B

วิทย

การผลิต

Bioplastic P

ยาศาสตรบณั

ตพลาสติกชวี

AlcaligenProduction

Alcaligen

จารุสุกญัสุวร

ณฑิต สาขามหาวิทยา

วภาพจากน้ํ

nes eutroph from Cas

nes eutroph

รุวรรณ ญญา รรณ ี

าวิชาชีววิทยลัยเทคโนโลพฤษภาคม

น้ายอยแปงมั

hus TISTRsava Starc

hus TISTR

มารุจกลา ศรีนอก แกวลอม

ยา คณะวิทยลยีราชมงคลม 2555

ันสําปะหลัง

R 1095 ch Hydroly

R 1095

ยาศาสตรแลลธัญบุรี

งดวย

ysated by

ละเทคโนโลยียี

การผลิตพลาสติกชีวภาพจากน้ํายอยแปงมันสําปะหลังดวย

Alcaligenes eutrophus TISTR 1095 Bioplastic Production from Cassava Starch Hydrolysated by

Alcaligenes eutrophus TISTR 1095

จารุวรรณ มารุจกลา สุกัญญา ศรีนอก สุวรรณ ี แกวลอม

โครงงานดานชีววิทยานี้เปนสวนหนึ่งของการศึกษาตามหลักสูตรวิทยาศาสตรบัณฑิต สาขาวิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี

มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีราชมงคลธัญบุรี พฤษภาคม 2555

การผลิตพลาสติกชีวภาพจากน้ํายอยแปงมันสําปะหลังดวย

Alcaligenes eutrophus TISTR 1095 Bioplastic Production from Cassava Starch Hydrolysated by

Alcaligenes eutrophus TISTR 1095

จารุวรรณ มารุจกลา สุกัญญา ศรีนอก สุวรรณ ี แกวลอม

โครงงานดานชีววิทยานี้ ไดรับการพิจารณาอนุมัติใหนับเปนสวนหนึ่งของการศึกษาตามหลักสูตรวิทยาศาสตรบัณฑิต สาขาวิชาชีววิทยา

คณะกรรมการโครงงานดานชีววิทยา

……………………………………………… ประธานกรรมการ (อาจารยอัษฎาวุธ อารีสริิสุข)

………………………………………………. กรรมการ (ดร. อนันต บุญปาน)

……………………………… ...………….… กรรมการ (อาจารยศิริพร ลุนพรม)

  

จารุวรรณ มารุจกลา สุกัญญา ศรีนอก สุวรรณี แกวลอม 2555 : การผลิตพลาสติกชีวภาพจากน้ํายอยแปงมันสําปะหลังดวย Alcaligenes eutrophus TISTR 1095 : ปริญญาวิทยาศาสตรบัณฑิต (ชีววิทยา) ประธานกรรมการที่ปรึกษา : อ. อัษฎาวุธ อารีสิริสุข

บทคัดยอ

งานวิจัยนี้มจีุดมุงหมายเพื่อศึกษาการผลิตพลาสติกชีวภาพ (Poly-β-hydroxybutyrate หรือ PHB) ดวยแบคทีเรีย Alcaligenes eutrophus TISTR 1095 จากน้ํายอยแปงมันสําปะหลัง ผลการทดลองพบวา ความเขมขนน้ําตาลกลูโคสในอาหารสูตรผลิต PHB ที่เหมาะสมตอการผลิต PHB คือ 10 กรัมตอลิตร การศึกษาการผลิต PHB จากน้ํายอยแปงมันสําปะหลัง พบวา สภาวะที่เหมาะสมคือ การใชสารสกัดจากยีสตเปนแหลงไนโตรเจน โดยทําการเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 30 องศาเซียส และที่อัตราการเขยา 200 รอบตอนาที ผลการทดลองพบวา แบคทีเรียสามารถผลิต PHB ไดเทากับ 161.760 x 10-3 กรัมตอลิตร คิดเปนผลไดของ PHB ตอสารตั้งตนที่ถูกใช (YP/S ) ผลไดของ PHB ตอชีวมวลที่สะสม (YP/X) และ อัตราการผลิต (QP) เทากับ 0.029 0.068 และ 0.007 กรัมตอลิตรตอชั่วโมง ตามลําดับ และการศึกษาการขยายขนาดผลิต PHB ในถังหมักขนาด 5 ลิตร รวมกับการใหอากาศดวยอัตรา 1.0 vvm พบวา ไดความเขมขนของ PHB เทากับ 20.600 x 10-3 กรัมตอลิตร คิดเปน YP/S YP/X และ QP เทากับ 0.002 0.025 และ 0.001 กรัมตอลิตรตอช่ัวโมง ตามลําดับ

คําสําคัญ : พลาสติกชีวภาพ น้ํายอยแปงมันสําปะหลัง Alcaligenes eutrophus

................................................................ ....../....../......

ลายมือช่ือประธานกรรมการ  

 

 

 

 

 

 

  

Jaruwan Marudkla Sukanya Srinork Suwannee Keawlom 2012 : Bioplastic Production from Cassava Starch Hydrolysated by Alcaligenes eutrophus TISTR 1095. Bachelor of Science (Biology), Thesis Advisor : Atsadawut Areesirisuk

ABSTRACT

The aim of this study was to produce bioplastic by Alcaligenes eutrophus TISTR 1095 from cassava starch hydrolysated . The optimum concentration of glucose in PHB production medium was 10 gl-1. Subsequently, the optimum condition of PHB production in cassava starch hydrolysate was investigated. The result showed that yeast extract was suitable nitrogen source for PHB production by A. eutrophus TISTR 1095. The optimum condition was obtained under 30oC and 200 rpm of cultivation. PHB concentration, PHB yield per substrate consumed (YP/S), PHB yield per biomass accumulated (YP/X) and productivity were 161.760 x 10-3 gl-1, 0.029, 0.068 and 0.007 gl-1h-1, respectively. Finally, PHB production was increased to 5L fermenter integrated with aeration at 1.0 vvm. It was found that PHB concentration, YP/S , YP/X and QP were 20.600 x 10-3 gl-1, 0.002, 0.025 and 0.001 gl-1h-1, respectively under this condition. Keywords : Bioplastic, Cassava Starch Hydrolysated, Alcaligenes eutrophus

................................................................... ....../....../...... Thesis Advisor’s signature  

 

กิตติกรรมประกาศ

รายงานวิจัยฉบับนี้ประสบความสําเร็จไดดวยความกรุณาของอาจารยอัษฎาวุธ อารีสิริสุข

อาจารยที่ปรึกษาโครงงาน ดร. อนันต บุญปาน และอาจารยศิริพร ลุนพรม อาจารยที่ปรึกษารวม

โครงงาน ที่ไดกรุณาใหโอกาส แนวทาง และคําแนะนําในการวิจัย ตลอดจนตรวจแกไขรายงานวิจัย

จนการศึกษาวิจัยเสร็จสมบูรณ คณะผูวิจัยขอกราบขอบพระคุณมา ณ ที่นี้

ขอกราบขอบพระคุณคณาจารยในสาขาวิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี

ทุกทาน ที่ใหการสนับสนุนและสงเสริมการทําวิจัย

ขอขอบคุณเจาหนาที่หองปฏิบัติการชีววิทยา คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี ที่ชวยเหลือ

การใชหองปฏิบัติการ และอํานวยความสะดวกในการวิจัย

ขอขอบคุณสาขาวิชาชีววิทยา และสถาบันวิจัยเคมี คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี ที่เอื้อเฟอสถานที่ เครื่องมืออุปกรณพื้นฐานตาง ๆ และเครื่องมือวิเคราะหในการทําวิจัย

ขอขอบคุณบริษัท ดับเบิ้ลยูจีซี จํากัด ที่กรุณาเอื้อเฟอวัตถุดิบสําหรับการทําวิจัย ขอขอบคุณครอบครัวมารุจกลา ครอบครัวศรีนอก ครอบครัวแกวลอม ที่เปนกําลังใจ

รวมทั้งความชวยเหลือตางๆที่ไดมอบใหจนทําใหโครงงานวิจัยนี้สําเร็จไปไดดวยดี

ขอขอบคุณเพื่อนชั้นปที่ 4 สาขาชีววิทยา รวมทั้งพี่และนองสาขาชีววิทยาที่คอยเปนกําลังใจ

และแรงสนับสนุนตลอดมา

จารุวรรณ มารุจกลา

สุกัญญา ศรีนอก

สุวรรณี แกวลอม

พฤษภาคม 2555

 

สารบาญ

หนา

กิตติกรรมประกาศ ก บทคัดยอภาษาไทย ข บทคัดยอภาษาอังกฤษ ค สารบาญ ง สารบาญตาราง จ สารบาญภาพ ฉ บทที่ 1 บทนํา 1 บทที่ 2 ทบทวนเอกสาร 3 บทที่ 3 วิธีดําเนินการทดลอง 16 บทที่ 4 ผลและวจิารณผลการทดลอง 23 บทที่ 5 สรุปผลการทดลอง 44 เอกสารอางอิง 45 ภาคผนวก 52 ประวัติผูดําเนนิการทดลอง 55

สารบาญตาราง

ตารางที่ หนา

1 เปรียบเทียบคณุสมบัติของโพลีโพรไพลีน (PP) และพอลบิีตาไฮดรอกซบีิวทิเรต (P3(HB))

4

2 จุลินทรียที่สามารถผลิต PHB ได 14 3 องคประกอบของน้ํายอยแปงมันสําปะหลงัที่เหลือจากการผลิตน้ําตาลกลูโคส 24 4 ประสิทธิภาพการผลิต PHB ในอาหารสังเคราะหที่มีความเขมขนน้ําตาล

กลูโคสในระดบัตางๆ 28

5 ประสิทธิภาพการผลิต PHB ในน้ํายอยแปงมันสําปะหลงัที่ใชแหลงไนโตรเจนตางกัน

31

6 การผลิต PHB ในแหลงไนโตรเจนตางๆ 32 7 ประสิทธิภาพการผลิต PHB จากน้ํายอยแปงมันสําปะหลงัที่อุณหภูมิตางๆ 35 8 ประสิทธิภาพการผลิต PHB จากน้ํายอยแปงมันสําปะหลงัที่อัตราการเขยา

ตางๆ 39

9 ประสิทธิภาพการผลิต PHB ในน้ํายอยแปงมันสําปะหลังดวยการหมกัแบบกะในถังหมักขนาด 5 ลิตร

41

10 ประสิทธิภาพการผลิต PHB ในสภาวะตางๆ 42

สารบาญภาพ

ภาพที่ หนา

1 สูตรโครงสรางโมเลกุลของ PHB 3 2 วิถีการสังเคราะหพอลิบีตาไฮดรอกซีบิวทิเรต 6 3 การเพาะเลีย้ง A. eutrophus ในอาหารสูตรผลิต PHB ที่มีน้ําตาลกลูโคส

เร่ิมตน 10 กรมัตอลิตร 25

4 การเพาะเลีย้ง A. eutrophus ในอาหารสูตรผลิต PHB ที่มีน้ําตาลกลูโคส เร่ิมตน 30 กรมัตอลิตร

26

5 การเพาะเลีย้ง A. eutrophus ในอาหารสูตรผลิต PHB ที่มีน้ําตาลกลูโคส เร่ิมตน 50 กรมัตอลิตร

26

6 วิถีการสังเคราะหและการสลาย PHB ในแบคทีเรีย R. eutropha 27 7 การเพาะเลีย้ง A. eutrophus ในน้ํายอยแปงมันสําปะหลังที่มีการใช

แอมโมเนียมซัลเฟตเปนแหลงไนโตรเจน 29

8 การเพาะเลีย้ง A. eutrophus ในน้ํายอยแปงมันสําปะหลังที่มีการใชสารสกัดจากยีสตเปนแหลงไนโตรเจน

30

9 การเพาะเลีย้ง A. eutrophus ในน้ํายอยแปงมันสําปะหลังที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส

33

10 การเพาะเลีย้ง A. eutrophus ในน้ํายอยแปงมันสําปะหลังที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส

34

11 การเพาะเลีย้ง A. eutrophus ในน้ํายอยแปงมันสําปะหลังที่อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส

34

12 การเพาะเลีย้ง A. eutrophus ในนํ้ายอยแปงมันสําปะหลังดวยอัตราการเขยา 100 รอบตอนาที

37

13 การเพาะเลีย้ง A. eutrophus ในน้ํายอยแปงมันสําปะหลังดวยอัตราการเขยา 200 รอบตอนาที

37

14 การเพาะเลีย้ง A. eutrophus ในน้ํายอยแปงมันสําปะหลังดวยอัตราการเขยา 300 รอบตอนาที

38

สารบาญภาพ(ตอ)

ภาพที่ หนา

15 การเพาะเลีย้ง A. eutrophus ในน้ํายอยแปงมันสําปะหลังในถังหมัก

ขนาด 5 ลิตร ดวยวิธีการหมกัแบบกะ 41

16 กราฟมาตรฐานน้ําตาลรีดิวซวิเคราะหโดยวธีิ DNS 53 17 กราฟมาตรฐานน้ําตาลทั้งหมดวิเคราะหโดยวิธี Phenol-sulfuric acid 53 18 กราฟมาตรฐานน้ําหนักเซลลแหง 54 19 กราฟมาตรฐานความเขมขน PHB 54

บทที่ 1

บทนํา

1.1 ท่ีมาและความสําคัญ

Poly-β-hydroxybutyrate (PHB) เปนพลาสติกที่ยอยสลายไดทางชีวภาพซึ่งถูกสรางขึ้น

ภายในเซลลของจุลินทรียหลายชนิด ทําหนาที่เปนแหลงสะสมคารบอนและพลังงานสํารอง

ของจุลินทรีย ในสภาวะที่มีแหลงคารบอนมากเกินพอ และขาดแคลนสารอาหารบางชนิด เชน

ไนโตรเจน และ ฟอสฟอรัส จุลินทรียที่สามารถผลิต PHB ไดมีหลายชนิด เชน Ralstonia eutropha

(Patnail, 2006) Azotobacter vinelandii ATCC 53799 (Coats et al., 2008) Wautersia eutropha

NRRL B-14690 (Patwardhan and Srivastava, 2008) Alcaligenes latus (Grothe et al., 1999)

Cupriavidus necator (Koutinas et al., 2007) Alcaligenes eutrophus (Raje and Srivastava, 1998)

และ Halomonas boliviensis (Quillaguaman et al., 2008) PHB ประยุกตใชไดในงานหลายดาน เชน

อุตสาหกรรมการแพทย เกษตรกรรม และอุตสาหกรรม เนื่องจากมีคุณสมบัติทางกายภาพใกลเคียง

กับพลาสติกสังเคราะหที่ไดจากอุตสาหกรรมปโตรเคมี และการผลิตไมมีผลกระทบกับส่ิงแวดลอม

จุลินทรียมีการผลิต PHB เพ่ือใชเปนแหลงเก็บพลังงานถึงประมาณ 30-40 เปอรเซ็นตของน้ําหนัก

แหง ปญหาหลักของการผลิต PHB คือ ตนทุนการผลิตที่สูง ซ่ึงเปนปจจัยสําคัญในการผลิต PHB

(Kim, 2000) การปรับปรุงการผลิต PHB ใหมีประสิทธิภาพ และลดตนทุนการผลิตเปนกลยุทธ

สําคัญในการทําให PHB ถูกนํามาใชในชีวิตประจําวันมากขึ้น ซ่ึงกระบวนการผลิต PHB โดย

จุลินทรีย และการใชวัตถุดิบที่มีราคาถูกเปนซับสเตรตกําลังไดรับความสนใจ (Li et al., 2007)

PHB กําลังไดรับความสนใจนํามาใชทดแทนพลาสติกจากปโตรเลียม เนื่องจากสามารถ

ยอยสลายได โดยการผลิตจากวัสดุเหลือทิ้งทางการเกษตรที่สามารถนํากลับมาใชใหมได

(renewable source) เชน หางนม (Nath et al., 2008) น้ําเสียจากอุตสาหกรรมการเกษตร (Anshuman

et al., 2007) wheat-based biorefinery (Apostolis et al., 2007) เปนตน แตเนื่องจากวัตถุดิบเหลานี้

ยังสามารถนํามาแปรรูปเพื่อใชในอุตสาหกรรมอื่นๆ ซ่ึงอาจเกิดการขาดแคลนแหลงวัตถุดิบในการ

ผลิต PHB ไดในอนาคตและเพื่อเพิ่มความหลากหลายของวัตถุดิบที่มีศักยภาพสําหรับการผลิต PHB

ดังนั้นจงึจําเปนตองมีการศึกษาหาแหลงวัตถุดิบใหมๆ มาใชในการผลิต PHB

2

ซ่ึงงานวิจัยนี้มีวัตถุประสงคที่จะศึกษาการผลิต PHB จากน้ํายอยแปงมันสําปะหลังซึ่งเหลือ

จากอุตสาหกรรมการผลิตน้ําตาลกลูโคส ดวยแบคทีเรีย A. eutrophus TISTR 1095 ในสภาวะที่มี

ปจจัยการผลิตแตกตางกัน ดวยกระบวนการหมักแบบกะในระดับฟลาสกและถังหมักขนาด 5 ลิตร

1.2 วัตถุประสงค

1.2.1 เพื่อศึกษาผลของความเขมขนน้ําตาลกลูโคสตอการผลิต PHB

1.2.2 เพื่อศึกษาการผลิต PHB จากน้ํายอยแปงมันสําปะหลังที่มีปจจัยการผลิตแตกตางกัน

ในระดับฟลาสก

1.2.3 เพื่อศึกษาประสิทธิภาพการผลิต PHB จากน้ํายอยแปงมันสําปะหลังดวยการหมัก

แบบกะในระดับถังหมักขนาด 5 ลิตร

  

บทที่ 2 ทบทวนเอกสาร

2.1 Poly-β-hydroxybutyrate (PHB)

พอลิบีตาไฮดรอกซีบิวทีเรต เปนอนุพันธของพอลิไฮดรอกซีอัลคาโนเอต ซ่ึงจัดไดวาเปนพอลิเมอรประเภทอะลิฟาติกโพลีเอสเทอร (aliphatic polyester) มีโครงสรางเปนสายยาว (ภาพที่ 1) และมีคุณสมบัติตางๆคลายกับพลาสติกทั่วไป เชน โพลีโพรไพลีน (polypropylene; PP) จากคุณสมบัตขิางตนนั้นทําใหพอลิบีตาไฮดรอกซีบิวทีเรตมีความยืดหยุน และสามารถนํามาหลอมเพื่อขึ้นรูปและใชใหมไดอีกครั้ง (ตริตาภรณ และพรเทพ, 2553 อางถึงใน Taguchi and Doi, 2004)

PHB ถูกคนพบโดย Maurice Lemoigne นักจุลชีววิทยาชาวฝรั่งเศส เมื่อป ค.ศ. 1926 ในเซลลของแบคทีเรีย Bacillus megaterium (Scholz , 2010 อางถึง Lemoigne, 1926) ปจจุบัน มีจุลินทรียหลายชนิดที่สามารถสังเคราะหและสะสม PHB ไวภายในเซลล เชน A.eutropus (Turesin et al., 2000), C. necator ( Koutinas et al., 2007) และ A. latus (Grothe et al., 1999) เปนตน

ภาพที่ 1 สูตรโครงสรางโมเลกุลของ PHB ที่มา : ตริตาภรณ และพรเทพ (2553) อางถึง Turesin et al. (2000) 2.2 คุณสมบัติท่ัวไปของพอลิบีตาไฮดรอกซีบิวทิเรต (ศิริวรรณ, 2552) 2.2.1 PHB ไมสามารถละลายน้ําและตานทานตอปฏิกิริยาไฮโดรไลซีส ทําให PHB ตางจากพลาสติกชีวภาพที่สามารถยอยสลายไดชนิดอ่ืนๆ ซ่ึงสามารถละลายน้ําไดหรือมีความไวตอความชื้น 2.2.2 PHB สามารถตานทานตอรังสีอัลตราไวโอเลตและออกซิเจนสามารถซึมผานไดดี แตมีความตานทานตอกรดและเบสต่ํา 2.2.3 PHB ละลายไดในคลอโรฟอรมและสารประกอบคลอริเนตไฮโดรคารบอนอื่นๆ

4  

2.2.4 PHB มีความสามารถเขากันไดกับเซลลหรืออวัยวะของสิ่งมีชีวิต (Biocompatible) ทําใหสามารถนําไปใชผลิตพลาสติกที่ใชในทางการแพทยได 2.2.5 PHB มีจุดหลอมเหลวที่อุณหภูมิ 175 องศาเซลเซียส มีอุณหภูมิทรานซิสซัน 15 องศาเซลเซียส และมีความทนแรงดึง 40 Mpa ซ่ึงมีคุณสมบัติใกลเคียงกับพลาสติกสังเคราะห 2.2.6 PHB สามารถจมน้ําไดทําใหถูกยอยสลายในสภาวะที่ไมใชอากาศได นอกจากคุณสมบัติตางๆ ของสาร PHB ที่กลาวมานี้แลว PHB ยังมีคุณสมบัติทางเคมีและทางกายภาพใกลเคียงกับพอลิโพรพิลีนซึ่งเปนพลาสติกสังเคราะห ดังแสดงในตารางที่ 1 ตารางที่ 1 เปรียบเทียบคุณสมบัติของโพลีโพรไพลีน (PP) และ PHB

Parameter Polypropylene(PP) P(3HB) Melting point Tm [oC] 171-186 171-182 Glass Transition Temperature Tg [oC] -15 5-10 Crystallinity [%] 65-70 65-80 Density [g cm-3] 0.905-0.94 1.23-1.25 Molecular weight Mw (x 10-5) 2.2-7 1-8 Molecular weight distribution 5-12 2.2-3 Flexural modulus [GPa] 1.7 3.5-4 Tensile strength [MPa] 39 40 Extension to break [%] 400 6-8 UV resistance poor good Solvent resistance good poor Oxygen permeability [cm-3m-2atm-1d-1] 1700 45 Biodegradability - good Other Due to low density floats

in aquatic system Due to more density

goes to the sediment in aquatic system

ที่มา : ตริตาภรณ และพรเทพ (2553) อางถึง Khanna and Srivastava (2005)

5  

2.3 การใชประโยชนจากพอลิบีตาไฮดรอกซีบิวทิเรต

จากคุณสมบัติของโพลิเบตาไฮดรอกซีบิวทีเรตที่สามารถยอยสลายไดงาย จึงมีการนําไปใชประโยชนในดานตางๆ มากมาย (ตริตาภรณ และพรเทพ, 2553) ไดแก

2.3.1 ดานการแพทย เชน ไหมเย็บแผล (Sutures) ตัวเย็บแผล (staples) วัสดุปดแผล (wound dressing) อุปกรณฝงในรางกาย (surgical implants) อุปกรณสําหรับยึดกระดูก (orthopedic fixation devices) วัสดุนําพาหรือสําหรับปลอยตัวยาซึ่งสามารถควบคุมอัตราและระยะเวลาในการปลอยตัวยาไดอยางมีประสิทธิภาพ

2.3.2 ดานการเกษตร เชน ภาชนะปลูกพืช วัสดุหอหุม และปลดปลอยยาฆาแมลง ยาฆาวัชพืช หรือปุยตามชวงเวลาที่กําหนด

2.33 ดานบรรจุภัณฑ เชน บรรจุภัณฑที่ใชแลวทิ้ง ภาชนะบรรจุอาหาร ขวดน้ํา ถุงพลาสติก กลองโฟม ฟลมสําหรับหีบหอ เม็ดโฟมกันกระแทก ตัวเคลือบภาชนะกระดาษ

2.4 การสังเคราะห PHB

วิถีการสังเคราะห PHB ภายในเซลลของจุลินทรียมีความเกี่ยวของกับสารตัวกลางใน วัฎจักรเครบส (Kreb’s cycle) โดยเริ่มตนจากการสรางอะซิทิลโคเอนไซมเอ (acetoacetyl-CoA) และ ไฮดรอกซีบิวทิริลโคเอนไซมเอ (hydroxylbutyryl-CoA) ดวยการทํางานของเอนไซมเบตา คีโตไธโอเลส (β-ketothiolase) และอะซิโตอะซิติลโคเอรีดักเตส (acetoacetyl-CoA reductase) ตามลําดับ หลังจากนั้นจะเกิดขบวนการพอลิเมอไรเซชั่น (polymerization) ของไฮดรอกซีบิวทิริลโคเอนไซมเอไปเปน PHB โดยเอนไซม PHB ซินเทส (PHB synthase) อยางไรก็ตาม PHB ที่เกิดขึ้นสามารถถูกยอยสลายดวยเอนไซมโพลิไฮดรอกซีบิวทิเรทดีไฮโดรจิเนส (polyhydroxybutyrate dehydrogenase) เมื่อพิจารณา PHB ที่อยูในเซลลพบวามีลักษณะเปนแกรนูล โดยมีโมโนเลเยอรฟอสฟอลิปดเมมเบรนหอหุมอยูโดยพบวามีโปรตีนที่เกี่ยวของกับการสังเคราะหและการสลายแทรกกระจายอยูโดยรอบ และการควบคุมการผลิต PHB นั้นพบวามีความเกี่ยวของกับ phaCBA cluster ซ่ึงประกอบดวย phaA phaB และ phaC โดย phaA เปนสวนที่ควบคุมการสรางเอนไซม β-ketothiolase ซ่ึงเปนตัวเรงปฏิกิริยาในการเปลี่ยนแปลง acetyl-CoA ไปเปน acetoacetyl-CoA สําหรับ phaB เปนยีนสวนที่ควบคุมการสรางเอนไซม NADPH-oxidoreductase ซ่ึงจะทําการเปลี่ยน acetoacetyl-CoA ใหเปน 3-hydroxylbutyryl-CoA และ phaC เกี่ยวของกับการสรางเอนไซม PHB polymerase ซ่ึงจะนํา 3-hydroxylbutyryl-CoA มาสรางโพลิเมอรจนได PHB (ภาพที่ 2)

6  

ภาพที่ 2 วิถีการสังเคราะหพอลิบีตาไฮดรอกซีบิวทิเรต ที่มา : Reddy et al. (2003)

2.5 การสกัดแยกพอลิบีตาไฮดรอกบิวทิเรต ( PHB) และการทําใหบริสุทธ์ิ PHB เปนสารที่สะสมอยูภายในเซลลของจุลินทรียดังนั้นการแยกพอลิเมอรของ PHB จึงตองมีการทําลายผนังเซลลของจุลินทรียกอน ทั้งนี้ในกระบวนการสกัดตองไมทําใหคุณสมบัติของโพลิเมอรเปลี่ยนแปลง และภายหลังการสกัดตองมีการตรวจสอบคุณสมบัติทางฟสิกสของ PHB ที่สกัดไดกอนนําไปใชตอไป วิธีการสกัด PHB แบงได 3 วิธีคือ 2.5.1 การสกัดดวยตัวทําละลาย (solvent extraction) การสกัด PHB ดวยตัวทําละลายอินทรีย เชน คลอโรฟอรม (chloroform) เมทิลีน คลอไรด (methyl chloride) เปนวิธีที่ทําใหผลผลิตของพอลิเมอรที่สกัดออกมามีมวลโมเลกุลสูง PHB ที่สกัดไดดวยวิธีนี้จะมีสีขาวสามารถทําเปนผลึกไดและมีมวลโมเลกุลสูง แตวิธีนี้ไมเหมาะสมที่จะใชในระดับอุตสาหกรรม เพราะตองใชสารสกัดในปริมาณมากแตมีขอดีคือ สกัดไดงาย และสามารถควบคุมความบริสุทธิ์ของโพลิเมอรใหสูงได (Lee, 1997) 2.5.2 การสกัดดวยโซเดียมไฮโปคลอไรด (sodium hypochloride extraction)

การสกัดวิธีนี้เปนวิธีที่ Williamson and Wikinson ใชในการแยกพอลิเมอรชนิด พอลิบีตาไฮดรอกซีบิวทิเรตในป 1958 จากเชื้อ Bacillus cereus โดยใชโซเดียมไฮโปคลอไรด

7  

ยอยสลายผนังเซลลนาน 30 – 60 นาที จากนั้นนําโพลิเมอรที่สกัดไดมาทําใหบริสุทธิ์ยิ่งขึ้นโดยการลางดวย ไดเอทธิล อีเธอร (diestyl ether) หรือเมธานอล (methanol) เพื่อกําจัดไขมันออก และยังพบอีกวาในการสกัดในสภาวะที่มีความเปนดางสูงจะทําใหสายพอลิเมอรของ PHB ถูกทาํลายซึ่งสงผลตอคุณสมบัติทางดานพื้นผิวและโมเลกุลของสายพอลิเมอร และการแชเซลลในสารลดแรงตึงผิวกอนทําการสกัดจะชวยเพิ่มความบริสุทธิ์และมวลโมเลกุลของสารถึง 95% แตอยางไรก็ตาม การสกัด โพลิเมอรดวยวิธีนี้จะมีโซเดียมไฮโปคลอไรดหลงเหลืออยูกับโพลิเมอรซ่ึงสามารถกอใหเกิดมลพิษกับสิ่งแวดลอมได 2.5.3 การสกัดดวยเอนไซม (enzymatic extraction) Doi (1990) ไดกลาวถึงการพัฒนากระบวนการสกัดโพลิเมอรโดยการยอยผนังเซลลดวยเอนไซมวาเปนกระบวนการที่นิยมใชในอุตสาหกรรม โดยสามารถใหผลผลิตตอน้ําหนักแหงของมวลชีวภาพในปริมาณที่สูง ซ่ึงมีการใชเอนไซมหลายชนิดรวมกัน เชน อัลคาเลส (alcalase) ฟอสโฟไลเปส (phospholipase) แลคซิเตส (lacitase) และไลโซไซม (lysozyme) เปนตน 2.6 ปจจัยท่ีมีผลตอการผลิตพอลิบีตาไฮดรอกซีบิวทิเรต 2.6.1 สายพันธุจุลินทรีย

สายพันธุจุลินทรียมีผลตอชนิดหรือกลุมของพอลิเมอรที่ตองการผลิต จากรายงานพบวาเมื่อใชแหลงคารบอนชนิดเดียวกันแตใชจุลินทรียตางสายพันธุกันจะทําใหพอลิเมอรที่ผลิตไดแตกตางกันออกไปดวย โดยจุลินทรียบางชนิดผลิตพอลิเมอรในรูปโฮโมพอลิเมอร (homopolymer) และบางชนิดผลิตในรูปโคพอลิเมอร (copolymer) เชน เมื่อใชน้ําตาลฟรุกโตสเปนแหลงคารบอนในการผลิตพอลิเมอรดวย A. eutrophus R3 จะไดพอลิเมอรชนิดโคพอลิเมอร (P(3HB-co-3HV)) ขณะที่การเพาะเลี้ยงดวย A. eutrophus ATCC 17697 จะผลิตพอลิเมอรชนิด โฮโมพอลิเมอร (Anderson and Wynn, 1995)

Kim and Chang (1995) ไดศึกษาการใช A. eutrophus โดยใช tapioca hydrolysate

เปนแหลงคารบอนเพื่อผลิต PHB ดวยกระบวนการหมักแบบกึ่งกะ พบวามี PHB สะสมอยู 58%

โดยน้ําหนักแหง คิดเปนผลไดของ PHB ตอสารตั้งตนเทากับ 0.33

Boman and Roth (1999) ทําการผลิต PHB จาก Methyrobacterium rhodesianum กับ Ralathonia euthopha ในอาหารเคซีนไฮโดรไลเซต ซ่ึงมีการเติมกลีเซอรอลพบวา M. rhodesianum สามารถผลิต PHB ได 39% โดยน้ําหนักโดยใชระยะเวลาในการเลี้ยงประมาณ 92 ชั่วโมง ในระดับฟลากส ขณะที่ทําการเพาะเลี้ยงในถังปฏิกรณพบวาที่เวลา 45 ชั่วโมง M. rhodesianum ผลิต PHB ไดสูงถึง 50% โดยน้ําหนักในขณะที่ R. euthopha สามารถผลิตได 47% โดยน้ําหนัก หลังการ

8  

เล้ียงประมาณ 47 ช่ัวโมงในฟลากส จากการเลี้ยงในถังปฏิกรณเมื่อเวลา 45 ช่ัวโมงสูงถึง 65% โดยน้ําหนัก

Patwardhan and Srivastava (2008) ไดศึกษาการใช W. eutropha NRRL B-14690

(ชื่อเดิมคือ Alcaligenes euthropus) ในการผลิต PHB โดยใชฟรุกโตสเปนแหลงคารบอนดวย

วิธีการหมักแบบกะ พบวาไดชีวมวลและ PHB สูงสุดเทากับ 14.0 และ 6.1 กรัมตอลิตร ตามลําดับ

คิดเปนเปอรเซ็นตการสะสม PHB ในเซลลเทากับ 43.6%

2.6.2 แหลงคารบอน แหลงคารบอนเปนองคประกอบหลักในอาหารที่ใชเพาะเลี้ยงจุลินทรีย โดยจุลินทรีย

จะนําแหลงคารบอนไปใชในการสรางพลังงานและสรางสวนประกอบตางๆ ของเซลล ในกระบวนการหมักโดยทั่วไปนิยมวัสดุทางการเกษตรที่มีคารโบไฮเดรตเปนแหลงคารบอน คารโบไฮเดรตที่มีมากและนิยมใชกันอยางกวางขวางไดแก แปงขาวโพด แปงจากธัญพืชชนิดตางๆ แปงมันฝรั่ง และแปงมันสําประหลัง (สมใจ, 2001) โดยแหลงคารบอนแตละชนิดนั้นจะมีผลตอองคประกอบของพอลิเมอรที่ได ดังนั้นในการผลิต จึงตองศึกษาถึงชนิดและแหลงคารบอน ที่เหมาะสม

Borman and Roth (1999) ทําการเพาะเลี้ยงเชื้อ M. rhodesianum ในอาหารที่ใช กลีเซอรอลเปนแหลงคารบอน พบวาแบคทีเรียสามารถผลิต PHB ได 39% โดยน้ําหนักแหง ซ่ึงใชเวลาในการผลิต 92 ชั่วโมง และเมื่อทําการเพาะเลี้ยงในถังหมักพบวาสามารถผลิต PHB ไดเพิ่มขึ้นเปน 50% โดยน้ําหนักแหง

Yu et al. (1999) นํา A. latus DSM 1124 มาใชในการผลิต PHB โดยใชของเหลือ

จากโรงงานผลิตเบียรและโรงงานผลิตนมถั่วเหลืองมาใชเปนแหลงคารบอนดวยวิธีการหมักแบบกึ่ง

กะ พบวาการใชซูโครสเปนแหลงคารบอนเพียงแหลงเดียวได PHB เทากับ 36.26% โดยน้ําหนัก

แหง สวนการใชซูโครสและมอลตจากโรงเบียรเปนแหลงคารบอนสามารถผลิต PHB ได 70.69%

โดยน้ําหนักแหง และการใชซูโครสและกากถั่วเหลืองจากโรงงานผลิตนมถ่ัวเหลืองเปนแหลง

คารบอนพบวาได PHB เทากับ 32.57% โดยน้ําหนักแหง

Ruan et al. (2003) ศึกษาการใชน้ําตาลฟรุกโตสและกรดบิวทิริก (butyric acid) เปนแหลงคารบอนในการเพาะเลี้ยง A. eutrophus โดยใชน้ําตาลฟรุกโตสและกรดบิวทิริกความเขมขน20 และ 10 กรัมตอลิตร ตามลําดับ พบวา เมื่อใชน้ําตาลฟรุกโตส A. eutrophus สามารถผลิต พอลิเมอรไดให 12.3 มิลลิกรัมตอลิตร ในขณะที่การใชกรดบิวทิริกสมารถผลิต PHB ได 2.4 มิลลิกรัมตอลิตร

9  

Koutinas et al. (2007) ศึกษาการใช C. necator NCIMB 11599 ในการผลิต PHB จาก Wheat flour hydrolysates ซ่ึงมีน้ําตาลกลูโคสเปนแหลงคารบอน พบวามีการสะสม PHB 0.36 เปอรเซ็นตโดยน้ําหนักแหง โดยการสะสม PHB ในเซลลของ C. necator เกิดจากการจํากัดสารอาหารที่ใชในการเจริญเติบโต

Yezza et al. (2007) ไดศึกษาการผลิต PHB จากแบคทีเรีย A. latus โดยใช maple

sap ซ่ึงมีน้ําตาลซูโครสเปนสวนประกอบหลักเปนแหลงคารบอน ทําการทดลองในระดับฟลาสก

เขยา พบวาได ชีวมวลของ A. latus สูงสุดเทากับ 4.4 ± 0.5 กรัมตอลิตร และมี PHB สะสมอยู

ภายในเซลล 77.6 ± 1.5 % โดยน้ําหนักแหง และเมื่อทําการศึกษาในถังหมักขนาด 20 ลิตร พบวา

ไดผลใกลเคียงกบัการทดลองในระดับฟลาสก โดยไดชีวมวลของ A. latus เทากับ 4.2 ± 0.3 กรัม

ตอลิตร และมี PHB สะสมอยูเทากับ 77.0 ± 2.6 % โดยน้ําหนักแหง

2.6.3 แหลงไนโตรเจน จุลินทรียมีไนโตรเจนเปนสวนประกอบประมาณรอยละ 8-10 ของน้ําหนักเซลลแหงความตองการไนโตรเจนของจุลินทรียแตละชนิดจะแตกตางกันไปจุลินทรียบางชนิดสามารถเจริญไดในอาหารที่มีอนินทรียไนโตรเจน แตบางชนิดตองการไนโตรเจนจากสารประกอบอินทรีย

2.6.3.1 แหลงอนินทรียไนโตรเจน แหลงอนินทรียไนโตรเจนที่นิยมใชในอุตสาหกรรมการหมัก เชน เกลือแอมโมเนียม และไนเตรท ซ่ึงเกลือแอมโมเนียม ที่มีราคาถูกที่สุดไดแก แอมโมเนียมซัลเฟต ((NH4)2SO4) ซ่ึงปกติจะทําใหอาหารเลี้ยงเชื้อมีสภาพเปนกรดเนื่องจาก เมื่อ NH4

+ ถูกใชไป จะเกิด SO4

-2 ขึ้นในอาหารเลี้ยงเชื้อ ในทางตรงขามแกสแอมโมเนียและไนเตรทเมื่อถูกเมแทบอไลซตามปกติจะทําใหเกิดสภาวะที่เปนดางในอาหารเลี้ยงเชื้อ แตในกรณีที่ใชแอมโมเนียมไนเตรท ตามปกติในระยะแรก NH4

+ จะถูกใชไปกอน ทําใหเกิดสภาวะที่เปนกรด จนกระทั่ง NH4+ หมด

จุลินทรียจึงสังเคราะหเอนไซม Nitrate reductase และใชไนเตรทเปนแหลงไนโตรเจนได (Beaulieu et al., 1995)

10  

2.6.3.2 แหลงอินทรียไนโตรเจน แหลงไนโตรเจนชนิดนี้อาจใชในรูปกรดอะมิโน โปรตีน หรือยูเรีย ก็ได

โดยทั่วไปจุลินทรียจะเจริญในอาหารที่มีอินทรียไนโตรเจนไดเร็วกวาอาหารที่มีอนินทรียไนโตรเจน วัตถุดิบที่นิยมใชเปนแหลงอินทรียไนโตรเจนในอุตสาหกรรมการหมัก ไดแก น้ําแชขาวโพด ถ่ัวเหลือง กากถั่วเหลือง กากถั่วลิสง distillers soluble casein hydrolysate และ yeast extract เปนตน (สมใจ, 2001)

Kim et al. (1994) ไดทําการทดลองผลิต PHB ดวยการเลี้ยงเชื้อ A. eutrophus แบบกึ่งกะ (Fed-batch) โดยทําการควบคุมความเขมขนของน้ําตาลกลูโคสและปริมาณไนโตรเจนใหอยูในชวง 60-70 และ 10-20 กรัมตอลิตร ตามลําดับ พบวา A. eutrophus สามารถผลิต PHB ไดสูงขึ้น เทากับ 76% ของน้ําหนักเซลลแหง คิดเปนอัตราการผลิตและผลไดของ PHB เทากับ 2.42 กรัมตอลิตรตอช่ัวโมง และ 0.3 กรัม PHB ตอกรัมกลูโคส ตามลําดับ

Grothe et al. (1999) ทําการศึกษาเปรียบเทียบการใชแหลงไนโตรเจนของเชื้อ A. latus ATCC 29714 โดยใชซูโครสเปนแหลงคารบอน และแหลงไนโตรเจนที่ใชไดแก แอมโมเนียมซัลเฟต แอมโมเนียมคลอไรด แอมโมเนียมไนเตรต และยูเรีย พบวา การเติมแอมโมเนียมซัลเฟต 1.4 กรัมตอลิตร (โมลคารบอนตอโมลไนโตรเจนเทากับ 28.3) มีผลทําใหมีการผลิต PHB ไดสูงสุดเทากับ 4.6 กรัมตอลิตร

Kumar et al. (2004) ศึกษาการผลิต PHB จากกลุมตะกอนเรง (Activated sludge) ของโรงงานผลิตอาหารโดยใชความเขมขนตะกอนเรงเริ่มตนเทากับ 3.15 กรัมตอลิตร ทําการเพาะเลี้ยงในอาหารสังเคราะหที่มีกรดอะซิติกเปนแหลงคารบอนที่ความเขมขน 500 ถึง 3000 มิลลิกรัมตอลิตร และศึกษาอัตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนที่ 24 96 120 144 และ 168 (โมลตอโมล) ตามลําดับ ผลการทดลองพบวาเมื่ออัตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนเพิ่มขึ้นทําใหมีการสะสม PHB ในเซลลมากยิ่งขึ้น โดยที่อัตราสวนคารบอนตอไนโตรเจนเทากับ 144 มีการสะสม PHB สูงสุดเทากับ 33 เปอรเซ็นต โดยน้ําหนักแหง

2.6.4 ฟอสฟอรัส อาหารเสริม และเกลือแร Ryu et al. (1997) ไดศึกษาการผลิต PHB โดยเลี้ยงเชื้อ A. eutrophus ในสภาวะที่มี

ปริมาณฟอสเฟสจํากัด มีการควบคุมความเปนกรดดาง เทากับ 6.8 โดยใชแอมโมเนียมไฮดรอกไซด และกรดไฮโดรคลอริก เพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 34 องศาเซลเซียส มีกลูโคสเปนแหลงคารบอน พบวาเมื่อความเขมขนฟอสเฟตเริ่มตนสูง A. eutrophus จะผลิต PHB สูงขึ้น โดยที่ความเขมขนฟอสเฟตเร่ิมตนเทากับ 5.5 กรัมตอลิตรจะใหปริมาณเซลลและ PHB สูงที่สุด

11  

Grothe et al. (1999) ศึกษาผลของการเติมและไมเติมธาตุอาหารรองตอการเจริญและผลิต PHB ของเชื้อ A. latus โดยใชซูโครสเปนแหลงคารบอนพบวา การเติมธาตุอาหารรอง ไดแก ZnSO2·7H2O 0.1 กรัมตอลิตร CuSO4·5H2O 0.01 กรัมตอลิตร NiSO·7H2O 0.02 กรัมตอลิตร CaCl2·6H2O 10 กรัมตอลิตร MnCl2·4H2O 0.03 กรัมตอลิตร Ammonium Fe (III) citrate 6 กรัมตอลิตร ทําให A. latus มีการสรางมวลเซลลและ PHB เทากับ 6.8 และ 3.2 กรัมตอลิตร ตามลําดับ

2.6.5 ออกซิเจน ปริมาณออกซิเจนมีผลตอการผลิต PHB ของจุลินทรีย โดยในสภาวะที่มีออกซิเจนจํากัด เอนไซมซิเตรทซินเทส (citrase synthase) และไอโซซิเตรทดีไฮโดรจิเนส (isocitrase dehydrogenase) จะถูกยบัยั้งการทํางานโดยการสะสม nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) ทําให acetyl Co A ไมสามารถเขาสูวัฏจักรเครบส (Kreb’s cycle) ได acetyl-CoA จึงถูกเปลี่ยนไปเปน acetoacetyl-CoA และเขาสูการสังเคราะห PHB โดยการทํางานของเอนไซม ketothiolase นอกจากนี้การมีปริมาณออกซิเจนจํากัดยังทําใหกระบวนการหายใจลดลงจุลินทรียจึงไมสามารถยอยสลายแหลงคารบอนไดอยางสมบูรณ จึงเกิดการสะสม PHB ซ่ึงเปนแหลงพลังงานสํารองในสภาวะที่มีอาหารไมสมบูรณ ( Luengo et al., 2003 )

2.6.6 พีเอช พีเอชเริ่มตนมีผลตออัตราการเจริญของจุลินทรียและการผลิตพอลิเมอรของเชื้อ พบวาการผลิตพอลิเมอรจะเกิดไดดีเมื่อควบคุมพีเอชเร่ิมตนที่ 7.0 ในขณะที่จากงานวิจัยของ Kinoshita et al. ในป 1991 พบวาพีเอชเริ่มตนที่มีผลตอการเจริญของ A. eutrophus No. 4 โดยแบคทีเรียสามารถเจริญเติบโตและผลิต PHB ไดสูงเมื่อพีเอชเริ่มตนสูงกวา 7.0 2.6.7 อุณหภูมิ Yezza et al. (2007) ไดศึกษาการผลิต PHB จากแบคทีเรีย A. latus โดยใช maple sap โดยทําการเพาะเลี้ยง A. latus ที่อุณหภูมิ 33 องศาเซลเซียล ซ่ึงใกลเคียงกับอุณหภูมิที่ Yu et al. (1999) ใชเพาะเลี้ยง A. latus DSM 1124 เพ่ือศึกษาการผลิต PHB โดยทําการเพาะเลี้ยงที่ 35 องศาเซลเซียส

2.7 กระบวนการหมัก

การผลิต PHB นั้นสามารถใชกระบวนการหมักไดหลายวิธี เชน กระบวนการหมักแบบกะ (Batch fermentation) การหมักแบบกึ่งกะ (Fed-batch fermentation) และการหมักแบบตอเนื่อง (Continuous fermentation) (Koutinas et al., 2007; Patwardhan and Srivastava., 2008; Tan et al., 2011)

12  

2.7.1 การหมักแบบกะ เปนการหมักในระบบปดที่มีอาหารเริ่มตนปริมาณจํากัด เมื่อใสจุลินทรียลงในอาหาร ในระยะแรกเปนระยะที่จุลินทรียกําลังปรับตัว เซลลจะยังไมมีการเพิ่มจํานวน เรียกวาชวง lag phase หลังจากนั้นจุลินทรียจะมีการเจริญเพิ่มขึ้นแบบทวีคูณ เรียกวา ชวง log phase จากนั้นจุลินทรียก็เร่ิมหยุดการเจริญเติบโตและเขาสูชวง stationary phase เนื่องจากจุลินทรียจะถูกจํากัดดวยสารอาหารและสารพิษที่จุลินทรียสรางขึ้น โดยหลังจากที่จุลินทรียเจริญเติบโตอยางรวดเร็วไประยะหนึ่งแลว อัตราการเจริญก็จะคอยๆ ลดลง และหยุดการเพิ่มจํานวน โดยเมื่อใสจุลินทรียแลว การหมักแบบกะนี้จะไมมีการเติมสารอาหารใดๆ เพิ่มลงไปอีก ระบบนี้มีขอดี คือ ปลอดจากการปนเปอน เนื่องจากทําในระบบปด จุลินทรียมีโอกาสกลายพันธุต่ําและพลังงานในระหวางการหมักนอย แตก็มีขอเสีย คือ ตองใชแรงงานจํานวนมากในการเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อ เตรียมการหมัก และการเก็บผลผลิต (กนกวรรณ และคณะ, 2553) Yezza et al. (2007) ทําการหมักแบบกะของ A. latus เพื่อศึกษาการผลิต PHB ที่ใช maple sap เปนแหลงคารบอนเพียงแหลงเดียวในถังหมักขนาด 10 ลิตร PHB ที่ผลิตขึ้นสูงสุดถึง 77 เปอรเซ็นตโดยน้ําหนักหลังจากการบม 27 ชั่วโมง Quillaquaman et.al (2008) ศึกษาการผลิตพลาสติกชีวภาพ PHB จาก Halomonas boliviensis ดวยกระบวนการหมักแบบกะ การศึกษาสภาวะที่เหมาะสมในการผลิต PHB ดวยการหมักแบบกะพบวาปริมาณของ (NH4)2SO4 , KH2PO4 และ yeast extract ที่เหมาะสมตอการผลิต PHB คือ 0.15, 0.20 และ 0.15 เปอรเซ็นตโดยน้ําหนักตอปริมาตร (%, w/v) ตามลําดับ โดยได PHB และน้ําหนักเซลลแหง (CDW) เทากับ 69 โดยน้ําหนัก และ 3.57 กรัมตอลิตร ตามลําดับ จากนั้นเมื่อเพิ่มความเขมขนของ yeast extract เปน 1.5 % (น้ําหนักตอปริมาตร) จะได PHB และ CDW เพิ่มขึ้นเปน 44 โดยน้ําหนัก และ 12 กรัมตอลิตร ตามลําดับ ตอมาศึกษาผลของปริมาณออกซิเจนตอการผลิต PHB โดยผันแปรอัตราการกวนที่ 800 900 และ 1000 รอบตอนาที พบวาที่อัตราการกวน 900 รอบตอนาที ได PHB และ CDW สูงสุดเทากับ 54 โดยน้ําหนัก และ 14 กรัมตอลิตร ตามลําดับ 2.7.2 การหมักแบบกึ่งกะ เปนการหมักที่มีการเติมสารอาหารบางอยางเพิ่มลงไปในอาหารที่

ใชเพาะเลี้ยงจุลินทรียเปนระยะ ๆ เพื่อใหจุลินทรียเจริญเติบโตและใชสารอาหารไดอยางเต็มที่โดย

ไมมีการถายอาหารเกาออก การหมักแบบนี้สวนใหญใชเพื่อแกปญหาเกี่ยวกับขอจํากัด เรื่องความ

เขมขนของสารอาหารเริ่มตน ซ่ึงในการหมักถามีการเติมสารอาหารเริ่มตนมากเกินไปอาจจะผล

ยับยั้งการเจริญของจุลินทรียเนื่องจากแรงดันออสโมติกได (osmotic pressure) แตมีขอเสีย คือ เสี่ยง

ตอการปนเปอนจากจุลินทรียชนิดอื่นในระหวางการเติมสารอาหารและมีความเขมขนของสารอาหาร

มากเกินไป (กนกวรรณ และคณะ, 2553)

13  

Quillaquaman et.al (2008) ศึกษา การผลิตพลาสติกชีวภาพ PHB จาก Halomonas

boliviensis ดวยกระบวนการหมักแบบกึ่งกะ โดยผันแปรความเขมขนของสารอาหารที่ใชเพาะเลี้ยง

H. boliviensis เมื่อแบคทีเรียเจริญเติบโตจึงเติมอาหารใหมซ่ึงมีความเขมขนของน้ําตาลซูโครสสูง

(700 กรัมตอลิตร) ลงไปในระหวางการเพาะเลี้ยง พบวาได PHB และ CDW เพ่ิมขึ้นสูงสุด 90

เปอรเซ็นตโดยน้ําหนัก และ 23 กรัมตอลิตร ตามลําดับ

2.7.3 การหมักแบบตอเนื่อง เปนการหมักที่มีการเติมอาหารใหมลงไปและถายอาหารเกาออก

จากระบบในอัตราเดียวกัน ซ่ึงจะสามารถยืดระยะเวลาในการเจริญชวง log phase ไดโดยการเติม

อาหารใหมเขาไปแทนในปริมาณเทาเดิม จะทําใหจุลินทรียเจริญเพิ่มไดอยางตอเนื่อง และถามีการ

ถายอาหารเกาออกและเติมอาหารใหมลงไปอยางตอเนื่องในปริมาณที่เหมาะสม จะทําใหเกิดสภาวะ

คงที่ (steady state) จุลินทรียมีอาหารเพียงพอสําหรับการเจริญเติบโต สามารถผลิตสารตาง ๆ ได

อยางตอเนื่องโดยไมมีขอจํากัดในเรื่องอาหาร และปริมาณเซลลที่เกิดขึ้นใหมจะเทากับปริมาณ

เซลลในอาหารเกาที่ถายออก (กนกวรรณ และคณะ, 2553)

การหมักแบบตอเนื่องมีขอดี คือ ไดผลผลิตที่สูงและสามารถหมักไดเปนเวลานานหลาย

สัปดาหหรือหลายเดือน แตมีขอเสีย คือ การควบคุมระบบใหอยูในสภาวะสมดุลทําไดยากและมี

ปญหาการปนเปอนจากจุลินทรียภายนอก และการหมักเปนเวลานานจะทําใหจุลินทรียเกิดการ

กลายพันธุได

2.8 ลักษณะทั่วไปของ Alacligenes euthophus A. euthophus เปนเชื้อจุลินทรียที่นิยมใชศึกษาการผลิต PHB กันอยางกวางขวาง เนื่องจาก

จุลินทรียชนิดนี้มีความสามารถที่จะสะสมสาร PHB ไวภายในเซลลไดมากถึงประมาณรอยละ 80 โดยน้ําหนักเซลล A. euthophus เปนแบคทีเรียแกรมลบ มีรูปรางเปนแทงกวางประมาณ 0.5 μm ยาวประมาณ 1.8-2.6 μm มีสีขาวหรือสีครีมและจะกลายเปนสีน้ําตาลเมื่ออายุมากขึ้น อุณหภูมิที่เหมาะสมตอการเจริญคือ 30 องศาเซลเซียส พบไดในดินและในน้ํา (Holding and Shewan, 1974)

A. euthophus สามารถสรางและสะสม PHB ได โดยใชแหลงคารบอนงายๆ เชน กลูโคส ฟรุกโตส เปนตน สามารถเพิ่มอัตราการผลิตไดเมื่อทําการเพาะเลี้ยงแบบกึ่งกะ โดยจะสะสม PHB ในปริมาณมากเมื่อจุลินทรียเขาสูระยะคงตัว และอยูภายใตการเจริญที่มีสารอาหารไมสมดุล เชน เมื่อจุลินทรียอยูในภาวะที่จํากัดสารอาหารบางชนิด เชน ไนโตรเจน ออกซิเจน จึงมีการสะสม PHB

14  

โดย A. euthophus จะสะสม PHB ไวในลักษณะของเม็ดแกรนูล สีขาว ซ่ึง PHB ที่สะสมอยูในแกรนูลจะมีขนาดตางๆ กัน ปจจุบันนี้มีจุลินทรียที่สามารถผลิต PHB ไดหลายชนิด ดังตารางที่ 2

ตารางที่ 2 จุลินทรียที่สามารถผลิต PHB ได

Organisms Cell conc. (gl-1)

PHB conc. (gl-1)

PHB content (%)

Productivity (gl-1h-1)

Azotobacter chroococcum 54 25 46 0.35 Haloferax mediterranei 10 6 60 1.03 Ralstonia eutropha 106 61 58 1.03 Recombinant Escherichia coli 31 25 80 0.48 Methylobacterium sp. ZP24 9.9 5.9 59.5 0.123 Pseudomonas cepacia 3.57 2 56 0.0167 Azotobacter vinelandii UWD 33 22 66 0.61 Alcaligenes latus 32.36 22.68 70.69 0.44 Alcaligenes eutrophus NCIMB 11599

5.40 0.12

Alcaligenes eutrophus DSM 545 69 0.2

ที่มา : ดัดแปลงจาก Kim (2000)

2.9 งานวิจัยท่ีเก่ียวของ Kim and Chang (1995) ไดศึกษาการใช A. eutrophus โดยใช Tapioca hydrolysate เปน

แหลงคารบอนเพื่อผลิต PHB ดวยกระบวนการหมักแบบกึ่งกะ พบวาไดคา PHB สะสมอยู 58%

โดยน้ําหนักแหง ไดคา yield เทากับ 0.33 (กรัม PHB ตอกรัมสารตั้งตน)

Yu et al. (1999) ไดใช A. latus DSM 1124 มาใชในการผลิต PHB โดยใชของเหลือจาก

โรงงานอุตสาหกรรมมาใชเปนแหลงคารบอนดวยวิธีการหมักแบบกึ่งกะ พบวาการใชซูโครสเปน

แหลงคารบอนเพียงแหลงเดียวไดคา PHB 36.26% โดยน้ําหนัก สวนการใชซูโครสและมอลตจาก

โรงเบียรเปนแหลงคารบอนได PHB 70.69% โดยน้ําหนัก และการใชซูโครสและกากถั่วเหลืองจาก

โรงงานผลิตนมถั่วเหลืองเปนแหลงคารบอนพบวาได PHB 32.57% โดยน้ําหนัก

15  

Koutinas et al. (2007) ไดศึกษาการใช C. necator NCIMB 11599 ( ปจจุบันคือ Wautersia eutropha) มาใชศึกษาการผลิต PHB โดยใช Wheat flour hydrolysates ซ่ึงมีน้ําตาลกลูโคส เปน

แหลงคารบอน พบวามีการสะสม PHB ได 0.36 % โดยน้ําหนักแหง โดยการสะสม PHB ในเซลล

ของ Cupriavidus necator เกิดจากการจํากัดสารอาหารจึงสามารถเจริญเติบโตไดโดยมีความเขมขน

ของกลูโคสนอยกวา 10 กรัมตอลิตร แสดงใหเห็นวากลูโคสมีความสําคัญในการผลิต PHB

Oliveira et al. (2007) ไดศึกษาการใช C. necator DSM 545 โดยใช soy cake เปนแหลง

คารบอน และเติม supplement medium เพิ่มในอาหาร พบวาการเติม supplemented medium และ

กากน้ําตาล ใหผลผลิต PHB 33.3 เปอรเซ็นตโดยน้ําหนัก สูงกวาการไมเติม non-supplemented

medium ซ่ึงได PHB เทากับ 14.4 เปอรเซ็นตโดยน้ําหนัก แสดงวาใน supplemented medium มี

สารอาหารที่จําเปนตอการเจริญเติบโตของแบคทีเรียจึงสงผลทําใหแบคทีเรียมีการสะสม PHB ขึ้น

Yezza et al. (2007) ไดศึกษาการผลิต poly-β-hydroxybutyrate (PHB) จากแบคทีเรีย

Alcaligenes latus โดยใช maple sap ซ่ึงมีซูโครสเปนสวนประกอบหลักเปนแหลงคารบอน ทํา

การทดลองในระดับ ฟลาสกเขยา พบวาได ชีวมวลของ A. latus สูงสุดเทากับ 4.4 ± 0.5 กรัมตอ

ลิตร และมี PHB สะสมอยูภายในเซลล 77.6 ± 1.5 % โดยน้ําหนัก และเมื่อทําการศึกษาในถังหมัก

ขนาด 20 ลิตร พบวาไดผลใกลเคียงกับการทดลองในระดับฟลาสก โดยไดชีวมวลของ A. latus

เทากับ 4.2 ± 0.3 กรัมตอลิตร และมี PHB สะสมอยูเทากับ 77.0 ± 2.6 %

Patwardhan and Srivastava (2008) ไดศึกษาการใช W. eutropha NRRL B-14690 ในการ

ผลิต PHB โดยใชฟรุกโตสเปนแหลงคารบอนดวยวิธีการหมักแบบกะ พบวาไดมวลสูงสุดและความ

เขมขนของ PHB เทากับ 14 กรัมตอลิตร และ6.1 กรัมตอลิตร ตามลําดับ PHB ของเซลลคือ 43.6%

บทที่ 3

อุปกรณ และวิธีการทดลอง

3.1 อุปกรณ 3.1.1 กลองจุลทรรศน

3.1.2 ขวดปรับปริมาตรขนาด 100 มิลลิลิตร

3.1.3 ขวดปรับปริมาตรขนาด 250 มิลลิลิตร

3.1.4 ขวดปรับปริมาตรขนาด 500 มิลลิลิตร

3.1.5 ขวดรูปชมพู ขนาด 500 มิลลิลิตร 3.1.6 เครื่องชั่ง 2 และ 4 ตําแหนง

3.1.7 เครื่องปนเหวี่ยง

3.1.8 เครื่องเขยาผสมสาร

3.1.9 เครื่องวัดคาดูดกลืนแสง

3.1.10 ตูแชเย็น

3.1.11 ตูดูดควัน

3.1.12 ตูถายเชื้อ

3.1.13 ตูบมเชื้อแบบเขยา

3.1.14 ตูอบแหง

3.1.15 ถังหมัก ขนาด 5 ลิตร พรอมอุปกรณประกอบ

3.1.16 ไมโครปเปต ขนาด 1,000 ไมโครลิตร

3.1.17 ไมโครปเปต ขนาด 5,000 ไมโครลิตร

3.1.18 หมอนึ่งความดันไอน้ํา

3.1.19 หลอดทดลอง

3.1.20 หวงถายเชื้อ

3.1.21 แฮนดรีแฟรกโตมิเตอร

17 

 

3.2 สารเคมี

3.2.1 3,5-dinitrosalicylic acid (C7H4N2O7)

3.2.2 Agar

3.2.3 Ammonium sulphate ((NH4)2SO4)

3.2.4 Ammonium molybdate tratahydrate ((NH4)6Mo7O24·4H2O)

3.2.5 Borax (Na2B4O7·10H2O)

3.2.6 Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)

3.2.7 Chloroform (CHCl3)

3.2.8 Citric acid (C6H8O7)

3.2.9 Copper sulphate (Cupric Sulfate) pentahydrate (CuSO4·5H2O)

3.2.10 Disodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)

3.2.11 Ferrous sulfate heptahydrate (FeSO4·7H2O)

3.2.12 Glucose (C6H12O6)

3.2.13 Hydrochloric acid conc. (HCl)

3.2.14 Manganese sulphate monohydrate (MnSO4·H2O)

3.2.15 Magnesium Sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O)

3.2.16 Monopotassium phosphate (KH2PO4)

3.2.17 Nutrient broth

3.2.18 Paraffin solution

3.2.19 Phenol (C6H6O)

3.2.20 Poly-β-hydroxybutyrate (C4H8O3)n

3.2.21 Potassium sodium tartrate (KNaC4H4O6·4H2O)

3.2.22 Sodium chloride (NaCl)

3.2.23 Sodium hydroxide (NaOH)

3.2.24 Sodium hypochlorite (NaClO)

3.2.25 Sulfuric acid conc. (H2SO4)

18 

 

3.2.26 Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O)

3.3 วิธีการทดลอง

3.3.1 การเก็บรักษาจุลินทรีย

จุลินทรียที่ใชในการศึกษาคือ Alcaligenes eutrophus TISTR 1095 จากสถาบันวิจัย

วิทยาศาสตรและเทคโนโลยีแหงประเทศไทย (วว.) โดยมาทําการขีด (streak) ลงบนอาหาร nutrient

agar (NA)ในหลอดทดลองแบบอาหารเอียง (slant) นําไปบมที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสเปนเวลา

24 ชั่วโมง จากนั้นเททับดวยสารละลายพาราฟน ท่ีนึ่งฆาเชื้อและไลความชื้นแลวลงไปใหสูงกวา

ระดับของอาหารเลี้ยงเชื้อประมาณ 1 เซนติเมตร นําไปเก็บที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส เปน stock

culture โดยทําการ subculture ทุกๆ 1 เดือน

3.3.2 การเตรียมอาหารสูตรผลิตPHB

อาหารสูตรผลิต PHB 1 ลิตร ประกอบดวย KH2PO4 13.3 กรัม MgSO4·7H2O 1.2 กรัม

citric acid 1.7 กรัม และ trace element solution 10 มิลลิลิตร การเตรียม trace element solution 500

มิลลิลิตร ประกอบไปดวย FeSO4·7H2O 5 กรัม ZnSO4·7H2O 1.125 กรัม CuSO4·5H2O 0.5 กรัม

MnSO4·H2O 0.17 กรัม CaCl2·2H2O 1 กรัม Na2B4O7·10H2O 0.115 กรัม (NH4)6Mo7O24·4H2O 0.05

กรัม, HCl 36% 5 ml (Sirisansaneekul and Mahasubpaiboon , n.d.) โดยใชแอมโมเนียมซัลเฟต

และ กลูโคสเปนแหลงไนโตรเจนและแหลงคารบอนตามลําดับ

3.3.3 การเพาะเลี้ยงกลาเชื้อ

ถายกลาเชื้อ A. eutrophus TISTR 1095 ที่เพาะเลี้ยงในอาหาร NA อายุ 24 ชั่วโมง

จํานวน 2 ลูป ลงในอาหาร nutrient broth (NB) ปริมาตร 150 ml นําไปบมที่อุณหภูมิ 30

องศาเซลเซียส อัตราการเขยาที่ 200 รอบตอนาที เปนเวลา 10 ช่ัวโมง นําไปใชเปนกลาเชื้อใน

การศึกษาตอไป

3.3.4 การศึกษาผลของความเขมขนน้ําตาลกลูโคสตอการผลิต PHB ในอาหารสังเคราะห

ดวยการหมักแบบกะในระดับฟลาสก

ถายกลาเชื้อ A. eutrophus TISTR 1095 จากขอ 3.3.3 ปริมาตร 15 มิลลิลิตรลงใน

อาหารสูตรผลิต PHB ที่แปรผันความเขมขนของน้ําตาลกลูโคสเทากับ 10 30 หรือ 50 กรัมตอลิตร

19 

 

ปริมาตร 150 มิลลิลิตร นําไปเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิที่ 30 องศาเซลเซียส อัตราการเขยา 200 รอบตอ

นาที เก็บตัวอยางทุก 4 ช่ัวโมง ตลอดการหมัก นํามาวิเคราะหความขุนของเซลล น้ําตาลกลูโคส

ความเปนกรดดาง ปริมาณของแข็งที่ละลายไดทั้งหมด และความเขมขนของ PHB

3.3.5 การศึกษาแหลงไนโตรเจน อุณหภมูิ และอัตราการเขยา ท่ีเหมาะสมตอการผลิต PHB

จากน้ํายอยแปงมันสําปะหลัง

ถายกลาเชื้อ A. eutrophus TISTR 1095 ปริมาตร 15 มิลลิลิตร ลงในอาหารสูตรผลิต

PHB ซ่ึงใชน้ํายอยแปงมันสําปะหลังเปนแหลงคารบอนและใชแอมโมเนียมซัลเฟต ((NH4)2SO4)

หรือสารสกัดจากยีสต (yeast extract) เปนแหลงไนโตรเจน ปริมาตร 150 มิลลิลิตร ทําการหมักที่

อุณหภูมิ 25 30 หรือ 35 องศาเซลเซียส อัตราการเขยา 100 150 หรือ 200 รอบตอนาที เก็บตัวอยาง

ทุก 4 ช่ัวโมง ตลอดการหมัก นํามาวิเคราะหเชนเดียวกับขอที่ 3.3.4

3.3.6 การศึกษาการผลิต PHB จากน้ํายอยแปงมันสําปะหลังดวยการหมักแบบกะ

ในถังหมักขนาด 5 ลิตร

ถายกลาเชื้อ A. eutrophus จากขอ 3.3.3 ปริมาตร 150 มิลลิลิตรลงในอาหารสูตรผลิต

PHB ซ่ึงใชน้ํายอยแปงมันสําปะหลังเปนแหลงคารบอนปริมาตร 3,000 มิลลิลิตร ที่มีการเติมแหลง

ไนโตรเจนที่เหมาะสม จากการทดลอง 3.3.5 ทําการเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิและอัตราการกวนที่

เหมาะสมจากการทดลอง 3.3.5 เก็บตัวอยางเปนชวงๆ ตลอดการหมัก นํามาวิเคราะหเชนเดียวกับ

การทดลองที่ 3.3.4

3.4 การวิเคราะห

3.4.1 การวิเคราะหความเขมขนของน้ําตาลรีดิวซดวยวิธีดีเอ็นเอส (DNS method)

3.4.1.1 ปเปตสารละลายตัวอยาง (ที่ผานการแยกเซลลออกแลว) หรือสารละลายกลูโคส

มาตรฐาน (แตละความเขมขน) ที่ตองการวิเคราะหปริมาตร 0.5 มิลลิลิตร ลงในหลอดทดลอง

3.4.1.2 เติมสารละลาย DNS ลงไป 0.5 มิลลิลิตร

3.4.1.3 นําไปตมในน้ําเดือดเวลา 5 นาที แชหลอดทดลองในน้ําเย็นจนกระทั่งตัวอยางเย็น

3.4.1.4 เติมน้ํากลั่นลงไป 5 มิลลิลิตร ผสมใหเขากันแลวนําไปวัดคาการดูดกลืนแสงที่

ความยาวคลื่น 520 นาโนเมตรโดยใชน้ํากลั่นเปน blank

20 

 

3.4.1.5 นําคาการดูดกลืนแสงไปเทียบกับกราฟมาตรฐาน เพื่อหาความเขมขนของน้ําตาลรีดิวซ

ในสารละลาย หรือคํานวณจากสมการเสนตรงของกราฟมาตรฐาน

3.4.2 การวิเคราะหความเขมขนของน้ําตาลทั้งหมดดวยวิธีฟนอลซัลฟูริก (phenol-

sulfuric acid method)

3.4.2.1 ปเปตสารละลายตัวอยางหรือสารละลายกลูโคสมาตรฐาน ปริมาตร 0.5 มิลลิลิตร

ใสในหลอดทดลองคอยๆ เติมสารละลายฟนอลความเขมขน 5 เปอรเซ็นตโดยน้ําหนักตอปริมาตร

(%w/v) 0.5 มิลลิลิตร เขยาใหเทากัน

3.4.2.2 เติมกรดซัลฟูริกปริมาตร 2.5 มิลลิลิตร ลงไปอยางชา โดยคอย ๆ ปลอยกรดซัลฟูริก

ลงดานขางหลอด เขยาใหเขากันระวังความรอนที่เกิดขึ้น

3.4.2.3 ตั้งหลอดทดลองทิ้งไว 10 นาที จากนั้นเขยาอีกครั้ง ตั้งทิ้งไวอีก 20 นาที

3.4.2.4 นําไปวัดคาการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 490 นาโนเมตร โดยใชน้ํากลั่นเปน

Blank

3.4.2.5 นําคาการดูดกลืนแสงไปเทียบกับกราฟมาตรฐาน เพื่อหาความเขมขนของน้ําตาล

ทั้งหมดในสารละลาย หรือคํานวณจากสมการเสนตรงของกราฟมาตรฐาน

3.4.3 การวัดคาความขุนของเซลล (optical density)

ปเปตสารละลายเซลลลงในคิวเวท (cuvette) นําไปวัดคาความขุนของเซลลที่ 650

นาโนเมตร โดยใชน้ํากลั่นเปน blank

3.4.4 การวิเคราะหความเขมขนของ PHB

3.4.4.1 ปเปตสารละลายเซลลปริมาตร 1 มิลลิลิตร ลงในหลอดทดลอง

3.4.4.2 เติมสารละลายโซเดียมไฮโปคลอไรดความเขมขน 6.25 เปอรเซ็นตโดยปริมาตร ลง

ไป 1 มิลลิลิตร

3.4.4.3 บมที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส เปนเวลา 1 ช่ัวโมง

3.4.4.4 นําไปปนเหวี่ยงที่ 10,000 รอบตอนาที เปนเวลา 10 นาที จากนั้นคอยๆ รินสวนใส

ทิ้ง

3.4.4.5 ปเปตน้ํากลั่นลงไปและนําไปปนเหวี่ยงเชนเดียวกับการทดลองที่ 3.4.4.2

3.4.4.6 ละลายตะกอนลงในน้ํากลั่นปริมาตร 3 มิลลิลิตรแลวถายลงในหลอดทดลอง

21 

 

3.4.4.7 เติมสารละลายคลอโรฟอรมรอนปริมาตร 5 มิลลิลิตร ผสมใหเขากันเปนเวลา 1

นาที

3.4.4.8 ปเปตสารละลายชั้นของคลอโรฟอรม (ชั้นลางสุดในหลอดทดลอง) นําไปแชในอางน้ํารอน 3.4.4.9 เมื่อสังเกตเห็นตะกอนเปนสีขาวที่กนของหลอดทดลอง ใหเติมกรดซัลฟูริกเขมขนปริมาตร 10 มิลลิลิตรใสลงในหลอดทดลอง นาํไปแชในอางน้ําเดือดเปนเวลา 1 ชั่วโมง 3.4.4.10 ทําใหเย็นที่อุณหภูมิหอง จากนั้นนํามาวัดคาการดูดกลืนแสงที่ 235 นาโนเมตร โดยใชกรดซัลฟูริกเขมขนเปน blank 3.4.5 กราฟมาตรฐานของ PHB 3.4.5.1 ละลาย PHB 0.5 กรัมลงในกรดซัลฟูริกเขมขน ปรับปริมาตรในขวดปรับปริมาตรขนาด 50 มิลลิลิตร จะไดสารละลาย PHB ความเขมขน 10 มลิลิกรัมตอมิลลิลิตร 3.4.5.2 ดูดสารละลายจากขอ 3.4.5.1 ปริมาตร 1 มิลลิลิตร ลงในกรดซัลฟูริกเขมขน ปรับปริมาตรในขวดปรับปริมาตรขนาด 50 มิลลิลิตร จะไดสารละลาย PHB ความเขมขน 200 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร 3.4.5.3 นําสารละลายจากขอ 3.4.5.2 ปริมาตร 2 มิลลิลิตร ลงในกรดซัลฟูริกเขมขน

ปริมาตร 18 มิลลิลิตร จะไดความเขมขน 20 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร

3.4.5.4 นําสารละลายจากขอ 3.4.5.3 มาเจือจางกับกรดซัลฟูริกเขมขน ใหไดความเขมขน 1

2 4 6 8 และ 10 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร

3.4.5.5 นําสารละลาย PHB แตละความเขมขนมาแชในอางน้ําเดือดเปนเวลา 1 ชั่วโมง

3.4.5.6 ทิ้งใหเย็นที่อุณหภูมิหอง นํามาวัดคาการดูดกลืนแสงที่ 235 นาโนเมตร

3.4.5.7 นําคาการดูดกลืนแสงที่ไดมาสรางกราฟความสัมพันธระหวางคาความเขมขนของ

PHB กับคาการดูดกลืนแสงที่ 235 นาโนเมตร

3.4.6 การคํานวณ

3.4.6.1 ผลไดของ PHB (yield of PHB; YP/S)

YP/S = [P] / [S]

[P] = ความเขมขนของ PHB ที่ถูกผลิตขึ้น (กรัมตอลิตร)

[S] = ความเขมขนของน้ําตาลที่ถูกใชไป (กรัมตอลิตร)

22 

 

3.4.6.2 ผลไดของ PHB ตอหนวยของเซลล (YP/X)

YP/X = [P] / [X]

[P] = ความเขมขนของ PHB ที่ถูกผลิตขึ้น (กรัมตอลิตร)

[x] = ความเขมขนของมวลเซลลที่เจริญเติบโตขึ้น (กรัมตอลิตร)

3.4.6.3 เปอรเซ็นตการสะสม PHB ภายในเซลล (%PHB content)

% PHB content = ([P] / [X]) x 100

[P] = ความเขมขนของ PHB ที่ถูกผลิตขึ้น (กรัมตอลิตร)

[x] = ความเขมขนของมวลเซลลที่เจริญเติบโตขึ้น (กรัมตอลิตร)

3.4.6.4 อัตราการผลิต PHB ท้ังหมด Total PHB productivity; QP

QP (g/h) = [Pmax] / h

[P max] = ความเขมขนของ PHB ที่ถูกสรางขึ้นสูงสุด (กรัมตอลิตร)

h = เวลาที่จุลินทรียใชในการผลิต PHB ไดสูงสุด (ชั่วโมง)

3.5 สถานที่ทําการทดลอง

สาขาวิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตรและเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีราชมงคลธัญบุรี

บทที ่4 ผลและวิจารณผลการทดลอง

4.1 การศึกษาองคประกอบของน้ํายอยแปงมันสําปะหลังท่ีเหลือจากการผลิตน้ําตาลกลูโคส เมื่อนําน้ํายอยแปงมันสําปะหลังที่เหลือจากโรงงานผลิตน้ําตาลกลูโคส จังหวัดนครปฐม มาวัดปริมาณของแข็งที่ละลายไดทั้งหมด ความเขมขนของน้ําตาลทั้งหมด น้ําตาลรีดิวซ และความเปนกรดดางดวยแฮนดรีแฟรกโตมิเตอร วิธีฟนอลซัลฟูริก วิธีดีเอ็นเอส และเครื่องวัดความเปนกรดดางตามลําดับ พบวามีปริมาณของแข็งที่ละลายไดทั้งหมดเทากับ 27.2 องศาบริกซ ความเขมขนของน้ําตาลทั้งหมด น้ําตาลรีดิวซ และความเปนกรดดาง เทากับ 209.13 กรัมตอลิตร 110.05 กรัมตอลิตร และ 4.44 ตามลําดับ (ตารางที่ 3) จากองคประกอบของน้ํายอยแปงมันสําปะหลังดังกลาว พบวาน้ํายอยแปงมันสําปะหลังมีความเขมขนของน้ําตาลทั้งหมดและน้ําตาลรีดิวซเพียงพอตอการผลิต PHB โดยจากการทดลองของ Patwardhan and Srivastava (2008) พบวาเมื่อเพาะเลี้ยง W. eutropha NRRLB-14690 ในอาหารที่มีน้ําตาลฟรุกโตส 40 กรัมตอลิตร เปนแหลงคารบอน สามารถผลิต PHB ไดชีวมวล และ PHB สูงสุด เทากับ 14.0 และ 6.1 กรัมตอลิตร ตามลําดับ คิดเปนเปอรเซ็นตการสะสม PHB ในเซลลเทากับ 43.6% โดยน้ําหนักแหง ในป 2003 Ruan et al. ไดศึกษาการใชน้ําตาลฟรุกโตส 20 กรัมตอลิตร เปนแหลงคารบอนในการเพาะเลี้ยงแบคทีเรีย A. eutrophus พบวา แบคทีเรียสามารถผลิตพอลิเมอรได 12.3 มิลลิกรัมตอลิตร ในป 2007 Yezza et al. ไดศึกษาการผลิต PHB จากแบคทีเรีย A. latus ในระดับฟลาสกเขยาโดยใช maple sap ซ่ึงมีน้ําตาลซูโครส กลูโคส ฟรุกโตสเปนองคประกอบเทากับ 20.0 0.8 และ 0.3 กรัมตอลิตร ตามลําดับ เปนแหลงคารบอน พบวาได ชีวมวลของ A. latus สูงสุดเทากับ 4.4 ± 0.5 กรัมตอลิตร และมี PHB สะสมอยูภายในเซลล 77.6 ± 1.5 % โดยน้ําหนักแหง จากงานวิจัยตางๆจะพบวาการผลิต PHB นั้นจะใชน้ําตาลที่มีความเขมขนอยูในชวงประมาณ 20 ถึง 40 กรัมตอลิตร ซ่ึงความเขมขนของน้ําตาลทั้งหมดและน้ําตาลรีดิวซในน้ํายอยแปงมันสําปะหลังมีเพียงพอตอการศึกษาการผลิต PHB ดวย A. eutrophus ในการทดลองตอไป

24

ตารางที่ 3 องคประกอบของน้ํายอยแปงมันสําปะหลังที่เหลือจากการผลิตน้ําตาลกลูโคส

*หมายเหตุ ทําการวิเคราะหแบบ 2 ซํ้า 4.2 การศึกษาผลของความเขมขนน้ําตาลกลูโคสในอาหารสังเคราะหตอการผลิต PHB ดวยการ

หมักแบบ กะในระดับฟลาสกเขยา เมื่อเพาะเลี้ยง A. eutrophus ในอาหารสูตรผลิต PHB ที่มีความเขมขนของน้ําตาลกลูโคสเร่ิมตนเทากับ 10 กรัมตอลิตร (Sirisansaneekul and Mahasubpaiboon , n.d.) พบวา แบคทีเรียมีการเจริญเติบโตอยางชาๆ ในชวง 12 ช่ัวโมงแรกของการเพาะเลี้ยง หลังจากชั่วโมงที่ 12 แบคทีเรียมีการเจริญเติบโตอยางรวดเร็ว โดยเขาสูชวง log phase จนกระทั่งถึงชั่วโมงที่ 36 โดยมีการสะสมมวลเซลล เทากับ 0.657 กรัมตอลิตร A. eutrophus เร่ิมมีการเจรญิเติบโตเขาสูชวง stationary phase และเขาสูชวง death phase ในชั่วโมงที่ 48 ของการหมัก ในขณะที่ความเขมขนของน้ําตาลกลูโคสที่ถูกใชไปก็มีแนวโนมเชนเดียวกับการเจริญของ A. eutrophus โดยแบคทีเรียมีการใชน้ําตาลกลูโคสอยางรวดเร็วเมื่อ A. eutrophus มีการเจริญเขาสูชวง log phase (ชั่วโมงที่ 12 ถึง 36) และมีน้ําตาลที่ถูกใชไปเทากับ 10.76 กรัมตอลิตร จากการทดลองยังพบวา A. eutrophus มีอัตราการผลิต PHB สูงขึ้นเมื่อการเพาะเลี้ยงเขาสูชั่วโมงที่ 24 และได PHB สูงสุดเทากับ 164.42 x 10-3 กรัมตอลิตรในช่ัวโมงที่ 36 และ ความเขมขนของ PHB ลดลงในชั่วโมงที่ 48 ของการเพาะเลี้ยง (ภาพที่ 3) เมื่อเพาะเลี้ยง A. eutrophus ในอาหารสูตรผลิต PHB ที่มีความเขมขนของน้ําตาลกลูโคสเร่ิมตนเทากับ 30 กรัมตอลิตร พบวา เซลลมีการเจริญเติบโตอยางชาๆ ในชวง 12 ชั่วโมงแรกของการเพาะเลี้ยง หลังจากชั่วโมงที่ 12 แบคทีเรียมีการเจริญเติบโตอยางรวดเร็ว โดยเขาสูชวง log phase จนกระทั่งถึงชั่วโมงที่ 36 โดยมีการสะสมมวลเซลล เทากับ 1.074 กรัมตอลิตร A. eutrophus เร่ิมมีการเจริญเติบโตเขาสูชวง stationary phase และเขาสูชวง death phase ในชั่วโมงที่ 48 ของการหมัก และ A. eutrophus มีการใชน้ําตาลกลูโคสอยางรวดเร็วเมื่อการเจริญเขาสูชวง

องคประกอบ ปริมาณ*

ของแข็งที่ละลายไดทั้งหมด น้ําตาลทั้งหมด น้ําตาลรีดิวซ ความเปนกรดดาง

27.20 ± 0.00 องศาบริกซ 209.13 ± 23.51 กรัมตอลิตร 110.05 ± 11.25 กรัมตอลิตร 4.44 ± 0.01

25

log phase (ชั่วโมงที่ 12 ถึง 36) และมีน้ําตาลที่ถูกใชไปเทากับ 6.58 กรัมตอลิตร และยังพบวา A. eutrophus มีการผลิต PHB สูงสุดไดเทากับ 199.35 x 10-3 กรัมตอลิตร ในชั่วโมงที่ 48 ของการเพาะเลี้ยง (ภาพที่ 4) ในขณะที่การเพาะเลี้ยงแบคทีเรียในอาหารสูตรผลิต PHB ที่มีความเขมขนของน้ําตาลกลูโคสเริ่มตนเทากับ 50 กรัมตอลิตร พบวา แบคทีเรียมีการเจริญเติบโตอยางชาๆ ในชวง 12 ชั่วโมงแรกของการเพาะเลี้ยง หลังจากชั่วโมงที่ 12 แบคทีเรียมีการเจริญเติบโตอยางรวดเร็ว โดยเขาสู log phase จนกระทั่งถึงชั่วโมงที่ 36 โดยมีการสะสมมวลเซลล เทากับ 1.076 กรัมตอลิตร และ A. eutrophus เร่ิมมีการเติบโตเขาสูชวง stationary phase และเขาสูชวง death phase ในชั่วโมงที่ 48 ของการหมัก และแบคทีเรียมีการใชน้ําตาลกลูโคสอยางรวดเร็ว เมื่อมีการเจริญเติบโตเขาสูชวง log phase (ชั่วโมงที่ 12 ถึง 36) และมีน้ําตาลกลูโคสที่ถูกใชไปเทากับ 4.29 กรัมตอลิตร และยังพบวา A. eutrophus มีการผลิต PHB เทากับ 160.17 x 10-3 กรัมตอลิตร ในชั่วโมงที่ 48 ของการเพาะเลี้ยง (ภาพที่ 5)

Time (h)

0 10 20 30 40 50

Optic

al de

nsity

at 65

0 nm

0.0

.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0Gl

ucos

e co

ncen

tation

(gl-1 )

0

10

20

30

40

50

60

PHB

conc

entra

tion (

x10-3 gl-1 )

0

50

100

150

200

Dry

cell w

eight

(gl-1 )

0.0

.5

1.0

1.5

2.0

Optical densityGlucosePHBDry cell weight

ภาพที่ 3 การเพาะเลี้ยง A. eutrophus ในอาหารสูตรผลิต PHB ที่มีน้ําตาลกลูโคสเริ่มตน 10 กรัมตอลิตร

26

Time (h)

0 10 20 30 40 50

Optic

al de

nsity

at 65

0 nm

0.0

.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Gluc

ose

conc

entat

ion (g

l-1 )

0

10

20

30

40

50

60PH

B co

ncen

tratio

n (x1

0- 3 gl-1 )

0

50

100

150

200

Dry

cell w

eight

(gl-1 )

0.0

.5

1.0

1.5

2.0

Optical density

Glucose

PHB

Dry cell weight

ภาพที่ 4 การเพาะเลี้ยง A. eutrophus ในอาหารสูตรผลิต PHB ที่มีน้ําตาลกลูโคสเริ่มตน 30 กรัมตอลิตร

Time(h)

0 10 20 30 40 50

Optic

al de

nsity

at 65

0 nm

0.0

.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0Gl

ucos

e co

ncen

tation

(gl-1 )

0

10

20

30

40

50

60

PHB

conc

entra

tion (

x10-3 gl-1 )

0

50

100

150

200

Dry

cell

weigh

t (gl-1 )

0.0

.5

1.0

1.5

2.0

Optical density

Glucose

PHB

Dry cell weight

ภาพที่ 5 การเพาะเลี้ยง A. eutrophus ในอาหารสูตรผลิต PHB ที่มีน้ําตาลกลูโคสเริ่มตน 50 กรัมตอลิตร จากการศึกษาผลของความเขมขนน้ําตาลกลูโคสในอาหารสังเคราะหตอการผลิต PHB ดวย การหมักแบบกะในระดับฟลาสกเขยา พบวา ในทุกสภาวะมีการเปลี่ยนแปลงระหวางการเพาะเลี้ยง A. eutrophus คลายคลึงกัน โดยน้ําตาลกลูโคสคอยๆ ลดลงในขณะที่ A. eutrophus มีการเจริญเติบโตและผลิต PHB ขึ้น แสดงวา A. eutrophus มีการใชน้ําตาลกลูโคสในการสรางเซลล

27

และผลิต PHB ในระหวางการเจริญเติบโตในทุกสภาวะ และการทดลองที่มีน้ําตาลกลูโคสเริ่มตน 10 กรัมตอลิตร ยังพบวา ในชั่วโมงที่ 48 ปริมาณ PHB ไดลดลงเนื่องจากแหลงคารบอน (น้ําตาลกลูโคส) ใกลจะหมด แบคทีเรียจึงนํา PHB กลับมาใชเปนแหลงคารบอนหรือแหลงพลังงานใหม ซ่ึงสอดคลองกับการทดลองของ Macrae and Wilkenson (1958) ซ่ึงถูกอางอิงโดยสุปริญญา ในป 2546 และ Khanna and Srivastsva (2005) ไดรายงานวา เมื่อแหลงคารบอนใกลจะหมด แบคทีเรียจะเปลี่ยน PHB เปน D(-) -3-hydroxybutyrate โดยเอนไซม PHA depolymerase และ D(-)-3-hydroxybutyrate จะถูกเรงปฏิกิริยาโดยเอนไซม D(-)-3-hydroxybutyrate กลายเปน acetoacetate และถูกเรงปฏิกิริยาดวย acetoacetyl-CoA synthase เกิดเปน acetoacety-CoA กอนเปล่ียนเปน acetyl-CoA เขาสูวัฏจักรเครปสตอไป (ภาพที่ 6) ยังพบอีกวาเมื่อระดับของน้ําตาลเริ่มตนสูงขึ้น แบคทีเรียมีเปอรเซ็นตการใชน้ําตาลกลูโคสลดลง (ตารางที่ 4) เชนเดียวกับการทดลองของ Shang et al. (2003) ซ่ึงไดแปรผันปริมาณน้ําตาลกลูโคสเริ่มตนที่ 2.5 9.0 16.0 และ 40.0 กรัมตอลิตร พบวา เมื่อความเขมขนน้ําตาลเริ่มตนสูงขึ้นการผลิต PHB จะลดลง เนื่องจากความเขมขนของน้ําตาลกลูโคสในระดับสูงจะทําใหเกิดแรงดันออสโมติก (osmotic pressure) สูงขึ้นดวย สงผลใหการเจริญและการนําสารอาหารตาง ๆ เขาออกเซลลถูกยับยั้ง การเจริญเติบโตและการผลิต PHB ของแบคทีเรียจึงลดลง โดยแบคทีเรียมีอัตราการผลิต PHB สูงสุดเทากับ 3.1 กรัมตอลิตรตอชั่วโมง และมีความเขมขนของเซลลและ PHB เทากับ 208 และ 139 กรัมตอลิตร ตามลําดับ ในการหมักแบบกึ่งกะที่มีการใหน้ําตาลกลูโคสเพิ่มขึ้นถึง 700 กรัมตอลิตร

ภาพที่ 6 วิถีการสังเคราะหและการสลาย PHB ในแบคทีเรีย R. eutropha ที่มา : Khanna and Srivastava (2005)

28

และเมื่อเปรียบเทียบประสิทธิภาพการผลิต PHB พบวาที่ความเขมขนน้ําตาลกลูโคส 10 กรัมตอลิตร มีผลได PHB ตอมวลเซลล (YP/X) สูงสุด เทากับ 0.250 และมีน้ําตาลกลูโคสเหลือในกระบวนการผลิตนอยที่สุด (5.32 เปอรเซ็นต) ขณะที่ความเขมขนน้ําตาลกลูโคส 30 กรัมตอลิตร มีการผลิต PHB สูงที่สุดเทากับ 199.35 x 10-3 กรัมตอลิตร คิดเปน YP/S และ YP/X เทากับ 0.03 และ 0.19 ตามลําดับ และท่ีความเขมขนน้ําตาล 50 กรัมตอลิตร มีน้ําตาลกลูโคสเหลือในกระบวนการผลิตมากที่สุด และมี YP/S เทากับ 0.037 และยังพบวา ทุกสภาวะใหอัตราการผลิต (Qp) ที่ใกลเคียงกัน แตจากการทดลองไดเลือกสภาวะที่มีน้ําตาลกลูโคสเริ่มตน 10 กรัมตอลิตรไปใชในการทดลองถัดไป เนื่องจากมี YP/X การสะสม PHB ในเซลลสูงสุด และมีน้ําตาลกลูโคสเหลือนอยที่สุด ทําใหสามารถลดตนทุนในการผลิตไดมี ดังนั้นจึงเลือกระดับความเขมขนน้ําตาลกลูโคสเริ่มตนที่ 10 กรัมตอลิตร มาใชในการศึกษาแหลงไนโตรเจน อุณหภูมิ และอัตราการเขยา ที่เหมาะสมตอการผลิต PHB จากน้ํายอยแปงมันสําปะหลังตอไป ตารางที่ 4 ประสิทธิภาพการผลิต PHB ในอาหารสังเคราะหที่มีความเขมขนน้ําตาลกลูโคสในระดับตางๆ

aGram PHB per gram of glucose consumed, bGram PHB per gram of dry cell weight 4.3 ผลของแหลงไนโตรเจนตอการผลิต PHB ในน้ํายอยแปงมันสําปะหลังดวยการหมักแบบกะใน ระดับฟลาสก เมื่อเพาะเลี้ยง A. eutrophus ในน้ํายอยแปงมันสําปะหลังที่มีปริมาณของแข็งที่ละลายไดทั้งหมดเทากับ 1 องศาบริกซ คิดเปนน้ําตาลทั้งหมดประมาณ 12-14 กรัมตอลิตร และใชแอมโมเนียมซัลเฟต((NH4)2SO4) และสารสกัดจากยีสต (yeast extract) 1.2 กรัมตอลิตร เปนแหลงไนโตรเจน ผลการทดลองพบวาเมื่อใชแอมโมเนียมซัลเฟตเปนแหลงไนโตรเจน แบคทีเรียมีการ

Glucose concentration (gl-1)

PHB concentration (x 10-3 gl-1)

Glucose consumption (%)

YaP/S

YbP/X

PHB content (%)

Qp (gl-1h-1)

10 164.42 94.68 0.015 0.250 25.03 0.005 30 199.35 22.36 0.030 0.357 35.66 0.004 50 160.17 8.77 0.037 0.301 30.11 0.003

29

เจริญเติบโตอยางชาๆ ในชวง 12 ชั่วโมงแรกของการเพาะเลี้ยง หลังจากชั่วโมงที่ 12 แบคทีเรียมีการเจริญเติบโตเขาสูชวง log phase อยางรวดเร็ว โดยมีการสะสมมวลเซลลเทากับ 0.060 กรัมตอลิตร ในขณะที่น้ําตาลทั้งหมดและน้ําตาลรีดิวซถูกใชอยางรวดเร็ว ซ่ึงสัมพนัธกับการเจริญเติบโตของแบคทีเรีย โดยน้ําตาลทั้งหมดและน้ําตาลรีดิวซถูกใชไปเทากับ 11.21 และ 8.09 กรัมตอลิตร ตามลําดับ และ A. eutrophus มีการผลิต PHB อยางรวดเร็วตั้งแตชั่วโมงที่ 12 เปนตนไปและมีการผลิตสูงสุดในชั่วโมงที่ 32 ของการเพาะเลี้ยง ซ่ึงได PHB เทากับ 106.88 x 10-3 กรัมตอลิตร (ภาพที่ 7) ในขณะที่การเพาะเลี้ยง A. eutrophus ในสภาวะเดียวกันแตใชสารสกัดจากยีสตเปนแหลงไนโตรเจนพบวา แบคทีเรียมีรูปแบบการเจริญคลายคลึงกับการใชแอมโมเนียมซัลเฟตเปนแหลงไนโตรเจน แตเซลลมีการเจริญเขาสูชวง stationary phase ตั้งแตช่ัวโมงที่ 12 ของการทดลอง ขณะที่นํ้าตาลทั้งหมดและน้ําตาลรีดิวซมีแนวโนมลดลงจนเทากับ 5.49 และ 5.02 กรัมตอลิตร ตามลําดับ และ PHB ถูกผลิตขึ้นตั้งแตชั่วโมงที่ 12 และมีคาสูงสุดเทากับ 161.76 x 10-3 กรัมตอลิตร ในชั่วโมงที่ 24 ของการเพาะเลี้ยง และเริ่มลดลงจนคงที่ตั้งแตช่ัวโมงที่ 32 จนเสร็จส้ินการเพาะเลี้ยง (ภาพที่ 8)

ภาพที่ 7 การเพาะเลี้ยง A. eutrophus ในน้ํายอยแปงมันสําปะหลังที่มีการใชแอมโมเนียมซัลเฟตเปน แหลงไนโตรเจน

Time(h.)

0 10 20 30 40 50

Optic

al de

nsity

at 65

0 nm

0

2

4

6

8

10

Dry c

ell w

eight

(gl-1

)

0.00

.01

.02

.03

.04

.05

Redu

cing s

ugar

and T

otal s

ugar

(gl-1

)

0

5

10

15

20

PHB

conc

entra

tion X

10-3

(gl-1

)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Optical density

Dry cell weight

Reducing sugar

Total sugar

PHB

30

ภาพที่ 8 การเพาะเลี้ยง A. eutrophus ในน้ํายอยแปงมันสําปะหลังที่มีการใชสารสกัดจากยีสตเปน แหลงไนโตรเจน จากตารางที่ 5 พบวาเมื่อใชแอมโมเนียมซัลเฟตเปนแหลงไนโตรเจน แบคทีเรียผลิต PHB ได 106.88 x10-3 กรัมตอลิตร คิดเปน YP/S YP/X และ QP เทากับ 0.010 0.030 และ 0.002 กรัมตอลิตรตอชั่วโมงตามลําดับ และมีเปอรเซ็นตการสะสม PHB ในเซลลเทากับ 2.96 เปอรเซ็นต ขณะที่การใชสารสกัดจากยีสตเปนแหลงไนโตรเจน แบคทีเรียมีประสิทธิภาพการผลิต PHB สูงกวาการใชแอมโมเนียมซัลเฟตเปนแหลไนโตรเจน โดยได PHB เทากับ 161.76 x 10-3 กรัมติอลิตร คิดเปน YP/S YP/X และ QP เทากับ 0.029 0.068 และ 0.007 กรัมตอลิตรตอชั่วโมง ตามลําดับ แสดงวาการใชสารสกัดจากยีสตใหประสิทธิภาพการผลิต PHB สูงกวาการใชแอมโมเนียมซัลเฟตเปนแหลงไนโตรเจน เนื่องจากความเขมขนของสารสกัดจากยีสตสูงๆ จะมีความจําเปนตอการเจริญเติบโตของเซลลสูง เพราะวาการใชสารสกัดจากยีสตเปนแหลงไนโตรเจนใหเซลลนั้นก็เพียงพอสําหรับการเจริญเติบโตเพราะสารสกัดจากยีสตนั้นจะมีผลตอการจํากัดการเจริญเติบโตของเซลล สวนการสงเสริมใหเกิดการสะสม PHB เพิ่มในเซลลมากขึ้นหรือปรับปรุงความเขมขนของเซลลนั้นจะมีผลเนื่องมาจากสวนประกอบในอาหาร (Quillaguaman et al., 2007) จากผลการทดลองของ Quillaguaman et al. (2007) เพื่อศึกษาการเตมิสารสกัดจากยีสตในปริมาณสูงตอการผลิต PHB ของ H. boliviensis ดวยการหมักแบบกะ พบวาเมื่อเพิ่มความเขมขนของสารสกัดจากยีสต จะได CDW และ PHB เพิ่มขึ้นสูงสุด ที่ 44 wt.% และ 12 g l-1 ตามลําดับ จะเห็นวาการเพิ่มสารสกัดจากยีสตในปริมาณที่สูงขึ้น สงเสริมการ ผลิต PHB และ มวลเซลล เนื่องจากวาสารสกัดจากยีสตสามารถถูกใชเปนแหลงไนโตรเจนที่เพียงพอสําหรับเซลล อีกทั้งการใชสารสกัดจากยีสตจะจํากัดการเจริญเติบโตของเซลลและเหนี่ยวนําใหเกิดการผลิต PHB ขึ้นใน

Time(h.)0 10 20 30 40 50

Optic

al de

nsity

at 65

0 nm

0

2

4

6

8

10

Dry c

ell w

eight

(gl-1 )

0.00

.01

.02

.03

.04

.05

Redu

cing s

ugar

and T

otal s

ugar

(gl-1 )

0

5

10

15

20

PHB

conc

entra

tion x

10-3 (g

l-1 )

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Optical density

Cell dry weight

Reducing sugar

Total sugar

PHB

31

เซลล สอดคลองกับการทดลองของ Khanna and Srivastava (2005) อางถึง Page (1992) ไดศึกษาการผลิต PHB จากแบคทีเรีย Azotobacter vinelandii UWD พบวา การใชแหลงไนโตรเจนเชิงซอน เชน สารสกัดจากยีสตจะสามารถเพิ่มปริมาณผลผลิตของ PHB ได Khanna and Srivastava (2005) อางถึง Nakamura et al. (1992) และ Fujita et al. (1993) วากรดอะมิโนบางชนิดสามารถกระตุนใหเกิดการสราง PHB ในเซลลของ R. eutropha ได ซ่ึงสารสกัดจากยีสตจะมีโปรตีนและกรดอะมิโนเปนสวนประกอบได ทําใหสารสกัดจากยีสตถูกใชเปนแหลงวิตามินและปจจัยสงเสริมการเจริญเติบโตใหแกแบคทีเรียได ตารางที่ 5 ประสิทธิภาพการผลิต PHB ในน้ํายอยแปงมันสําปะหลังที่ใชแหลงไนโตรเจนตางกัน Nitrogen Source (1.2 gl-1)

PHB concentration (x10-3 gl-1)

Ya P/S

Yb P/X

PHB content (%)

QP (gl-1h-1)

Ammonium sulfate 106.88 0.010 0.030 2.96 0.002 Yeast extract 161.76 0.029 0.068 6.75 0.007

aGram PHB per gram of glucose consumed, bGram PHB per gram of dry cell weight

32

ตารางที่ 6 การผลิต PHB ในแหลงไนโตรเจนตางๆ Nitrogen source

PHB concentration (gl-1)

PHB content (%)

PHB productivity (gPHBl-1h-1)

Organism Reference

(NH4)2HPO

4 149.70 73.0 3.40 E. coli XL1-

Blue Wang and Lee (1997)

(NH4)2SO4 - 88.0 4.94 A. latus DSM 1123

Wang and Lee (1997)

(NH4)2SO4 3.41 77.6 - A. latus Yezza et al. (2007)

Yeast extract

11.66 - 0.45 Azotobacter beijerinckii DSM 1041

Bormann et al. (1998)

Yeast extract

12.00 44.0 - H. boliviensis Quillaguaman et al. (2007)

Yeast extract + Peptone

8.04 60 - Recombinant E. coli

Mahishi et al. (2003)

4.4 ผลของอุณหภูมิตอการผลิต PHB จากน้ํายอยแปงมันสําปะหลัง ดวยการหมักแบบกะใน ระดับฟลาสก การศึกษาอุณหภูมิที่เหมาะสมตอการผลิต PHB จากน้ํายอยแปงมันสําปะหลัง โดยทําการปรับปริมาณของแข็งที่ละลายไดทั้งหมดของน้ํายอยแปงมันสําปะหลังใหอยูในระดับที่เหมาะสมตามการทดลองที่4.2 และใชสารสกัดจากยีสตเปนแหลงไนโตรเจน (จากผลการทดลองที่4.3) จากนั้นทําการแปรผันอุณหภูมิที่ใชในการหมักที่ 25 30 หรือ 35 องศาเซลเซียส อัตราการเขยา 200 รอบตอนาที ผลการทดลองพบวา ที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส แบคทีเรียมีการเจริญเติบโตอยางรวดเร็วจนถึงชั่วโมงที่ 24 และมีการสะสมมวลเซลลสูงสุดเทากับ 2.715 กรัมตอลิตร จากนั้นการเจริญเติบโตคอยๆลดลง ในขณะที่น้ําตาลทั้งหมดและน้ําตาลรีดิวซนั้นเริ่มลดลงหลังจากชั่วโมงที่

33

12 ของการเพาะเลี้ยง โดยถูกใชไปเทากับ 4.838 และ 1.454 กรัมตอลิตร ตามลําดับ และ A. eutrophus มีการผลิต PHB อยางรวดเร็วตั้งแตชั่วโมงที่ 12 และมีการผลิตสูงสุดในชั่วโมงที่ 32 ของการเพาะเลี้ยง โดยมีการผลิต PHB เทากับ 26.740 x 10-3 กรัมตอลิตร (ภาพที่ 9) ในขณะที่การเพาะเลี้ยง A. eutrophus ในสภาวะเดียวกันที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส พบวา แบคทีเรียมีการเจริญเขาสูชวง log phase ตั้งแตชั่วโมงที่ 12 ของการทดลอง ขณะที่น้ําตาลทั้งหมดและน้ําตาลรีดิวซมีแนวโนมลดลงจนเทากับ 5.49 และ 5.02 กรัมตอลิตร ตามลําดับ และ PHB ถูกผลิตขึ้นพรอมกับการเจริญของแบคทีเรียตั้งแตชั่วโมงที่ 12 และมีคาสูงสุดเทากับ 161.76 x 10-3 กรัมตอลิตร ในชั่วโมงที่ 24 ของการเพาะเลี้ยง และเริ่มลดลงจนคงที่ตั้งแตช่ัวโมงที่ 32 จนเสร็จสิ้นการเพาะเลี้ยง (ภาพที่ 10) และที่อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส ผลการทดลองพบวา แบคทีเรียมีการเจริญเติบโตอยางชาๆในชวงชั่วโมงแรกจนถึงชั่วโมงที่ 12 และเจริญเติบโตอยางรวดเร็วจนชั่วโมงที่ 28 มีการสะสมมวลเซลลสูงสดุที่ 2.683 กรัมตอลิตร ขณะที่น้ําตาลทั้งหมดและน้ําตาลรีดิวซนั้นลดลงอยางรวดเร็วตั้งแต ชั่วโมงที่ 4 เปนตนไป จนเหลือ 8.819 และ 5.641 กรัมตอลิตร ตามลําดับ และ PHB ถูกผลิตขึ้นตั้งแตชั่วโมงที่ 4 และมีคาสูงสุดเทากับ 120.325 x 10-3 กรัมตอลิตร ในชั่วโมงที่ 28 ของการเพาะเลี้ยง จนเสร็จสิ้นการเพาะเลี้ยง (ภาพที่ 11)

Time (h)

0 10 20 30 40 50

Optic

al de

nsity

at 65

0 nm

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Dry c

ell w

eight

(gl-1 )

0.0

.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Redu

cing s

ugar

and T

otal s

ugar

(gl-1 )

0

5

10

15

20

PHB

conc

entra

tion x

10-3 (g

l-1 )

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Optical density

Dry cell weight

Reducing sugar

Total sugar

PHB

ภาพที่ 9 การเพาะเลี้ยง A. eutrophus ในน้ํายอยแปงมันสําปะหลังที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส

34

Time (h)0 10 20 30 40 50

Optic

al de

nsity

at 65

0 nm

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Dry c

ell w

eight

(gl-1 )

0.0

.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Redu

cing s

ugar

and T

otal s

ugar

(gl-1 )

0

5

10

15

20

PHB

conc

entra

tion x

10-3 (g

l-1 )

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Optical density

Dry cell weight

Reducing sugar

Total sugar

PHB

ภาพที่ 10 การเพาะเลี้ยง A. eutrophus ในน้ํายอยแปงมันสําปะหลังที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส

Time (h)

0 10 20 30 40 50

Optic

al de

nsity

at 65

0 nm

0

1

2

3

4

5

6

7

8Dr

y cell

weig

ht (gl

-1 )

0.0

.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Redu

cing s

ugar

and T

otal s

ugar

(gl-1 )

0

5

10

15

20

PHB

conc

entra

tion x

10-3 (g

l-1 )

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Optical density

Dry cell weight

Reducing sugar

Total sugar

PHB

ภาพที่ 11 การเพาะเลี้ยง A. eutrophus ในน้ํายอยแปงมันสําปะหลังที่อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส จากตารางที่ 7 พบวา เมื่อทําการเพาะเลี้ยงแบคทีเรียที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส A. eutrophus สามารถผลิต PHB ไดเพียง 26.740 x10-3 กรัมตอลิตร คิดเปน YP/S และ YP/X เทากับ 0.006 และ0.015 ตามลําดับ เนื่องจากยีน cI857 ซ่ึงมีหนาที่เกี่ยวกับการแสดงออกของยีนที่สงเสริมการผลิต PHB ถูกยับยั้งการทํางานอันเนื่องมาจากอุณหภูมิต่ํา ซ่ึงสงผลตอประสิทธิภาพการเจริญเติบโตของแบคทีเรีย (Shi et al., 2001)

35

เมื่ออุณหภูมิในการเพาะเลี้ยงสูงขึ้น พบวา แบคทีเรียสามารถผลิต PHB ไดสูงขึ้นเทากับ 161.760 x 10-3 กรัมตอลิตร คิดเปน YP/S และ YP/X เทากับ 0.029 และ 0.068 ตามลําดับ และมี Qp สูงสุดเทากับ 0.007 กรัมตอลิตรตอช่ัวโมง จากรายงานของ Tamdogan and Sidal (2011) พบวาอุณหภูมิที่เหมาะสมนั้นมีผลตอกิจกรรมของเอนไซมที่ใชในการสังเคราะห PHB ขณะที่เพิ่มอุณหภูมิในการเพาะเลี้ยงเปน 35 องศาเซลเซียส พบวา ประสิทธิภาพในการผลิต PHB ลดลงเมื่อเทียบกับการเพาะเลี้ยงที่ 30 องศาเซลเซียส เนื่องจากอุณหภูมิที่สูงขึ้นนั้น จะทําใหอัตราการเจริญจําเพาะของแบคทีเรียลดลง (ไมแสดงขอมูล) ทําใหการผลิต PHB ลดลงดวย และเมื่อพิจารณาจากการสะสมมวลเซลลจะพบวา มีปริมาณใกลเคียงกัน แตที่อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซยีส ผลิต PHB นอย แบคทีเรียอาจมีการเอาน้ําตาลไปใชในการผลิตผลิตภัณฑชนิดอื่นที่ไมไดทําการวัดระหวางการทดลอง ซ่ึงสอดคลองกับการทดลองของ Tripathi and Srivastava (2011) ซ่ึงศึกษาการผลิต PHB จาก A. eutrophus พบวาอุณหภูมิที่เหมาะสมตอการผลิต PHB คือ30 องศาเซลเซียส โดยสามารถผลิต PHB ไดสูงสดุเทากับ 6.25 กรัมตอลิตร และงานวิจัยของ Beaulieu et al. (1995) ไดรายงานวา อุณหภูมิที่เหมาะสมในการผลิต PHB คือ 30 องศาเซลเซียส สามารถผลิต PHB ไดเทากับ 13.0 กรัมตอลิตร ตารางที่ 7 ประสิทธิภาพการผลิต PHB จากน้ํายอยแปงมันสําปะหลังที่อุณหภูมิตางๆ

aGram PHB per gram of glucose consumed, bGram PHB per gram of dry cell weight

Temperature (oC)

PHB concentration (x 10-3 gl-1)

YaP/S

Yb

P/X

PHB content (%)

Qp (gl-1h-1)

25 26.740 0.006 0.015 1.50 0.001 30 161.760 0.029 0.068 6.75 0.007 35 120.325 0.014 0.045 4.53 0.004

36

4.5 ผลของอัตราการเขยาท่ีเหมาะสมตอการผลิต PHB จากน้ํายอยแปงมันสําปะหลังดวยการหมักแบบในระดับฟลากส

การศึกษาอัตราการเขยาที่เหมาะสมตอการผลิต PHB ของ A. eutrophus ทําการทดลองโดยใชระดับของแหลงคารบอน แหลงไนโตรเจน และระดับอุณหภูมิที่เหมาะสมจากการทดลอง 4.2 4.3 และ 4.4 ตามลําดับ และทําการแปรผันอัตราการเขยาระหวางการเพาะเลี้ยงที่ 100 200 หรือ 300 รอบตอนาที ผลการทดลองพบวาที่อัตราการเขยา 100 รอบตอนาที แบคทีเรียมีการเจริญเติบโตอยางตอเนื่องโดยไมพบชวง lag phase จนถึงชั่วโมงสุดทายของการเพาะเลี้ยง (ช่ัวโมงที่ 48) โดยมีการสะสมมวลเซลล เทากับ 3.40 กรัมตอลิตร ที่ 48 ชั่วโมง ในขณะที่ความเขมขนของน้ําตาลทั้งหมดและน้ําตาลรีดิวซ มีแนวโนมลดลงจนเทากับ 8.787 และ 7.966 กรัมตอลิตร ตามลําดับ และจากการทดลองยังพบวา A. eutrophus มีการผลิต PHB เพียงเล็กนอยจนถึงชั่วโมงที่ 32 และเริ่มผลิต PHB สูงสุดเทากับ 75.120 x10-3 กรัมตอลิตร ที่ 48 ช่ัวโมงของการเพาะเลี้ยง (ภาพที่ 12) เมื่อเพาะเลี้ยง A. eutrophus ที่สภาวะเดียวกันกับการทดลองขางตนและมีการเขยา 200 รอบตอนาที ระหวางการเพาะเลี้ยง ผลการทดลองพบวา แบคทีเรียมีการเจริญเติบโตอยางชาๆ ในชวง 12 ช่ัวโมงแรกของการเพาะเลี้ยง หลังจากนั้นแบคทีเรียจะมีการเจริญเติบโตเขาสูชวง log phase จนกระทั่งถึงชั่วโมงที่ 28 จึงมีการสะสมมวลเซลล เทากับ 2.500 กรัมตอลิตร หลังจากนั้น A. eutrophus มีการเจริญเติบโตเขาสูชวง stationary phase และเขาสูชวง death phase ในชั่วโมงที่ 48 ของการเพาะเลี้ยง และ A. eutrophus มีการใชน้ําตาลทั้งหมดและน้ําตาลรีดิวซอยางรวดเร็วเมื่อการเจริญเขาสูชวง log phase (ช่ัวโมงที่ 12 ถึง 28) และพบวา A. eutrophus มีการผลิต PHB สูงสุดเทากับ 161.760 x 10-3 กรัมตอลิตรในชั่วโมงที่ 24 ของการเพาะเลี้ยง (ภาพที่ 13) และการเพาะเลี้ยง A. eutrophus โดยใชอัตราการเขยาที่ 300 รอบตอนาที ผลการทดลองพบวา แบคทีเรียมีการเจริญเติบโตอยางรวดเร็วและมีการเจริญเติบโต โดยเขาสู stationary phase ภายใน 8 ชั่วโมงของการเพาะเลี้ยง โดยมีการสะสมมวลเซลล เทากับ 1.840 กรัมตอลิตร และเขาสูชวง death phase ในชั่วโมงที่ 36 ของการเพาะเลี้ยง และ A. eutrophus มีการใชน้ําตาลรีดิวซสัมพันธกับการเจริญ ขณะที่น้ําตาลทั้งหมดคอยๆ ลดลงตลอดการเพาะเลี้ยง และแบคทีเรียมีการผลิต PHB ตั้งแตชั่วโมงที่ 8 เปนตนไป และมีการผลิตสูงสุดเทากับ 38.900 x 10-3 กรัมตอลิตร ในช่ัวโมงที่ 28 ของการเพาะเลี้ยง (ภาพที่ 14)

37

Time (h)0 10 20 30 40 50

Optic

al de

nsity

at 65

0 nm

0

2

4

6

8

10

Dry c

ell w

eight

(gl-1 )

0

1

2

3

4

Redu

cing s

ugar

and T

otal s

ugar

(gl-1 )

0

5

10

15

20PH

B co

ncen

tratio

n X 10

-3 (gl-1 )

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Optical density

Dry cell weight

Reducing sugar

Total sugar

PHB

ภาพที่ 12 การเพาะเลี้ยง A. eutrophus ในน้ํายอยแปงมันสําปะหลังดวยอัตราการเขยา 100 รอบตอนาที

Time (h)0 10 20 30 40 50

Optic

al de

nsity

at 65

0 nm

0

2

4

6

8

10Dr

y cell

weig

ht (gl

-1 )

0

1

2

3

4

Redu

cing s

ugar

and T

otal s

ugar

(gl-1 )

0

5

10

15

20

PHB

conc

entra

tion x

10-3 (g

l-1 )

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Optical density

Dry cell weight

Reducing sugar

Total sugar

PHB

ภาพที่ 13 การเพาะเลี้ยง A. eutrophus ในน้ํายอยแปงมันสําปะหลังดวยอัตราการเขยา 200 รอบตอนาที

38

Time (h)

0 10 20 30 40 50

Optic

al de

nsity

at 65

0 nm

0

2

4

6

8

10

Dry c

ell w

eight

(gl-1 )

0

1

2

3

4

Redu

cing s

ugar

and T

otal s

ugar

(gl-1 )

0

5

10

15

20PH

B co

ncen

tratio

n X 10

-3 (gl-1 )

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Optical density

Dry cell weight

Reducing sugar

Total sugar

PHB

ภาพที่ 14 การเพาะเลี้ยง A. eutrophus ในน้ํายอยแปงมันสําปะหลังดวยอัตราการเขยา 300 รอบตอนาที จากตารางที่ 8 พบวาที่อัตราการเขยา 100 รอบตอนาที แบคทีเรียมีการสะสม PHB เทากับ 75.120 x10-3 กรัมตอลิตร คิดเปน YP/S และ YP/X เทากับ 0.009 และ 0.022 ตามลําดับ เมื่อเพิ่มอัตราการเขยาเปน 200 รอบตอนาที พบวา แบคทีเรียมีการสราง PHB สูงที่สุดเทากับ 161.760 x10-3 กรัมตอลิตร คิดเปน YP/S YP/X และ QP เทากับ 0.029 0.068 และ 0.007 กรัมตอลิตรตอชั่วโมง ตามลําดับ ซ่ึง A. eutrophus มีประสิทธิภาพการผลิต PHB สูงกวาที่อัตราการเขยา 100 รอบตอนาที เนื่องจากเมื่ออัตราการเขยาสูงขึ้นจะทําใหแบคทีเรียไดรับออกซิเจนสูงขึ้น จนถึงระดับที่สงผลตอการสราง PHB และเมื่อเพิ่มการเขยาเปน 300 รอบตอนาที แบคทีเรียมีการผลิต PHB นอยที่สุดเทากับ 38.904 x10-3 กรัมตอลิตร คิดเปน YP/S YP/X และ QP เทากับ 0.011 0.022 และ 0.001 กรัมตอลิตรตอช่ัวโมง ตามลําดับ จากผลการทดลองทั้งหมดพบวาเมื่ออัตราการเขยาเพิ่มขึ้น PHB จะสูงขึ้น และหากอัตราการเขยาเพิ่มขึ้น ถึง 300 รอบตอนาทีประสิทธิภาพการผลิต PHB จะลดลง ซ่ึง Luengo et al. (2003) รายงานวา การรักษาปริมาณออกซิเจนในระดับที่จํากัด (oxygen limitation) จะทําใหเอนไซมซิเตรทซินเทส (citrate synthase) และไอโซซิเตรท ดีไฮโดรจีเนส ( isocitrate dehydrogenase ) ถูกยับยั้ง สงผลใหอะซิติลโคเอ (acetyl CoA) ไมสามารถเขาสูวัฎจักรเครปส ( TCA cycle ) acetyl CoA จึงถูกนําไปสรางเปนอะซิโตอะซิติลโคเอ (acetoacetyl CoA) และ PHB ตามลําดับ และ Savenkova et al. (1999) ยังรายงานวา การสะสม PHB ถูกชักนําจากปริมาณออกซิเจนที่จํากัด และไดอางถึง Hine and Lees (1976) วาการเจริญของแบคทีเรีย Azotobacter chroococcum จะเพิ่มขึ้นเมื่อมีการใหอากาศ การเจริญและการสะสม PHB จะสูงขึ้นเมื่อมีการใหอากาศอยางเพียงพอ โดยตองรักษาการใหออกซิเจนใหต่ํากวาระดับการจํากัด

39

ออกซิเจน (oxygen limiting condition) จะทําใหมีการผลิต PHB สูง แสดงวาที่อัตราการเขยา 200 รอบตอนาที สามารถรักษาระดับของออกซิเจนอยูในระดับที่เหมาะสมจึงสามารถทําใหแบคทีเรียผลิต PHB ไดสูงที่สุด และเมื่ออัตราการเขยาเพิ่มขึ้นเปน 300 รอบตอนาที อัตราการผลิต PHB ลดลง เนื่องจากเมื่อมีออกซิเจนสูง แบคทีเรียจะสามารถนําเอา PHB ที่ผลิตขึ้นกลับมาใชในการเจริญเติบโตอีกครั้ง ทําใหปริมาณ PHB สุทธิในระหวางการเพาะเลี้ยงต่ํา สงผลใหประสิทธิภาพการผลิตลดลงดวย

Wei et al. (2011) ไดทําการศึกษาการผลิต PHB โดยใชอัตราเขยาที่ 150 200 250 และ 300 รอบตอนาที ผลการทดลองพบวา การใชอัตราการเขยาที่ 200 รอบตอนาทีใหการผลิต PHB และมวลเซลล สูงสุดที่ 1.05 และ 2.50 กรัมตอลิตร ตามลําดับ แตเมื่อเพิ่มอัตราการเขยาที่ 300 รอบตอนาที พบวาเกิดการผลิต PHB และมวลเซลล ไดเพียง 0.4 และ 2.0 กรัมตอลิตร ตามลําดับ เนื่องมาจากแรงเฉือนที่เกิดขึ้นทําใหการเจริญเติบโตและการผลิต PHB ลดลง ในขณะที่ สุปริญญา (2546) ศึกษาการผลิต PHB จาก Bacillus sp. BA-019โดยใชอัตราการเขยาที่ 100 200 และ 300 รอบตอนาที โดยมีปริมาตรอาหารเลี้ยงเชื้อคงที่เทากับ 50 มิลลิลิตร บรรจุในขวดขนาด 250 มิลลิลิตร บมที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส ผลการทดลองพบวา เมื่อเล้ียงเชื้อโดยใหความเร็วรอบของการเขยาเทากับ 200 รอบตอนาที ใหปริมาณ PHB สูงสุดเทากับ 53.81 เปอรเซ็นตตอน้ําหนักเซลลแหง เมื่อใชความเร็วรอบสูงหรือต่ํากวาพบวา Bacillus sp. BA-019 ผลิต PHB ไดต่ํากวาที่ความเร็วรอบเทากับ 200 รอบตอนาที

ตารางที่ 8 ประสิทธิภาพการผลิต PHB จากน้ํายอยแปงมันสําปะหลังที่อัตราการเขยาตางๆ

aGram PHB per gram of glucose consumed, bGram PHB per gram of dry cell weight

Agitation rate (rpm)

PHB concentration (x 10-3 gl-1)

YaP/S

Yb

P/X

PHB content (%)

Qp (gl-1h-1)

100 75.120 0.009 0.022 2.20 0.002 200 161.760 0.029 0.068 6.75 0.007 300 38.904 0.011 0.022 2.20 0.001

40

4.6 การศึกษาการผลิต PHB จากน้ํายอยแปงมันสําปะหลังดวยการหมักแบบกะในถังหมักขนาด 5 ลิตร เมื่อเพาะเลี้ยง A. eutrophus ในน้ํายอยแปงมันสําปะหลังที่มีปริมาณของแข็งที่ละลายไดทั้งหมดเทากับ 1 องศาบริกซ คิดเปนน้ําตาลทั้งหมดประมาณ 12.0-14.0 กรัมตอลิตร และใชสารสกัดจากยีสต 1.2 กรัมตอลิตร เปนแหลงไนโตรเจน ปริมาตรทํางาน 3 ลิตร ในถังหมักขนาด 5 ลิตร และใชปริมาณกลาเชื้อ 10 เปอรเซ็นตโดยปริมาตร การเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส อัตราการกวนที่ 200 รอบตอนาที ผลการทดลองพบวา แบคทีเรียมีการเจริญเติบโตอยางชาๆ ในชวง 8 ช่ัวโมงแรกของการเพาะเลี้ยง หลังจากชั่วโมงที่ 8 แบคทีเรียมีการเจริญเติบโตเขาสูชวง log phase อยางรวดเร็ว โดยมีการสะสมมวลเซลลเทากับ 0.591 กรัมตอลิตร ในชั่วโมงที่ 32 ของการเพาะเลี้ยง ในขณะที่น้ําตาลทั้งหมดและน้ําตาลรีดิวซถูกใชอยางรวดเร็ว แตจากการทดลองไมพบการผลิต PHB ภายในเซลลของ A. eutrophus ซ่ึงอาจจะเกิดจากการควบคุมอัตราการกวนที่ 200 รอบตอนาที ภายในถังหมักขนาด 5 ลิตร ไมสามารถเพิ่มปริมาณออกซิเจนใหแกแบคทีเรียในระดับที่เหมาะสมได แบคทีเรียจึงไมมีการผลิต PHB ซ่ึงจากผลการทดลองยังพบวา แบคทีเรียนําน้ําตาลไปใชในการเจริญเติบโตเพียงอยางเดียวโดยไมมีการผลิต PHB ซ่ึงสอดคลองกับรายงานของ ศิริวรรณ (2552) วาการเพาะเล้ียงแบคทีเรียที่อัตราการกวน 100 และ 200 รอบตอนาที โดยไมมีการใหอากาศเพิ่มเติม จะไมสามารถเพิ่มปริมาณออกซิเจนในระบบได ตอมาจึงไดทําการทดลองโดยเพิ่มการพนอากาศเขาไปในระบบดวยอัตรา 1.0 วีวีเอ็ม (vvm) และควบคุมสภาวะการทดลองอื่นๆตามขางตน ผลการทดลองพบวา แบคทีเรียมีการเจริญเติบโตเพิ่มขึ้นอยางรวดเร็วตั้งแตชวงแรกของการเพาะเลี้ยง จนมีการเจริญเติบโตสูงที่สุดที่ชั่วโมงที่ 12 ของการเพาะเลี้ยง โดยมีการสะสมมวลเซลล เทากับ 1.567 กรัมตอลิตร หลังจากชั่วโมงที่ 12 เปนตนไป A. eutrophus เร่ิมมีการเจริญลดลงจนกระทั่งถึงชั่วโมงที่ 48 ของการเพาะเลี้ยง ในขณะที่ความเขมขนของน้ําตาลทั้งหมดและน้ําตาลรีดิวซมีปริมาณลดลงอยางรวดเร็วใน 24 และ12 ชั่วโมง ตามลําดับ และ A. eutrophus มีอัตราการผลิต PHB สูงขึ้นในชวง log phase และสูงสุดเทากับ 20.60 x 10-3 กรัมตอลิตร ในช่ัวโมงที่ 24 ของการเพาะเลี้ยง จากนั้น PHB จึงคอยๆลดลง และคงที่ในชวงทายของการทดลอง (ภาพที่ 15 ) จากผลการทดลองแสดงใหเห็นวา การขยายขนาดการผลิต PHB จากระดับฟลาสกเปนการผลิตในถังหมักขนาด 5 ลิตรนั้น จําเปนตองมีการคํานึงถึงอัตราการใหอากาศแก A. eutrophus ดวย ซ่ึงหากทําการผลิตในระดับที่ใหญขึ้นตองเพิ่มอัตราการใหอากาศแกระบบในระดับที่สัมพันธกับความตองการของแบคทีเรีย โดยจากการทดลอง 4.5 พบวา หากใหอากาศนอยหรือมากเกินไป จะสงผลกระทบตอประสิทธิภาพการผลิต PHB ของแบคทีเรียมาก ซ่ึงสอดคลองกับรายงานของ

41

Satoh et al. (1998) โดยรายงานวา การเพิ่มอากาศจะทําใหมีการผลิต PHA มากขึ้นดวย อยางไรก็ตาม Arunpan (1998) ยังไดอธิบายวา อากาศและอัตราการกวนที่เหมาะสมตอการผลิต PHA นั้น ยังขึ้นอยูกับชนิดของจุลินทรียและสภาพแวดลอมที่ใชในการเพาะเลี้ยงที่แตกตางกัน โดยอากาศจะชวยสงเสริมการเจริญและการผลิต PHA สวนอัตราการกวนนั้นจะชวยผสมอาหารกับเซลล และทําใหจุลินทรียสามารถดูดซึมอาหารและอากาศไดดีขึ้น

Time (h)

0 10 20 30 40 50

Optic

al de

nsity

at 65

0 nm

0

1

2

3

4

5

Dry c

ell w

eight

(gl-1 )

0.0

.2

.4

.6

.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

Redu

cing s

ugar

and T

otal s

ugar

(gl-1 )

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

PHB

conc

entra

tion x

10-3 (g

l-1 )

0

5

10

15

20

25

Optical density

Dry cell weight

Reducing sugar

Total sugar

PHB

ภาพที่ 15 การเพาะเลี้ยง A. eutrophus ในน้ํายอยแปงมันสําปะหลังในถังหมักขนาด 5 ลิตร ดวยวิธีการหมัก

แบบกะ ตารางที่ 9 ประสิทธิภาพการผลิต PHB ในน้ํายอยแปงมันสําปะหลังดวยการหมักแบบกะในถังหมักขนาด

5 ลิตร

aGram PHB per gram of glucose consumed, bGram PHB per gram of dry cell weight ดังนั้นการปรับปรุงประสิทธิภาพการผลิต PHB ในถังหมักควรศึกษาอตัราการใหอากาศและการกวนทีเ่หมาะสม ซ่ึงจะสงเสริมใหเกิดการผลิต PHB จากการเพาะเลี้ยงแบคทีเรียไดมากขึน้

PHB concentration (x 10-3 gl-1)

Glucose consumption (%)

YaP/S

YbP/X

PHB content (%)

Qp (gl-1h-1)

20.60 52.88 0.002 0.025 2.56 0.001

42

ตารางที่ 10 ประสิทธิภาพการผลิต PHB ในสภาวะตาง ๆ Substrate Condition Cell concentration

(gl-1) PHB concentration (gl-1)

PHB content (%)

Productivity of PHB (gl-1h-1)

Reference

Glucose R. eutropha NCIMB 11599 30oC, DO 20%, 1.0 vvm, 950 rpm, pH 6.7

208.00 139.00 67.00 3.10 Shang et al. (2003)

Glucose A. eutrophus DSM 545 34 oC, 1.0 vvm, 1000 rpm, pH 6.8

75.00 0.15 Sirisansaneekul and Mahasubpaiboon (n.d.)

Maltose and Sucrose A. latus DSM 1124 35 oC, DO 20%, pH 7.0

32.36 22.68 70.69 0.44 Yu et al. (1999)

Maple sap A. latus 33 oC, DO 30%,

4.20 3.26 77.00 Yezza et al. (2007)

Whey Recombinant E. coli Oxygem limitation, pH 7.1

31.00 25.00 80.00 0.48 Kim (2000)

Fructose W. eutropha DO 30%

6.10 43.61 Patwardhan and Srivastsva (2008)

42

43

ตารางที่ 10 ประสิทธิภาพการผลิต PHB ในสภาวะตาง ๆ(ตอ) Substrate Condition Cell concentration

(g.l-1) PHB concentration (g.l-1)

PHB content (%)

Productivity of PHB (g.l-1.h-1)

Reference

Strach hydrolysate (flask)

A. eutrophus TISTR 1095 30oC, 200 rpm

2.400 0.162 6.75 0.007 This research

Strach hydrolysate (5 L fermentor)

A. eutrophus TISTR 1095 30oC, 1.0 vvm, 200 rpm

0.806 0.021 2.56 0.001 This research

43

44  

 

บทที่ 5 สรุปผลการทดลอง

การศึกษาผลของความเขมขนน้ําตาลกลูโคสตอการผลิต PHB พบวา ที่ระดับความเขมขนน้ําตาลกลูโคส 10 กรัมตอลิตร เหมาะสมตอการผลิต PHB มากที่สุด โดยไดความเขมขนของ PHB เทากับ 164.420 x 10-3 กรัมตอลิตร คิดเปน YP/S YP/X และ QP เทากับ 0.015 0.025 และ 0.005 กรัมตอลิตรตอช่ัวโมง ตามลําดับ จากนั้นศึกษาการผลิต PHB จากน้ํายอยแปงมันสําปะหลังเพื่อใชเปนแหลงคารบอน เมื่อทําการทดลองในระดับฟลาสกเขยา พบวา สารสกัดจากยีสตสามารถเปนแหลงไนโตรเจนที่เหมาะสม ดวยสภาวะการเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส อัตราการกวนที่ 200 รอบตอนาที โดยใหความเขมขน PHB สูงสุดเทากับ 161.760 x 10-3 กรัมตอลิตร คิดเปน YP/S YP/X และ QP เทากับ 0.029 0.068 และ 0.007 กรัมตอลิตรตอชั่วโมง ตามลําดับ เมื่อทําการศึกษาประสิทธิภาพการผลิต PHB จากน้ํายอยแปงมันสําปะหลังดวยการหมักแบบกะในระดับถังหมักขนาด 5 ลิตร ในสภาวะที่เหมาะสมและใหอากาศที่ 1 vvm พบวาไดความเขมขนของ PHB เทากับ 20.600 x 10-3 กรัมตอลิตร คิดเปน YP/S YP/X และ QP เทากับ 0.002 0.025 และ 0.001 กรัมตอลิตรตอช่ัวโมง ตามลําดับ ขอเสนอแนะ 1. ควรศึกษาอัตราการใหอากาศที่เหมาะสมในการผลิต PHB จากน้ํายอยแปงมันสําปะหลังดวยการหมักแบบกะในถังหมักขนาด 5 ลิตร เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการผลิต PHB ใหสูงขึ้น 2. ควรศึกษาการผลิต PHB แบบกึ่งกะ ซ่ึงเปนกระบวนการที่สามารถลดปญหาการเกิดการยับยั้งจากสารตั้งตน (substrate inhibition) ได และยังอาจจะสามารถเพิ่มการสะสมมวลเซลลและ PHB ใหมากขึ้นดวย

 

  

เอกสารอางอิง กนกวรรณ เมอืงซอง รัชนี ไชยชวย ศุภราภรณ ปุรณะวทิย และอัมพวนั มีทรัพยมั่น. 2553.

การศึกษาการปรับปรุงการหมักผลิตเอทานอลแบบกะซ้าํโดยการตรึงเซลล. โครงงานปริญญาตรี สาขาวิชาชีววิทยา มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีราชมงคลธัญบุรี.

ตริตาภรณ จนัทนเทศ และ พรเทพ ถนนแกว. 2553. โพลีไฮดรอกซีบิวทีเรต:พลาสติกชีวภาพทีย่อยสลายไดงาย. วารสารศูนยวิชาการ. 18(1)

ตริตาภรณ จนัทนเทศ และ พรเทพ ถนนแกว. 2553. โพลีไฮดรอกซีบิวทีเรต:พลาสติกชีวภาพทีย่อยสลายไดงาย. วารสารศูนยวิชาการ. 18(1) อางถึงใน Khanna, S. and Srivastava, A.K. 2005. Recent advances in microbial polyhydroxyalkanoates. Process Biochemistry. 40 : 607-619.

ตริตาภรณ จนัทนเทศ และ พรเทพ ถนนแกว. 2553. โพลีไฮดรอกซีบิวทีเรต:พลาสติกชีวภาพทีย่อยสลายไดงาย. วารสารศูนยวิชาการ. 18(1) อางถึงใน Taguchi, S. and Doi, Y. 2004. Evolution of polyhydroxyalkanoate (PHA) production system by enzyme evolution : successful case studies of directed evolution. Macromolecular Bioscience. 4 :146-156.

ตริตาภรณ จนัทนเทศ และ พรเทพ ถนนแกว. 2553. โพลีไฮดรอกซีบิวทีเรต:พลาสติกชีวภาพทีย่อยสลายไดงาย. วารสารศูนยวิชาการ. 18(1) อางถึงใน Turesin, F., Gumusyazici, Z., Kok, F.N., Gursel, I., Alaaddinoglu, N.G. and Hasirci, V. 2000. Biosynthesis of polyhydroxybutyrate and its copolymers and their use in controlled drug release. Turk J. Med. Sci. 30, 535-541.

ศิริวรรณ ระเดนอาหมดั. 2552. สภาวะทีเ่หมาะสมตอการผลิตพอลิไฮดรอกซีบิวทีเรต-โค-ไฮดรอกซีวาเลอเรตจากน้ําเสียโรงงานอาหารทะเลโดยกลุมเชื้อจลิุนทรียระบบเอสบีอาร. วิทยานิพนธวทิยาศาสตรมหาบัณทิต. มหาวิทยาลัยสงขลานครินทร

สุปริญญา สุขผลพลา. 2546. ปจจัยที่มีผลตอการสรางสปอรและการผลิตพอลิ-3-ไฮดรอกซีบิวทีเรตโดยเชื้อ Bacillussp. BA-019. วิทยานิพนธปริญญาวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต จุฬาลงกรณมหาวิทยาลัย. กรุงเทพ.

สุปริญญา สุขผลพลา. 2546. ปจจัยที่มีผลตอการสรางสปอรและการผลิตพอลิ-3-ไฮดรอกซีบิวทีเรต โดยเชื้อ Bacillus sp. BA-019. วิทยานิพนธปริญญาวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต จฬุาลงกรณมหาวิทยาลัย. กรุงเทพ. อางถึงใน Macrae, R.M. and Wilkinson, J.F. 1958. poly-β -

46  

hydroxybutyrate Metabolism in Washed suspensions of Bacillus cereus and Bacillus megaterium. 19 : 210-222

สมใจ ศิริโภค. 2001. จุลชีววทิยาอุตสาหกรรม. ส่ือเสริมกรุงเทพ, กรุงเทพมหานคร. 339 หนา Anderson, A.J. and Wynn, J.P. 1995. Microbial polyhydroxyalkanoates, polysaccharides and

lipids in basic biotechnology. 2nd ed. (Ratledge, C. and Kristion, B., eds.). Cambridge : Cambridge University Press. 325- 333.

Anshuman, A., Khardenavis, M., Suresh, K., Sandeep, N.M. and Tapan, C. 2007. Biotechnological conversion of agro-industrial wastewaters into biodegradable plastic, poly-β-hydroxybutyrate. Bioresource Technology. 98 : 3579–3584.

Apostolis, A.K., Yunji, X., Ruohang, W. and Colin, W. 2007. Polyhydroxybutyrate production from a novel feedstock derived from a wheat-based biorefinery. Enzyme and Microbial Technology. 40 : 1035–1044.

Arunpan, N. 1998. Production of poly-β -hydroxyalkanoates from microorganism. Master of science thesis of Biotechnology. Prince of Songkla University.

Beaulieu, M., Beaulieu, Y., Melinard, J., Pandian, S. and Goulet, J. 1995. Influence of ammonium salt and cane molasses on growth of Alcaligenes eutrophus and production of polyhydroxybutyrate. Applied and Environmental Microbiology.

61 : 165–169. Borman, E. and Roth, M. 1999. The production of polyhydroxybutyrate by Methylobacterium

rhodesianum and Ralstonia eutropha in media containing glycerol and casein hydrolysates. Biotechnology Letters. 12 : 1059-1063.

Bormann, E. J., Leibner, M. and Beer, B. 1998. Growth-associated production of poly(hydroxybutyric acid) by Azotobacter beijerinckii from organic nitrogen substrates. Applied Microbiology and Biotechnology. 49 : 84-88.

Coats, E.R., Loge, F.J., Wolcott, M.P., Englund, K. and McDonald, A.G. 2008. Production of natural fiber reinforced thermoplastic composites through the use of polyhydroxybuty rate-rich biomass. Bioresource Technology. 99 : 2680–2686.

Doi, Y. 1990. Microbial Polyester. New York : VCH. p. 156. Grothe, E., Moo-Young, M. and Christi, Y. 1999. Fermentation optimization for production of Poly (β-hydroxybutyric acid) microbialthermoplastic. Enzyme and Microbial

47  

Technolnology. 25 : 132-141. Holding, A.J. and Shewan, J.M. 1974. Genera of uncertain affiliation. In Bergey’s Manual of

Determinative Bacteriology, 8th edn. eds. Khanna, S. and Srivastava, A.K. 2005. Recent advances in microbial polyhydroxyalkanoates.

Process Biochemistry. 40 : 607-619. Khanna, S. and Srivastava, A.K. 2005. Statistical media optimization studies for growth and

PHB production by Ralstonia eutropha. Process Biochemistry. 40 : 607-619. อางถึงใน Nakamura, K., Goto, Y., Yoshie, N. and Inoue, Y. 1992. Biosynthesis of poly(3-hydroxybutyrate) from amino acids. International Journal of Biological Macromolecules. 14 : 321 – 35.

Khanna, S. and Srivastava, A.K. 2005. Statistical media optimization studies for growth and PHB production by Ralstonia eutropha. Process Biochemistry. 40 : 607-619. อางถึงใน Fujita, M., Nakamura, K., Kuroki, H., Yoshie, N. and Inoue, Y. 1993. Biosynthesis of polyesters from various amino acids by Alcaligenes eutrophus. International Journal of Biological Macromolecules. 15 : 253–255.

Khanna, S. and Srivastava, A.S. 2005. Statistical media optimization studies for growth and PHB production by Ralstonia eutroph. Process Biochemistry. 40 : 2173-2182 อางถึงใน Page, W.J. 1992. Production of poly-ß-hydroxybutyrate by Azotobacter vinelandii UWD in media containing sugars and complex nitrogen sources. Applied Microbiology and Biotechnology.38 : 117-121 Kim, B. 2000. Production of poly (3-hydroxybutyrate) from inexpensive substrates. Enzyme and Microbial Technology. 27 : 774-777. Kim, B.S., Lee, S.C., Lee, S.Y., Chang, H.N., Chang, Y.K. and Woo., S.I. 1994. Production of

poly ( 3- hydroxybutyric acid) by fed batch culture of Alcaligenes eutrophus with substrate control using on-line glucose analyzer. Enzyme and Microbial Technology.

16 : 556-561. Kim, B.S. and Chang, H.N. 1995. Control of glucose feedimg using exit gas data and its

application to the production of PHB from tapioca hydrolysate by Alcaligenes eutrophus. Biotechnology Techniques. 9(5) : 311-314

48  

Kinoshita, S., Kulprecha, K. and Chao, A. 1991. Microbial production of poly(β-hydroxybutyric acid). In Annual Report of IC Biotech (Oshima, Y., ed). Osaka University. Osaka.p. 347-349

Koutinas, A.A., Xu, Y., Wang, R. and Webb, C. 2007. Polyhydroxybutyrate production from a novel feedstock derived from a wheat – based biorefinery. Enzyme and Microbial Technology. 40 : 1035-1044.

Kumar, M.S., Mudliar, H.N., Reddy, K.M.K. and Chankrabarti, T. 2004. Production of biodegradable plastics from activated sludge generated from a food processing industrial waste water treatment plant. Bioresource Technology. 95 : 327-330

Lee, S. and Yu, J. 1997. Production of biodegradable thermoplastics from municipal sludge by a two-stage bioprocess. Resources, Conservation and Recycling. 19(3) : 151-164.

Li, R., Zhang, H. and Qi, Q. 2007. The production of polyhydroxyalkanoates in recombinant Escherichia coli. Bioresourse Technology. 98 : 2313–2320.

Luengo, J.M., García, B., Naharro, G. and Olivera, E.R. 2003. Bioplastics from microorganisms. Current Opinion in Microbiology. 6(3) : 251-260.

Mahishi, L.H., Tripathi, G. and Rawal, S.K. 2003. Poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) synthesis by recombinant Escherichia coli harbouring Streptomyces aureofaciens PHB biosynthesis genes: Effect of various carbon and nitrogen sources. Microbiological Research. 158 : 19-27.

Nath, A., Dixit, M., Bandiya, A., Chavda, S. and Desai, A.J. 2008. Enhanced PHB production and scale up studies using cheese whey in fed batch culture of Methylobacterium sp. ZP24. Bioresource Technology. 99 : 5749–5755.

Oliveira, F.C., Dias M.L., Castilho, L.R. and Freire, D.M.G. 2007. Characterization of poly (3-hydroxybutyrate) produced by Cupriavidus necator in solid – state fermentation. Bioresource Technology. 98:633-638

Patnail, P.R. 2006. Enhancement of PHB biosynthesis by Ralstonia eutrophan in fed-batch culture by neural filtering and control. Food and Bioproducts Processing. 84(2) :

150 – 156. Patwardhan, P. and Srivastava, A.K. 2008. Fed-batch cultivation of Wautersia eutropha.

Bioresource Technology. 99 : 1787–1792.

49  

Quillaguaman, J., Doan-Van, T., Guzman, H., Guzman, D., Martin, J., Everest, A. and Hatti-Kaul R. 2008. Poly (β-hydroxybutyrate) production by Halomonas boliviensis in fed-batch culture. Applied Microbiology and Biotechnology. 72 : 227-232.

Quillaguaman, J., Munoz, M., Mattiasson, B. and Hatti-Kaul, R. 2007. Optimizing condition for poly (β-hydroxybutyrate) production by Halomonas boliviensis LC1 in batch culture with sucrose as carbon source. Applied Microbiology and Biotechnology. 74 : 981-986.

Raje, P. and Srivastava, A.K. 1998. Update mathematical model and fed-batch strategies for poly-β -hydroxybutyrate (PHB) production by Alcaligenes eutrophus. Bioresource Technology. 64 : 185-192.

Reddy, C.S.K.; Ghai, R., Rashmi and Kalai, V.C. 2003. Polyhydroxyalkanoates : an overview. Bioresource Technology. 87(2) : 137-146.

Ruan, W., Chen, J. and Lun, S. 2003. Production of biodegradable polymer by A. eutrophus using volatile fatty acids from acidified wastewater. Process Biochemistry. 39(3) : 295-299.

Ryu, H.W., Hahn, S.K., Chang, Y.K. and Chang, H.N. 1997. Production of poly (3)-hydroxybutyrate by high cell density fed-batch culture of Alcaligenes eutrophus with phosphate limitation. Biotechnol Bioeng. 55 : 28-32.

Satoh, H., Iwamoto, Y., Mino, T. and Matsuo, T. 1998. Activated sludge as a possible source of biodegradable plastic. Water Science Technology. 38 : 103–109

Savenkova, L., Gercberga, Z., Kizhlo, Z. and Stegantseva, E. 1999. Effect of phosphate supply and aeration on poly-β-hydroxybutyrate production in Azotobacter chroococcum. Process Biochemistry. 34 : 109-114. อางถึงใน Hine, P. W. and Lees, H. 1976. The growth of nitrogen-fixing Azotobacter chroococcum in continuous culture under intense aeration.Canadian Journal of Microbiology. 22 : 611–618.

Scholz, C. 2010. Perpectives to produce positively or negatively charged polyhydroxyalkanoic acids. Applied Microbiology and Biotechnology. 88 : 829-837.อางถึงใน Lemoigne M. 1926. Produits de deshydration et de polymerisation del’ acide β-oxybutyrique. Bulletin de la Société de Chimie Biologique. 8 : 770–782.

Shi, H., Kyuwa, K., Takasu, M. and Shimizu, K. 2001. Temperature-Induced of phb Genes in Escherichai coli and the effect of temperature patterns on the production of poly-3-hydroxybutyrate. Journal of Bioscience and Bioengineering. 91 : 21-26

50  

Shilpi, K. and Asok K. 2005. Recent advances in microbial polyhydroxyalkanoate. Process Biochemistry. 40 : 607-619.

Shang L., Jiang M. and Chang H.N. 2003. Poly (3-hydroxybutyrate) synthesis in fed-batch culture of Ralstonia euthopha with phosphate limitation under different glucose concentration. Biotechnology Letters. 25 : 1415-1419 Sirisansaneeyakul, S. and Mahasubpaiboon, Y. n.d. Kinetic modeling of poly-β-

hydroxybutyrate production by Alcaligenes eutrophus DSM 545. Department of Biotechnology, Faculty of Agro-Industry, Kasetsart University.

Tamdogan, N. and Sidal, U. 2011. Investigation of poly-β-Hydroxybutyrate(PHB) production by Bacillus subtillis ATCC 6633 under different condition. Department of Biology, Cecal Bayar University. Turkey.

Tan, D., Xue, Y.S., Dula, G.A., and Chen, G.Q. 2011. Unsterile and continuous production of polyhydroxybutyrate by Halomonas TD 01. Bioresource Technology. 102 : 8130-8136.

Tripathi, A.D. and Srivastava, S.K. 2011. Novel approach for optimization of fermentative condition for polyhydroxybutyrate (PHB) production by Alcaligenes sp. Using Taguchi (DOE) methodology. African Jounal of Biotechnology. 10(37) : 7219-7224

Turesin, F., Gumusyazici, Z., Kok, F.N., Gursel, I., Alaaddinoglu, N.G. and Hasirci, V. 2000. Biosynthesis of polyhydroxybutyrate and its copolymers and their use in controlled drug release. Turk J. Med. Sci. 30, 535-541.

Wang, F. and Lee, S.Y. 1997. Production of Poly(3-Hydroxybutyrate) by fed-batch culture of filamentation-suppressed recombinant Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 63 : 4765-4769.

Wei, Y.H., Chen, W.C., Huang, C.K. Wu, H.S., Lo, C.W. and Janarthanan, O.M. 2011. Screening and evaluation of polyhydroxybutyrate-producing strains from indigenous isolate Cupriavidus taiwanensis strains. International Journal of Molecular Sciences. 12 : 252-265

Williamson, D.H. and Wilkinson, J.F. 1958. The isolation and estimation of the poly -β-hydroxybutyrate inclusions of Bacillus species. Journal of General Microbiology.19 : 198-209.

51  

Yezza, A., Halasz, A., Levadoux, W. and Hawari, J. 2007. Production of poly -β- hydroxybutyrate (PHB) by Alcaligenes latus from maple sap. Microbiology and Biotechnology. 77 : 269-274.

Yu, P., Chua, H., Huang, A. and Ho, K. 1999. Conversion of industrial food waste by Alcaligenes latus into polyhydroxyalkanoates. Applied Biochemistry and Biotechnology. 99 : 77-79.

                       

ภาคผนวก

กราฟมาตรฐานการวิเคราะห                       

53  

Glucose concentration (mgl-1)

0 200 400 600 800 1000 1200

Optic

al de

nsity

(OD)

at 52

0 nm.

0.0

.2

.4

.6

.8

1.0

1.2

ภาพที่ 16 กราฟมาตรฐานน้ําตาลรีดิวซวิเคราะหโดยวิธี DNS

Glucose concentration (mgl-1)

0 20 40 60 80 100

Optic

al de

nsity

(OD)

at 49

0 nm.

0.0

.2

.4

.6

.8

1.0

 

ภาพที่ 17 กราฟมาตรฐานน้ําตาลทั้งหมดวิเคราะหโดยวิธี Phenol-sulfuric acid

y = 0.0011x - 0.0437 R² = 0.9991

y = 0.0089x + 0.015 R² = 0.9951

54  

Dry cell weight (gl-1)

0.000 .005 .010 .015 .020 .025 .030

Optic

al de

nsity

(OD)

at 65

0 nm.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

  

ภาพที่ 18 กราฟมาตรฐานน้ําหนักเซลลแหง  

PHB concentration x 10-3(gl-1)

0 2 4 6 8 10 12

Optic

al de

nsity

(OD)

at 23

5 nm.

0.0.2.4.6.8

1.01.21.41.61.82.02.2

 

ภาพที่ 19 กราฟมาตรฐานความเขมขน PHB  

y = 241.19x + 0.7553 R² = 0.9904 

y = 0.1825x + 0.0889 R² = 0.9972

55  

ประวัติผูดําเนินการทดลอง

ชื่อ นางสาวจารุวรรณ มารุจกลา วัน เดือน ป เกิด 6 เมษายน 2533 ประวัติการศึกษา สําเร็จการศึกษามัธยมศึกษาตอนปลาย โรงเรียนสวนกุหลาบวิทยาลัย รังสิต ปการศึกษา 2550 สถานที่ที่สามารถติดตอได 9/1 หมู 3 ต.คลอง 6 อ.คลองหลวง จ.ปทุมธานี 12120 โทร 084-9054920 E-mail address:Jaruwan_juneny@hotmail.com ชื่อ นางสาวสุกัญญา ศรีนอก วัน เดือน ป เกิด 13 สิงหาคม 2532 ประวตัิการศึกษา สําเร็จการศึกษามัธยมศึกษาตอนปลาย โรงเรียนสุรศักดิ์มนตรี ปการศึกษา 2550 สถานที่ที่สามารถติดตอได 1/20 หมู 5 ซอย รวมสุข 4 ถนนไสวประชาราษฎร ต.ลาดสวาย

อ.ลําลูกกา จ.ปทุมธานี 12150 โทร 087-9020137 E-mail address:panda-fon@hotmail.com ชื่อ นางสาวสุวรรณี แกวลอม วัน เดือน ป เกิด 2 มีนาคม 2533 ประวัติการศึกษา สําเร็จการศึกษามัธยมศึกษาตอนปลาย โรงเรียนบานหมี่วิทยา ปการศึกษา 2550 สถานที่ที่สามารถติดตอได 303/9 หมู 6 ถนนรังสิต-ปทุมธานี ต.บางพูน อ.เมือง จ.ปทุมธานี 12000 โทร 087-0863056 E-mail address:Suwannee_desu@hotmail.com