Alexandre Borges Murad

7/25/2019 Alexandre Borges Murad

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INSTITUTO DE TECNOLOGIA EM IMUNOBIOLGICOS

MESTRADO EM TECNOLOGIA DE IMUNOBIOLGICOS

AVALIAO DE ALTERNATIVAS DE MEIO DE CULTIVO PARAA PRODUO DA ERITROPOETINA HUMANA

RECOMBINANTE EXPRESSA EM CLULAS CHO EMSUSPENSO

ALEXANDRE BORGES MURAD

RIO DE JANEIRO2015


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Mestrado Profissional em Tecnologia de Imunobiolgicos

ALEXANDRE BORGES MURAD


RECOMBINANTE EXPRESSA EM CLULAS CHO EM

SUSPENSO

Dissertao apresentada ao Instituto de Tecnologia em

Imunobiolgicos como parte dos requisitos para obteno

do ttulo de Mestre em Tecnologia de Imunobiolgicos

RIO DE JANEIRO2015


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Trabalho realizado no Laboratrio deTecnologia Virolgica Bio-

Manguinhos, Fundao Oswaldo Cruz,

sob a orientao do D.Sc. Rodrigo

Coelho Ventura Pinto e do D.Sc.

lvaro Paiva Braga de Sousa.


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Mestrado Profissional em Tecnologia de Imunobiolgicos


RECOMBINANTE EXPRESSA EM CLULAS CHO EMSUSPENSO

ORIENTADORES: D. Sc. Rodrigo Coelho Ventura Pinto

D. Sc. lvaro Paiva Braga de Sousa

Dissertao aprovada em 03 de maro de 2015

Examinadores:

________________________________D. Sc. Marta Cristina de Oliveira SouzaFiocruz/Presidente

________________________________D. Sc. Ariane Leites LarentisFiocruz

________________________________D. Sc. Aldo TonsoUSP

Rio de Janeiro2015


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minha famlia e amigos,

Todas as conquistas almejadas e alcanadas foram possveis pelo apoio incondicionalde todos vocs. Agradeo, de todo o meu corao, a todos pelo carinho e pela

confiana!


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AGRADECIMENTOS

Gostaria de agradecer a Deus que, independente de crena, f ou religio, sempre memostrou os melhores caminhos e os melhores desafios para vencer constantemente.

Fiocruz e Bio-Manguinhos, pela oportunidade de fazer o MPTI, pelo incentivo de

sempre buscar o conhecimento e o aperfeioamento, como ser humano e profissional.

minha famlia, em especial meu pai Paulo Eduardo Murad, minha me Rita de CssiaBorges Murad, meu irmo Leonardo Borges Murad e minha cunhada Luana DalbenMurad. Amo muito todos vocs! Sem vocs, eu no seria ningum!

Aos meus orientadores, D. Sc. Rodrigo Coelho Ventura Pinto e D. Sc. lvaro PaivaBraga de Sousa que, alm de considera-los profissionais excepcionais, eu os considerodois grandes amigos. Sou muito grato por tudo que aprendi com vocs.

coordenao e secretaria do MPTI, Dra. Sheila Farage por toda luta e defesa que fez esempre far em prol dos seus alunos e Zara por todo cuidado e ateno prestados.Meus mais sinceros agradecimentos.

Aos meus queridos amigos do Projeto EPO, Alvio Cardero, Anna Carolina Marinho,Danilo Parmera, Eduardo Ruback, Esther Gutierrez, Ethiene Corra, Luana de Souza,Mara Pellegrini, Marina Vergne, Tnia Pato e Tiago Pereira por todas as conversas,motivaes e por me fazer acreditar que tenho amigos sempre por perto!

Natlia Pedra Gonalves, por simplesmente tudo! Por toda amizade, desde o primeiro

dia de mestrado, por todas as conversas e, principalmente, por todo carinho. Essemestrado no seria o mesmo sem voc! Obrigado por estar fazendo parte destemomento to especial da minha vida! Eu amo voc!

Aos meus amados irmos de MPTI! Andr Vincius, Ariane Barcellos, Artur Boechat,Camila Xavier, Christina Cerqueira, Jssica Yukie, Maria Carolina Martins, MayraMartho, Monique Stvale, Periela Vasconcelos, Priscila Ramos Martins, Robson Cruz eVivian Pereira. Minha mais nova famlia! J disse uma vez e sempre direi: amo muitovocs!

Aos amigos do LATEV, LATER, LATIM e do LECC/UFRJ, por todo apoio prestadoque foi fundamental para o desenvolvimento deste projeto.

Aos amigos da vida, Artur de Souza, Bernardo de Noronha, Caroline Moutinho, ErickMaia, Flvio Matassoli, Gabriel Vincenzi, Gustavo Rademacher, Henrique Hatano, Jeande Oliveira Santos, Leonardo Montanholi, Pedro Leo, Thiago Patro e Weslley dePaiva Santos. Mais uma vez, obrigado! Vocs podem contar comigo pra tudo como euconto com vocs!

Ao rgo fomentador FIOTEC, pelo fornecimento da bolsa de mestrado.


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Os homens devem moldar seu caminho. A partir do momento em que voc vir o

caminho em tudo o que fizer, voc se tornar o prprio caminho.

Miyamoto Musashi.


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NDICE

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS........................................................... XI

LISTA DE FIGURAS, GRFICOS E TABELAS.............................................. XV

RESUMO................................................................................................................. XIXABSTRACT............................................................................................................. XX

1 INTRODUO................................................................................................. 1

1.1 Produo de biofrmacos em cultivos celulares..................................... 4

1.2 Glicosilao................................................................................................ 6

1.3 Sistemas de cultivo.................................................................................... 10

1.3.1 Cultivo em frascos............................................................................... 10

1.3.2 Cultivo em biorreatores...................................................................... 11

1.3.2.1 Biorreatores do tipo tanque agitado............................................. 12

1.4 Modos de operao................................................................................... 13

1.4.1 Batelada simples.................................................................................. 14

1.4.2 Batelada alimentada............................................................................ 14

1.4.3 Contnuo e contnuo com reciclo celular........................................... 15

1.5

Meios de cultivo para clulas animais..................................................... 171.5.1 Fatores que interferem na produo e qualidade dos

biofrmacos.......................................................................................... 18

1.5.1.1 Carboidratos................................................................................... 18

1.5.1.2 Aminocidos.................................................................................... 19

1.5.1.3 Sais minerais................................................................................... 21

1.5.1.4 Vitaminas........................................................................................ 21

1.5.1.5 Nucleotdeos....................................................................................22

1.5.1.6 Elementos-trao.............................................................................. 22

1.5.1.7 Soro fetal bovino............................................................................. 23

1.5.1.8 Fatores fsicos-qumicos................................................................. 23

2 PROPOSTA DE TRABALHO........................................................................ 26

3 MATERIAL E MTODOS............................................................................. 27

3.1 Material...................................................................................................... 27

3.1.1 Linhagem celular e banco de clulas de trabalho............................. 27


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viii

3.1.2 Meio de cultivo controle...................................................................... 27

3.1.3 Meios de cultivo alternativos.............................................................. 27

3.1.4 Sistemas de cultivo............................................................................... 29

3.2

Mtodos...................................................................................................... 293.2.1 Quantificao celular.......................................................................... 293.2.2 Anlise bioqumica para determinao da concentrao de

glicose e lactato..................................................................................... 303.2.3 Determinao da concentrao de Eritropoietina humana

recombinante (EPOhr)........................................................................ 30

3.2.4 Criao do banco de clulas de trabalho........................................... 31

3.2.5 Descongelamento de clulas CHO para experimentao................. 323.2.6 Sub-cultivos das clulas CHO e cintica comparativa entre os

meios...................................................................................................... 323.2.7 Cultivo em biorreator.......................................................................... 33

3.2.8 Clculo das taxas especficas e rendimentos..................................... 35

4 RESULTADOS................................................................................................. 374.1 Cultivos celulares para adaptao de clulas CHO com meios

alternativos e cinticas comparativas..................................................... 374.1.1 Adaptao e cintica comparativa entre os meios SFM4CHO

Utility e SFM4CHO.......................................................................... 394.1.2 Adaptao e cintica comparativa entre os meios SFM4CHO

Utility e HyCellsem HT.................................................................... 424.1.3 Adaptao e cintica comparativa entre os meios SFM4CHO

Utility e CD FortiCHO...................................................................... 474.1.4 Adaptao e cintica comparativa entre os meios SFM4CHO

Utility e CellventoCHO-110 sem HT.............................................. 504.1.5 Adaptao e cintica comparativa entre os meios SFM4CHO

Utility e CPCHO................................................................................ 54

4.1.6. Integral de Clulas Viveis (ICV)..................................................... 57

4.2. Cultivo em biorreator com meio SFM4CHO..................................... 59

5 DISCUSSO..................................................................................................... 62

6 CONCLUSO................................................................................................... 67

7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS........................................................... 69


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LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

Letra grega alfa

AG Aparelho de Golgi

AIDSSndrome da Imunodeficincia Adquirida (do ingls Acquired

Immunodeficiency Syndrome)

AMPK Enzima quinase ativada por AMP

ANVISA Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria/Brasil

Asn Aminocido Asparagina

BHK Clulas de rim de filhotes de hamster (do ingls, baby kidney hamster)Bio-Manguinhos Instituto de Tecnologia em Imunobiolgicos

C Graus Celsius

CDA Conjugado Droga-Anticorpo

CHOClulas de ovrio de hamster chins (do ingls, Chinese hamster

ovary)

CIGB Centro de Engenharia Gentica de Biotecnologia/Cuba (do espanhol,Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa)

CIMCentro de Imunologia Molecular/Cuba (do espanhol, Centro de

Inmunologa Molecular)

CMC Carboximetilcelulose

COPPEInstituto Alberto Luiz Coimbra de Ps-Graduao e Pesquisa de

Engenharia

CO2 Dixido de carbono

DHFR Diidrofolato Redutase (do ingls,Dihidrofolate Reductase)

DMSO Dimetilsulfxido

ELISAEnsaio Imunoenzimtico (do ingls, Enzyme-Linked Immunosorbent

Assay)

EPO Relativo Alfaepoetina

EPOhr Eritropoetina humana recombinante


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x

[EPOhr]max Concentrao mxima de EPOhr produzida

EUA Estados Unidos da Amrica

Fiocruz Fundao Oswaldo Cruz

Fuc Fucose

Gal Galactose

GalA cido Galacturnico

GalN Galactosamina

Glc Glicose

GlcA cido Glucurnico

GlcN Glicosamina

GlcNac Carboidrato N-acetilglicosamina

GS Glutamina Sintetase

HEK293Clulas de rim de embrio humano 293 (do ingls, Human Embryonic

Kidney)

HK Enzima Hexoquinase

HPV Vrus do Papiloma Humano (do ingls,Human Papiloma Virus)

HT Hipoxantina e Timidina

ICV Integral de Clulas Viveis

IC95% Intervalo de Confiana com 95% de confiana

IdoA cido Idurnico

IFA Ingrediente Farmacutico Ativo

IFN- Interferon-

IGF Fator de Crescimento tipo-Insulina

IP Iodeto de Propdio

Kdn cido 2-ceto-3-deoxinnico


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xi

LATEV Laboratrio de Tecnologia Virolgica

LECC Laboratrio de Engenharia do Cultivo Celular

Ln Logaritmo Neperiano

exp Taxa especfica de crescimento celular da fase exponencial

Man Carboidrato Manose

ManA cido Manurnico

ManN Manosamina

ManNAc N-Acetilmanosamina

MEM Meio Essencial Mnimo

mRNA cido ribonucleico mensageiro

MS Ministrio da Sade

MSX Droga Metionina Sulfoximida

MTX Droga Metotrexato

NaHCO3 Bicarbonato de sdio

Neu5Ac cido N-Acetilneuramnico

Neu5Gc cido N-Glicolilneuramnico

OD Oxignio dissolvido

OGT Enzima N-Acetilgalactosamina transferase

OMS Organizao Mundial de Sade

OST Enzima Oligossacariltransferase

PAF Programa de Assistncia Farmacutica do Ministrio da Sude

PEG Polietileno Glicol

PBS Tampo fosfato-salino (do ingls,Phosphate-buffered saline)

pCO2 Presso parcial de CO2

PFK/PFK1 Enzima Fosfofrutoquinase


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P Produtividade

pH Potencial hidrogeninico

qEPOhr Taxa especfica de formao de eritropoietina

qGlic Taxa especfica de consumo de glicose

qLact Taxa especfica de produo de lactato

RER Retculo Endoplasmtico Rugoso

Ser Aminocido Serina

SFB Soro Fetal Bovino

SUS Sistema nico de Sade

td Tempo de duplicao

Thr Aminocido Treonina

tPAAtivador de Plasminognio tecidual (do ingls, tissue-type

Plasminogen Activator)

TT Transferncia de Tecnologia

UFRJ Universidade Federal do Rio de Janeiro

v/v Volume por volume

VDTEC Vice-Diretoria de Desenvolvimento Tecnolgico

VPROD Vice-Diretoria de Produo

Vvd Volume de reciclo por volume de biorreator por dia

Vvm Volume de gs por volume de biorreator por minuto

Xaa Denominao para qualquer aminocido

v Mdia das clulas viveis

Xyl Xilose

YX/Glic Coeficiente de rendimento celular a partir da concentrao de glicose


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LISTA DE FIGURAS, GRFICOS E TABELAS

Figura 1. Tipos de oligossacardeos N-ligados. Os oligossacardeos esto ligadossempre ao resduo Asn da sequncia Asn-X-Ser/Thr e apresentamdiversas estruturas (rica em manose, hbrida ou complexa). Adaptado de

Stanley et al, 2009............................................................................... 8Figura 2. Desenho esquemtico dos tipos de frascos e garrafas utilizadas para o

cultivo celular............................................................................................. 10

Figura 3. Esquema simplificado de um biorreator do tipo tanque agitado e algunsdos seus componentes impelidor, motor, termostato, um duto pararetirada de amostra e efluentes, chicanas e duto para entrada de gases.Adaptado de Li et al, 2009........................................................................ 13

Figura 4. Esquema simplificado de um cultivo realizado em batelada simples.......... 14

Figura 5. Esquema simplificado de um cultivo realizado em batelada alimentada..... 15Figura 6. Esquema simplificado de um cultivo realizado em sistema contnuo.......... 15

Figura 7. Esquema simplificado de um cultivo realizado em sistema contnuo comperfuso........................................................................................................ 16

Figura 8. Desenho esquemtico da metodologia do sub-cultivo para realizao dascinticas. A figura mostra, de forma resumida, as etapas que precedem ascinticas, incluindo o inculo inicial at a adaptao em garrafasrotatrias....................................................................................................... 34

Figura 9. Clulas CHO em meio TransFx-C . Conforme foi observado e destacadopelos crculos vermelhos, algumas clulas perderam a caracterstica decrescimento em suspenso e voltaram ao estado de aderncia. Aumentode 250x....................................................................................................... 40

Figura 10. Clulas CHO viveis e viabilidade em meio SFM4CHO - Utility eSFM4CHO, respectivamente.- Clulas viveis; - Viabilidade. Nocanto inferior direito do grfico so apresentados os valores de taxaespecfica de proliferao na fase exponencial (exp) e tempo deduplicao (td)............................................................................................................... 42

Figura 11. Produtividade e metabolismo de clulas CHO no meio SFM4CHO -Utility e SFM4CHO. - Concentrao de EPOhr; - Taxaespecifica de formao de EPOhr; - Concentrao de glicose nomeio; - Taxa especfica de consumo de glicose; + - Concentrao delactato no meio; - Taxa especfica de produo de lactato..................... 44

Figura 12. Clulas CHO viveis e viabilidade em meio SFM4CHO - Utility eHyCell sem HT, respectivamente. - Clulas viveis; -Viabilidade. No canto inferior direito do grfico so apresentados osvalores de taxa especfica de proliferao na fase exponencial (exp) etempo de duplicao (td)............................................................................. 46


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Figura 13. Produtividade e metabolismo de clulas CHO nos meios SFM4CHO -Utility e HyCell sem HT, respectivamente. - Concentrao deEPOhr;- Taxa especifica de formao de EPOhr;- Concentraode glicose no meio; - Taxa especfica de consumo de glicose; + -Concentrao de lactato no meio; - Taxa especfica de produo delactato....................................................................................................... 47

Figura 14. Clulas CHO em meio CD FortiCHO . Conforme foi observado edestacado pelos crculos vermelhos, grande parte das clulas cultivadasneste meio formaram mltiplos grumos, dificultando os processos decontagem e adaptao no prprio meio. Aumento 250x............................ 49

Figura 15.Clulas CHO viveis e viabilidade em meio SFM4CHO - Utility e CDFortiCHO. - Clulas viveis; - Viabilidade. No canto inferiordireito do grfico so apresentados os valores de taxa especfica de

proliferao na fase exponencial (exp) e tempo de duplicao(td)............................................................................................................... 50

Figura 16. Produtividade e metabolismo de clulas CHO no meio SFM4CHO -Utility e CD FortiCHO, respectivamente. - Concentrao deEPOhr; - Taxa especifica de formao de EPOhr; - Concentraode glicose no meio; - Taxa especfica de consumo de glicose; + -Concentrao de lactato no meio; - Taxa especfica de produo delactato......................................................................................................... 52

Figura 17. Clulas CHO viveis e viabilidade em meio SFM4CHO - Utility eCellventoCHO-110 sem HT. - Clulas viveis; - Viabilidade. Nocanto inferior direito do grfico so apresentados os valores de taxa

especfica de proliferao na fase exponencial (exp) e tempo deduplicao (td). * Este grfico se repete para facilitar a comparao dosresultados.................................................................................................... 54

Figura 18.Produtividade e metabolismo de clulas CHO nos meios SFM4CHO -Utility e CellventoCHO-110, respectivamente. - Concentrao deEPOhr; - Taxa especifica de formao de EPOhr; - Concentraode glicose no meio; - Taxa especfica de consumo de glicose; + -Concentrao de lactato no meio; - Taxa especfica de produo delactato......................................................................................................... 55

Figura 19. Clulas CHO viveis e viabilidade em meio SFM4CHO - Utility eCPCHO. - Clulas viveis; - Viabilidade. No canto inferiordireito do grfico so apresentados os valores de taxa especfica de

proliferao na fase exponencial (exp) e tempo de duplicao (td)........... 57

Figura 20.Produtividade e metabolismo de clulas CHO nos meios SFM4CHO -Utility e CPCHO. - Concentrao de EPOhr; - Taxa especificade formao de EPOhr;- Concentrao de glicose no meio; - Taxaespecfica de consumo de glicose; + - Concentrao de lactato no meio; - Taxa especfica de produo de Lactato............................................... 59

Figura 21. Grfico com os valores da Integral de Clulas Viveis (ICV) ao longo

do cultivo para os meios CD FortiCHO, CPCHO, HyCellsem HT,SFM4CHO- Utility, SFM4CHOe CellventoCHO-110................... 60


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Figura 22. Clulas CHO viveis, viabilidade e produtividade em meio SFM4CHO

em biorreator. - Clulas viveis; - Viabilidade. A linha tracejadaindica o incio da troca de meio. No canto inferior direito do grfico soapresentados os valores de taxa especfica de proliferao na faseexponencial (exp) e tempo de duplicao (td); - Concentrao deEPOhr; - Taxa especifica de formao de EPOhr; - Concentraode glicose no meio; - Taxa especfica de consumo de glicose. Nocanto inferior direito do grfico apresentada a concentrao mximade produto ([EPOhr]max)............................................................................. 62

Tabela 1.Tabela de expanso celular em meio SFM4CHO Utility e tabelas deadaptao/expanso celular no meio HyCell. Cada valor estrepresentado com seu respectivo desvio-padro. A linha tracejada indicaa substituio do meio SFM4CHO- Utility pelo meio alternativo. GR

Garrafa Rotatria/Roller.......................................................................... 39

Tabela 2. Tabela de expanso celular em meio SFM4CHO Utility e tabelas de

adaptao/expanso celular no meio TransFx-C. Cada valor estrepresentado com seu respectivo desvio-padro. A linha tracejada indicaa substituio do meio SFM4CHO - Utility pelo meio alternativo; oretngulo indica o cultivo feito em meio TransFx-C; GR GarrafaRotatria/Roller.......................................................................................... 39

Tabela 3. Tabela de expanso celular em meio SFM4CHO Utility e tabela deadaptao/expanso celular no meio SFM4CHO. Cada valor estrepresentado com seu respectivo desvio-padro. A linha tracejada indicaa substituio do meio SFM4CHO- Utility pelo meio alternativo. GR

Garrafa Rotatria/Roller.......................................................................... 41

Tabela 4. Tabela de expanso celular em meio SFM4CHO Utility e tabela deadaptao/expanso celular no meio HyCellsem HT. Cada valor estrepresentado com seu respectivo desvio-padro. A linha tracejada indicaa substituio do meio SFM4CHO- Utility pelo meio alternativo. GR

Garrafa Rotatria/Roller................................................................................... 45

Tabela 5. Tabela de expanso celular em meio SFM4CHO Utility e tabela deadaptao/expanso celular no meio CD FortiCHO. Cada valor estrepresentado com seu respectivo desvio-padro. A linha tracejada indicaa substituio do meio SFM4CHO- Utility pelo meio alternativo. GR

Garrafa Rotatria/Roller.......................................................................... 48Tabela 6.Tabela de expanso celular em meio SFM4CHO Utility e tabela de

adaptao/expanso celular no meio Cellvento CHO-110 sem HT.Cada valor apresentado est com seu respectivo desvio-padro. A linhatracejada indica a substituio do meio SFM4CHO- Utility pelo meioalternativo. GRGarrafa Rotatria/Roller................................................ 53

Tabela 7.Tabela de expanso celular em meio SFM4CHO Utility e tabela deadaptao/expanso celular no meio CPCHO.Cada valor apresentadoest com seu respectivo desvio-padro. A linha tracejada indica asubstituio do meio SFM4CHO- Utility pelo meio alternativo. GRGarrafa Rotatria/Roller............................................................................. 56


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Tabela 8. Resumo das taxas, concentrao e rendimentos das cinticas dos meiostestados. TdTempo de duplicao; XvmaxConcentrao mxima declulas vivas; expTaxa especfica de crescimento exponencial por dia;[Glicose]Concentrao inicial de glicose; qGlicTaxa mdia especficade consumo de glicose; [Lactato] Concentrao de lactato formado;qLact Taxa mdia especfica de formao de lactato; [EPOhr]maxConcentrao mxima de EPOhr produzida; qEPOhr Taxa mdiaespecfica de formao de eritropoetina; P Produtividade do cultivo emgerar EPOhr ao dia; YX/Glic Rendimento da formao de clulas porglicose consumida, durante o cultivo........................................................... 60


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RESUMO

Com o avano das tcnicas de biologia molecular, os cultivos celulares passaram a seruma importante plataforma para a produo dos biofrmacos, que so protenasrecombinantes com fins teraputicos, obtidos atravs de processos biotecnolgicos. Amanuteno das condies ideais de cultivo de grande importncia para a obteno do

produto conforme especificaes de qualidade e requisitos de segurana. Desta forma,os meios de cultivo promovem o ambiente e fornecimento de nutrientes ideais sclulas, garantindo o funcionamento normal do metabolismo, do crescimento celular e acorreta sntese do biofrmaco. Neste projeto foi realizada a comparao de diferentes

alternativas de meios de cultivo comerciais, livres de soro fetal bovino e componentesanimais, com o meio de cultivo atualmente utilizado para o cultivo em suspenso declulas CHO secretoras de EPOhr, observando-se a capacidade de promoo decrescimento, produtividade da molcula e metabolismo. Os experimentos foramconduzidos a partir do descongelamento de criotubos de um banco de clulas detrabalho, com clulas CHO secretoras de EPOhr. As clulas foram adaptadas emdiferentes meios de cultivo e em sistemas de cultivo de frascos e garrafas. Ao final daetapa de adaptao direta, foram realizadas cinticas comparativas com o meio utilizadoatualmente. As cinticas (candidato e controle) foram iniciadas a partir da ltima etapade adaptao, durando de quatro a nove dias, dependendo das condies de cultivo. Dosmeios testados, trs apresentaram condies melhores ou iguais ao do meio padro

SFM4CHO

- Utility. Os meios SFM4CHO

e Cellvento

CHO-110 apresentarammelhor capacidade de promoo de crescimento (2,42x106 clulas/mL e 4,6x106clulas/mL, respectivamente), enquanto o meio CPCHO apresentou maior

produtividade e taxa especfica de formao da EPOhr (P = 12,16 g/dia e qEPOhr= 7,3g/106clulas/dia, respectivamente). Os meios de cultivo SFM4CHO e CellventoCHO-110 apresentaram boa capacidade de sustentar a proliferao, alcanandoconcentrao mxima de clulas viveis superior ao meio de cultivo controle, indicando

possuir melhor promoo de crescimento. O meio CPCHO apresentou melhorproduo de EPOhr, em comparao ao meio de cultivo padro. Os resultados sugeremque os trs meios mencionados acima podem ser mais estudados para embasar o seu usocomo alternativa de matria prima numa eventual substituio de meio de cultivo, como

a descontinuao do meio atualmente utilizado no processo.

Palavras-chave: Clulas CHO; Cultivo celular; Eritropoetina humana recombinante;Meio de cultivo;


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ABSTRACT

The development in the field of molecular biology allowed cell culture to play animportant role in the production of biological drugs. Biopharmaceuticals arerecombinant proteins used for therapy purposes that are obtained by biotechnological

processes. Providing the ideal cell culture conditions is extremely important for thesynthesis of a biological product that must comply with quality specifications and safetyrequirements. The culture medium provides physiological environment and nutrientsrequired, thus it has to guarantee the normal cell metabolism, cellular growth andcorrect biopharmaceutical synthesis by the cells. In the present project it was performedan evaluation between different media free of calf serum and animal components andthe standard medium presently used in CHO cell culture for the production of hrEPO,comparing cell growth promotion capability, productivity and cell metabolism. Theexperiments were executed by thawing one vial of hrEPO producing CHO cells fromthe working bank. The cells were directly adapted in different culture media and culturesystems (flasks and bottle). By the end of the adapting stage, it was performed a kineticevaluation (candidate media and standard medium) starting from the last adaptationstage and its duration was variable subjected to the culture conditions. It was observedthat three tested media showed better or similar results comparing to the standardmedium (SFM4CHO-Utility). The SFM4CHO and Cellvento CHO-110 mediademonstrated good capability to promote cell growth (2.4x106 cells/mL and 4.6x106

cells/mL, respectively), while CPCHO

medium showed a better product yield andspecific hrEPO production rate (PCPCHO= 12.2 g/day and qEPOhr_CPCHO_m = 7.3 g/106

cells/day, respectively). In comparison with the standard medium, SFM4CHO andCellvento CHO-110 media demonstrated a better capability for cell growth while theCPCHO medium showed better product yield. The results indicate that the threemediums stated above should be more thoroughly evaluated to support their use asalternative raw material for an eventual medium substitution, such as thediscontinuation of the currently used in the process.

Key-words:CHO cell; Cell culture; Culture media; Human recombinant erythropoietin;


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1

1. INTRODUO

Atualmente, a demanda internacional por medicamentos de alto valor agregado,

como os biofrmacos, vem se tornando prioridade em diversos pases e,

consequentemente, vrios governos vm reduzindo seus gastos com a compra para

atender suas demandas de medicamentos excepcionais de alto custo, incorporando a

produo atrelada a polticas de autossuficincia (Angle 2012). Em linhas gerais, os

biofrmacos so classificados como produtos teraputicos de natureza biolgica,

produzidos por processos biotecnolgicos, onde so utilizados organismos ou clulas

vivas e geralmente envolvendo bioprocessos para gera-los (Rader 2008). Nos polos

produtores de biofrmacos, como Estados Unidos e Unio Europeia, esta categoria de

medicamento cresce progressivamente. Apenas nos Estados Unidos, entre 2010 e 2014,

147 produtos farmacuticos foram aprovados, entre os quais 38 26% dos frmacos

criados so da classe dos biofrmacos. A mesma observao pode ser feita para a

Europa (Walsh 2014).

Aps a primeira aprovao de um biofrmaco para o uso em seres humanos em

1982 Humulin, Insulina humana recombinante (Eli Lilly) novos biofrmacos

entraram no mercado, tendo nas ltimas duas dcadas um crescimento exponencial,

contabilizando um nmero aproximado de 60 biofrmacos produzidos e liberados para

consumo. Com a demanda acentuada por essa nova classe de medicamentos, o mercado

farmacutico apresenta alta taxa de retorno financeiro. A exemplo, 37 produtos

farmacuticos que se enquadram nessa classe e considerados bem sucedidos atingiram

mais de US$ 1 bilho em vendas em 2013, s nos Estados Unidos (Walsh 2014).Algumas empresas, visando o retorno garantido pelo mercado criado pelo uso do

medicamento original, passaram a desenvolver medicamentos denominados

biossimilares. Quando a patente dos biofrmacos j descritos expira, outras empresas

que no detinham os direitos de produo podem produzi-los, gerando os biossimilares.

A vantagem dos biossimilares encontrada no preo, j que estes costumam ser mais

baratos, em comparao ao produto-matriz (Walsh 2014).


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2

Alguns exemplos podem ser citados, como os conjugados droga-anticorpo (CDA)

anticorpos monoclonais associados a medicamentos para tratamento de certas

doenas, geralmente para cncer (Mylotarg/Wyeth e Kadcyla/Genentech) os

biofrmacos que recebem uma molcula de polietileno glicol (PEG), como o PEG-

Interferon ou o acrscimo de uma cadeia de cido silico na molcula de eritropoetina,

como na -Darbepoetina (Elgrie & Browne 2001; Walsh 2014).

O Brasil est includo neste contexto por intermdio do Ministrio da Sade (MS)

e algumas de suas instituies federais. O Instituto de Tecnologia em Imunobiolgicos

(Bio-Manguinhos) da Fundao Oswaldo Cruz (Fiocruz), alinhado a sua misso,

trabalha no intuito de desenvolver e produzir novos biofrmacos que atendero as

necessidades de sade pblica da populao.

Com a nacionalizao de processos produtivos de medicamentos que eram

importados a preos elevados, grande parte da populao brasileira passou a ter acesso a

medicamentos de alto valor agregado por intermdio do Sistema nico de Sade (SUS),

que distribui gratuitamente esses itens. A partir desta estratgia, Bio-Manguinhos passa

a fazer parte do grupo de fornecedores do MS, no mbito do Componente Especializado

da Assistncia Farmacutica. Neste momento, Bio-Manguinhos/Fiocruz d um salto

tecnolgico na produo de medicamentos, o que aumenta a sua variedade produtiva e

fortalece seu posto no programa de desenvolvimento industrial e tecnolgico do

governo federal. Este fato mostra a inteno do governo federal em fortalecer a rea

tecnolgica do pas e reduzir a dependncia nacional de imunobiolgicos e biofrmacos

importados.

A deciso do governo brasileiro em obter imunobiolgicos e biofrmacos com

qualidade e distribuir gratuitamente para a populao possui como exemplo a parceria

entre Cuba e Brasil. Por intermdio da Fundao Oswaldo Cruz (Fiocruz/RJ) e de Bio-

Manguinhos os dois pases estreitaram relaes cooperativas e firmaram acordos de

transferncia de tecnologia de biofrmacos de interesse do Ministrio da Sade do

Brasil. Estes acordos foram firmados entre o Centro de Imunologia Molecular

(CIM/Cuba) e o Centro de Engenharia Gentica de Biotecnologia (CIGB/Cuba) com

Bio-Manguinhos, visando transferncia parcial ou total dos processos produtivos da

Eritropoetina humana recombinante (EPOhr), Alfaepoetina, e da Interferona alfa 2b

(Alfainterferona), respectivamente. Ao mostrar o grande valor para economia brasileira,


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3

os acordos de transferncia de tecnologia TT levam reduo de gastos com a

compra desses medicamentos pelos cofres pblicos, fortalecendo a economia nacional.

O fornecimento gratuito dos componentes especializados (PAF Programa de

Assistncia Farmacutica/MS), representados por inmeros biofrmacos de alto custo,resulta em gastos significativos para o governo. Aps a assinatura da TT (2004) e

obteno do registro junto Agncia Nacional Vigilncia Sanitria (ANVISA) em

2006, o Ministrio da Sade passa a adquirir esses biofrmacos de Bio-Manguinhos

(laboratrio pblico produtor), promovendo assim aes de desenvolvimento produtivo

no complexo industrial da sade, conforme disposto na portaria N1554 de 30 de Julho

de 2013. Alfaepoetina humana recombinante (EPO), um dos biofrmacos que faz parte

do portflio de Bio-Manguinhos desde 2006 indicada para pacientes com anemia por

insuficincia renal crnica, anemia resultante do tratamento para a Sndrome da

Imunodeficincia Adquirida (AIDS) em regime teraputico com Zidovudina e pacientes

oncolgicos em tratamento quimioterpico (Alfaepoetina 2011). Aps assinado o

acordo de Transferncia de Tecnologia, Bio-Manguinhos vem se preparando

gradualmente para a incorporao de toda produo de EPOhr, desde a produo do

Ingrediente Farmacutico Ativo (IFA), baseado em sistema de cultivo de clulas

animais, at seu processamento final, culminando na completa nacionalizao da

tecnologia de produo.


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4

1.1. Produo de biofrmacos em cultivos celulares

Os cultivos celulares so empregados para produo de compostos qumicos e

produtos de origem biolgica. Atualmente, com o avano da biotecnologia e da

engenharia gentica, os cultivos celulares foram os sistemas encontrados para aproduo dos biofrmacos, que so protenas recombinantes com fins teraputicos,

obtidos atravs de processo biotecnolgicos (Stryjewska et al 2013). A biotecnologia

industrial aplicada na rea dos biofrmacos foi inicialmente impulsionada com a

produo em larga escala da penicilina, durante a Segunda Guerra Mundial, evoluindo

com o respaldo dos avanos no campo da biologia molecular para criao de sistemas

de obteno de molculas complexas de uso teraputico (Stryjewska et al 2013).

Diversos organismos podem ser cultivados e utilizados industrialmente paraproduo de inmeros metablitos primrios, como aminocidos, vitaminas e

metablitos secundrios (antibiticos, agentes antitumorais e anti-helmnticos), enzimas

e protenas recombinantes expressas por sistemas biolgicos, ao qual a protena de

interesse no nativa (Adrio & Demain 2010). Muitos micro-organismos como

Escherichia coli e Pichia pastoris so utilizados na produo de produtos biolgicos

simples que no necessitam de modificaes ps-traducionais ou apresentam

modificaes bsicas, no sendo necessria utilizao de clulas com maquinariaenzimtica mais complexa (Rabert et al 2013; Wang et al 2014; Jappelli et al 2014).

Entretanto, quando a protena recombinante precisa de modificaes ps-traducionais

complexas para ter sua atividade biolgica completa, estabilidade funcional e a

qualidade requerida, torna-se necessrio o emprego de clulas eucariontes superiores

que so capazes de realizar as modificaes ps-traducionais necessrias (Meyer et al

2013).


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5

A modificao ps-traducional mais comum e que ocorre em todas as clulas

animais a glicosilao, onde as protenas recombinantes recebem cadeias de

carboidratos em regies especficas da cadeia de aminocidos (Li & dAnjou 2009).

Diversas linhagens celulares so empregadas na expresso de protenas recombinantes,

dando destaque s clulas de mamferos, sendo as mais utilizadas as HEK 293 (clulas

de rim humano embrionrio), CHO (clulas de ovrio de hamster chins) e BHK

(clulas de rim de filhotes de hamster). Em alguns casos o animal trangnico, como

coelhos e cabras, podem ser utilizados obtendo-se o produto solvel no leite produzido

pelo tecido geneticamente modificado (glndulas mamrias), como o Atryn uma

antitrombina alfa recombinante secretado no leite de cabras transgnicas (Walsh

2014).

Entretanto, no s clulas de mamferos so empregadas para a expresso dessas

molculas. Atualmente, clulas de insetos e de plantas tm sido estudadas e,

consequentemente, utilizadas para a produo de biofrmacos. Clulas de inseto que

utilizam sistemas de expresso virais foram empregadas para a produo de vacinas,

como a Flublok (Sciences; Meriden/EUA) contra o vrus Influenza e a Cervarix

(GlaxoSmithKline/Gr-Bretanha) contra o HPV (Vrus do Papiloma Humano) e,

recentemente, uma protena recombinante expressa por clulas vegetais que

expressam a protena e a armazenam nos vacolos celulares Elelyso (Protalix

Biotherapeutics/Pfizer), foi aprovado para o uso em seres humanos pelos EUA (Walsh

2014).

Mesmo com novos sistemas de expresso desenvolvidos, a clula CHO a mais

utilizada em processos de produo de protenas recombinantes para uso teraputico

(Meleady et al 2011; Wuest et al 2012). Mediante o emprego das clulas CHO nos

cultivos celulares para produo de protenas recombinantes, diversas estratgias podem

ser aplicadas para o aprimoramento da expresso proteica. Desde a obteno de um

vetor mais competente na expresso da protena recombinante, sistemas de

amplificao, o emprego de genes que expressam fatores de crescimento, o controle de

apoptose e ainda a suplementao do meio de cultivo com componentes que beneficiam

o crescimento celular (Hee et al 2013; Khan 2013). Com relao aos sistemas de

amplificao, os mais empregados so os da Diidrofolato Redutase (DHFR) e

Glutamina Sintetase (GS) (Chartrain & Chu 2008). O processo comea quando o gene

da DHFR ou da GS retirado do genoma da populao de clulas CHO que ser usada


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para a expresso da protena de interesse. Aps a deleo, o vetor com o gene-alvo junto

com o gene que expressa a DHFR ou a GS transfectado nas clulas CHO e d-se

incio ao processo de seleo criado pelo sistema de amplificao (Omasa et al 2010).

Para verificar a integrao do vetor no genoma das clulas transfectadas, as mesmas so

tratadas, em diferentes concentraes, com substncias inibidoras como o metotrexato

(MTX) para o sistema com DHFR ou metionina sulfoximida (MSX) para o sistema com

GS. As clulas que integraram o vetor ao seu material gentico passaro a expressar em

grande quantidade o gene da DHFR ou GS para suprir a inibio qumica e

consequentemente co-expressaro o produto do gene-alvo (Matasci et al 2009). O grau

de resistncia desejado ao inibidor vai depender das concentraes aplicadas durante a

seleo. Aps a confirmao da resistncia desejada, a populao resistente passa a

expressar a DHFR ou GS e co-expressar a protena de interesse no meio de cultivo semadio do MTX ou MSX (Butler 2004). O nvel de expresso no depende apenas dos

inibidores qumicos, mas de inmeras outras caractersticas, como o vetor empregado, o

local de insero do vetor no cromossoma da clula, da linhagem celular utilizada e do

meio de cultivo empregado na produo da protena recombinante (Matasci et al 2009).

A seleo feita pelos inibidores gera clulas que expressam grandes quantidades

da protena de interesse. Isso est relacionado ao fato da integrao do gene de interesse

ocorrer no mesmo stio de integrao do gene de seleo no cromossoma da clula

(Omasa et al 2010). As subpopulaes que sobreviveram ao processo de seleo so

clonadas, de acordo com seu nvel de produtividade da protena-alvo e pela taxa de

crescimento. Para garantir a constante expresso do gene de interesse, se faz necessrio

o uso de uma rotina de verificao da produo da protena, j que a produtividade pode

reduzir em cultivos de longa durao (Omasa et al 2010).

1.2. Glicosilao

A glicosilao modificao ps-traducional mais comum realizada por clulas

eucariontes e consiste na ligao enzimtica de cadeias oligossacardicas em

determinados aminocidos das protenas expressas pelas clulas. Existem dois tipos de

glicosilao, gerando os N-glicanos e os O-glicanos (Li & dAnjou 2009). Essas

ligaes so possveis na presena de enzimas situadas no aparelho de Golgi (AG) e no

retculo endoplasmtico rugoso (RER) das clulas, podendo variar de atividade de

acordo com a espcie origem da linhagem, levando formao de diferentes


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glicoformas. As N-glicosilaes so as modificaes ps-traducionais mais comuns e

so realizadas por fungos e outros eucariotos superiores, como as clulas vegetais e

animais. O processo de N-glicosilao comea quando um oligossacardeo precursor

composto de trs resduos de glicose na poro no reduzida da sequncia manose-9-N-

Acetilglicosamina-2 (Man9GlcNAc2) gerado pela adio de monossacardeos

associados a nucleotdeos e fica ancorado em uma molcula lipdica denominada

dolicol-pirofosfato, formando a estrutura glicose-3-manose-9-N-Acetilglicosamina-

dolicol pirofosfato (Glc3Man9GlcNAc2-P-P-dolicol) (Butler 2008). A transferncia da

estrutura central Glc3Man9GlcNAc2 para a cadeia polipeptdica ocorre durante a

traduo do mRNA no RER e catalisada pela enzima oligossacariltransferase (OST),

formando uma ligao N-glicosdica. No caso dos N-glicanos, a estrutura central

liberada do dolicol-fosfato ancorada em resduos de Asparagina presentes nasequncia consenso asparagina-Xaa-Serina/Treonina (Asn-Xaa-Ser/Thr) da protena

recombinante, onde Xaa pode ser qualquer aminocido, exceto Prolina (Helenius &

Aebi 2004). Os oligossacardeos so aparados por glicosidases, como a -manosidase 1,

residentes na membrana do RER antes da protena ser transportada para o aparelho de

Golgi e, dependendo da linhagem de clula animal utilizada, novos padres de

glicosilao podem ocorrer, diferenciando as glicoformas produzidas (Butler 2008).

Em clulas animais como a clula CHO e clulas HEK 293, por exemplo, existem

variedades de exoglicosidases e glicosiltransferases presentes no AG capazes de

remodelar o coreMan9GlcNAc2, criando uma gama de glicoformas heterogneas com

regies antenrias variadas, como as antenas ricas em resduos de Manose, hbridas,

complexa com ou sem resduos de Fucose e estruturas multiantenrias, conforme

mostrado na figura 1 (Li & dAnjou2009; Hossler et al 2009; Butler 2008; Stanley et al

2009). Uma caracterstica interessante o fato de oligossacardeos ancorados com

galactose terminal possurem uma taxa maior de sialilao (insero de cido silico no

coreoligossacardico). A sialilao das protenas recombinantes torna-se importante no

mbito de muitas glicoprotenas utilizadas como biofrmacos, pois este fenmeno

garante caractersticas fundamentais, como a sua atividade biolgica, maior tempo de

circulao da protena no organismo (previne a remoo de protenas pelo fgado) e

baixa antigenicidade (Durocher & Butler 2009). Os nveis de sialilao podem variar, de

acordo com a linhagem celular, protena recombinante e condies de cultivo, como

concentrao de nutrientes e fatores fsico-qumicos (Durocher & Butler 2009). As


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diferentes vertentes citadas acima so estudadas com certa frequncia. Em especial,

estudos sobre a disponibilidade e diferentes concentraes de nutrientes e metablitos

esto entre os assuntos mais pesquisados (Aghamohseni et al 2014; Borys et al 2010;

Liu et al 2014).

Figura 1.Figura ilustrativa dos tipos de sacardeos e oligossacardeos N-ligados que podem ser ligados protena de interesse. Os oligossacardeos esto ligados sempre ao resduo Asn da sequncia Asn-X-Ser/Thr e apresentam diversas estruturas (rica em manose, hbrida ou complexa). Adaptado de Stanley etal 2009.

Esta grande variedade de estruturas pode ser definida pelos termos macro-

heterogeneidade e micro-heterogeneidade (Butler 2008). A macro-heterogeneidade

caracterizada pela possibilidade de ocupao das sequncias consenso ao longo da

Rica em manose Complexa Hbrida

Complexas

Origemde

estruturas

multinatenrias


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cadeia polipeptdica pelos N-glicanos, mesmo em pontos de baixa acessibilidade (Butler

2008). Como a formao de pontes dissulfeto nos polipeptdeos tambm ocorre ao

mesmo tempo da traduo do mRNA, algumas sequncias consenso podem no receber

o N-glicano. Devido a este fato, a mesma protena pode apresentar glicoformas

diferentes no mesmo organismo. J a micro-heterogeneidade caracterizada pela

diversidade dos N-glicanos ancorados na mesma protena. Este fato acontece quando

nem todas as reaes catalisadas pelas transferases do AG so executadas corretamente

na estrutura final do N-glicano, podendo criar diferentes estruturas, principalmente nas

estruturas complexas (Butler 2008).

Existe outro tipo de glicosilao, a O-glicosilao, onde o N-acetil-galactosamina

(GalNAc) ligado covalentemente pela ao da N-Acetilgalactosamina transferase

(OGT) em resduos de Ser ou Thr da protena, gerando O-glicanos (Li & dAnjou 2009;

Brockhausen et al 2009). Os resduos de Ser e Thr podem apresentar trs estados:

intactas sem a presena de qualquer molcula acoplada fosforilada ou com O-

glicanas ligadas (Hart et al 1996; Lubas et al 1997). Os O-glicanos so estruturas

menores do que os N-glicanos e so inseridos aps a etapa de traduo no aparelho de

Golgi, quando a protena est totalmente enovelada. Aps a insero do GalNAc nos

resduos de Ser ou Thr, at oito estruturas centrais podem ser formadas, devido ao

grande nmero de transferases que agem aps a insero da estrutura principal (Butler

2008; Hart & Akimoto 2009). Atualmente, j se sabe que as O-glicanas tm a funo de

regular a conformao proteica, facilitar a montagem da estrutura multimrica da

protena, assim como a estabilidade estrutural da mesma e que as modificaes nos O-

glicanos so dinmicas e podem ter o propsito regulatrio da molcula (Bektas &

Rubenstein 2011).

Como previamente citado, a linhagem de clulas CHO so as mais empregadas

nos cultivos celulares para a produo de protenas recombinantes de uso teraputico.

Este fato explicado pela alta produtividade, robustez, biossegurana, facilidade na

manipulao gentica e pela habilidade em criar padres de glicosilao similares aos

padres humanos (Meleady et al 2011; Rahimpour et al 2013), alm disso, por ser a

clula mais utilizada, apresenta maior quantidade de informao disponvel. Rahimpour

e colaboradores (2013) discutem que apesar da clula CHO apresentar um baixo nvel

de produo, em comparao clula procaritica ou eucaritica inferior, os nveis e


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complexidade da glicosilao que a clula CHO possui compensa a relativa baixa

produtividade.

1.3. Sistemas de cultivo

Para a realizao da produo de biofrmacos, dois sistemas de cultivo so

bastante explorados: o cultivo de clulas em frascos (estticos, em garrafas rotatrias e

frascosspinnerem pequena escala) e o cultivo de clulas em biorreatores para obteno

de um maior volume produtivo para obter uma maior massa do produto de interesse. Os

cultivos de clulas em frascos e em garrafa, geralmente, so utilizados para expanso da

linhagem celular, como preparao do inculo para o cultivo em biorreatores ou

adaptao das clulas ao cultivo em suspenso. O biorreator utilizado para aumentar a

escala do cultivo e, por consequncia, empregado na produo, tanto experimentalquanto industrial (Vliz et al 2008).

1.3.1. Cultivo em frascos

Os cultivos realizados em frascos e garrafas, exemplificados na figura 2, so

muito utilizados como propagador do inculo. Nos frascos estticos T-25 e T-75, o

inculo costuma ser basal para dar incio propagao do cultivo celular, no sendo

inferior a 105

clulas por mililitro, devido ao volume do frasco e necessidade deconcentrao mnima tima para a propagao (Lu et al 2007).

Figura 2.Desenho esquemtico dos tipos de frascos e garrafas utilizadas para o cultivo celular.

O escalonamento do cultivo celular realizado para se obter maior superfcie ou

volume, possibilitando a obteno de mais biomassa e, consequentemente, maior

produtividade. Tal processo pode ser empregado em garrafas rotatrias do tipo Roller.

As garrafas rotatrias so garrafas cilndricas que ficam em constante movimento em

uma base que apresenta rolamentos, permitindo que as clulas ali presentes entrem em

contato constantemente com o meio de cultivo. Apesar da iminente substituio das

garrafas rotatrias por novas tecnologias frascos spinner e frasco shakers

Frasco T-25 Frasco T-75

GarrafaRoller Frasco Spinner


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(Amanullah et al 2010; Bleckwein et al 2005), vacinas com base na utilizao destas

garrafas se encontram em fase de desenvolvimento, onde importantes resultados foram

obtidos (Chou et al 2012).

Outra opo de frasco que pode ser utilizado no escalonamento de cultivoscelulares so os frascos do tipo spinner (Kallel et al 2002). um frasco que apresenta,

ligada tampa, uma barra magntica com uma hlice que se estende at o fundo do

frasco (Bleckwein et al 2005), ou um pndulo com a mesma funo de agitao. Este

sistema j foi muito utilizado nos ltimos 10-20 anos, mas atualmente est sendo

substitudo pelos sistemas de frascos agitados do tipo shakers, que, como principal

caracterstica, apresentam maior facilidade de manipulao (Amanullah et al 2010).

1.3.2. Cultivo em biorreatores

Os biorreatores permitem o cultivo apropriado de micro-organismos e clulas

tanto animais quanto clulas vegetais permitindo o monitoramento e controle dos

parmetros de processo e com a vantagem de poderem alcanar maiores volumes de

cultivo (escalonamento), visando escala industrial (Vliz et al 2008). Os biorreatores

possuem algumas classificaes, porm uma bastante utilizada em relao

homogeneidade da distribuio celular.

Os biorreatores possuem, pelo menos, duas fases dentro dos seus vasos: a fase

lquidareferente ao meio de cultivoe a fase slida (referente s clulas cultivadas).

Os equipamentos que conseguem uniformizar a fase lquida com a fase slida, ou seja,

as clulas encontram-se difundidas no meio, so considerados biorreatores homogneos.

Os equipamentos que apresentam uma diviso de fases e no apresentam clulas

difundidas na fase lquida, so denominados biorreatores heterogneos (Vliz et al

2008). O enfoque dado neste trabalho foi aos biorreatores homogneos devido ao

escalonamento dos cultivos celulares e futuras produes de EPOhr em biorreatores

homogneos de tanque agitado.

Biorreatores homogneos: so os mais empregados no desenvolvimento e na

indstria, pela facilidade que eles apresentam para monitorar o ambiente do cultivo e

permitem realizar correes que no alterem a fisiologia celular (Vliz et al 2008). Os

biorreatores homogneos mais utilizados so os biorreatores de tanque agitado, do tipo

wavee air-lift.


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Biorreatores heterogneos: so assim denominados por apresentarem duas fases

em seu interior, uma onde as clulas utilizadas para a produo do produto de interesse

ficam imobilizadas em compartimentos contendo superfcies ou em leito biocompatvel,

simulando o tecido de origem da clula e a outra sendo a circulao de meio de cultivo

para nutrir essas clulas aderidas. Estes biorreatores foram desenvolvidos para atender

ao uso de clulas com caractersticas aderentes, o que representa uma desvantagem no

que se refere ao monitoramento das condies de cultivo, pois no possvel realizar

uma amostragem homognea da populao celular presente no biorreator. Devido

caracterstica do crescimento celular (semelhante a um tecido), nem todas as clulas tm

o aporte necessrio de nutrientes e oxignio, criando diferentes nveis de crescimento e

fases metablicas em um mesmo cultivo e a dificuldade no escalonamento da matriz

aderente (Vliz et al 2008).

1.3.2.1. Biorreatores do tipo tanque agitado

Os biorreatores em ao inox do tipo tanque agitado so os mais utilizados na

indstria, mesmo j existindo novas alternativas para o cultivo celular como os

biorreatoressingle use (Eibl et al 2010; Hsu et al 2012). Os sistemas de tanque agitado

apresentam como vantagem a sua simplicidade operacional, a facilidade no

monitoramento, controle e escalonamento da produo do biofrmaco (Warnock & Al-Rubeal 2006; Jain & Kumar 2008). Porm, a formao de bolhas e as tenses de

cisalhamento que podem danificar as clulas durante o cultivo so desvantagens que

este biorreator apresenta (Kunas & Papoutsakis 2009).

Basicamente, este tipo de biorreator composto por um vaso (geralmente feito de

vidro borossilicato) resistente ao calor, quando o uso do biorreator voltado para a

pesquisa em pequenos volumes e de ao inoxidvel, quando utilizado escala industrial

(50 L 15.000 L) (Vliz et al 2008). Este biorreator possui diversos componentes

ilustrados na figura 3 (tubulaes, vlvulas, bombas, motores e sensores), que esto

envolvidos nas operaes necessrias para a conduo do cultivo, como a injeo de

meio e suplementos, agitao, aerao, exausto, monitoramento, colheita e etc. Esses

perifricos podem ser feitos de diversos materiais (silicone, polmeros e ao inox)

dependendo da escala em questo. O sistema que caracteriza este tipo de biorreator o

de agitao, apresentando impelidores movidos por um motor, de acoplagem mecnica

ou magntica. Os biorreatores tambm apresentam chicanas que so estruturas presentes


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nas paredes internas do vaso que evitam o fenmeno de vrtice, favorecendo a

homogeneizao ideal do contedo do biorreator (Sauid et al 2013).

Figura 3.Esquema simplificado de um biorreator do tipo tanque agitado e alguns dos seus componentesimpelidor, motor, termostato, um duto para retirada de amostra e efluentes, chicanas e duto para entradade gases. Adaptado deLi et al 2009.

O biorreator de tanque agitado pode ser operado em diversos modos, devido a sua

simples caracterstica operacional, sendo possvel realizar ajustes e modificaes nas

suas correntes de entrada e sada, resultando na sua supremacia como sistema de

produo de biofrmacos em grande escala. Desde a produo de clulas-tronco (Olmer

et al 2012), produo de biomassa para produzir a vacina da gripe (Hundt et al 2011),

anticorpos (Tuvesson et al 2008) e protenas recombinantes, como a Eritropoetinahumana recombinante (Chuan et al 2006) e a Isoflavona (Kokotkiewicz et al 2013) em

quantidades relevantes para comercializao em massa.

1.4. Modos de operao

Os quatro principais modos de operao de cultivo em biorreatores so: cultivo

descontnuo (conhecido como batelada ou batch), cultivo descontnuo alimentado

(caracterizado como batelada alimentada oufed-batch), cultivo contnuo e contnuo comreteno de clulas, tambm denominado como contnuo com perfuso (Vliz et al

2008). Cada modo de operao empregado de acordo com as caractersticas que o

processo apresenta, como caractersticas da linhagem celular empregada (estabilidade

gentica para expresso da protena de interesse, capacidade da linhagem em suportar

concentraes elevadas de metablitos txicos e resistncia s condies fsico-

qumicas do biorreator) e a necessidade do mercado pelo produto gerado, determinando

a capacidade produtiva do sistema (Vliz et al 2008).

Entrada degases

Termostato

Chicanas

Impelidor

Efluentes

Bomba

Nvel de gua

MotorEntrada de gases

Tanque de alimentao


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1.4.1. Batelada simples

Este o modo mais simples de cultivo em biorreatores. Como esquematizado na

figura 4, este sistema consiste no cultivo realizando-se um inculo em um volume

determinado de meio que ser coletado ao final do processo. Neste processo, no ocorreacrscimo de nutrientes ao longo da corrida nem reciclo celular ou do meio

metabolizado. Durante este processo, ocorre heterogeneidade metablica, exposio

prolongada do biofrmaco a condies que podem deterior-lo, alm de esgotamento

dos nutrientes e acmulo de metablitos txicos para a clula (Vliz et al 2008).

Figura 4.Esquema simplificado de um cultivo realizado em batelada simples.

Mediante tais fatos, muito utilizado para produo de biolgicos e compostos

resistentes a eventuais degradaes, tendo como base celular micro-organismos ou

clulas eucariticas. Estudos mais recentes mostram o uso da batelada simples como

padro para definir parmetros experimentais para a aplicao de outros modos de

operao, como a batelada alimentada (Vanz et al 2014; Moreno et al 2013).

1.4.2. Batelada alimentada

Em bioprocessos utilizando o modo de conduo do cultivo celular denominado

de batelada alimentada, ocorre suplementao de nutrientes ao meio de cultivo inicial e

o volume de operao varia de acordo com a capacidade do vaso do biorreator, como

mostrado na figura 5. O cultivo comea com um volume inicial padro e ao longo do

processo, novas quantidades de meio de cultivo ou determinados nutrientes so

adicionados ao volume inicial, viabilizando uma sobrevivncia mais longa do cultivo

celular e uma maior produtividade relativa do biolgico, porm o problema do acmulo

de metablitos txicos permanece, alm do maior tempo de exposio do produto alvo a

condies desfavorveis, o que prejudica a produo de produtos mais lbeis (Vliz et al

2008).

InculoPerodo

Cultivo

Colheita


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15

Figura 5.Esquema simplificado de um cultivo realizado em batelada alimentada.

O emprego da batelada alimentada auxilia na extenso da viabilidade celular e,

consequentemente, aumenta os nveis de produo da protena de interesse (Ren et al

2013), assim como possvel aperfeioar a produo de certos compostos alternativos

com o uso da batelada alimentada (Zhang et al 2014).

1.4.3. Contnuo e contnuo com reciclo celular (perfuso)

O modo contnuo baseia-se, conforme figura 6, na troca constante de meio

metabolizado por meio de cultivo novo, a fim de prolongar a durao da corrida. Ao

retirar o meio metabolizado, clulas presentes no cultivo tambm so retiradas,

juntamente com os metablitos txicos e o produto de interesse, permitindo a

recuperao constante do mesmo. Esta troca e retirada, quando feita de forma racional,

ou seja, vinculada velocidade especfica de crescimento das clulas, evita a lavagemdo biorreator retirada em excesso de clulas do cultivo proporcionando um maior

tempo de corrida e uma maior viabilidade celular, o que favorece a produo da

protena recombinante. J o processo contnuo com reciclo celular mais complexo e

mais eficaz, ao se tratar de produo de biofrmacos (Vliz et al 2008).

Figura 6.Esquema simplificado de um cultivo realizado em sistema contnuo.

O modo contnuo com perfuso segue a mesma linha do modo contnuo, porm

com a vantagem de reter as clulas durante a troca do meio, no sendo necessrio o

vnculo entre a taxa de perfuso e a taxa especfica de crescimento, conforme figura 7.

Inculo

Perodo

Cultivo

AlimentaoColheita

Inculo

Alimentao

Cultivo

Colheita

Cultivo

Perodo Perodo


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16

Este processo permite a troca constante de meio metabolizado por meio de cultivo

novo e uma corrida prolongada que gera um alto ndice de viabilidade celular e

concentrao celular, consequentemente, maior produo do biolgico. Diversos

dispositivos podem ser usados com o objetivo de reter as clulas durante o modo

contnuo com perfuso. Podem ficar externamente ao biorreator, igual ao da figura 7, ou

podem ficar dentro do biorreator. Normalmente, eles so baseados em separao por

campo gravitacional ou centrfugo e filtrao, mas todos dependentes do tamanho e

densidade da clula a ser retida e separada do meio retirado. Estes dispositivos tm

algumas desvantagens, os baseados em filtrao podem apresentar entupimento e os

dispositivos baseados em centrifugao podem sofrer com a adeso celular nas paredes

do dispositivo e entupimento dos dutos de sada. Para amenizar os problemas, algumas

estratgias so adotadas como sistemas de refrigerao que induzem a formao deagregados celulares, facilitando a sedimentao das clulas retidas e estruturas pulsantes

que previnem a adeso celular nos compartimentos de drenagem (Castilho & Medronho

2002).

Figura 7. Esquema simplificado de um cultivo realizado em sistema contnuo com reciclo celular.

A grande vantagem dos modos contnuos, de uma forma geral, a homogeneidade

das condies de cultivo, garantindo a produo de produtos com baixa variabilidade.

Gorenflo e colaboradores (2004) j haviam documentado a vantagem do modo contnuocom reteno de biomassa que garantia nveis altssimos de densidade celular e taxas de

produtividade superiores a uma ordem de grandeza, em comparao com o modo de

batelada simples. Um fator muito importante que garante os elevados nveis descritos

pelo modo em perfuso a capacidade de manter os metablitos txicos a nveis no-

letais, favorecendo a longevidade do cultivo (Petiot et al 2011; Yeo et al 2013).

Perodo

Cultivo

Alimentao

Reciclo Celular

DispositivoReteno Celular

Inculo Colheita


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1.5. Meios de cultivo para clulas animais

Os meios de cultivo so compostos por componentes que oferecem nutrientes e

condies ambientais ideais s clulas presentes no cultivo, possibilitando o

funcionamento normal do metabolismo e do crescimento celular. Os primeiros relatosde meios de cultivo datam do sculo XIX, onde estes eram compostos de diferentes sais

em suas concentraes timas com o propsito de cultivar e manter vivas clulas

animais. Desde ento, pouca coisa foi estudada at Harry Eagle que, em 1955,

desenvolveu o meio basal MEM (Meio Essencial Mnimo), servindo de base para o

desenvolvimento de outros meios mais completos. O desenvolvimento do MEM foi o

marco inicial para a pesquisa na rea e hoje existem diversas linhas de desenvolvimento

com base na criao de novos meios de cultivo (Van der Valk et al 2010; Jordan et al

2013). A partir dos meios basais, os meios de cultivo podem ser classificados como

meios complexos por apresentarem componentes de proporo no definida (extratos e

hidrolisados) e meios definidos, que apresentam a proporo de todos os componentes

da sua formulao em concentraes conhecidas. Os meios livres de soro (meios que

no necessitam da suplementao com soro, podendo conter extratos e hidrolisados), os

meios livres de protena (no apresentam protenas de alto peso molecular, mas

apresentam peptdeos na sua composio) e os meios livres de componentes de origem

animal (no apresentam nenhum componente de origem animal ou humana, porm

podem apresentar componentes no-definidos, como extratos de levedura ou de

plantas), em essncia, so considerados meios complexos (Van der Valk et al 2010). Os

meios quimicamente definidos no apresentam protenas, hidrolisados ou extratos de

composio desconhecida, s contendo componentes conhecidos, como hormnios e

fatores de crescimentos purificados. Os novos meios de cultivo estudados e

desenvolvidos so baseados na unio dos diferentes tipos de meios de cultivo, visando

melhor resposta da clula e melhoria do processo e do produto de interesse (Van der

Valk et al 2010).

Conforme Van der Valk e colaboradores (2010) e Jordan e colaboradores (2013)

discutem em seus trabalhos, atualmente a grande maioria das pesquisas voltadas para

este campo visa criao de meios quimicamente definidos (meio de cultivo que no

contm protenas, hidrolisados ou qualquer outro componente de composio

desconhecida) e livres de soro fetal bovino. O motivo dessa padronizao no processo

se d pelo fato de que algumas substncias ou fatores podem alterar os perfis de


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expresso e de glicosilao de certas protenas recombinantes e prejudicar sua produo

(Gawlitzek et al 2009). A busca por meios quimicamente definidos impulsionada por

questes regulatrias (retirada de componentes de origem animal) e de homogeneidade

de insumos para a produo (quimicamente definidos, eliminando a variao lote-a-lote)

(Van der Valk et al 2010).

1.5.1. Fatores que interferem na produo e qualidade do biofrmaco

Inmeros fatores ou compostos presentes nos meios de cultivo podem alterar o

perfil metablico celular, impactando na proliferao, expresso da protena e processo

de glicosilao, refletindo assim na qualidade da protena recombinante. A seguir, foram

listados alguns destes fatores e como eles podem afetar o produto de interesse, alm de

fatores fsico-qumicos referentes s condies de cultivo, como faixa de pH,temperatura, osmolalidade, concentrao de gases e tenses de cisalhamento. Nos dois

ltimos casos, importante destacar que, apesar de no serem fatores ligados

diretamente composio do meio, existem elementos e caractersticas especficas da

sua formulao que podem amortizar os efeitos negativos de estresses hidrodinmicos

causados pela aerao intensa e a agitao.

1.5.1.1. Carboidratos

Os carboidratos exercem diversos papis no cultivo celular. Os sacardeos so

importantes fontes de energia e tambm possuem funo estrutural, como no processo

de glicosilao (Wang et al 2010). Exercendo seu papel de principal fonte de energia do

meio, a concentrao ideal de glicose necessria para a manuteno do cultivo celular

em condies adequadas. Estudos mostram que nveis aceitveis de glicose no meio

influenciam diretamente o crescimento celular e a produtividade da protena

recombinante (Dowd et al 2001).

O correto balano da quantidade de componentes presentes no meio de extrema

importncia, uma vez que a presena de altas concentraes de glicose acarreta na

produo de altos nveis metablitos, como o lactato at 50 mM ou 4,5 g/L que

podem ser txicos para o cultivo, inibindo o crescimento celular (Zhou et al 2011).

Zhou e colaboradores (2011) ainda citam a necessidade de adio de compostos

alcalinos para regular o pH do meio que tende a acidificar por causa do lactato e, como

consequncia da adio de mais compostos, a osmolaridade do meio tambm alterada.


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O conjunto destes fatores pode inibir o crescimento celular e levar a uma produo

reduzida da protena recombinante (Cruz et al 2000; Lao & Toth 1997).

Devido ao grande consumo de glicose pelas clulas e, em consequncia, o alto

nvel de lactato no meio de cultivo, estratgias de controle do consumo de glicose eproduo de lactato vm sendo estudadas para aprimorar a produtividade e a

longevidade celular, durante o perodo de cultivo (Mulukutla et al 2010). A regulao

de certas enzimas metablicas como a hexoquinase (HK) e fosfofrutoquinase (PFK ou

PFK1) e a regulao metablica por protenas sinalizadoras e elementos de controle de

crescimento, como insulina, fator de crescimento do tipo-insulina (IGF), o proto-

oncogene cMyc e protena quinase ativada por AMP (AMPK) so possveis gene-alvos

que podem ser transfectados e favorecer o cultivo, aumentando a produtividade da

linhagem celular que expressa a protena de interesse (Mulukutla et al 2010).

Alm da funo energtica, os carboidratos apresentam a funo de integrar as

cadeias laterais de oligossacardeos ancoradas nas protenas pelo processo da

glicosilao. Inmeras glicoformas podem ser geradas com grande variabilidade de

estruturas de glicanos ancoradas em regies especficas do esqueleto proteico como

efeito da composio de acares do meio de cultivo, que influencia nas estruturas

antenrias adicionadas protena (Butler 2008) e a grande quantidade de enzimas daclula relacionada neste processo, onde, por exemplo, para ocorrer a sialilao, diversas

sialiltransferases precisam estar presentes (Murphy et al 2013).

1.5.1.2. Aminocidos

Os aminocidos so nutrientes para o desenvolvimento da linhagem celular no

cultivo e para a expresso da protena recombinante de interesse. Todo meio de cultivo

precisa ter todos os vinte aminocidos, tanto os essenciais quanto os no essenciais, para

que possam exercer suas funes estruturais e energticas na clula e secreo da

protena recombinante (Kyriakopoulos et al 2013). Os aminocidos so as unidades

primordiais que formam as protenas recombinantes. Alm da funo estrutural, os

aminocidos servem como pontos de ancoragem para a ocorrncia das modificaes

ps-traducionais e sua disposio estrutural pode interferir na mesma, promovendo ou

inibindo stios de glicosilao (Ben-Dor et al 2004).


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Em termos energticos, a glutamina o aminocido mais importante e est

presente nos meios de cultivo por sua versatilidade (Hossler et al 2009). Este

aminocido pode ser usado para integrar as protenas recombinantes expressas pelas

clulas, na sntese de nucleotdeos e como fonte de energia. Apesar das funes que a

glutamina desempenha, o aminocido quimicamente instvel, o que no permite a

estocagem do meio em temperaturas acima de 4C e a sua esterilizao por meio de

calor (Butler & Christie 1994).

Uma consequncia desfavorvel do uso da glutamina o fato da liberao de

amnio no meio de cultivo, resultado da degradao do aminocido pelas clulas e da

molcula ser quimicamente instvel. A liberao do on amnio pela clula decorre do

processo de utilizao da glutamina no ciclo do cido tricarboxlico, principal rota

metablica para a alta gerao de energia celular aerbica (Butler & Christie 1994). A

glutamina pode ser utilizada pela clula para retroalimentar o ciclo do cido

tricarboxlico, gerando intermedirios do ciclo, contribuindo para a manuteno do

mesmo e preservando a respirao aerbica da clula no cultivo (Alberts et al 2010).

Concentraes de amnio acima de 5,1 mM podem ser txicas para a clula e

interferem no pH intracelular, afetando as modificaes ps-traducionais realizadas no

aparelho de Golgi, que so dependentes do pH (Chen & Harcum 2005; Xing et al 2008).

Uma alternativa que pode diminuir a concentrao de amnio no meio a troca da

glutamina por glutamato (Van der Valk et al 2010). A vantagem do uso do glutamato

a liberao de uma molcula de amnio para cada molcula de glutamato, o que no

ocorre com a glutamina que tem a taxa de duas molculas de amnio para cada

molcula de glutamina. Assim, menos amnio liberada no meio, diminuindo a sua

influncia inibitria e aumentando a longevidade do cultivo (Huang et al 2006).

Outra estratgia que vem sendo explorada a utilizao de um dipeptdeo, mais

especificamente, L-alanil-L-glutamina (Imamoto et al 2013). Este dipeptdeo mais

estvel e mais solvel do que a L-glutamina livre. Apesar da reduo da taxa de

crescimento celular, os nveis de produtividade da protena de interesse aumentaram

quando a L-glutamina foi totalmente substituda pelo dipeptdeo. Alm do aumento na

produtividade, ficou evidenciada uma reduo de amnio no meio de cultivo, devido

estabilidade da molcula e o consumo mais equilibrado do dipeptdeo (Imamoto et al

2013).


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1.5.1.3. Sais minerais

Alm dos nutrientes orgnicos, as clulas animais necessitam do aporte de sais

minerais presentes no meio de cultivo (Gong et al 2006), em especial os ons clcio

(Ca

2+

) e magnsio (Mg

2+

). O on Ca

2+

considerado um dos mais importantes ctionsmetlicos por sua participao ativa em mecanismos intracelulares, regulando a

transcrio de genes, a mitose celular e apoptose (Crabtree 2001).

O on Mg2+ est envolvido no co-transporte de outros ons pelas membranas

celulares e ajuda na regulao de, no mnimo, trezentas enzimas presentes no

metabolismo celular, sntese de cidos graxos, estabilizao ribossomal e sntese

proteica (Gong et al 2006). Devido importncia dos sais minerais na manuteno

celular, a presena no meio de cultivo de vital importncia, onde a disponibilidadepode interferir no crescimento e na produo da protena recombinante de interesse.

1.5.1.4. Vitaminas

As vitaminas contidas nos meios de cultivo desenvolvidos para as clulas animais

costumam estar presentes em pequenas concentraes e apresentam importante

influncia no crescimento celular e na secreo de protenas heterlogas. A sua

participao no controle da mitose celular e apoptose garantem s vitaminas grandeimportncia na formulao dos meios de cultivo e necessidade de um balano muito

bem afinado com as demandas metablicas da linhagem celular empregada (Ishaque &

Al-Rubeai 2002).

O grupo de vitaminas da famlia do complexo B costuma estar presente em

diversos meios de cultivo para clulas animais atuando como cofatores e coenzimas no

metabolismo de carboidratos, lipdeos, protenas e cidos nuclicos. Na ausncia de

determinadas vitaminas do complexo B, altos nveis de apoptose foram detectados,demonstrando a sua importncia na suplementao do meio. Outras vitaminas devem

ser adicionadas, como as vitaminas lipossolveis (E, D, A e K) e o cido ascrbico

(vitamina C) (Moraes et al 2008).

A vitamina E ajuda a combater as espcies reativas de oxignio geradas no

cultivo. A vitamina D regula o transporte de ons clcio do meio pela clula. A vitamina

A tem papel fundamental na diferenciao e no crescimento celular, a vitamina K


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importante no processamento proteico realizado pela clula e o cido Ascrbico

essencial na sntese de colgeno pela clula animal (Moraes et al 2008).

1.5.1.5. Nucleotdeos

Os precursores de nucleotdeos modulam as concentraes intracelulares dos

prprios nucleotdeos, resultando em diferentes nveis de sialilao e estruturas

antenrias (Hossler et al 2009). Baker e colaboradores (2001) mostraram que

suplementando o meio de cultivo com Glicosamina e uridina, os nveis de N-acetil-

hexosamina intracelular foram elevados, aumentando a presena de estruturas antenrias

no cultivo de clulas CHO secretoras de inibidores de metaloproteinases teciduais 1,

porm reduzindo os nveis de sialilao da protena.

Entretanto, Gu & Wang (1998) usaram de mesma tcnica e suplementaram um

cultivo de clulas CHO produtoras de Interferon- (IFN-) com N-Acetilmanosamina

(precursor do cido silico) com o intuito de aumentar a sialilao nas molculas de

IFN-e o resultado foi positivo, resultando em um aumento da sialilao das cadeias de

carboidratos. A suplementao aumentou os nveis de cido silico circulante em at

trinta vezes comparado ao cultivo-controle. Estes resultados mostraram que os nveis de

acares nucleotdicos interferem diretamente na glicosilao das protenas

recombinantes e sua suplementao no meio de cultivo importante fator para a

qualidade da glicosilao e consequentemente da glicoprotena.

1.5.1.6. Elementos-trao

Os elementos-trao so elementos inorgnicos, em sua grande maioria compostos

por metais, e servem como cofatores para ativao completa de certas protenas

essenciais no metabolismo celular (Merchant et al 2006). Alguns metais, como ferro,

cobre, mangans, molibdnio e vandio existem em diversos estados oxidados estveisem meio aquoso e representam metais importantes para as reaes redox do organismo.

Devido sua importncia metablica, os elementos-trao precisam fazer parte do meio

de cultivo para serem utilizados como nutrientes pelas clulas.

Contudo, as mesmas propriedades essenciais dos elementos-trao podem ser

prejudiciais e causar danos celulares. Alguns elementos tm seu potencial citotxico

exacerbado quando entram em contato com o oxignio (Imlay 2003). Em metais como o

ferro e o selnio, a dose letal e a dose recomendada para consumo humano so muito


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prximas e o mesmo acontece com outros animais, o que requer uma homeostase por

parte dos organismos para no ocorrer o desequilbrio (Merchant et al 2006).

1.5.1.7. Soro Fetal Bovino (SFB)

O soro fetal bovino uma mistura complexa formada de diversos fatores de

crescimento, vitaminas, protenas e outros compostos que so considerados essenciais

para a proliferao e manuteno celular e para a correta sntese do biofrmaco/protena

recombinante (Van der Valk et al 2010). No entanto, o SFB possui desvantagens que

desencorajam a continuidade do seu uso nas aplicaes biotecnolgicas para a produo

de insumos para sade falta de padronizao dos soros, ocorrendo variao nos

cultivos e no produto final de acordo com o lote de insumo utilizado, contaminao por

vrus, prons e um maior nmero de etapas de purificao da protena recombinante(Berlec & Strukelj 2013).

Apesar dos cultivos celulares apresentarem resultados melhores com o uso do

SFB, como descrito por Grillberger e colaboradores (2009), as autoridades regulatrias

no mbito da vigilncia sanitria vm encorajando a busca de alternativas para a

substituio do SFB. Dado este motivo, sugere-se o uso de substncias definidas que

exeram as mesmas funes do SFB, como protenas e hormnios sintticos, para

alcanar os mesmo efeitos no processo de produo. A preocupao em substituir os

meios com soro por meios livres de soro no recente. Alternativas para o SFB so

estudadas desde a dcada de 90. Por exemplo, Keen & Rapson (1995) desenvolveram

um meio de cultivo livre de soro fetal bovino para a produo, em grande escala de um

anticorpo monoclonal produzido por clulas CHO, o CAMPATH-1H. Entretanto, a

melhor opo para a substituio do SFB o uso dos meios quimicamente definidos.

Devido aos avanos na rea de meio de cultivo, diversos processos biotecnolgicos j

empregam os meios livres de soro para cultivar suas respectivas linhagens celulares e

obter boas taxas de produtividade celular (Chu & Robinson 2001; Rodrigues et al 2012;

Zhang et al 2013).

1.5.1.8. Fatores fsico-qumicos

Diversos fatores fsico-qumicos podem interferir na produo do

biofrmaco/protena recombinante. Um fator de grande relevncia a temperatura de

cultivo que tem impacto no crescimento celular e, consequentemente, na expresso da


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protena recombinante. Dependendo da linhagem celular, as variaes de temperatura

podem interferir na produo e nas modificaes ps-traducionais (Vergara et al 2012).

Em clulas de mamferos, que tem a temperatura tima de crescimento

estabelecida em 37C, as variaes trmicas podem ser benficas ou prejudiciais (Yoonet al 2006a). Estudos mostram que uma diminuio na temperatura do cultivo (de 37C

para 32C) pode levar a um aumento na produtividade da protena recombinante, porm

interferir nos padres de glicosilao gerados pelo sistema biolgico, como no caso da

EPOhr que tem nveis de sialilao menores em temperaturas mais baixas que 37 oC

(Bollati-Fogoln et al 2005; Trummer et al 2006).

Se a temperatura considerada um fator importante na expresso da protena, o

pH dentro do reator tambm exerce importante papel. De acordo com Yoon ecolaboradores (2006b), uma pequena variao na faixa de pH (de 7,0 a 7,2) pode

intensificar a produo sem prejudicar as modificaes ps-traducionais sofridas pela

protena. Entretanto, uma maior variao na faixa de pH pode causar alteraes nos

perfis de glicosilao (Muthing et al 2003), salientando a importncia de se manter as

condies de cultivo constante/homogneas, onde o modo de operao escolhido tem

grande influncia.

As concentraes de gases dentro do biorreator e o valor de saturao de oxignio

oxignio dissolvido (OD) tambm tm papel importante na glicosilao. Com

relao concentrao de gases, a presso parcial de CO2 (pCO2) tem ligao direta

com a sialilao, onde quanto maior a pCO2, menor o nvel da glicosilao (Zanghi

1999). J em relao ao oxignio dissolvido, o efeito nas modificaes ps-traducionais

varia de acordo com a linhagem celular e a protena expressa. Em uma faixa de 10 a

100% de saturao, a linhagem consegue realizar suas modificaes sem alteraes

relevantes (Butler 2006; Restelli et al 2006).

Com relao s tenses de cisalhamento foras vetoriais que as clulas esto

expostas dentro do biorreator devido agitao para homogeneizar o meioelas podem

provocar alteraes no tamanho das ramificaes de carboidratos gerados durante a

glicosilao no seu stio especfico de ancoragem. Estudos mostram que altos nveis de

danos provocados pelas tenses de cisalhamento so suficientes para reduzir o tamanho

da cadeia polissacardica localizada na posio Asn 184 na protena tPA (ativador de

plasminognio tecidual) (Senger & Karim 2003).


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A osmolaridade um importante parmetro no processo de cultivo celular. Este

fenmeno causa alteraes no rendimento, glicosilao e sialilao da protena

recombinante (Konno et al 2012). Diferentes nveis de osmolaridade j foram testados

em diversas linhagens celulares, onde a faixa tima de crescimento celular encontra-se

entre 280 a 320 mOsmmiliosmol (Takagi et al 2001). As clulas CHO, por exemplo,

quando entram em situao de hiperosmolaridade, podem alterar sua conformao

celular. As clulas CHO nessa condio apresentam um maior volume e reduo no seu

crescimento, porm a produtividade da protena recombinante pode apresentar

incremento significativo, em comparao com a mesma linhagem em condies

normais (Takagi et al 2001; Zhang et al 2010). Outro motivo para a necessidade do

controle da osmolaridade a capacidade de altos nveis de presso osmtica causar

apoptose nas linhagens celulares, como foi observado em clulas CHO,independentemente de qualquer outro fator que tambm leva apoptose, como a

depleo de nutrientes (Han et al 2009).


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2. PROPOSTA DE TRABALHO

Direcionado pela necessidade de alternativas para o insumo meio de cultivo

utilizado atualmente no processo de transferncia de tecnologia, antecipando uma

eventual descontinuao do mesmo, o presente projeto busca analisar o comportamento

dos cultivos de clulas de ovrio de hamster chins (CHO) e o padro de secreo da

EPOhr, em sistemas de frascos do tipo T25cm2, T75cm2, garrafas rotatrias e em

biorreator de tanque agitado, utilizando diferentes meios de cultivo, afim de encontrar

meios alternativos que apresentam caractersticas semelhantes s encontradas no meio

de cultivo atualmente utilizado (SFM4CHOUtility).

Objetivo principal:

Comparar diferentes alt

Alexandre Borges Murad

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