Aktyvių deguonies formų sukeltų pažaidų nustatymas ...28322659/28322659.pdf(8-OH-G) arba jo...
Transcript of Aktyvių deguonies formų sukeltų pažaidų nustatymas ...28322659/28322659.pdf(8-OH-G) arba jo...
1
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
MEDICINOS FAKULTETAS
BIOCHEMIJOS KATEDRA
Aktyvių deguonies formų sukeltų pažaidų
nustatymas eksperimentinių gyvūnų organuose Baigiamasis magistro darbas
Darbą atliko: VI kr.stud. Goda Laucaitytė
Vadovas: prof. dr. Artūras Kašauskas
Konsultantė: prof. dr. Ilona Sadauskienė
2018, KAUNAS
2
TURINYS
1. SANTRAUKA ..................................................................................................................................... 3
2. SUMMARY ......................................................................................................................................... 4
3. INTERESŲ KONFLIKTAS ................................................................................................................ 5
4. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ...................................................................................................... 5
5. SANTRUMPOS ................................................................................................................................... 6
6. SĄVOKOS ........................................................................................................................................... 6
7. ĮVADAS ............................................................................................................................................... 7
8. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ................................................................................................. 8
9. LITERATŪROS APŽVALGA ............................................................................................................ 8
9.1 Oksidacinis stresas .......................................................................................................................... 8
9.2 Aktyvios deguonies formos ............................................................................................................ 9
9.3 Oksidacinio streso biologinis vaidmuo lipidams, baltymams ir DNR ......................................... 10
9.4 Geležis ir aktyvios deguonies formos ........................................................................................... 11
9.5 Aliuminis ir jo sukeliamos pažaidos ............................................................................................ 12
9.6 Oksidacinio streso molekuliniai žymenys ir jų nustatymo būdai ................................................. 13
9.6.1 Karbonilinės grupės baltymuose ........................................................................................... 13
9.6.2 Lipidų peroksidacijos produktai ............................................................................................ 13
9.6.3 DNR pažaidų aptikimas ........................................................................................................ 14
10. TYRIMO METODIKA .................................................................................................................... 14
10.1 Tyrimo objektas ir reagentai ....................................................................................................... 14
10.2 Tyrimo metodai .......................................................................................................................... 15
10.2.1 Metalų poveikio laboratorinių gyvūnų organams tyrimo modelis ...................................... 15
10.2.2 Baltymų karbonilinių grupių koncentracijos nustatymas .................................................... 15
10.2.3 MDA koncentracijos nustatymas ........................................................................................ 17
10.2.4 DNR elektroforezė .............................................................................................................. 17
10.3 Duomenų patikimumo vertinimas .............................................................................................. 18
11. REZULTATAI ................................................................................................................................. 18
12. REZULTATŲ APTARIMAS .......................................................................................................... 21
13. IŠVADOS ......................................................................................................................................... 22
14. LITERATŪROS SĄRAŠAS ............................................................................................................ 23
PRIEDAI ................................................................................................................................................ 27
1. Priedas Nr. 1 .................................................................................................................................. 27
2. Tezės pristatytos Lietuvos neuromoskslų asociacijos konferencijoje 2017 m. gegužės 1 d. ......... 28
3
1. SANTRAUKA
VI kr. stud. Goda Laucaitytė
Baigiamasis magistrinis darbas „Aktyvių deguonies formų sukeltų pažaidų nustatymas
eksperimentinių gyvūnų organuose“
Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Kaunas, 2018.
Šiame darbe buvo tiriama aliuminio ir geležies jonų įtaka aktyvių deguonies formų (ADF)
susidarymui ir galima baltymų, lipidų ir DNR pažaida veikiant šių metalų jonais pelių organų
homogentus in vitro. Tam buvo nustatytas baltymų ir lipidų oksidacijos produktų kiekis ir atlikta DNR
elektroforezė.
Darbo tikslas: Įvertinti aktyvių deguonies formų sukeliamas baltymų, lipidų ir nukleorūgščių
pažaidas pelių organuose.
Tikslui įgyvendinti buvo iškelti uždaviniai: nustatyti aliuminio ir geležies jonų sukeliamas
baltymų pažaidas pelių organuose; įvertinti aliuminio ir geležies jonų indukuotų aktyvių deguonies
formų įtaką lipidų peroksidacijai pelių organuose; ištirti aliuminio ir geležies jonų sukeliamų DNR
pažaidų lygį pelių organuose
Tyrimo metodai. Tyrime buvo naudojami laboratorinių pelių organų (kepenų ir smegenų)
homogenatai, kurie buvo paveikti aliuminio ir geležies jonais tam tikrą laiką. Oksidacinio streso sukeltos
pažaidos baltymams buvo vertinamos naudojant karbonilines grupes kaip baltymų oksidacijos
molekulinį žymenį. Tuo tarpu vertinant oksidacinio streso sukeltą lipidų peroksidaciją molekuliniu
žymeniu pasirinktas malondialdehidas (MDA). DNR pažaidų vertinimui atlikta elektroforezė agarozės
gelyje.
Gauti rezultatai parodė, kad AlCl3 neturėjo įtakos karbonilinių grupių susidarymui
baltymuose, bei lipidų peroksidacijos produkto MDA susidarymui pelių organų homogenatuose.
Naudojant FeCl3, karbonilinių grupių kiekis bei MDA kiekis pelių organų homogenatuose reikšmingai
padidėjo lyginant su kontrole. DNR, išskirtų iš pelės kepenų ir paveiktų aliuminio druskomis, judėjimo
greitis atliekant elektroforezę sumažėjo lyginant su kontroline grupe, o paveiktos geležies druskomis
DNR struktūros suiro.
Išvados: Aliuminio (III) jonai neturėjo reikšmingos įtakos baltymų ir lipidų pažaidų
susidarymui eksperimentinių pelių organuose, tačiau paveikė išskirtos DNR judėjimą elektroforezės
gelyje. Geležies (III) jonai sukėlė ženklų baltymų ir lipidų oksidacijos produktų padidėjimą ir visiškai
suardė DNR.
4
2. SUMMARY
Master‘s thesis “Identification Of The Damage Induced By Reactive Oxygen Species In
Experimental Animals“ by 6th. year medical student Goda Laucaitytė, Lithuanian University of Health
Sciences, Kaunas, 2018.
In this research the damage of proteins, lipids and nucleic acids caused by reactive oxygen
species (ROS) was evaluated. Oxidative stress which forms such the species was induced by aluminum
and ferric ions in mice organs homogenates in vitro.
Aim of the research. To evaluate the damage of proteins, lipids and nucleic acids induced by
reactive oxygen species.
Tasks of the research. To determine the damage of the proteins caused by aluminum and ferric
ions in mice organs; to evaluate the level of the lipids peroxidation induced by aluminum and ferric ions
in mice organs; to do research on the damage of DNA caused by aluminum and ferric ions in mice
organs.
Methods. In this research homogenates of mice organs (brain and liver) were used. They were
treated with aluminum and ferric ions. Damage of the proteins caused by oxidative stress was identified
by measuring the level of carbonyl groups. Meanwhile the level of lipids peroxidation was evaluated by
detecting the biomarker called malondialdehyde (MDA). Agarose gel electrophoresis was used to detect
the damage of DNA.
The results showed that aluminum ions had no impact neither on the formation of carbonyl
groups in the proteins, neither on the formation of MDA (lipids peroxidation product) in mice organs
homogenates. However, higher level of proteins carbonyl groups as well as higher level of MDA was
found in mice organs homogenates treated with ferric ions compared to control. DNAs which were
extracted from mice organs homogenates and treated with aluminum ions were migrating slower in
agarose gel electrophoresis field compared to control, meanwhile DNAs treated with ferric ions had
collapsed.
Conclusions: Aluminum (III) ions didn‘t cause the damage of the proteins and the lipids in
mice organs, but affected the speed of the migration of DNA in agarose gel electrophoresis field.
Ferric (III) ions made damage to lipids and proteins and caused the destruction of DNA.
5
3. INTERESŲ KONFLIKTAS
Autoriui interesų konflikto nebuvo.
4. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS
Lietuvos laboratorinių gyvūnų naudojimo etikos komisijos prie Valstybinės maisto ir
veterinarijos tarnybos 2014-12-10 išvada Nr. 11 gautas leidimas darbui su laboratoriniais gyvūnais
(leidimo Nr. G2-19). Leidimo kopija pridedama prie priedų.
6
5. SANTRUMPOS
ADF – aktyviosios deguonies formos
DNR – deoksiribonukleorūgštis
RNR – ribonukleorūgštis
TBR – tiobarbitūro rūgštis
CO – karbonilinės baltymų grupės
2,4-DNFH – 2,4-dinitrofenilhidrazinas
DNF – dinitrofenilhidrazonas
UV – ultravioletiniai spinduliai
SOD – superoksido dismutazė
CAT – katalazė
4-HNE – 4-hidroksinonenalis
MDA – malondialdehidas
8-OH-G – 8-hidroksiguaninas
TChR – trichloracto rūgštis
6. SĄVOKOS
Apoptozė – genetiškai užprogramuota, reguliuojama ląstelių mirtis
Mitoptozė – programuota mitochondrijų mirtis
Hemochromatozė – geležies perteklius organizme
7
7. ĮVADAS
Neigiamo balanso tarp aktyvių deguonies formų (ADF) atsiradimo organizme ir ląstelės
antioksidacinės sistemos gebėjimo efektyviai šias kenksmingas formas detoksikuoti pasekmė yra
oksidacinis stresas [1]. Įvairūs aplinkos dirgikliai, tokie kaip chemikalai, UV spinduliuotė, jonizuojanti
radiacija, sunkieji metalai bei organizmo endogeniniai procesai sukelia aktyvių deguonies formų
susidarymą, kurios savo ruožtu atakuoja ląstelės komponentus: lipidus [2], baltymus [3] ir DNR [4].
Veikiant aliuminio ar geležies metalų jonams susidaro aktyvios deguonies formos, kurios visų
pirma pažeidžia ląstelės lipidus. Vykstant lipidų peroksidacijai, aktyvios deguonies formos jungiasi prie
dvigubojo polinesočiųjų riebalų rūgščių ryšio ir susidaro lipidų hidroperoksidai. Kaip antrieji oksidacijos
produktai susiformuoja įvairūs aldehidai, tarp jų ir malondialdehidas (MDA). Tai yra mutageninis ir
citotoksiškas junginys, kuris plačiai naudojamas kaip molekulinis žymuo lipidų peroksidacijai nustatyti.
Šio junginio koncentraciją galima apskaičiuoti reakcijoje su tiobarbitūro rūgštimi (TBR), panaudojus
spektrofotometrijos metodą [2].
Kiti svarbūs žymenys, atspindintys ADF sukeltas organizmo pažaidas, yra baltymų oksidacijos
tarpiniai produktai. Vyksta proteinų oksidacija, dėl kurios susiformuoja proteinų karbonilinės (CO)
grupės. Pastarąsias galima naudoti kaip molekulinį žymenį oksidacinio streso lygiui apskaičiuoti. Tai
yra labai patogus žymuo, kurį dėl ankstyvo susiformavimo ir stabilumo lengva aptikti. Reakcijoje su 2,4
dinitrofenilhidrazinu (2,4-DNFH) susiformuoja dinitrofenilhidrazonas (DNF), kurio kiekis
skaičiuojamas spektrofotometrijos metodu ties 370 nm ilgio banga [3].
Ląstelės DNR taip pat yra jautri oksidaciniam stresui. DNR yra pažeidžiama įvairiai. Aktyvios
deguonies formos atakuoja DNR azotines bazes tokias kaip guaninas. Susiformuoja 8-hidroksiguaninas
(8-OH-G) arba jo nukleozidinė forma. Sutrikdoma DNR replikacija, transkripcija, transliacija ir tai lemia
mutacijas bei ląstelės kancerogeniškumą. Vienas iš būdų ląstelės DNR fragmentacijai nustatyti yra
elektroforezės metodas [4].
Atliktame tyrime su pelių organais (kepenimis ir smegenimis) vertinamos aliuminio ir geležies
jonų indukuoto oksidacinio streso sukeltos pažaidos baltymams, lipidams bei DNR, pritaikomi
biocheminiai metodai šioms pažaidoms įvertinti. Rezultatai suteikia žinių apie oksidacinio streso poveikį
organizmui bei jo lygio nustatymo metodus.
8
8. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Aktyvios deguonies formos reikšmingai veikia ląsteles sukeldamos baltymų, lipidų ir DNR
pažaidas. Metalų jonai yra svarbūs faktoriai turintys įtakos ADF susidarymui ir jų sukeliamų pažaidų
lygiui. Todėl šiame darbe siekiama įvertinti aliuminio ir geležies jonų sukeliamas oksidacines pažaidas
pelių organuose. Šiam tikslui įgyvendinti vertinamas pažaidų metu susidariusių metabolitų
(molekulinių žymenų) kiekis.
Tikslas: Įvertinti aktyvių deguonies formų sukeliamas baltymų, lipidų ir nukleorūgščių pažaidas
pelių organuose
Uždaviniai:
1. Nustatyti aliuminio ir geležies jonų sukeliamas baltymų pažaidas pelių organuose.
2. Įvertinti aliuminio ir geležies jonų indukuotų aktyvių deguonies formų įtaką lipidų
peroksidacijai pelių organuose.
3. Ištirti aliuminio ir geležies jonų sukeliamų DNR pažaidų lygį pelių organuose.
9. LITERATŪROS APŽVALGA
9.1 Oksidacinis stresas
Visiems žinoma, kad molekulinis deguonis O2 nuo pat jo pasirodymo atmosferoje, prieš
maždaug 2,3 milijardus metų, yra neatsiejamas mūsų planetos elementas, būtinas gyvybiniams
procesams. Jis yra galutinis elektronų akceptorius substratų oksidacijos metu [5]. Antra vertus, O2 gali
sukelti ir kitus oksidacinius procesus, pažeidžiančius svarbiausias biologines molekules: DNR, lipidus
ir baltymus. Oksidacinis stresas atspindi disbalansą tarp ADF atsiradimo ir ląstelės biologinės sistemos
sugebėjimo efektyviai detoksikuoti šiuos radikalus arba atstatyti atsiradusias pažaidas [1,6,7]. Visi gyvi
organizmai produkuoja ADF veikiant įvairiems endogeniniams ir egzogeniniams faktoriams. Tokiais
faktoriais gali būti aerobinis kvėpavimas, fagocitozė, toksinai, oro tarša, cigarečių dūmai, alkoholis,
alergenai, jonizuojanti spinduliuotė, metalų jonai, trauma, elektromagnetinis laukas, infekcijos,
uždegiminiai procesai ir kt. [6,8]. ADF yra labai aktyvios molekulės, visos aktyvesnės už molekulinį
deguonį ir gali pažeisti įvairias ląstelių struktūras ir taip paveikti ląstelės funkcijas bei nulemti jų mirtį.
Šių oksidantų mažinimas yra kritiškai svarbus normaliai organizmo veiklai, ląstelių gyvybingumui ir
normaliam jų dauginimuisi. Žmogaus organizmas su oksidaciniu stresu kovoja pasitelkdamas turimas
antioksidacines sistemas, kurias sudaro fermentiniai ir nefermentiniai antioksidantai. Jie blokuoja
žalingas ADF ir išlaiko oksidacinę pusiausvyrą [9]. Tačiau, išsekus organizmo antioksidacinėms
sistemoms arba esant ADF pertekliui, šis balansas gali būti sutrikdytas ir užsitesęs oksidacinis stresas
sąlygoti ligas ir būkles tokias kaip vėžys, senėjimas, Alzheimerio liga, Parkinsonsono liga, cukrinis
9
diabetas, aterosklerozė, hipertenzija, reumatoidinis artritas, išemija, idiopatinė plaučių fibrozė, lėtinė
obstrukcinė plaučių liga, astma ir kt. [1,6,8-12].
9.2 Aktyvios deguonies formos
Radikalu vadinama bet kuri atomų ar molekulių rūšis, kurios valentiniame sluoksnyje yra
vienas ar daugiau nesuporuotų elektronų. ADF taip pat yra radikalai, reaktyvios cheminės medžiagos
sudėtyje turinčios deguonį. Jos susiformuoja kaip tarpiniai produktai normalaus deguonies metabolizmo
metu [10].
Molekulinis deguonis (O2) turi unikalią elektronų konfiguraciją ir taip pat yra radikalas.
Prijungus vieną elektroną prie molekulinio deguonies (redukcijos reakcija) susidaro superoksido anijono
radikalas (O2•-), kuris skatina formuotis kitas ADF ir yra laikomas pirmine ADF. Dažniausiai O2
•-
susidaro elektronų pernašos grandinėse mitochondrijose, nukrypus elektronams nuo grandinės tarpinių
komponentų deguonies link [10].
O2 + e− → O2•-
Superoksido anijono radikalas yra oksidantas, turintis neryškių redukcinių savybių, gali
reaguoti su baltymais ir pažeisti jų funkcijas, pvz., pakeisti fermentų aktyvumą [9,10].
Kita svarbi paminėti ADF yra vandenilio peroksidas (H2O2) kuris pats nebūdamas radikalu,
dalyvauja kitų radikalų susidaryme, pasižymi silpnomis oksidacinėmis savybėmis ir pažeidžia
biologines molekules, turinčias –SH grupes ar FeS. Superoksido dismutazė (SOD) detoksikuoja O2•-
radikalą, vieną pagrindinių prooksidantų ląstelėje, sudarydama vandenilio peroksidą ir O2 [5,10]:
2H• + 2O2•- –(SOD)→ H2O2 + O2
Vandenilio peroksidas toliau redukuojamas iki vandens, dėl to, kad būtų išvengta labai
reaktyvios ADF susiformavimo – hidroksido radikalo (OH•). Tai vyksta dalyvaujant fermentui katalazei
(CAT) [5, 10].
2H2O2 –(CAT)→ 2H2O + O2
Jeigu ląstelėje yra metalų jonų (pvz. Fe3+), H2O2 gali būti paverčiamas hidroksido radikalais
vykstant Haber-Weiss ir Fentono reakcijoms. 1894 m. Fentonas (Fenton) pastebėjo, kad geležies druskos
labai didina H2O2 oksidacinį poveikį, o Haberis (Haber) ir Veisas (Weiss) 1934 m. nustatė reakciją [13]:
Harber-Weiss Fe3+ + O2• → Fe2+ + O2
Fentono Fe2+ + H2O2 → Fe3+ +OH- + OH•
Hidroksido radikalas (OH•) yra pats aktyviausias iš visų žinomų oksidatorių. Ypač aktyvus OH•
pažeidžia artimiausius baltymus, DNR, lipidus. Kitos ADF gali būti naudingos fiziologiniams ląstelės
procesams, tačiau OH• yra tik žalingas [9,6,8].
10
9.3 Oksidacinio streso biologinis vaidmuo lipidams, baltymams ir DNR
Mažomis koncentracijomis ADF atlieka svarbų vaidmenį kaip signalinės molekulės ir yra
žalingos tik esant per dideliam jų kiekiui. Laisvieji radikalai svarbūs daugeliui fiziologinių ląstelės
vyksmų [11]:
1. Veikia kaip signalinės molekulės (genų aktyvavimas, ląstelės augimas, cheminių reakcijų
moduliavimas ląstelėje ir kt.);
2. Moduliuoja prostaglandinų biosintezę;
3. Dalyvauja mitoptozėje;
4. Saugo audinius nuo pažeidimo išplitimo esant uždegiminiam komponentui;
5. Dalyvauja apoptozėje.
Normaliomis sąlygomis ADF koncentracija ląstelėje turi būti maža, tuomet jos atlieka savo
biologinę funkciją. Tačiau sutrikus ADF pusiausvyrai ir išsivysčius oksidaciniam stresui yra
pažeidžiamos organizmo ląstelės, audiniai ir vystosi patologinės būklės bei ligos. Kaip jau minėta
anksčiau, oksidaciniam stresui yra jautrios visos ląstelės struktūros: baltymai, lipidai ir DNR [1,6-12].
Pirmiausiai ADF oksiduoja lipidus, vyksta lipidų peroksidacija, kurios metu susidarę junginiai
pasižymi mutageniniu bei citotoksiniu poveikiu [2,9]. Lipidų peroksidacija tai procesas, kurio metu
oksidantai atakuoja lipiduose esančius dvigubuosius ryšius tarp anglies atomų, ypač esančių
polinesočiosiose riebalų rūgštyse [6,10]. Priklausomai nuo individualių ląstelės savybių ji gali išgyventi
arba įsivyravusi lipidų peroksidacija gali nulemti ląstelės žūtį ir taip skatinti įvairių patologinių būklių
organizme išsivystymą [2,9,14].
Visas lipidų peroksidacijos procesas susideda iš trijų etapų: pradėties (angl. k. − initiation),
sklidimo (angl. k. − propagation) ir baigmės (angl. k. − termination) [2,14,15]. Pirmiausia veikiama
arachidoninė rūgštis, kuri yra viena iš labiausiai paplitusių nesočiųjų membranos riebalų rūgščių [3].
Pradėties stadijoje, veikiant oksidantams (R•), atimamas H atomas iš nesočiosios riebalų rūgšties,
susiformuoja lipidinis radikalas (L•). Dauginimo stadijoje šis radiklas pakartotinai reaguoja su
deguonimi ir formuojamas lipidinis peroksiradikalas (LOO•), pastarasis pritraukia vandenilio atomus iš
kitų lipidų molekulių vėl formuojant L•, o pats virsta hidroperoksidu (LOOH). Užvedama grandininė
reakcija, kuri vykta tol, kol neprasideda baigmės stadija. Šioje stadijoje, antioksidantai, pavyzdžiui
vitaminas E, atiduoda vandenilio atomą lipidoperoksi-radikalo molekulei [2,10,14].
Pagrindinis pirminis lipidų peroksidacijos produktas yra lipido hidroperoksidas (LOOH), o
antriniai – MDA, propanalis, heksanalis, 4-hidroksinonenalis (4-HNE). MDA yra laikomas labiausiai
mutageniniu lipidų peroksidacijos produktu, o 4-HNE labiausiai toksiniu [2].
Baltymų oksidacija yra kitas oksidacinio streso sukeliamas procesas, priklausomas jau ne tik
nuo O2, bet ir nuo susiformavusių radikalų, susidarančių oksiduojantis lipidams [3]. Molekuliniu
požiūriu baltymų oksidacijos rezultatu gali būti daug įvairių cheminių modifikacijų nuo molekulės
11
skilimo ar baltymų persikryžiavimo iki aminorūgščių grandinės subtilių modifikacijų [10,16]. Baltymų
oksidacinė modifikacija pasireiškia arba jų agregacija ir molekulinės masės padidėjimu, arba
fragmentacija ir skilimu į mažesnius polipeptidus. Tokie pakitę baltymai greičiau suyra, pakinta jų
elektrinis krūvis. Taip pat oksidacinės pažaidos gali suformuoti naujas reaktyvias chemines grupes,
tokius kaip aldehidus arba ketonus, palikti neįprastus peptidinius galus N ar C terminalėse [9,17]. Dėl
tokios gausos sukeliamų pokyčių, visi tyrimai nagrinėjantys baltymų oksidacijos pasėkmes
susikoncentruoja į vienintelės modifikacijos aptikimą, pavyzdžiui cisteino ar tirozino oksidacijos, arba
tarpinių produktų poklasio, kaip baltymų karbonilinių (CO) grupių [3]. Šie tyrimai yra nuoseklūs,
reikšmingi žingsniai siekiant išsiaiškinti oksidacijos procesus ir jų efektus, tačiau iki šiol nėra metodo
išaiškinti bendrą baltymų oksidacijos procesų vaizdą [3,16,17].
Taip pat ADF gali sukelti įvairias DNR modifikacijas, pavyzdžiui bazių degradaciją, vienos ar
abiejų grandinių pertraukimą, purino, pirimidino bazių mutacijas, delecijas ar translokacijas [4,9,11].
Todėl ne vien tiesiogiai veikiančios ADF tampa ligų etiologiniu veiksniu, tačiau ir DNR pažeidimas
lemia esminius biologinius pokyčius nulemiančius tam tikrų ligų išsivystymą. Padidėjęs mutageninio 8-
OH-G susiformavimo lygis yra nustatomas senstančiose ir vėžinėse ląstelėse [6,18]. Taip pat, H2O2
sukelta oksidacinė DNR pažaida sukelia mikrosatelitų nestabilumą, kuris yra asocijuojamas su
kolorektaliniu vėžiu [19,20]. Daugelis modifikacijų yra glaudžiai susijusių su karcinogeneze, senėjimu,
neurodegeneracinėmis, kardiovaskulinėmis ir autoimuninėmis ligomis. 8-OH-G yra plačiausiai ištirta,
oksidacinio streso metu atsirandanti DNR pažaida ir gali būti naudojama kaip molekulinis žymuo
kancerogenezės procese [4,6,18].
9.4 Geležis ir aktyvios deguonies formos
Geležis, kaip ir deguonis yra būtinas elementas organizmo išgyvenimui. Visos organizmo
ląstelės tiesiogiai ar netiesiogiai yra veikiamos ląstelinio geležies metabolizmo [13,20]. Geležis gali
asocijuotis su baltymais, prisijungti prie deguonies, pernešti elektronus ir katalizuoti reakcijas. Taip pat
tai yra esminis hemoglobino, mioglobino, citochromų komponentas, dalyvauja metabolinėse reakcijose,
tokiose kaip O2 pernaša, elektronų pernaša, oksidacinio fosforilinimo, ksenobiotikų metabolizme,
ląstelių augime, DNR sintezėje, apoptozės, uždegimo, genų raiškos reguliavime. CNS geležis reikalinga
mielogenezės procesams ir mielino išlaikymui oligodendrocituose, taip pat kaip kofaktorius
neurotransmiterių dopamino, norepinefrino, serotonino sintezėje [21,22]. Taigi geležis dalyvauja
daugelyje biologinių procesų ir fundamentalių biocheminių reakcijų visose ląstelėse. Tokių reakcijų
reguliavimas gali būti teigiamas, palaikantis ląstelinį aktyvumą, būtiną jų gyvybingumui išlaikyti.
Tačiau geležis pasižymi ir neigiamu poveikiu – sukelia žalingų ADF susiformavimą [20].
Normaliai potenciali geležies jonų žala yra minimali, dėl jos sudaromų kompleksų su pernašos
baltymais transferinu ir feritinu, kurie sumažina nekontroliuojamą deguonies ir geležies sąveiką bei ADF
12
formavimąsi. Tačiau, bet koks kiekis laisvos geležies skatina formuotis ADF [22]. Prie oksidacinio
streso formavimosi geležis prisideda keliais būdais ir svarbiausias jų – anksčiau minėta Fentono reakcija,
kurios metu susidaro pavojingi, reaktyvūs hidroksido radikalai [5,13,20]. Todėl nenuostabu, kad geležies
homeostazė organizme yra griežtai kontroliuojama, kad būtų išvengta pavojingų junginių formavimosi
keliančio didelę žalą ląstelėms ir audiniams [5,13].
Dėl specifinių geležies sekrecijos mechanizmų trūkumo, nenormaliai gausios geležimi dietos
ar nuolatinių kraujo transfuzijų išsivysto hemochromatozė [12]. Kaip skelbia geležies sutrikimų
institutas, JAV, padidėjęs geležies kiekis organizme padidina riziką susirgti kepenų ligomis, miokardo
infarktu ar širdies nepakankamumu, cukriniu diabetu, osteoartritu, osteoporoze, metaboliniu sindromu,
hipotiroidizmu, hipogonadizmu ir neurodegeneracinėmis ligomis, tokiomis kaip Alzheimerio,
Huntingtono, epilepsija [5,23,24]. Viename tyrime (Madeiros ir kt.) [24] buvo nagrinėjamas ryšys tarp
geležies, oksidacinio streso ir Parkinsono ligos. Nustatyta, kad Parkinsono liga sergančių ligonių
juodojoje medžiagoje yra susikaupusios daugiau geležies lyginant su kontrole, kas lemia oksidacinį
stresą ir uždegimą čia esančiuose dopaminerginiuose neuronuose [24]. Taip pat yra įrodymų, kad
geležies koncentracija organizme didėja su amžiumi, dėl geležies homeostazės sutrikimo [25]. Atliktame
tyrime (Servais ir kt.), kuriame buvo tirtas geležies kaupimasis žiurkių mitochondrijose, nustatyta, kad
intraląstelinės geležies padaugėja 233 % žiurkėms senstant, ir dėl to oksiduotos RNR kiekis padidėja 83
% [26]. Taip pat įtakos geležies kaupimuisi turi menopauzė. Po menopauzės moterims yra nustatomos
didesnės feritino koncentracijos [25]. Feritinas izoliuoja potencialiai reaktyvią geležį ir yra ląsteles
apsaugantis. Tačiau fagocitozės būdu feritinas patenka į ląstelę, lizosomos jį degraduoja ir tuomet gali
būti išlaisvinama geležis. Tai lemia ADF produkciją citozolyje. Geležis ir oksidacinis stresas kaip
manoma turi reikšmės odos sausumui, storėjimui ir raukšlėjimuisi menopauzės metu [25].
9.5 Aliuminis ir jo sukeliamos pažaidos
Aliuminis tai cheminis elementas, kurio simbolis yra Al, o atominis numeris periodinėje
elementų lentelėje - 13. Tai minkštas, nemagnetinis metalas, kuris sudaro apie 8 proc. žemės plutos
masės. Jis randamas daugiau nei 270 mineralų sudėtyje. Nepaisant jo naudos aplinkai, nei viena žinoma
gyvybės forma žemėje gyvybiniuose procesuose nenaudoja aliuminio druskų [27]. Taigi, nors aliuminis
ir yra vienas plačiausiai paplitusių metalų žemėje, bet iki šiol nėra žinomos jokios jo biologinės
funkcijos.
Aliuminis yra plačiai paplitęs aplinkoje, įeina į kai kurių antiperspirantų, antacidinių vaistų
sudėtį, gali būti gaunamas su vandeniu, per aliuminio įrankius, maisto pakuotes ir kt. Labai didelėmis
dozėmis aliuminis gali pereiti kraujo – smegenų barjerą ir čia būti itin kenksmingas organizmui.
Nedidelė dalis žmonių yra alergiški aliuminiui ir gali kentėti nuo kontaktinio dermatito, virškinimo
13
sutrikimų, vėmimo ar kitų simptomų esant kontaktui su aliuminiu per odą ar sistemiškai. Nustatyta, kad
aliuminio toksiškumas pasireiškia vartojant daugiau nei 40 mg/kg/d aliuminio [28].
Aliuminis yra laikomas reliatyviai žemo redoksiškumo elementu, tačiau jis gali sukelti
oksidacinį stresą veikiant paprastiems mechanizmams. Jis gali prisijungti prie neigiamai įkrautų
fosfolipidų, kurių sudėtyje yra polinesočiųjų riebalų rūgščių jautrių ADF. Aliuminis skatina geležies
inicijuojamą lipidų peroksidaciją Fentono reakcijų metu, tai lemia Fe3+ jonų formavimąsi ir ADF
produkciją. Superoksidas O2•- yra neutralizuojamas Al3+ jonų formuojant Al-O2
•- kompleksą, kuris
didina oksidacinę O2•- talpą [29]. Kaip jau minėta anksčiau, susiformavusios ADF taip pat sukelia
ląstelių pažaidą oksiduodamos aminorūgštis baltymuose, susidarant karbonilinėms grupėms. Viena
studija (Kowalczyk ir kt.) parodė, kad ilgalaikis (3 mėn) vandens su AlCl3 (80 mg/l) davimas žiurkėms,
reikšmingai padidino karbonilinių grupių koncentraciją žiurkių eritrocitų hemolizate [29]. Kitame tyrime
(Abubakar ir kt.) eksperimentinėms žiurkėms buvo taikoma dieta su aliuminio laktatu ir nustatyta
didesnė ADF produkcija kepenų homogenate lyginant su kontrole [30]. Studija (Yuan ir kt.) tyrusi
aliuminio įtaka ADF formavimuisi ir jų pažaidas skirtingose smegenų vietose nustatė padidėjusį lipidų
peroksidacijos produktų kiekį hipokampe, vidurinėse smegenyse, smegenėlėse ir smegenų kamiene [31].
9.6 Oksidacinio streso molekuliniai žymenys ir jų nustatymo būdai
9.6.1 Karbonilinės grupės baltymuose
Vykstant baltymų oksidacijai formuojasi karbonilinės (CO) grupės (aldehidai ir ketonai). Šios
struktūros yra chemiškai stabilios, dėl to yra palanku jas aptikti, vertinant baltymų oksidacijos procesą,
kartu ir nustatant oksidacinio streso lygį. Šiuo metu praktikoje yra naudojama daug skirtingų
biocheminių testų šioms karbonilinėms grupėms aptikti [3]. Vienas iš populiariausių metodų yra 2,4-
DNFH reakcija su karbonilinėmis grupėmis apskaičiuojant jų kiekį spektrofotometrijos metodu ties 370
nm banga. Šis būdas tinka įvertinti baltymų oksidaciją plazmoje, audinių homogenate, ląstelių ekstrakte.
Baltymų koncentracija tiriamajame mėginyje neturėtų būti didesnė nei 5 mg/ml. Metodas naudojamas
oksidacinio streso lygiui nustatyti smegenų audinyje, pacientų sergančių Alzheimerio liga ar amiotrofine
šonine skleroze po jų mirties, diabetu sergančiųjų kraujo plazmoje ir akies kamerų skystyje, artritu
sergančiųjų kraujo plazmoje ar sinoviniame skystyje, ar pacientų sergančiųjų cistine fibroze kraujyje
[3,32].
9.6.2 Lipidų peroksidacijos produktai
Kaip jau minėta anksčiau, lipidų peroksidacija tai procesas, kurio metu oksidantai veikia lipidų
dvigubuosius ryšius, ypač polinesočiųjų riebalų rūgščių [2]. Glikolipidai, fosfolipidai ir cholesterolis yra
pagrindiniai oksidacinio streso taikiniai. Susidarę peroksidacijos produktai gali būti naudojami kaip
molekuliniai žymenys. MDA yra plačiai naudojamas kaip patogiausias žymuo lipidų peroksidacijai
14
nustatyti, dėl paprastos reakcijos su TBR. TBR testas yra paremtas reaktyvumo su MDA principu, kurio
kiekis nustatomas spektrofotometrijos būdų ties 540 nm banga [3,33,34].
Oksidacinio lygio nustatymui baltymų karbonilinių grupių kiekio matavimas turi pranašumų
lyginant su lipidų peroksidacijos produktų nustatymu vien dėl to, kad baltymai oksiduojasi greitai, o
susidarę produktai išlieka stabilūs ilgesnį laiką, tuo tarpu lipidų peroksidacijos produktai organizme
detoksikuojami per keletą minučių [3].
9.6.3 DNR pažaidų aptikimas
Išmatuoti DNR pažaidas ląstelėje yra sudėtinga analitinė užduotis, kadangi pažeidimo lygis yra
reliatyviai mažas ir reprezentuoja mažiau nei 1 modifikaciją milijonui normalių bazių. Pažaidoms aptikti
yra naudojami tiek tiesioginiai, tiek netiesioginiai metodai [4]. Tiesioginiai būdai yra pagrįsti analitine
chemija, kuomet DNR yra išskiriama iš ląstelės, hidrolizuojama iki monomerinių vienetų ir tuomet
specifiniais aptikimo metodais (sudėtinė skysčių chromatografija su elektrocheminiu aptikimu (HPLC-
ECD), sudėtinė dujų chromatografija su masių spektrofotometrija (GC-MS), skysčių chromatografija su
masių spektrofotometrija (HPLC-MS/MS)) kiekybiškai apskaičiuojamos DNR pažaidos. Kiti būdai yra
vadinami netiesioginiais, arba biocheminiais [4,18]. Pradžioje buvo bandoma panaudoti specifinius
antikūnus prieš pirimidino dimerus, tačiau metodas pasirodė nepakankamai tikslus. Pagrindiniu
netiesioginiu DNR pažaidų aptikimo metodu šiuo metu yra laikoma elekroforezė [4]. Nukleorūgščių
elektroforezė paprastai vykdoma agarozės gelyje. Proceso metu DNR ar RNR molekulės yra atskiriamos
pagal dydį. Taikant modifikuotą elektroforezės metodą, vadinamą pulsuojančio lauko gelio
elektroforeze (angl. pulsed field gel electrophoresis, PFGE), pagal dydį išskiriami dideli DNR
fragmentai (pvz., chromosomos). Lengviausias ir daugiausia paplitęs metodas yra nukleorūgščių
horizontali elektroforezė agarozės gelyje. Dvigrandės linijinės DNR molekulės juda gelyje greičiu, kuris
yra atvirkščiai proporcingas jų molekulinės masės logaritmui. Tai yra, kuo molekulė mažesnė, tuo
greičiau ji juda gelyje [35].
10. TYRIMO METODIKA
10.1 Tyrimo objektas ir reagentai
Eksperimentai atlikti su nelinijinėmis 4-6 savaičių amžiaus baltosiomis laboratorinėmis
pelėmis, sveriančiomis 20-25 g. Moksliniai tyrimai atlikti remiantis Lietuvos Respublikos gyvūnų
globos, laikymo ir naudojimo įstatymo (Žin., 1997, Nr. 108-2728) 14 straipsniu, Valstybinės
veterinarijos tarnybos 1998 m. gruodžio 31 d. įsakymu Nr. 4-361 „Dėl laboratorinių gyvūnų veisimo,
dauginimo, priežiūros ir transportavimo veterinarinių reikalavimų“ ir 1999 m. sausio 18 d. įsakymu Nr.
4-16 „Dėl laboratorinių gyvūnų naudojimo moksliniams bandymams“ bei sveikatos apsaugos ministro
1999 m. balandžio 12 d. įsakymu Nr. 155 „Dėl geros laboratorinės praktikos taisyklių neklinikinių
15
(eksperimentinių) laboratorijų tyrimams“, o taip pat Europos etikos komiteto darbui su laboratoriniais
gyvūnais nustatytų reikalavimų. Darbui su laboratoriniais gyvūnais gautas leidimas, kurį išdavė Lietuvos
laboratorinių gyvūnų naudojimo etikos komisijos prie Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos
(leidimo Nr. G2-19, 1 priedas).
Eksperimentams naudotos laboratorinės pelės iš LSMU VA vivariumo, kurios atsivežtos ir 7
dienas laikytos karantino sąlygomis. Patinai ir patelės laikyti atskiruose narveliuose, sudarant optimalias
laikymo sąlygas: patalpų temperatūra ~20°C, santykinė oro drėgmė 55±10 %, natūralus šviesos
(diena/naktis, 12/12) režimas. Pakratams naudotos medienos drožlės ir šienas, kuriuos kiekvieną dieną
keitėme švariais. Pelės šertos „Kauno grūdų“ pilnaverčiu maistu graužikams ir girdytos vandentiekio
vandeniu ad libitum.
Eksperimentams naudojome šiuos reagentus: tiobarbituro rūgštis (TBR), AlCl3, FeCl3 – firmos
„Sigma“ (JAV); kalio chloridas (KCl), druskos rūgštis (HCl) – firmos „Merck“ (Vokietija); natrio
chloridas (NaCl) – firmos „Lachema“ (Čekija); trichloracto rūgštis (TChR) – Rusija, 2,4-
dinitrofenilhidrazino (2,4-DNFH), guanidinas, Tris-HCl, natrio chloridas (NaCl), etilendiamino
tetraacto rūgštis (EDTA), 80 % fenolio tirpalas, 10 % natrio dodecilsulfato (NDS) tirpalas. Tirpalams
gaminti naudotas dejonizuotas vanduo.
10.2 Tyrimo metodai
10.2.1 Metalų poveikio laboratorinių gyvūnų organams tyrimo modelis
Vienas iš pagrindinių cheminių reagentų toksiškumo gyviems gyvūnams įvertinimo būdų yra
jų vidutinės mirtinos dozės (LD50) nustatymas. Tai yra minimali reagento koncentracija, nuo kurios
paros laikotarpyje žūva 50 % visų bandomųjų gyvūnų. LD50 išreiškiama miligramais reagento, tenkančio
vienam eksperimentinio gyvūno kūno masės kilogramui. Eksperimentai parodė, kad LD50 AlCl3 atitinka
50 mg Al3+ vienam kg kūno masės. Kadangi tyrimai atlikti su kontrolinių laboratorinių pelių organais,
naudojamų metalų tirpalų koncentracijos modifikuotos, kad būtų sukeltas ūmus oksidacinis poveikis in
vitro. Buvo naudoti 1 M AlCl3 ir 1 M FeCl3 tirpalai.
10.2.2 Baltymų karbonilinių grupių koncentracijos nustatymas
Baltymų karbonilinių grupių koncentracijai pelių kepenyse nustatyti naudojome Levine ir
bendraautorių pasiūlytą metodiką [36]. Iš pradžių buvo paruošti tyrimui reikalingi reagentai: audinių
homogenatas, 0,1 M fosfatinis buferis (pH 7,4), 10 mM 2,4-dinitrofenilhidrazino (2,4-DNFH) paruošto
2,5 M HCl, 20 % ir 10% trichloracto rūgšties (TChA), 6 M guanidinas, 1 M aliuminio (III) chloridas
(AlCl3) ir 1 M geležies (III) chloridas (FeCl3).
Laboratorinių pelių kepenys pasvertos ir homogenizuotos fosfatiniame buferyje, kurio tūris 5
kartus didesnis nei homogenizuotų kepenų masė ir mišinys inkubuotas 15 min 37˚C temperatūroje.
16
Baltymų koncentracija mišinyje pamatuota Warburg-Christian metodu [37]. Mišinys praskiestas
fosfatiniu buferiu tiek, kad baltymų koncentracija būtų mažesnė nei 10 mg/ml.
Į mėgintuvėlius išpilstyta po 0,3 ml homogenato, tada 0,1 M fosfatinio buferio iki 1 ml ir
paruošti tiriamieji bei kontroliniai mėginiai. Į tiriamuosius mėginius pridėti skirtingi kiekiai 1 M AlCl3
ar 1 M FeCl3. Mėgintuvėliai inkubuoti 37˚C temperatūroje 2 val. arba 24 val. Homogenato ir veikiamos
metalo druskos tūrių santykiai mėginyje bei inkubacijos laikas skirtingų bandymų metu pavaizduoti 1
lentelėje.
I lentelė. Baltymų karbonilinių grupių koncentracijos nustatymo bandymų sąlygos
I
band.,
Nr. Al/Fe H:M
Ink.
(val.)
II
band.,
Nr. Al/Fe H:M
Ink.
(val.)
III
band.,
Nr. Al/Fe H:M
Ink.
(val.)
1 k k k 1 k k k 1 k k k
2 k k k 2 k k k 2 k k k
3 AlCl3 1:1 2 3 k k k 3 k k k
4 FeCl3 1:1 2 4 FeCl3 1:1 2 4 AlCl3 1:1 2
5 AlCl3 1:1 24 5 FeCl3 1:1 2 5 AlCl3 1:1 2
6 FeCl3 1:1 24 6 FeCl3 1:1 2 6 AlCl3 1:1 2
7 AlCl3 3:1 2 7 FeCl3 1:1 24 7 AlCl3
1:1 24
8 FeCl3 3:1 2 8 FeCl3 1:1 24 8 AlCl3
1:1 24
9 AlCl3 3:1 24 9 FeCl3 1:2 24 9 AlCl3
1:2 24
10 FeCl3 3:1 24 10 FeCl3 1:2 2 10 AlCl3 1:2 2
11 FeCl3 1:2 2 11 AlCl3 1:2 2
12 FeCl3 1:2 2 12 AlCl3 1:2 2
13 FeCl3 1:2 24 13 AlCl3 1:2 24
14 FeCl3 1:2 24 14 AlCl3 1:2 24
k – kontrolė, H:M – tūrio santykis tarp homogenato ir veikiamo metalo druskos, band,. – bandymas, Nr. – mėgintuvėlio
numeris, ink. – inkubacijos laikas valandomis.
Po nustatyto laiko į tiriamuosius mėginius ir vieną kontrolinį mėginį pridėta 4 ml 10 mM 2,4-
DNFH, paruošto 2,5 M HCl. Į kitą kontrolinį mėginį tik 4 ml 2,5 M HCl. Visi mėgintuvėliai inkubuoti
1 val. kambario temperatūroje, tamsoje, pamaišant kas 15 min.
Po valandos į visus mėgintuvėlius pridėta po 5 ml šaltos 20 % TchA baltymų nusodinimui ir
mėginiai šaldyti ledo vonioje 15 min. Baltymo nuosėdos surinktos centrifuguojant 15 min 10000
aps./min greičiu. Iš mėgintuvėlių nupiltas supernatantas, o likusios baltymų nuosėdos tirpintos 6 M
guanino tirpale ir inkubuotos 1 val 37˚C temperatūroje, nuolatos maišant.
Optinis tankis apskaičiuotas 370 nm bangoje. Laisvų karbonilinių grupių kiekis (nmol)
skaičiuojamas pagal molinės ekstinkcijos koeficintą: 22,000 cm-1 x M-1. Perskaičiuojama miligramui
baltymo (nmol/mg).
17
10.2.3 MDA koncentracijos nustatymas
MDA koncentracijai pelių kepenyse nustatyti naudota Uchiyama ir bendraautorių pasiūlyta
metodika [38]. Pradžioje paruošti tyrimui reikalingi reagentai: audinių homogenatas, 50 % trichloracto
rūgštis (TChA), 1,2 % KCl tirpalas, 0,1 M fosfatinio buferio, pH 7,35, tirpalas, 35 % TChR tirpalas, 0,75
% 2-tiobarbituro rūgšties (TBR) tirpalas, 0,5 % TBR tirpalas, 10 % TChR tirpalas
Audinių homogenatas buvo ruošiamas audinių smulkintuvu, pradžioje pasvėrus laboratorinių
pelių kepenis ar smegenis ir pridėjus 4 kartus didesnį tūrį (lyginant su organo mase) šalto 1,2 % KCl.
Gautas homogenatas išskirstytas į mėgintuvėlius po 0,2 ml, įpilta 0,1 M fosfatinio buferio (pH
7,35) iki 1 ml ir paruošti tiriamieji bei kontroliniai mėginiai. Į tiriamuosius mėginius pridėta 1 ml 1 M
AlCl3 ar 1 ml 1M FeCl3, mėgintuvėliai inkubuoti 2val 37 ˚C temperatūroje.
Po nustatyto laiko į tiriamuosius bei kontrolinį mėginius pridėta 0,5 ml 35 % TChR tirpalo, 1
ml 0,75 % TBR vandeninio tirpalo ir visi mėgintuvėliai inkubuoti 1 val. 37 0C vandens vonioje,
retkarčiais supurtant.
Po inkubacijos visi mėgintuvėliai dar 15 min. laikyti verdančio vandens vonioje. Po to 10 min.
atšaldyti ledo vonioje. Į atšaldytus mišinius pridėjus 1 ml 35 % TchA, jie buvo centrifuguojami 10 min.
5000 aps./min greičių.
Po centrifugavimo spektrofotometriškai pamatuota supernatanto sugertis ties 532 nm banga.
Prietaiso nulio nustatymui buvo ruošiamas kontrolinis mėginys, kuriame vietoje 0,2 ml audinių
homogenato buvo įpilta 0,2 ml 1,2 % KCl tirpalo.
MDA koncentracija apskaičiuota pagal formulę: C = A/M, kur M – molinės ekstinkcijos
koeficientas, lygus 1,56x105 mol-1cm-1, A – supernatanto sugerties reikšmė ties 532 nm banga.
10.2.4 DNR elektroforezė
Pradžioje iš laboratorinės pelės kepenų buvo išskirta DNR. Šis procesas atliktas pagal DNR
išskyrimo protokolą [39]. Šiam etapui buvo paruošti reikalingi tirpalai: 1 M Tris-HCl (pH 8,0); 1 M
Tris-HCl (pH 7,0); buferis A (0,25 M Tris-HCl, pH 8,0; 50 mM natrio chloridas (NaCl); 25 mM
etilendiamino tetraacto rūgštis (EDTA)); buferis B (0,1 M Tris-HCl, pH 7,0; 1 mM EDTA), 80 % fenolio
tirpalas., 10 % natrio dodecilsulfato (NDS) tirpalas.
Paimtos laboratorinės pelės kepenys, sveriančios 1g, kurios prieš tai buvo užšaldytos 70 0C
temperatūroje 24 valandas. Atšaldytas audinys buvo susmulkintas iki miltelių konsistencijos
porcelianinėje grūstuvėje, kuri iš anksto taip pat buvo šaldyta 70 0C temperatūroje 24 valandas.
Gauti susmulkinto audinio milteliai buvo atsargiai surinkti ir pernešti į centrifūginį mėgintuvėlį
bei užpilti 8,2 ml buferio A. Į šį homogenatą buvo pridėta 1,8 ml 10 % NDS, kad galutinė koncentracija
būtų lygi 1 %. Tada homogenatas buvo lizuotas 10 min. kambario temperatūroje.
18
Po to buvo pridėta toks pat tūris fenolio-chloroformo mišinio (6,8 ml:6,8 ml), mišinys
energingai purtytas 1-2 min, o paskui centrifuguotas 10000 g pagreičiu 5 min. Atsiskyrusi vandens
fazė buvo atsargiai nuimta naudojant 1 ml pipetę su siauru antgaliu.
Ištirpusi šioje fazėje DNR buvo nusodinta pridedant lygų tūrį izopropilo spirito. Kad DNR
nusėdimas būtų pilnas, mišinys 2 val. buvo laikomas –20˚C temperatūroje. Po 2 val. DNR nuosėdos
buvo surinktos centrifuguojant 10000 g pagreičiu 5 min. Galiausiai gautos DNR nuosėdos ištirpintos
1,7 ml buferio B ir laikytos kambario temperatūroje.
Po 16val. paimta 800 µl buferio su ištirpinta DNR ir pridėjus 3200 µl vandens, mišinys
praskiestas 5 kartus. Tada plokštelė su agarozės geliu įdedama į horizontalios elektroforezės aparatą.
Visi 20 µl talpos šulinėliai užpildyti tokiais mišinių kiekiais:
1, 4 ir 12 šulinėliuose įnešta po 20 µl buferio (kuriame yra dažų leidžiančių elektroforezės metu
stebėti DNR molekulių judėjimą elektros lauke);
2 ir 3 – 2,5 µl paruošto DNR mišinio ir 17,5 µl buferio;
5 – 5 µl DNR mišinio ir 15 µl buferio;
6 – 10 µl DNR standarto (DNR Ladder) ir 10 µl buferio;
7 – 10 µl DNR mišinio ir 10 µl buferio;
8 – 10 µl DNR mišinio paveikto 1M AlCl3 15min ir 10 µl buferio;
9 – 10 µl DNR mišinio paveikto 1M AlCl3 30min ir 10 µl buferio;
10 – 10 µl DNR mišinio paveikto 1M FeCl3 15min ir 10 µl buferio;
11 – 10 µl DNR mišinio paveikto 1M FeCl3 30min ir 10 µl buferio.
Šulinėlius užpildžius pradėta elektroforezė. Jai pasibaigus DNR fragmentų pasiskirstymas
gelyje vertintas ant stalelio su UV lempa.
10.3 Duomenų patikimumo vertinimas
Gauti duomenys analizuoti IBM SPSS 23 paketu. Duomenų patikimumas vertintas pagal
neparametrinį Mann-Whitney U testą skirtą dviem nepriklausomoms imtims lyginti. Skirtumai laikyti
statistiškai reikšmingais, kai reikšmingumo lygmuo p 0,05.
11. REZULTATAI
Baltymų karbonilinių grupių koncentracijų palyginimui atlikti 3 bandymai (sąlygos nurodytos
1 lentelėje) su skirtingų laboratorinių pelių kepenų preparatais. Pirmajame bandyme metalais veiktuose
mišiniuose nustatyta 78 nmol/mg karbonilinių grupių koncentracija. Rezultatai statistiškai nesiskyrė
lyginant su koncentracija kontroliniame mišinyje - 75 nmol/mg. Tačiau mišinius paveiktus skirtingu
metalu vertinant atskirai, nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas tarp kontrolės (75 nmol/mg) ir
mišinio veikto FeCl3 – 88 nmol/mg (1 pav.). Didžiausia karbonilinių grupių koncentracija (98 nmol/mg)
19
nustatyta mėginyje, kuriame homogenato ir FeCl3 mišinys buvo santykiu 1:1, homogenatą veikiant
FeCl3 2 val.
1 pav. Karbonilinių grupių koncentracija (nmol/mg) pelės kepenų homogenate paveikto metalais
K- kontrolė; Al – AlCl3; Fe- FeCl3; * - statistiškai reikšmingas skirtumas lyginant su kontroline grupe
Antrajame bandyme statistiškai reikšmingai skyrėsi karbonilinių grupių koncentracija tarp
kontrolės - 98 nmol/mg ir mišinio veikto FeCl3 - 128 nmol/mg, o didžiausia karbonilinių grupių
koncentracija (142 nmol/mg) nustatyta mėginyje, kuriame homogenato ir FeCl3 mišinys buvo santykiu
1:1, metalas veikė homogenatą 24 val. Trečiajame bandyme karbonilinių grupių koncentracija
kontroliniame mėginyje (41 nmol/mg) ir mišinyje veiktame AlCl3 (43 nmol/mg) statistiškai reikšmingai
nesiskyrė. Visuose bandymuose lyginant mišinius su skirtingu homogenato ir veikiamos metalo druskos
santykiu, komponentų santykis karbonilinių grupių koncentracijai įtakos neturėjo. Taip pat nei vienas
bandymas neparodė oksidacinio streso lygio statistiškai reikšmingo skirtumo tarp mišinių inkubuotų
metalais skirtingą laiko tarpą (2 arba 24 val.).
Vertinant MDA koncentraciją atlikti du bandymai su laboratorinės pelės kepenų ir smegenų
preparatais. Kepenų homogenate, veiktu FeCl3, MDA koncentracija buvo 3 kartus didesnė lyginant su
kontroliniu mėginiu (p<0,05). AlCl3 tokio poveikio nesukėlė ir reikšmingo skirtumo tarp tiriamo ir
kontrolinio mėginių nebuvo (2 pav.). Panašūs rezultatai gauti ir su smegenų homogenatu. Jį veikiant
FeCl3 nustatyta MDA koncentracija buvo 3,5 kartus didesnė lyginant su kontroliniu mėginiu (p<0,05).
Kontrolę lyginant su homogenatu veiktu AlCl3 MDA koncentracijų skirtumo nenustatyta (3 pav.).
2 pav. Malondialdehido koncentracija pelių kepenyse paveiktose AlCl3 arba FeCl3
K- kontrolė; Al – AlCl3; Fe- FeCl3; * - statistiškai reikšmingas skirtumas lyginant su kontroline grupe
75,668,6
*88,0
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
K Al Fe
*
0
100
200
300
400
K Al Fe
20
MDA koncentracija kontrolinių pelių kepenyse (0,540 nmol/l) prilyginta 100%
3 pav. Malondialdehido koncentracija pelių smegenyse paveiktose AlCl3 arba FeCl3
K- kontrolė; Al – AlCl3; Fe- FeCl3; * – statistiškai reikšmingi skirtumai lyginant su kontrole
MDA koncentracija kontrolinių pelių smegenyse (0,719 nmol/l) prilyginta 100%
DNR paveiktų metalų druskomis fragmentų pasiskirstymas pavaizduotas nuotraukoje (4 pav.).
Stebint agarozės gelį ant stalelio su UV lempa buvo matoma tvarkingai iš 6 šulinėlio išsidėsčiusi
standartinė DNR (DNR ladder). 1, 4 ir 12 šulinėliuose buvo įneštas tik buferis, todėl po jais nematoma
nieko. Po 2, 3, 5 ir 7 šulinėliais matomos panašaus ilgio (lyginant su DNR standartu) juostelės, tačiau
nefragmentuotos, labiausiai tikėtina, jog dėl per didelės koncentracijos. Po 8 ir 9 šulinėliais matomos
per pus trumpesnio ilgio juostelės. Po 10 ir 11 šulinėliais nematoma nieko.
*
0
50
100
150
200
250
300
350
400
K Al Fe
21
4 pav. Kontrolinių DNR, ir DNR paveiktų metalų druskomis fragmentų pasiskirstymas
atliekant elektroforeze agarozės gelyje.
1, 4, 12 šulinėliuose – tik buferis; 2 ir 3 šulinėliuose – 2,5 µl paruošto DNR mišinio ir 17, 5 µl buferio;
5 – 5 µl DNR mišinio ir 15 µl buferio; 6 – 10 µl DNR standarto (DNR Ladder) ir 10 µl buferio; 7 – 10
µl DNR mišinio ir 10 µl buferio; 8 – 10 µl DNR mišinio paveikto 1 M AlCl3 15 min ir 10 µl buferio; 9
– 10 µl DNR mišinio paveikto 1 M AlCl3 30min ir 10 µl buferio; 10 – 10 µl DNR mišinio paveikto 1 M
FeCl3 15 min ir 10 µl buferio; 11 – 10 µl DNR mišinio paveikto 1 M FeCl3 30 min ir 10 µl buferio.
12. REZULTATŲ APTARIMAS
Vykstant organizmo gyvybiniams procesams ir dėl išorinių faktorių organizme susidaro
aktyvios deguonies formos [1,7-9]. Manoma, kad kai kurių patologijų priežastimis kaip tik ir yra ADF
poveikis ląstelėms [7,12]. Įvairūs autoriai nurodo, kad ADF sukelia baltymų, lipidų ir nukleorūgščių
pažaidas, kas ir gali būti įvairių susirgimų priežastimi [6-12,17,19,23]. Žinoma, kad įvairių metalų jonai
daro įtaką aktyvių deguonies formų, o tuo pačiu ir organizmo makromolekulių pažaidų atsiradimui
[6,13,22]. Yra tyrimų, kuriuose nurodyta, kad geležis bei aliuminis sukelia lipidų, baltymų ir
nukleorūgščių pažaidas eksperimentinių gyvūnų organuose atliekant eksperimentus in vivo [29-31,40-
42,44-48].
Savo darbe tyriau galimas baltymų, lipidų ir nukleorūgščių pažaidas pelių organuose in vitro,
paveikus juos aliuminio ar geležies druskomis. Gauti rezultatai rodo, kad Al3+ jonai neturėjo reikšmingos
įtakos lipidų peroksidacijai ir veikiant jais pelių kepenų ir smegenų homogenatus reikšmingas MDA
lygio skirtumas lyginant su kontrole nenustatytas. Tuo tarpu žinoma, kad eksperimentinius gyvūnus
veikiant aliuminio druskomis in vivo matomi akivaizdūs molekulinio žymens padidėjimai [29,31,40,41].
Taip pat gautuose rezultatuose matoma, kad Al3+ jonai nesukėlė reikšmingo skirtumo karbonilinių
grupių susidarymui, paveikus pelių kepenų homogenatą panaudojus skirtingus aliuminio druskų tūrius
bei parenkus skirtingą inkubacijos laiką. Ankstesni tyrimai in vivo parodė, kad eksperimentinių gyvūnų
girdymas aliuminio druskomis nulėmė karbonilinių grupių lygio padidėjimą tiriant jų kraują ir organus
[29,41]. Gautų rezultatų ir pasaulinių tyrimų duomenų neatitikimą galima būtų paaiškinti metodikų,
tyrimo objektų ar aliuminio druskų naudojimo skirtumais. Gali būti, kad metalo jonas stipriau veikia
fermentų dalyvaujančių baltymų skaldymo procese funkciją nei patį baltymą, todėl in vitro nestebimas
toks poveikis, kuris įprastai nustatomas in vivo. Tuo tarpu ištyrus poveikį DNR rezultatuose nėra matoma
didesnės DNR, veiktos Al3+ jonais, fragmentacijos lyginant su kontroline grupe, kaip nurodoma
ankstesnių pasaulinių tyrimų duomenyse su laboratorinėmis pelėmis in vivo [43]. Tai galėjo įvykti dėl
per didelės išskirtos DNR koncentracijos mišinyje. Tačiau rezultatai parodė, kad DNR paveikta Al3+
22
jonais agarozės gelyje judėjo akivaizdžiai lėčiau lyginant su kontroline grupe, todėl galima teigti, kad
įvyko DNR struktūrinių pokyčių lėmusių lėtesnę DNR migraciją.
Eksperimentuose panaudojus Fe3+ jonus, buvo pastebėtas labai ženklus baltymų karbonilinių
grupių susidarymo ir lipidų peroksidacijos molekulinio žymens MDA padidėjimas lyginant su
kontrolinėmis grupėmis. Gauti rezultatai neprieštarauja anksčiau atliktiems tyrimamas su laboratoriniais
gyvūnais, kuriuose nustatytas tų pačių oksidacinio streso molekulinių žymenų padidėjimas esant
geležies pertekliui [44-47]. Rezultatai parodė, kad nebuvo jokio reikšmingo skirtumo tarp mėginių
veiktų geležies druskomis 2 ir 24 valandas. Galima daryti prielaidą, kad mano eksperimente, tiek lipidų,
tiek baltymų oksidacija įvyko per pirmąsias 2val pelių organų homogenatus paveikus geležies
druskomis. Atlikus DNR elektroforezę po šulinėliais, kuriuose buvo mėginiai veikti geležies druskomis
nematoma nieko, taip galėjo nutikti dėl to, jog parinkta geležies druskos koncentracija suardė visą DNR
ir buvo negalima stebėti jos fragmentacijos. Tuo tarpu publikuotose straipsniuose autoriai nurodo, jog
geležies junginių perteklius eksperimentiniuose gyvūnuose sukelia DNR fragmentaciją, ko priežastis yra
susidariusių ADF poveikis [46,48]. Toks neatitikimas galimas dėl panaudotos per didelės FeCl3
koncentracijos ar per ilgo veikimo laiko.
13. IŠVADOS
1. Al3+ jonai neturėjo įtakos karbonilo grupių susidarymui pelių kepenų baltymuose, tuo tarpu
naudojant Fe3+ jonus, karbonilinių grupių kiekis pelių kepenyse ženkliai padidėjo.
2. Al3+ jonai neturėjo įtakos lipidų peroksidacijos produkto MDA susidarymui pelių kepenyse.
Naudojant Fe3+ jonus, MDA kiekis reikšmingai padidėjo pelių kepenyse ir smegenyse.
3. Paveikus DNR, išskirtų iš pelės kepenų, Al3+ jonais matomas lėtesnis DNR judėjimas
elektroforezės lauke, tuo tarpu panaudojus Fe3+ jonus DNR buvo suardyta ir nematoma agarozės gelyje.
23
14. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Sies H. Oxidative stress. London: Academic Press; 1991, p 506.
2. Ayala A, Muñoz M, Argüelles S. Lipid Peroxidation: Production, Metabolism, and Signaling
Mechanisms of Malondialdehyde and 4-Hydroxy-2-Nonenal. Oxid Med Cell Longev. 2014;1-31
3. Dalle-Donne I, Rossi R, Giustarini D, Milzani A, Colombo R. Protein carbonyl groups as
biomarkers of oxidative stress. Clin Chim Acta. 2003;329(1-2):23-38.
4. Nikitaki Z, Hellweg C, Georgakilas A, Ravanat J. Stress-induced DNA damage biomarkers:
applications and limitations. Frontiers in Chemistry. 2015;3:35.
5. Galaris D, Pantopoulos K. Oxidative Stress and Iron Homeostasis: Mechanistic and Health
Aspects. Crit Rev Clin Lab Sci. 2008;45(1):1-23.
6. A.M. Adly A. Oxidative Stress and Disease: An Updated Review. J Immunol Res. 2010;3(2):129-
45.
7. Di Meo S, Reed T, Venditti P, Victor V. Harmful and Beneficial Role of ROS. Oxid Med Cell
Longev. 2016;1-3.
8. Beckman KB, Ames BN. The free radical theory of aging matures. Physiol Rev. 1998;78:547-81
9. Birben E, Sahiner U, Sackesen C, Erzurum S, Kalayci O. Oxidative Stress and Antioxidant
Defense. World Allergy Organization Journal. 2012;5(1):9-19.
10. Valko M, Leibfritz D, Moncol J, Cronin M, Mazur M, Telser J. Free radicals and antioxidants in
normal physiological functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol. 2006;39(1):44-50.
11. Reuter S, Gupta S, Chaturvedi M, Aggarwal B. Oxidative stress, inflammation, and cancer: How
are they linked?. Redox Biol. 2010;49(11):1603-16.
12. Di Meo S, Reed T, Venditti P, Victor V. Role of ROS and RNS Sources in Physiological and
Pathological Conditions. Oxid Med Cell Longev. 2016; doi.: 10.1155/2016/1245049.
13. Valko M, Morris H, Cronin M. Metals, Toxicity and Oxidative Stress. Curr Med Chem.
2005;12(10):1161-208.
14. Repetto M, Semprine J, Boveris A. Lipid Peroxidation: Chemical Mechanism, Biological
Implications and Analytical Determination. Lipid Peroxidation. 2012; doi.org/10.5772/45943.
15. Vasilaki A, McMillan D. Lipid Peroxidation. Encyclopedia of Cancer. 2011;2054-5.
16. Barelli S, Canellini G, Thadikkaran L, Crettaz D, Quadroni M, Rossier J et al. Oxidation of
proteins: Basic principles and perspectives for blood proteomics. Proteomics Clin Appl.
2008;2(2):142-57.
17. Berlett B, Stadtman E. Protein Oxidation in Aging, Disease, and Oxidative Stress. Journal of
Biological Chemistry. 1997;272(33):20313-16.
24
18. Sung C, Hsu Y, Chen C, Lin Y, Wu C. Oxidative Stress and Nucleic Acid Oxidation in Patients
with Chronic Kidney Disease. Oxid Med Cell Longev. 2013;1-15.
19. Lee J, Son Y, Pratheeshkumar P, Shi X. Oxidative stress and metal carcinogenesis. Redox Biol.
2012;53(4):742-57.
20. Angelova D, Brown D. Iron, Aging, and Neurodegeneration. Metals. 2015;5(4):2070-92.
21. Bresgen N, Eckl P. Oxidative Stress and the Homeodynamics of Iron Metabolism. Biomolecules.
2015;5(4):808-47.
22. Udipi S, Ghugre P, Gokhale C. Iron, Oxidative Stress and Health, Oxidative Stress - Molecular
Mechanisms and Biological Effects, Dr. Volodymyr Lushchak (Ed.), ISBN: 978-953-51-0554-1.
2012. InTech, Prieinama: https://www.intechopen.com/books/oxidative-stress-molecular-
mechanisms-and-biological-effects
23. Uttara B, Singh A, Zamboni P, Mahajan R. Oxidative Stress and Neurodegenerative Diseases: A
Review of Upstream and Downstream Antioxidant Therapeutic Options. Curr Neuropharmacol.
2009;7(1):65-74.
24. Iron Overload [Internetas]. idi. 2018. Prieinama: http://www.irondisorders.org/iron-overload
25. Medeiros M, Schumacher-Schuh A, Cardoso A, Bochi G, Baldissarelli J, Kegler A et al. Iron and
Oxidative Stress in Parkinson’s Disease: An Observational Study of Injury Biomarkers. PLOS
ONE. 2016; doi.org/10.1371/journal.pone.0146129.
26. Seo AY, Xu J, Servais S, et al. Mitochondrial iron accumulation with age and functional
consequences. Aging cell. 2008;7(5):706-16.
27. Frank W, Haupin W, Vogt H, Bruno M, Thonstad J, Dawless R et al. Aluminum. Ullmann's
Encyclopedia of Industrial Chemistry. 2009; doi.org/10.1002/14356007.a01_459.pub2.
28. Exley C. Human exposure to aluminium. Environ Sci Process Impacts. 2013;15(10):1807-16.
29. Kowalczyk E et al. Effect of long-term aluminium chloride intoxication on selected biochemical
parameters and oxidative-antioxidative balance in experimental animals. Polish Journal of
Environmental Studies. 2004;13(1):41–3.
30. Abubakar M, Taylor A, Ferns G. Aluminium administration is associated with enhanced hepatic
oxidant stress that may be offset by dietary vitamin E in the rat. Int J Exp Pathol. 2003;84(1):49-
54.
31. Yuan C, Lee Y, Hsu G. Aluminum overload increases oxidative stress in four functional brain
areas of neonatal rats. Biomed J. 2012;19(1):19-51.
32. Hensley K, Floyd R. Methods in biological oxidative stress. Totowa, N.J.: Humana Press; 2010.
33. Halliwell B, Whiteman M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell
culture: how should you do it and what do the results mean?. Br J Clin Pharmacol.
2004;142(2):231-55.
25
34. Bresgen N, Eckl P. Oxidative Stress and the Homeodynamics of Iron Metabolism. Biomolecules.
2015;5(4):808-47.
35. Kaufmann M. Pulsed-Field Gel Electrophoresis. Molecular Bacteriology. 1998;15:33-50.
36. Levine R, Garland D, Oliver C, Amici A, Climent I, Lenz A et al. Determination of carbonyl
content in oxidatively modified proteins. Oxygen Radicals in Biological Systems Part B: Oxygen
Radicals and Antioxidants. 1990;464-78.
37. Burgess R, Deutscher M. Guide to protein purification. San Diego, Calif: Academic Press/
Elsevier; 2009. Prieinama: http://www.academia.edu/27325090/Guide_to_Protein_Purification-
Methods_in_Enzymology
38. Uchiyama M, Mihara M. Determination of malondialdehyde precursor in tissues by thiobarbituric
acid test. Anal Biochem. 1978;86:271–8.
39. Inovatyvūs mokymosi metodai ir naujausios technologijos gamtos mokslų bakalaurų rengimui.
EVOLIUCIJA IR POPULIACIJŲ GENETIKA Laboratorinis darbas Populiacinis DNR
polimorfizmas. 2004;2-3.
40. Cheraghi E, Golkar A, Roshanaei K, Alani B. Aluminium-Induced Oxidative Stress, Apoptosis
and Alterations in Testicular Tissue and Sperm Quality in Wistar Rats: Ameliorative Effects of
Curcumin. International Journal of Fertility & Sterility. 2017;11(3):166-75.
41. El-Sayed M, El-Habibi Wafa M, El-Kholy Hana M. Aluminium-induced brain oxidative stress in
male rats and the possible ameliorating role of omega-3. The Egyptian Society of Experimental
Biology. 2011;7(2):329-42.
42. Zhuang T, Han H, Yang Z. Iron, Oxidative Stress and Gestational Diabetes. Nutrients.
2014;6(9):3968-80.
43. Chen X, Deng W, Liu Y, Lv Q. Study of antagonism of citric acid on aluminum-induced toxicity
in mice testis cells. Eur J Pharmacol. 2014;10(4):443-50.
44. Elseweidy M, El-Baky A. Effect of dietery iron overload in rat brain: Oxidative stress,
neurotransmitter level and serum metal ion in relation to neurodegnerative disorders. J Biosci.
2008;46:855-8.
45. Nahdi, A., Hammami, I., Kouidhi, W. et al. Protective effects of crude garlic by reducing iron-
mediated oxidative stress, proliferation and autophagy in rats. J Mol Histol. 2010;41:233-45.
46. Allameha A, Asghar A et al. Iron Overload Induced Apoptotic Cell Death in Isolated Rat
Hepatocytes Mediated by Reactive Oxygen Species. Iranian Journal of Pharmaceutical Research.
2008;7(2):115-21
47. Ajith T. Ameliorating reactive oxygen species-induced in vitro lipid peroxidation in brain, liver,
mitochondria and DNA damage by Zingiber officinale Roscoe. Indian Journal of Clinical
Biochemistry. 2010;25(1):67-73.
26
48. Chtourou Y, Fetoui H, Gdoura R. Protective Effects of Naringenin on Iron-Overload-Induced
Cerebral Cortex Neurotoxicity Correlated with Oxidative Stress. Biol Trace Elem Res.
2014;158(3):376-83.
27
PRIEDAI
1. Priedas Nr. 1
28
2. Tezės pristatytos Lietuvos neuromoskslų asociacijos konferencijoje 2017 m. gegužės
1 d.