiamenti Processi di riparazione del DNA Metodi di studio dei cariotipi Allineamenti genomici Analisi delle regioni di breakpoint
![Page 42: Alice Fulgido & Giuseppe Cazzato. Concetti base Mutazioni e riarrangiamenti Processi di riparazione del DNA Metodi di studio dei cariotipi Allineamenti.](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062418/5542eb5d497959361e8cc036/html5/thumbnails/42.jpg)
Individuazione dei breakpoint (tramite metodi di allineamento genomico)
Lo scopo non è presentare un metodo specifico (ve ne sono molti, con scopi diversi) ma dare le idee base.
Nella discussione utilizzeremo le idee presentate inGRIMM-SYNTENY
CHAINNETCouronne & Patcher (CP)MAUVE
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BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)Strumenti per la ricerca rapida di sequenze di
similarità in banche dati di DNA e proteine.
Perchè?I programmi dinamici (Smith-Waterman) sono stati ideati per allineare due sequenze in modo esatto ma sono troppo lenti per fare ricerche in banche dati.
Come?Sfruttando l’indicizzazione delle sequenze nel DB
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BLAST - funzionamento
1. Crea un elenco di parole di lunghezza W a partire dalla sequenza query.(W=3 per le proteine, W=11 per il DNA)
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45
BLAST - funzionamento
2. Per ogni parola crea un elenco di parole affini (W-mers) con score maggiore di una soglia T
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46
BLAST - funzionamento
3. Analizza tutte le sequenze del DB cercando un match con un W-mers
4. Cerca di estendere ciascun hit in entrambe le direzioni (senza gap) e mantiene gli HSP che superano una certa soglia S
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Anchoring [1/2]
GRIMM-SYNTENY esegue PatternHunter (gapped)
e prende allineamenti unici e non sovrappostiCHAINNET
esegue BLASTZ (gapped) e prende solo gli allineamenti non interrotti
CPBLAT match quasi esatto (+ veloce)
MAUVESolo allineamenti con match esatto e unico
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Individua la similarità locale tra due genomi
Num. di basi trovate
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Anchoring (variante)
Problema:Due specie “distanti” DNA intergenico è mal conservato
Sol.1: allineamento più lasco più falsi positivi
Proposta: utilizzare il DNA codificante (meglio conservato)ed effettuare l’allineamento a livello di proteine(le ancore saranno i geni)
Secondo gli studi di Bourque (confronto mammiferi/polli)i risultati con i due tipi di ancore sono consistenti.
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FilteringIdea: basarsi sul contesto.
1.Raggruppare le ancore
GRIMM-SYNTENY: Manhattan distance < soglia Gruppi con almeno C coppie di basi
CP Raggruppa senza tenere conto dell’orientamento delle
ancore Allineamento globale dei gruppi
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Filtering2. Collegare le ancore
(considerando ordine e orientazione delle ancore)
ChainnetUsa un albero a k-dimensioniUn’ancora potrebbe appartenere a più cateneNon butta via niente ma assegna un punteggio
MauveRipete i passi precedenti con parametri sempre più stringentiConserva le catene con più di X elementi
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AllineamentoSi passa dalle ancore ad un unico allineamento
estendendo i gruppi/catene trovati sinora
Livelli di soglia e parametri minuziosi => difficile fare un confronto tra gli
algoritmi
Ogni algoritmo è stato studiato per specifiche condizioni e specifiche tipologie di studi.
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Concetti base Mutazioni e riarrangiamenti Processi di riparazione del DNA Metodi di studio dei cariotipi Allineamenti genomici Analisi delle regioni di breakpoint
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Analisi delle regioni di breakpoint
Breakpoint:porzione di genoma che è coinvolta in un riarrangiamento
Regioni di breakpoint:regione genomica tra due segmenti “corretti”
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Analisi delle regioni di breakpoint
Analisi puntualeevoluzione di un breakpoint nel tempoEs: studio malattia e sua evoluzione
Analisi sistematica(tutti) i breakpoint nel complesso
Più utile a livello statistico Molti progetti nell’ultima decade per cercare
caratteristiche comuni
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ObiettivoScoprire i meccanismi molecolari che regolano
i riarrangiamenti.
modello di apparizione dei breakpoint ?? Random [Nadau & Taylor -1980]Hotspot [Pevzner, Kent, …]
(accettato per i breakpoint somatici)
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Studi sistematiciFenomeno:
perdita di similarità tra grandi blocchi di sintenia
Causa ?Errori di allineamento [Trinh, Sankov,
…]Micro-riarrangiamenti [Kent, … ]
-> modello non-random(molti rearrangement rendono quella regione più propensa ad ulteriori rearrangement)
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DupliconiDuplicazioni Segmentali (Low Copy Repeats)
- elementi molto simili (>95%)- relativamente piccoli (1-15 kb)
Spesso sono duplicati nella stessa regione cromosomica e sono quindi soggetti a ricombinazioni omologhe tra due copie in differenti loci NAHR
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Sperimentalmente: Duplicazione segmentale prima di un rearrangement
Associazione tra i due cambiamenti (causa/effetto? ) [Armengol]
Dupliconi e Rearrangement sono indipendentiTrovati solo di recente
[Bailey]Caratteristici dei primati
Si trovano entrambi nelle “regioni di rottura”58
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Fragile sitesAree del cromosoma con tendenza a rompersi
in specifiche condizioni di coltura cellulare
La loro presenza indica una zona propensa a possibili riarrangiamenti e a rotture di tipo evoluzionistico(80% secondo gli studi di Ruiz Herrera)
Non esiste un modello e tale correlazione (e
sua tipologia) resta in discussione.
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Analisi puntualeL’esplorazione più in dettaglio del singolo
breakpointporta a modelli per spiegare il rearrangement.
Come al solito, molti studi e molti risultati diversi..
Per quanto riguarda i dupliconi i risultati sono analoghi rispetto agli studi sistematici anche se in molti casi non si è ancora compreso il meccanismo esatto.
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Conclusioni
Molti aspetti riguardanti i processi di rottura dei cromosomi sono ancora irrisolti.
Trend: combinare la potenza dell’approccio puntuale con le ipotesi generate da analisi sistematiche.
Modello di distribuzione dei breakpoint sembra essere quello non-random
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References (principali)
A small trip in the untranquil world of genomes. A survey on the detection and analysis of genome rearrangement breakpoints.
Claire Lemaitre, Marie-France Sagot
Genetica in una prospettiva genomica Hartl Daniel L. – Jones Elisabeth W.
Introduzione alla bioinformaticaG.Valle, M.H.Citterich, M.Attimonelli,
G.Pesole
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