AKTIVITAS DAN STABILITAS GLUKOSA DEHIDROGENASE Escherichia coli

YANG DIIMOBILISASI PADA ZEOLIT CIKEMBAR

YUANITA EKA TASWANDA

DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR

2013

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Aktivitas dan Stabilitas

Glukosa Dehidrogenase Escherichia coli yang Diimobilisasi pada Zeolit Cikembar adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.

Bogor, Maret 2013

Yuanita Eka Taswanda NIM G44104038

ABSTRAK

YUANITA EKA TASWANDA. Aktivitas dan Stabilitas Glukosa Dehidrogenase Escherichia coli yang Diimobilisasi pada Zeolit Cikembar. Dibimbing oleh DYAH ISWANTINI PRADONO, NOVIK NURHIDAYAT, dan TRIVADILA.

Kadar glukosa dalam darah dapat diukur dengan menggunakan biosensor glukosa. Biosensor glukosa lazim menggunakan enzim glukosa dehidrogenase (GDH) yang dihasilkan oleh mikrob sebagai sensor hayatinya. Pada penelitian ini, metode elektrokimia digunakan untuk mengukur aktivitas dan stabilitas GDH sel Escherichia coli ATCC25922 yang diimobilisasi pada zeolit alam Cikembar, dalam pengembangan biosensor glukosa. Zeolit alam sebagai matriks imobilisasi didapati meningkatkan aktivitas dan stabilitas GDH. Pengoptimuman aktivitas GDH sel E. coli terimobilisasi dilakukan dengan rancangan percobaan metode permukaan respons dan menghasilkan kondisi optimum pada suhu 30 oC, pH 7, [glukosa] 20.2 mM, [PQQ] 4.1 µM, dan zeolit 250 mg. Aktivitas maksimum diperoleh pada [glukosa] 60 mM, dan mengikuti persamaan Lineweaver-Burk dengan nilai KM app 8.8 mM dan Imaks app 1.2 µA. Stabilitas aktivitas GDH sel E. coli adalah 60−70% selama 24 jam. Berdasarkan hasil ini, zeolit alam Cikembar dapat meningkatkan aktivitas dan stabilitas GDH sel E. coli, tetapi afinitas dan stabilitasnya masih rendah atau belum maksimum.

Kata kunci: biosensor, Escherichia coli, glukosa, glukosa dehidrogenase, zeolit

ABSTRACT

YUANITA EKA TASWANDA. Activity and Stability of Glucose Dehydrogenase from Escherichia coli Immobilized on Cikembar Zeolite. Supervised by DYAH ISWANTINI PRADONO, NOVIK NURHIDAYAT, and TRIVADILA.

Glucose level in blood can be measured by using a glucose biosensor. Glucose biosensor commonly utilize glucose dehydrogenase (GDH) produced by microbes as the biological sensors. In this study, electrochemical method was used to measure the activity and stability of GDH from Escherichia coli ATCC25922 immobilized on Cikembar’s natural zeolite, in development of glucose biosensor. Natural zeolite as immobilization matrix was found to increase the activity and stability of the GDH. Optimization of immobilized E. coli cell’s GDH activity was carried cut with response surface method experimental design obtaining optimum conditions at 30 °C, pH 7, [glucose] 20.250 mM, [PQQ] 4.0686 μM, and 250 mg zeolite. Maximum GDH activity was obtained at [glucose] 60 mM, following Lineweaver-Burk equation with the value of 8.8289 mM for KM app and 1.2020μA for Imax app. The stability and activity of E. coli cell’s GDH was 60−70% for 24 hours. Base on these results, Cikembar’s natural zeolite can increase the activity and stability of the E. coli cell’s GDH, but the affinity and stability are still low or not maximum.

Key words: biosensor, Escherichia coli, glucose, glucose dehydrogenase, zeolite

AKTIVITAS DAN STABILITAS GLUKOSA DEHIDROGENASE Escherichia coli

YANG DIIMOBILISASI PADA ZEOLIT CIKEMBAR

YUANITA EKA TASWANDA

Skripsi sebagai salah satu syarat memperoleh gelar

Sarjana Sains pada

Departemen Kimia

DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR

2013

Judul Skripsi : Aktivitas dan Stabilitas Glukosa Dehidrogenase Escherichia coli yang Diimobilisasi pada Zeolit Cikembar Nama : Yuanita Eka Taswanda NIM : G44104038

Disetujui oleh

Prof Dr Dyah Iswantini Pradono, MScAgr Pembimbing I

Dr Novik Nurhidayat Pembimbing II

Trivadila, SSi, MSi Pembimbing III

Diketahui oleh

Prof Dr Ir Tun Tedja Irawadi, MS Ketua Departemen Kimia

Tanggal lulus:

PRAKATA

Puji dan syukur ke hadirat Allah SWT yang telah memberikan berkat

rahmat dan hidayah-Nya kepada penulis sehingga dapat menyusun dan menyelesaikan karya tulis ini. Karya tulis ini disusun berdasarkan kegiatan penelitian dengan judul Aktivitas dan Stabilitas Glukosa Dehidrogenase Escherichia coli yang Diimobilisasi pada Zeolit Cikembar yang dilaksanakan pada bulan Mei sampai dengan November 2012 di Laboratorium Kimia Fisik dan Lingkungan dan Laboratorium Bersama Kimia, Departemen Kimia FMIPA IPB, serta Laboratorium Genetika Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi, Cibinong Science Center.

Penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof Dr Dyah Iswantini Pradono, MScAgr, Dr Novik Nurhidayat, dan Trivadila SSi, MSi selaku pembimbing yang telah memberikan bimbingan, arahan, dan waktu selama penelitian berlangsung. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Ibu Ai dan Bapak Mail, staf Laboratorium Kimia Fisik dan Lingkungan, Ibu Henny Purwaningsih selaku Kepala Laboratorium Bersama Kimia, Bapak Wawan, dan Bapak Eko, staf Laboratorium Bersama Kimia. Apresiasi juga penulis sampaikan kepada seluruh staf dan karyawan Puslit Biologi LIPI Ibu Ratih, Ibu Neri, Ibu Erna, Bapak Acun, dan Ibu Enok atas izin, bantuan dan kerja samanya selama penelitian berlangsung.

Penulis ucapkan terima kasih yang tulus kepada yang terhormat dan tersayang Ibu T Herawati, Ayah Tata R Taswanda, dan adik tercinta Moch Zain Nur Fazrie yang telah banyak memberikan dorongan moral dan material, doa restu, kasih sayang, dan kepercayaannya dalam menyelesaikan studi, penelitian, dan menyelesaikan karya tulis ini. Tak lupa penulis mengucapkan terima kasih kepada keluarga besar H Mumu, Rizal, Liyonawati, Kak Dian, Lukman, Okik, Dinie, Dwi Artha, dan Bapak Muammar serta semua rekan peneliti di Laboratorium Kimia Fisik dan Lingkungan yang telah memberikan saran, bantuan, dan dukungannya. Penulis berharap semoga karya tulis ini dapat bermanfaat bagi penulis khususnya dan pembaca umumnya.

Bogor, Maret 2013

Yuanita Eka Taswanda

DAFTAR ISI

DAFTAR GAMBAR vii DAFTAR LAMPIRAN vii PENDAHULUAN 1 TINJAUAN PUSTAKA 2 Biosensor Glukosa 2 Glukosa Dehidrogenase 3 Escherichia coli 3 Zeolit 4 Imobilisasi Enzim 5 Metode Elektrokimia 5 BAHAN DAN METODE 6 Bahan dan Alat 6 Lingkup Penelitian 6 Penyiapan Media 6

Peremajaan Isolat Bakteri E. coli 7 Pembuatan Elektrode Pasta Karbon 7 Aktivasi Zeolit 7 Imobilisasi GDH Sel E. coli 7 Penentuan Aktivitas Optimum GDH Sel E. coli 7 Penentuan Parameter Kinetika 8 Pengukuran Stabilitas Aktivitas GDH Sel E. coli 8 HASIL DAN PEMBAHASAN 9 Aktivitas Optimum GDH Sel E. coli Terimobilisasi 9 Kinetika Enzim GDH Sel E. coli Terimobilisasi 10 Stabilitas Aktivitas GDH Sel E. coli Terimobilisasi 13 SIMPULAN DAN SARAN 14 DAFTAR PUSTAKA 15 LAMPIRAN 17 RIWAYAT HIDUP 23

vi

DAFTAR GAMBAR

1 Skema proses biosensor 2 2 Biosensor glukosa darah 3 3 Struktur PQQ 3 4 Bakteri Escherichia coli 4 5 Struktur bangun primer zeolit 4 6 Struktur mordenit 5 7 Voltamogram siklik 9 8 Oksidasi glukosa dengan katalis GDH dan mediator Qo 9 9 Alur kontur optimisasi aktivitas GDH sel E. coli terimobilisasi 11 10 Hubungan dan kisaran linear konsentrasi glukosa dengan aktivitas GDH sel E. coli 12

11 Kurva Lineweaver-Burk GDH sel E. coli terimobilisasi 12 12 Kestabilan aktivitas GDH sel E. coli pada suhu ruang dan 4 ºC 14

DAFTAR LAMPIRAN

1 Bagan alir umum penelitian 17 2 Optimisasi aktivitas GDH sel E. coli terimobilisasi 18 3 Aktivitas GDH E. coli pada berbagai konsentrasi substrat 19 4 Kinetika enzim GDH E. coli terimobilisasi dengan zeolit 20 5 Kinetika enzim GDH E. coli terimobilisasi tanpa zeolit 21 6 Stabilitas aktivitas enzim GDH E. coli terimobilisasi pada suhu kamar 22 7 Stabilitas aktivitas enzim GDH E. coli terimobilisasi pada suhu 4 ºC 22

vii

1

PENDAHULUAN

Penyakit diabetes melitus (DM) dapat disebabkan oleh menurunnya produksi hormon insulin oleh kelenjar pankreas sehingga kadar glukosa di dalam tubuh meningkat melebihi batas normal (Sari 2007). Kadar glukosa dalam darah dapat diukur menggunakan biosensor glukosa yang sebagian besar menggunakan enzim sebagai sensornya. Biosensor adalah sensor yang menggabungkan senyawa hayati dengan transduser dan mengubah isyarat menjadi luaran yang terukur (Wang et al. 2007).

Sensor enzim memiliki kestabilan aktivitas yang rendah karena enzim mudah didegradasi atau dinonaktifkan oleh suhu dan pH. Selain itu, harganya mahal. Sensor mikrob penghasil enzim dapat dijadikan alternatif untuk mengatasi kelemahan tersebut. Menurut Iswantini et al. (2011), sensor mikrob lebih efektif karena tidak memerlukan tahap isolasi dan pemurnian enzim aktif. Selain itu, sensor mikrob lebih tahan lama karena enzim yang dihasilkan terlindungi di dalam sel mikrob dan enzim baru dapat terus dihasilkan. Sel mikrob yang digunakan juga dapat memanfaatkan keanekaragaman mikrob penghasil enzim Indonesia.

Enzim glukosa oksidase (GOD) lazim digunakan dalam biosensor glukosa, tetapi reaksi enzimatiknya sangat dipengaruhi oleh kadar oksigen dalam darah. Sebaliknya, reaksi enzimatik glukosa dehidrogenase (GDH) tidak bergantung pada kadar oksigen (Hiratsuka et al. 2008). Pirolokuinolina kuinon glukosa dehidrogenase (PQQGDH) merupakan bentuk enzim yang aktif karena penambahan PQQ dari luar sebagai gugus prostetik enzim GDH (Witarto 2007). Menurut Trivadila (2006), enzim GDH dapat dihasilkan dari bakteri gram negatif seperti Escherichia coli KRGL yang aktivitasnya secara in vivo lebih besar daripada Bacillus subtilis KRGS.

Pengukuran glukosa dapat dilakukan dengan metode spektrofotometri. Akan tetapi, metode ini mahal karena menggunakan berbagai pereaksi dalam jumlah banyak, waktu preparasinya lama, dan kurang peka karena pengujian contoh dipengaruhi oleh kekeruhan akibat konsentrasi yang tinggi. Dengan metode elektrokimia, pengukuran lebih sensitif, selektif, dan efektif (Campanella et al. 2004). Iswantini et al. (2011) melaporkan E. coli sebagai bakteri yang paling berpotensi untuk dikembangkan sebagai biosensor glukosa di Indonesia karena secara elektrokimia, E. coli yang diimobilisasi di atas permukaan elektrode pasta karbon (EPK) dapat mendeteksi konsentrasi glukosa hingga 20 mM.

Teknik imobilisasi mikrob penghasil enzim digunakan dalam mengatasi masih kurang stabilnya biosensor. Dengan teknik ini, sel mikrob dijaga agar tidak lepas akibat pencucian dan akan memiliki daya tahan hidup yang lebih lama sehingga dapat meningkatkan stabilitas biosensor. Selain itu, aktivitas katalitik molekul enzim pada permukaan matriks imobilisasi dapat dipertahankan untuk jangka waktu tertentu. Menurut Nazaruddin (2007), biopolimer dan polimer sintetik dapat digunakan sebagai matriks imobilisasi, tetapi stabilitas kimia dan mekaniknya masih rendah. Bahan anorganik seperti liat, alumina berpori, dan silika (Bhatia et al. 2000), serta zeolit juga dapat digunakan. Penggunaan zeolit sebagai matriks pengimobilisasi telah banyak dilaporkan antara lain oleh Dai et al. (2004), Balal et al.(2009), Goriushkina et al. (2010), Saiapina et al. (2011), dan Weniarti (2011).

2

Zeolit alam merupakan senyawa alumina silikat terhidrasi yang secara fisik dan kimia mempunyai kemampuan sebagai penjerap, penukar kation, dan katalis. Menurut Valdes et al. (2006) zeolit stabil pada suhu tinggi, tahan terhadap pelarut organik, dan keras sehingga lebih stabil terhadap tekanan mekanik dan enzim yang terjerap akan lebih stabil. Rangka dan pori dari struktur zeolit yang seragam menyebabkan selektivitas dan keterulangan yang dihasilkan tinggi. Herawati (2012) menggunakan zeolit alam Bayah sebagai pengimobilisasi untuk biosensor glukosa dan memberikan aktivitas yang cukup baik. Keberadaan zeolit alam di Indonesia sangat melimpah dan pemanfaatannya masih perlu dioptimalkan. Zeolit alam Cikembar dari Sukabumi belum banyak dilaporkan penggunaannya, maka pada penelitian ini dipilih sebagai pengimobilisasi sel E. coli ATCC25922 penghasil enzim GDH pada permukaan EPK. Aktivitas serta stabilitas enzim GDH yang dihasilkan oleh sel yang diimobilisasi juga ditentukan.

TINJAUAN PUSTAKA

Biosensor Glukosa

Biosensor (Gambar 1) merupakan perangkat sensor yang menggabungkan senyawa hayati dengan tranduser, terdiri atas 3 bagian utama. Bagian pertama adalah unsur hayati berupa enzim, organel, jaringan, antibodi, mikroorganisme, atau DNA, yang terimobilisasi pada transduser. Bagian kedua adalah transduser atau elemen detektor, bekerja secara fisikokimia. Prosesnya dapat berupa kalorimetri, potensiometri, atau amperometri. Bagian ketiga adalah sistem elektronik pemroses isyarat yang keluar dari tranduser (Gunawan 2010).

Gambar 1 Skema proses biosensor (Borgmann et al. 2011)

Senyawa aktif hayati berinteraksi dengan molekul sasaran menghasilkan besaran fisis seperti panas, arus listrik, atau potensial listrik. Transduser akan memantau dan mengolahnya menjadi isyarat yang dapat dimengerti. Biosensor dalam perkembangannya mempunyai 3 generasi. Generasi pertama ialah biosensor berbasis oksigen, generasi kedua biosensor berkembang lebih spesifik dan melibatkan mediator, dan generasi ketiga merupakan biosensor berbasis tandem enzim (Gunawan 2010).

Biosensor glukosa pertama kali dikembangkan oleh Leland Clark, ahli fisiologi dan biokimia dari Amerika Serikat, menggunakan enzim GOD dari jamur Aspergillus niger yang bereaksi spesifik dengan glukosa (Clark 1956, diacu dalam

transduser

penguat suara

matriks sampel

pemroses isyarat

senyawa hayati

pemroses data

3

Turner 1996) dengan menggunakan transduser elektrokimia sebagai sensor secara amperometri. Namun, menurut Witarto (2007), enzim GOD dapat menghasilkan kadar glukosa darah yang berbeda-beda akibat kadar oksigen terlarut. Hal tersebut mendorong penggantian enzim GOD dengan enzim GDH yang aktivitasnya tidak dipengaruhi oleh kadar oksigen, dan dapat dihasilkan dari bakteri gram negatif. Penelitian terkait biosensor glukosa dengan menggunakan mikrob sebagai biokatalis telah dilaporkan oleh Ikeda et al. (2001) dan Iswantini et al. (2011). Salah satu alat pengukur glukosa darah komersial ditunjukkan pada Gambar 2.

Gambar 2 Biosensor glukosa darah

Glukosa Dehidrogenase

Glukosa dehidrogenase (GDH) bekerja mengoksidasi glukosa membentuk asam glukonat secara langsung tanpa menggunakan oksigen sebagai akseptor elektron. GDH termasuk kuinoprotein yang menggunakan PQQ (Gambar 3) sebagai gugus prostetik dan ion Mg2+ atau Ca2+ sebagai pengaktif, serta ditemukan pada berbagai bakteri gram negatif. Acinetobacter calcoaceticus memiliki 2 jenis PQQGDH, yaitu soluble dan membrane-bound PQQGDH (Yoshida et al. 1999). Bakteri E. coli hanya memiliki mGDH dalam bentuk apoenzim (tidak aktif), tetapi tidak dapat menyintesis PQQ. Dibutuhkan PQQ dari lingkungan untuk mengubah apo-GDH menjadi holo-GDH. Bentuk PQQGDH digunakan sebagai enzim aktif.

Gambar 3 Struktur PQQ

Escherichia coli

Taksonomi bakteri E. coli adalah kerajaan Bacteria, filum Proteobacteria, kelas Gamma proteobacteria, ordo Enterobacteriales, famili Enterobacteriaceae, genus Escherichia, dan spesies E. coli. Bakteri E. coli (Gambar 4) ditemukan oleh Theodor Escherich, tergolong kelompok gram negatif, berbentuk batang dari

4

pendek sampai kokus, saling terlepas satu sama lain atau bergandeng dua-dua (diplobasil) atau membentuk rantai pendek, tidak membentuk spora maupun kapsul, dan berdiameter ± 1.1−1.5 x 2,0–6,0µm. Bakteri ini bertahan hidup di medium sederhana dan memfermentasikan laktosa menghasilkan asam dan gas dalam kondisi anaerob.

Gambar 4 Bakteri Escherichia coli (Shofyan 2010)

Bakteri E. coli berkembang biak setiap 20 menit jika faktor media, derajat

keasaman, dan suhu sesuai. Suhu optimum pertumbuhan 37 ºC, maka dapat hidup dalam tubuh manusia seperti usus besar dan juga dalam vertebrata lainnya (Shofyan 2010). Sel E. coli dipilih karena pertumbuhannya sangat cepat dan mudah dalam penanganannya. Menurut Iswantini et al. (2011), bakteri E. coli telah banyak digunakan dalam pengembangan biosensor glukosa karena batas deteksinya sebanding dengan enzim murni. Metode ini juga lebih murah karena tidak memerlukan proses isolasi dan pemurnian enzim aktif.

Zeolit

Istilah zeolit berasal dari bahasa Yunani zein berarti membuih dan lithos berarti batu. Zeolit terdiri atas 3 komponen, yaitu kation yang dipertukarkan, kerangka aluminosilikat, dan fase air yang mengandung kation alkali dan alkali tanah. Zeolit (Gambar 5), memiliki struktur kompleks berupa kerangka 3 dimensi SiO4

4- dan AlO45- dengan geometri tetrahedral, yang saling dihubungkan oleh

pembagian bersama ion oksigen membentuk rongga-rongga intrakristalin dan saluran-saluran yang teratur (Widianti 2006).

Gambar 5 Struktur bangun primer zeolit (Widianti 2006)

Zeolit alam terbentuk karena zeolitasi atau proses perubahan alami batuan

vulkanik tuf. Zeolit alam di Indonesia tersebar di beberapa daerah seperti Bayah, Banten, Cikalong, Tasikmalaya, Cikembar, dan Lampung. Struktur kerangka zeolit yang berpori memungkinkan anion atau molekul yang berukuran lebih kecil

5

atau sama dengan rongga dapat masuk dan terjebak. Zeolit memiliki sifat sebagai penukar kation, adsorben, katalis, penyaring, dan dehidrator (Widianti 2006).

Zeolit yang digunakan pada penelitian ini berasal dari Cikembar Sukabumi, tergolong jenis mordenit dengan kandungan silikon tinggi berdasarkan hasil analisis difraksi sinar-X (Hasanah 2012). Struktur penyusun mordenit ialah Na8(Al8Si40O96)·24H2O yang berbentuk ortorombik (Gambar 6) dengan pori kecil dan nilai kapasitas tukar kation 56.76 mek/100g.

Gambar 6 Struktur mordenit (Hasanah 2012)

Imobilisasi Enzim

Enzim yang terimobilisasi secara fisis maupun kimia menjadi tidak bebas bergerak sehingga waktu kontak dengan substrat dapat dikendalikan. Imobilisasi secara fisis tidak melibatkan pembentukan ikatan kovalen, sedangkan pada imobilisasi secara kimia, sedikitnya 1 ikatan kovalen terbentuk antara 2 atau lebih residu dari enzim yang sejenis. Enzim redoks banyak digunakan dalam biosensor elektrokimia karena enzim ini dapat menghasilkan atau menggunakan elektron dalam mengatalisis pengubahan substrat menjadi produk; elektron ini yang akan dideteksi (Grieshaber et al. 2008). Permasalahan penggunaan enzim dalam biosensor seperti pemulihan enzim, stabilitas enzim, selektivitas enzim, dan pelemahan inhibisi oleh medium atau produk, dapat diatasi dengan mengimobilisasi enzim pada material tertentu. Imobilisasi enzim dapat meningkatkan selektivitas substrat dan laju regenerasi pusat aktif. Selain itu, enzim dapat digunakan dan diolah kembali sehingga biaya lebih murah, desain menjadi sederhana karena tidak membutuhkan reaktor, dan reaksi dapat dikendalikan (Mateo et al. 2007).

Metode Elektrokimia

Metode elektrokimia merupakan salah satu transduser yang digunakan dalam biosensor berdasarkan hubungan antara reaksi kimia dan aliran listrik. Teknik voltametri merupakan salah satu teknik analisis elektrokimia yang mengukur arus sebagai fungsi potensial. Hasil pengukuran divisualisasikan dalam bentuk voltamogram, dan memiliki sensitivitas yang tinggi untuk rentang konsentrasi yang besar. Sel voltametri terdiri atas 3 elektrode. (1) Elektrode kerja adalah tempat terjadinya reaksi oksidasi dan reduksi analit bergantung pada potensial yang diberikan, seperti elektrode emas, platinum, raksa, dan karbon. (2) Elektrode pembanding memiliki potensial yang telah diketahui seperti elektrode

6

Ag/AgCl. (3) Elektrode bantu berfungsi mengalirkan arus untuk memperkecil galat dan mengatur potensial elektrode kerja, seperti elektrode platinum atau grafit (Hattu 2009). Biosensor elektrokimia telah digunakan untuk memantau pembentukan holo-GDH dari apo-GDH sel E. coli secara in vivo dengan penambahan gugus prostetik PQQ (Ikeda et al. 2001), menentukan aktivitas GDH sel E. coli K-12 (Iswantini et al. 2011), studi kinetika dan termodinamika aktivasi kuinoprotein apo-GDH secara in vivo dan aktivitas katalitik holo-GDH sel E. coli (Iswantini et al. 2000), serta mempelajari E. coli serta aplikasinya pada metode amperometri sebagai sensor glukosa dengan mediator 2,3-dimetoksi-5-metil-1,4-benzokuinon (Q0).

BAHAN DAN METODE

Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan antara lain zeolit alam dari Cikembar Indonesia, mikrob sel E. coli ATCC25922 dari koleksi LIPI Mikrobiologi, poli (vinil alkohol), AgNO3, tripton, ekstrak khamir, agar nutrien, MgSO4, glukosa, PQQ, Q0, DMSO, bufer fosfat, grafit, parafin cair, membran dialisis, jaring nilon, saringan 100 mesh, dan gas N2.

Peralatan yang digunakan antara lain potensiostat-galvanostat eDAQ yang dilengkapi perangkat lunak Echem v2.1., elektrode Ag/AgCl, elektrode pasta karbon, platinum, sel elektrokimia, laminar air flow, inkubator, oven, autoklaf, oven, tanur, high speed refrigated centrifuge Kubota 6500, pengaduk magnet, pelat pemanas, mikropipet, dan alat-alat kaca.

Lingkup Penelitian

Penelitian dilakukan dalam beberapa tahap (Lampiran 1). Sampel disiapkan dan sel E. coli diimobilisasi. Aktivitas optimum GDH E. coli terimobilisasi ditentukan berdasarkan parameter pH, suhu, konsentrasi glukosa, konsentrasi PQQ, dan komposisi zeolit. Selanjutnya parameter kinetika ditentukan dan stabilitas aktivitas GDH E. coli diukur menggunakan metode elektrokimia.

Penyiapan Media

Media Luria broth (LB) agar miring dibuat dengan mencampurkan 10 g tripton dengan 5 g ekstrak khamir, 5 g NaCl, dan 15 g agar, dilarutkan dengan akuades sampai volumenya 1 L. Media dipanaskan sampai mencair dan larut secara homogen, lalu ± 6 mL dituangkan ke dalam tabung reaksi yang berbeda. Tabung reaksi ditutup sumbat dan disterilisasi dalam autoklaf selama kurang lebih 2 jam. Setelah itu, diletakkan pada rak miring sampai dingin dan memadat. Media LB cair sama cara pembuatannya, tetapi tanpa penambahan agar dan tidak diletakkan pada rak miring (Marlina 2008).

7

Peremajaan Isolat Bakteri E. coli

Bakteri E. coli ditumbuhkan di media LB agar miring, diinkubasi selama 1 hari pada suhu 37 ºC. Bakteri yang tumbuh ditanam ke dalam 6 mL media LB cair sebagai starter, lalu diinkubasi sampai mencapai nilai OD610=0.9. Setelah itu, ½ mL starter diinokulasi ke dalam 50 mL media LB cair dan diinkubasi selama 1 hari pada suhu 37 ºC. Sel bakteri dipanen dengan cara disentrifugasi pada kecepatan 10 000 rpm selama 5 menit. Pelet dipisahkan dari supernatan, dicuci 2 kali dengan air, dan disuspensikan dengan NaCl 0.85%.

Pembuatan Elektrode Pasta Karbon

Grafit dicampur dengan parafin cair dengan nisbah 2:1 hingga membentuk pasta kemudian dimasukkan ke dalam badan elektrode sampai memadat ke permukaan. Permukaan elektrode dihaluskan dan dibersihkan dengan ampelas dan kertas minyak.

Aktivasi Zeolit

Sebanyak 50 g zeolit dicuci dengan akuades sampai pH 7, disaring, dan dikeringkan dalam oven pada suhu 105 ºC. Zeolit lalu diaktivasi dengan menambahkan 250 mL HCl 3 M, diaduk selama 1 jam. Setelah itu, disaring dan dicuci dengan akuades sampai pH 7. Filtrat diuji kandungan klorin dengan AgNO3, zeolit dicuci kembali dengan akuades sampai tidak mengandung klorin. Setelah netral dan bebas klorin, zeolit dikeringkan pada suhu 300 ºC selama 3 jam kemudian dihaluskan dan diayak dengan ayakan 100 mesh (Arif 2011).

Imobilisasi GDH Sel E. coli

Metode ini dilakukan dengan memodifikasi metode Dai et al. (2004). Zeolit dengan bobot 250, 200, 100, 50, 25, dan 10 mg ditambahkan ke dalam 10 mL akuades. Seratus µL suspensi ini dicampur dengan 5 µL larutan PVA 3%. Koloid zeolit yang dihasilkan dicampur dengan suspensi sel E. coli dalam NaCl 0.85%, masing-masing 10 µL, lalu didiamkan selama 24 jam pada suhu 4 ºC. Sel terimobilisasi diteteskan sebanyak 10 µL pada permukaan EPK, lalu didiamkan hingga pelarutnya menguap. Permukaan EPK kemudian dilapisi dengan membran dialisis, ditutup dengan jaring nilon, dan diikat dengan parafilm. Elektrode direndam dalam larutan garam (NaCl fisiologis) pada suhu 4 ºC ketika belum digunakan.

Penentuan Aktivitas Optimum GDH Sel E. coli

Pengukuran secara voltametri siklik dilakukan menggunakan alat potensiostat-galvanostat eDAQ dan komputer, dilengkapi perangkat lunak Echem

8

v2.1. pengolah data Compac. Elektrode yang digunakan ialah elektrode pembanding Ag/AgCl, elektrode pembantu platinum, dan elektrode kerja pasta karbon-sel bakteri terimobilisasi. Parameter pengukuran dibuat berdasarkan hasil screening dengan Mode: Cyclic, Initial E: -400mV, Final E: -400mV, Rate:250mV/s, Step W: 20ms, Upper E: 600mV, Lower: -400mV, Range: 5V.

Satu mL larutan bufer fosfat dimasukkan ke dalam sel elektrokimia dan ketiga elektrode dimasukkan sampai tercelup. Larutan diaerasi aliran gas N2 selama kurang lebih 1 menit sebelum pengukuran. Puncak arus anode yang terbentuk diamati sebagai blangko. Selanjutnya 100 µL Qo 5 mM, glukosa, PQQ, dan MgSO4 10 mM berturut-turut ditambahkan, diaduk sampai homogen, dan perubahan yang terjadi pada profil voltamogram yang dihasilkan diamati.

Optimisasi yang dilakukan melalui parameter suhu reaksi (25−40) ºC, pH (6−9), konsentrasi glukosa (0.5−40) mM, konsentrasi PQQ (0.1−6) µM, dan komposisi zeolit (10−250) mg. Metode permukaan respons (RSM) digunakan sebagai rancangan percobaan untuk analisis aktivitas GDH optimum. Metode ini dilakukan dengan cara memasukkan kombinasi faktor-faktor peubah bebas pada perangkat lunak statistik Minitab.

Penentuan Parameter Kinetika

Parameter kinetika ditentukan pada kondisi optimum dengan mengukur aktivitas GDH E. coli pada berbagai konsentrasi glukosa (5−70 mM). Penentuan dilakukan dengan persamaan Michaelis Menten:

 Imaks app, yaitu respons arus maksimum yang terukur (apparent) dan KMapp, yaitu tetapan Michaelis-Menten (apparent) merupakan parameter kinetika yang ditentukan, diperoleh dari bentuk linear persamaan Michaelis-Menten, yaitu alur Lineweaver-Burk, Eadie-Hofstee, dan Hanes (Trivadila 2011).

Pengukuran Stabilitas Aktivitas GDH Sel E. coli

Stabilitas aktivitas enzim GDH juga ditentukan pada kondisi optimum. EPK yang telah diimobilisasi bakteri dengan dan tanpa matriks zeolit disimpan pada suhu ruang dan 4 ºC. Aktivitas yang diperoleh pada awal pengukuran dianggap 100%, lalu diukur setiap 2 jam hingga 24 jam.

Aktivitas GDH (%) = × 100%

9

HASIL DAN PEMBAHASAN

Aktivitas Optimum GDH Sel E. coli Terimobilisasi

Berdasarkan voltamogram siklik yang dihasilkan (Gambar 7), tidak terbentuk puncak oksidasi maupun reduksi saat penambahan bufer yang menandakan tidak ada aktivitas GDH sel E. coli. Penambahan Q0 menghasilkan puncak katode yang signifikan, sedangkan penambahan glukosa menghasilkan puncak anode yang tidak terlalu signifikan. Menurut Iswantini et al. (2011), hal tersebut disebabkan reaksi oksidasi glukosa belum berlangsung karena enzim GDH masih dalam keadaan inaktif (apo-GDH). Penambahan gugus protestik PQQ dan zat pengaktif MgSO4 meningkatkan puncak anode tersebut karena enzim GDH telah berubah menjadi keadaan aktif (holo-GDH).

Gambar 7 Voltamogram siklik. bufer fosfat, Qo, glukosa, PQQ,

dan MgSO4

Oksidasi glukosa menjadi asam glukonat disebabkan oleh pengambilan atom H dari glukosa oleh enzim GDH sebagai katalis oksidoreduktase yang spesifik terhadap substrat glukosa. Elektron yang dilepaskan akan ditangkap oleh Q0 sebagai mediator yang akan teroksidasi kembali dengan melepaskan elektron dan akan terbaca sebagai arus (Gambar 8). Oleh karena itu, perubahan arus yang terukur dari hasil reaksi oksidasi dapat menunjukkan aktivitas GDH sel E. coli.

Gambar 8 Oksidasi glukosa dengan katalis GDH dan mediator Q0

(Ikeda et al. 2001)

I (A

)

E (V)

10

Hasil optimisasi (Lampiran 2) dianalisis menggunakan metode RSM pada perangkat lunak statistik Minitab. Respons hasil optimisasi aktivitas GDH sel E. coli terimobilisasi digambarkan dalam bentuk alur kontur hubungan antara berbagai faktor (Gambar 9). Respons aktivitas optimum ditandai dengan daerah hijau gelap yang menunjukkan puncak arus oksidasi. Kondisi optimum dianalisis lebih lanjut dengan cara nilai Hold Values pada alur kontur digunakan sebagai Starting Value pada Response Optimizer. Aktivitas optimum GDH sel E. coli terimobilisasi diperoleh pada suhu 30 ºC, pH 7, [glukosa] 20.3 mM, [PQQ] 4.1 µM, dan zeolit 250 mg. Nilai optimum sebagian besar diperoleh pada nilai tengah dari kisaran nilai parameter yang dioptimumkan, tetapi ada pula yang tidak.

Hasil penelitian ini tidak berbeda jauh dengan hasil penelitian Iswantini et al. (2011), dengan kondisi optimum pada pH 6.5, [PQQ] 4.6 µM, dan [glukosa] 20 mM. Arslan et al. (2011), memperoleh kondisi optimum pada suhu ruang dan pH 7.5 saat film polianilina-poli(vinil sulfonat) digunakan sebagai matriks imobilisasi untuk biosensor glukosa. Herawati (2012) dan Gia (2012) yang mengimobilisasi GDH sel E. coli dengan zeolit jenis klinoptilolit memperoleh kondisi optimum yang sama pada suhu 30 ºC, pH 6, dan [glukosa] 15 mM. Akan tetapi, kondisi optimum berbeda pada [PQQ], berturut-turut 3.1 dan 3.5 μM, serta zeolit 137.5 dan 150 mg. Perbedaan nilai yang tidak terlalu jauh tersebut dapat disebabkan oleh perbedaan proses imobilisasi dan matriks imobilisasi yang digunakan. Gia (2012) menambahkan glutaraldehida ke dalam matriks pengimobilisasi. Sumber enzim juga berpengaruh pada kondisi optimum aktivitas GDH. Sel E. coli memiliki suhu pertumbuhan optimum 37 ºC maka aktivitas GDH juga akan optimum di sekitar suhu tersebut. Selain itu, pH dan suhu memiliki pengaruh dalam menentukan arus puncak optimum aktivitas GDH sel E. coli. Menurut Trivadila (2011), pergeseran pH terjadi karena enzim diimobilisasi pada matriks yang memiliki perbedaan muatan, sedangkan menurut Bisswanger (2008), pergeseran suhu disebabkan oleh ketidakhomogenan imobilisasi enzim.

Kinetika Enzim GDH Sel E. coli Terimobilisasi

Kinetika enzim menunjukkan kespesifikan enzim terhadap substrat yang diikatnya. Aktivitas GDH diukur dengan variasi konsentrasi glukosa 50−70 mM (Gambar 10a dan Lampiran 3). Pengukuran dilakukan pada kondisi optimum dan suhu ruang, sesuai dengan aplikasi biosensor glukosa. Kisaran linear aktivitas GDH E. coli terhadap konsentrasi glukosa ditentukan (Gambar 10b) dan berhubungan dengan kepekaan biosensor glukosa yang dihasilkan. Peningkatan konsentrasi substrat meningkatkan aktivitas GDH E. coli secara linear pada rentang konsentrasi substrat yang cukup lebar, yaitu 5−60 mM, dengan maupun tanpa matriks zeolit. Nilai R2 GDH sel E. coli yang diimobilisasi zeolit lebih tinggi, yaitu 96.01%, artinya penambahan zeolit berpotensi memberikan hasil pengukuran yang lebih tepat. Kisaran linearitas Herawati (2012) dan Gia (2012) ialah 0−50 mM, lebih sempit dibandingkan dengan hasil penelitian ini.

11

Gambar 9 Alur kontur optimisasi aktivitas GDH sel E. coli terimobilisasi:

hubungan antara pH dan suhu (a), [glukosa] dan suhu (b), [PQQ] dan suhu (c), komposisi zeolit dan suhu (d), [glukosa] dan pH (e), [PQQ] dan pH (f), komposisi zeolit dan pH (g), [PQQ] dan [glukosa] (h), komposisi zeolit dan [glukosa] (i), dan komposisi zeolit dan [PQQ] (j)

(b) (a)

(c) (d)

(e) (f)

(i) (j)

(g) (h)

12

(a) (b)

Gambar 10 Hubungan (a) dan kisaran linear (b) dan kisaran linear konsentrasi glukosa dengan aktivitas GDH sel E. coli. dengan zeolit, tanpa zeolit

Penambahan konsentrasi substrat lebih tinggi dari pada konsentrasi substrat

maksimum sangat menurunkan aktivitas GDH sel E. coli terimobilisasi dengan maupun tanpa zeolit. Hal ini disebabkan substrat yang lebih banyak lagi akan menghambat aktivitas enzim GDH E. coli. Menurut Bisswanger (2008), ketika konsentrasi substrat masih rendah, di bawah 60 mM pada penelitian ini, belum semua tapak aktif enzim GDH mengikat substrat. Di atas 60 mM, semua tapak aktif GDH telah mengikat substrat. Aktivitas GDH E. coli mencapai maksimum dan penambahan konsentrasi glukosa lebih tinggi tidak lagi berpengaruh terhadap laju reaksi atau aktivitas GDH. Dengan kata lain, enzim GDH telah bekerja pada kapasitas penuh.

Parameter kinetika enzim GDH E. coli terimobilisasi yang meliputi KMapp dan Vmaks app (dianalogikan dengan arus maksimum nyata [Imaks app]) ditentukan berdasarkan 3 metode, yaitu Lineweaver-Burk, Hanes, dan Eadie-Hofstee (Lampiran 4 dan 5). Linearitas terbaik diperoleh dengan kinetika Lineweaver-Burk (Gambar 11), walaupun nilainya masih kurang dari 0.9999.

Gambar 11 Kurva Lineweaver-Burk GDH sel E. coli terimobilisasi.

dengan zeolit, tanpa zeolit

13

Berdasarkan persamaan kurva Lineweaver-Burk, nilai KMapp GDH E. coli yang diimobilisasi dengan zeolit (8.8 mM) lebih kecil, sedangkan nilai Imaks app-nya (1.2 µA) lebih besar dibandingkan dengan tanpa zeolit (berturut-turut 11.9 mM dan 0.8 µA). Nilai KMapp menunjukkan afinitas atau daya ikat enzim GDH E. coli terhadap substrat glukosa. Jadi, GDH E. coli yang diimobilisasi dengan zeolit lebih tinggi afinitasnya atau enzim semakin kuat mengikat substrat sehingga hanya diperlukan sedikit substrat saja untuk menjenuhkannya. Nilai Imaks app di sisi lain menunjukkan laju reaksi katalitik oksidasi glukosa oleh GDH E. coli. Artinya, saat diimobilisasi zeolit, reaksi katalitik enzim lebih cepat. Arslan et al. (2011) memperoleh nilai KMapp yang lebih kecil (0.2 mM), sedangkan Herawati (2012) dan Gia (2012) mendapatkan berturut-turut 1 dan 2.7 mM dengan R2 lebih baik, yaitu 95.60% dan 93.28%. Perbedaan ini dapat disebabkan oleh perbedaan jenis matriks imobilisasi yang digunakan. Berdasarkan parameter kinetika yang diperoleh, zeolit alam Cikembar berpotensi sebagai material pendukung untuk biosensor glukosa berbasis E. coli, tetapi afinitas yang dihasilkan masih rendah atau belum maksimum.

Stabilitas Aktivitas GDH sel E. coli Terimobilisasi

Bakteri E. coli memiliki dinding sel yang tipis dengan kandungan peptidoglikan sedikit sehingga protein periplasma, termasuk enzim GDH banyak dihasilkan dan dapat langsung digunakan serta ditentukan aktivitasnya tanpa memecah dinding sel E. coli terlebih dahulu. Namun, enzim yang dihasilkan dapat dipengaruhi oleh pH dan suhu yang menyebabkan enzim terdenaturasi. Material pengimobilisasi seperti zeolit diharapkan dapat menjaga kestabilan enzim GDH E. coli dalam pori zeolit. Selain itu, muatan yang terdapat dalam zeolit akan membantu meningkatkan transfer elektron sehingga meningkatkan arus yang dihasilkan. Menurut Dai et al. (2004), partikel zeolit tidak merusak struktur dan lingkungan enzim dan menurut Balal et al. (2009), penggunaan zeolit sebagai pemodifikasi EPK dapat meningkatkan puncak oksidasi dan reduksi.

EPK yang telah diimobilisasi dengan sel E. coli dengan dan tanpa zeolit dibandingkan stabilitasnya ketika disimpan pada suhu kamar dan pada suhu 4 ºC, yaitu kondisi penyimpanan saat tidak digunakan dengan direndam dalam larutan NaCl 0.85%, keadaan yang sama dengan lingkungan sel E. coli. Kestabilan aktivitas GDH E. coli diamati dari puncak anode yang dihasilkan selama 24 jam setiap 2 jam.

Stabilitas aktivitas GDH sel E. coli pada jam ke-0 dianggap 100%. Setelah 2 jam, aktivitas GDH pada elektrode yang disimpan di suhu ruang turun menjadi 85.5% (tanpa zeolit) dan 73.8% (dengan zeolit) (Lampiran 6). Penurunan aktivitas ini diperlambat pada suhu 4 ºC, menjadi berturut-turut 89.7% dan 78% (Lampiran 7). Setelah jam ke-2, aktivitas GDH E. coli pada suhu ruang cenderung stabil hingga di jam ke-18 (dengan zeolit) dan jam ke-16 (tanpa zeolit), kemudian turun pada jam ke-24 berturut-turut menjadi 41.9 dan 24.4%. Pada suhu 4 ºC, stabilitas aktivitas GDH E. coli bertahan lebih lama hingga di jam ke-20 (dengan zeolit) dan jam ke-18 (tanpa zeolit), lalu turun hingga 58.1 dan 36.6% setelah 24 jam (Gambar 12). Berdasarkan hasil tersebut, suhu ruang lebih menurunkan stabilitas aktivitas GDH E. coli dibandingkan dengan suhu 4 ºC. Trivadila (2006)

14

melaporkan penurunan aktivitas GDH E. coli setelah 6 jam. Arslan et al. (2011) dengan cara penjebakan masih memberikan aktivitas GDH 19.4% setelah 40 hari. Menurut Herawati (2012), setelah 3 jam GDH E. coli terimobilisasi tanpa zeolit tidak lagi menghasilkan puncak arus oksidasi, sedangkan dengan zeolit masih dihasilkan puncak arus oksidasi hingga 48 jam. Gia (2012) melaporkan penurunan aktivitas GDH sel E. coli setelah 7 hari karena adanya matriks taut-silang dari glutaraldehida. Kestabilan yang lebih rendah dapat disebabkan sel E. coli hanya terjerap pada pori-pori zeolit tanpa mengalami taut-silang seperti dengan glutaraldehida. Selain itu, perbedaan ukuran memungkinkan penjerapan molekul dari berbagai ukuran. Akibatnya sel E. coli yang sudah terjerap tidak akan bertahan terlalu lama. Penelitian ini menunjukkan potensi zeolit alam dari Cikembar sebagai material pengimobilisasi enzim GDH E. coli untuk biosensor glukosa.

Gambar 12 Kestabilan aktivitas GDH sel E. coli. dengan zeolit, 4 ºC; tanpa zeolit, 4 ºC; dengan zeolit, suhu ruang; tanpa

zeolit, suhu ruang

SIMPULAN DAN SARAN

Zeolit alam (Cikembar, Sukabumi) dapat digunakan sebagai material pengimobilisasi enzim GDH dari isolat bakteri E. coli ATC25922 pada permukaan elektrode pasta karbon sebagai biosensor glukosa. Aktivitas GDH terimobilisasi zeolit meningkat dibandingkan dengan tanpa zeolit dan aktivitas tersebut lebih stabil pada suhu 4 ºC dibandingkan dengan pada suhu kamar. Nilai KMapp yang dihasilkan enzim GDH terimobilisasi dengan zeolit lebih kecil daripada tanpa zeolit yang menyatakan bahwa afinitasnya lebih tinggi terhadap substrat glukosa. Akan tetapi, afinitas dan stabilitas tersebut masih rendah atau belum maksimum.

Masih perlu dilakukan optimisasi jumlah enzim GDH sel E. coli yang diimobilisasi, penggunaan matriks taut-silang, serta validasi metode seperti keterulangan, ketepatan, dan limit deteksi. Setelah itu, dilakukan pengujian secara langsung pada alat biosensor glukosa berbasis E. coli.

15

DAFTAR PUSTAKA

Arif Z. 2011. Karakterisasi dan modifikasi zeolit alam sebagai bahan media pendeteksi studi kasus: kromium heksavalen [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Arslan F, Ustabas S, Arslan H. 2011. An amperometric biosensor for glucose determination prepared from glucose oxidase immobilized in polyaniline-polyvinylsulfonate film. Sensors 11:8152-8163.

Balal K, Mohammad H, Bahareh B, Ali B, Maryam H, Mozhgan Z. 2009. Zeolite nanoparticle modified carbon paste electrode as a biosensor for simultaneous determination of dopamine and tryptophan. J Chin Chem. 56:789-796.

Bhatia R, Gupta AK, Anup KS, Brinker CJ. 2000. Aqueous sol-gel process for protein encapsulation. Chem Mat. 12:2434-2441.

Bisswanger H. 2008. Enzyme Kinetics Principles and Methods. Weinheim (DE): Wiley-VCH.

Borgmann S, Schulte A, Neugebauer S, Schuhmann W. 2011. Amperometric Biosensors. Weinheim (DE): Wiley-VCH.

Campanella L, Bonanni A, Bellantoni D, Favero G, Tomassetti M. 2004. Comparison of fluorometric, voltammetric and biosensor methods for the determination of total antioxidant capacity of drug products containing acetylsalicylic acid. J Pharm Biomed Anal. 36:91-99.

Dai Z, Liu S, Ju H. 2004. Direct electron transfer of cytochrome c immobilized on a NaY zeolite matrix and its application in biosensing. Electrochem Acta. 49:2139-2144.

Gia LL. 2012. Aktivitas dan stabilitas biosensor glukosa berbasis Escherichia coli yang diimobilisasi pada zeolit-glutaraldehida [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Goriushkina TB, Kurc BA, Sacco A, Dzyadevych SV. 2010. Application of zeolites for glucose oxidase in amperometric biosensors. Sensor Electronics & Microsyst Technol. 1:36-42.

Grieshaber D, Mackenzie R, Voros J, Reimhult E. 2008. Electrochemical biosensor-sensor principles and architectures. Sensor. 8:1400-1458.

Gunawan B. 2010. Aplikasi Sensor Kimia sebagai Biosensor Berbasis DNA. Kudus (ID): Mawas

Hasanah MU. 2012. Komposit oksida besi magnetit-zeolit Cikembar sebagai adsorben Cr(III) dan Cr(VI) [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Hattu N. 2009. Studi voltametri dan analisis antihistamin setrizin dihidroklorida dan deksklorfeniramin maleat dalam medium surfaktan menggunakan elektroda pasta karbon [disertasi]. Bandung (ID): Institut Teknologi Bandung.

Herawati D. 2012. Stabilitas dan efektivitas biosensor glukosa berbasis Escherichia coli yang diimobilisasi pada matriks nanokomposit zeolit [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Hiratsuka A., Fujisawa K., Muguruma H. 2008. Amperometric biosensor based on glucose dehydrogenase and plasma-polymerized thin films. Anal Sci. 24:483-486.

16

Ikeda T, Iswantini D, Ito Y, Kano K. 2001. Electrochemical analysis of glucose dehydrogenase activity exhibited by Escherichia coli cell. Anal Sci. 17:285-286.

Iswantini D, Kano K, Ikeda T. 2000. Kinetics and thermodynamics of activation of quinoprotein apoenzyme in vivo and catalytic activity of the activated enzyme in Escherecia coli cells. Biochem J. 350:917-923.

Iswantini D, Nurhidayat N, Trivadila. 2011. Glucose biosensor using selected Indonesian bacteria. Microbiol Indones. 5:9-14.

Marlina. 2008. Identifikasi bakteri Vibrio parahaemolitycus dengan metode biologi dan deteksi gen ToxR secara PCR. J Sains Teknol Farm. 13:1-7.

Mateo C, Palomo JM, Fernandez-Lorente G, Guisan JM, Fernandez-Lafuente R. 2007. Improvement of enzyme activity, stability and selectivity via immobilization techniques. J Enzmictec. 40:1451-1463.

Nazaruddin. 2007. Biosensor urea berbasis biopolimer kitin sebagai matriks imobilisasi. J Rekayasa Kim Lingkungan. 6:41-44.

Saiapina OY, Pyeshkova VM, Soldatkin OO, Melnik VG, Akata Kurc B, Walcarius A, Dzyadevych SV, Jaffrezic-Renault N. 2011. Conductometric enzyme biosensors based on natural zeolite clinoptilolite for urea determination. Mat Sci Eng. 31:1490-1497.

Sari MI. 2007. Reaksi-reaksi biokimia sebagai sumber glukosa darah [tesis]. Medan (ID): Universitas Sumatera Utara.

Shofyan. 2010. Escherichia coli [Internet]. [diunduh 2012 Apr 1]; Tersedia pada: http://forum.upi.edu/index.php?topic=15614.0.

Trivadila. 2011. Biosensor antioksidan menggunakan superoksida dismutase Deinococcus radiodurans yang diimobilisasi pada permukaan elektrode pasta karbon dan parameter kinetikanya [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Trivadila. 2006. Aktivitas glukosa dehidrogenase pada tiga isolat bakteri Indonesia terpilih yang diimobilisasi untuk pengembangan biosensor glukosa [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Turner APF. 1996. Biosensor past, present and future [Internet]. [diunduh 2012 Apr 1]; Tersedia pada: http://www.cranfield.ac.uk/biotech/chinap.htm.

Valdes MG, Perez-Cordoves AI, Diaz-Garcia ME. 2006. Zeolites and zeolite based materials in analytical chemistry. J Trends Anal Chem. 25:24-30.

Wang JH, Zhou CM, Peng F, Yu H. 2007. Glucose biosensor based on platinum nanoparticles supported sulfonated-carbon nanotubes modified glassy carbon electrode. Electrochemistry. 2:508-516.

Weniarti. 2011. Biosensor antioksidan berbasis superoksida dismutase Deinococcus radiodurans diimobilisasi pada nanokomposit zeolit alam Indonesia [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Widianti T. 2006. Pengujian Kapasitas Tukar Kation Zeolit sebagai Penukar Kation Alami untuk Pengolahan Limbah Industri. Tangerang (ID): LIPI.

Witarto AB. 2007. Rekayasa protein enzim PQQ glucose dehydrogenase untuk alat pengukur gula darah. Inovasi. 9:61-68.

Yoshida H, Kojima K, Witarto AB, Sode K 1999. Engineering a chimeric pyrroloquinoline quinone glucose dehydrogenase: improvement of EDTA tolerance thermal stability and specifity. Prot Eng. 12:63-70.

17

Lampiran 1 Bagan alir umum penelitian

Penanaman dan peremajaan bakteri E. coli

Pemanenan bakteri E. coli

Pembuatan EPK Aktivasi zeolit

Imobilisasi enzim GDH sel E. coli

Pengoptimuman aktivitas enzim

Penentuan parameter kinetika enzim

Pengujian stabilitas aktivitas enzim

18

Lampiran 2 Optimisasi aktivitas GDH sel E. coli terimobilisasi

Suhu pH [Glukosa] (mM)

[PQQ] (µM)

Zeolit (mg) Ip (µA)

25 6 10.375 1.575 190 1.650 35 6 10.375 1.575 70 0.276 25 8 10.375 1.575 70 0.520 35 8 10.375 1.575 190 1.470 25 6 30.125 1.575 70 0.650 35 6 30.125 1.575 190 1.505 25 8 30.125 1.575 190 1.680 35 8 30.125 1.575 70 1.333 25 6 10.375 4.525 70 1.390 35 6 10.375 4.525 190 6.120 25 8 10.375 4.525 190 1.720 35 8 10.375 4.525 70 1.745 25 6 30.125 4.525 190 6.168 35 6 30.125 4.525 70 1.760 25 8 30.125 4.525 70 1.930 35 8 30.125 4.525 190 2.158 20 7 20.250 3.050 130 1.990 40 7 20.250 3.050 130 3.250 30 5 20.250 3.050 130 1.960 30 9 20.250 3.050 130 2.731 30 7 0.500 3.050 130 1.970 30 7 40.000 3.050 130 2.455 30 7 20.250 0.100 130 3.011 30 7 20.250 6.000 130 3.260 30 7 20.250 3.050 10 2.940 30 7 20.250 3.050 250 6.951 30 7 20.250 3.050 130 3.655 30 7 20.250 3.050 130 3.325 30 7 20.250 3.050 130 3.650 30 7 20.250 3.050 130 4.678 30 7 20.250 3.050 130 4.975 30 7 20.250 3.050 130 5.568

Optimum pada suhu 30 ºC, pH 7, [glukosa] 20.250 mM, [PQQ] 4.525 µM, dan zeolit 250 mg.

19

Lampiran 3 Aktivitas GDH E. coli pada berbagai konsentrasi substrat

[Glukosa] (mM) Ip (µA) Dengan zeolit Tanpa zeolit

5 0.456 0.243 10 0.605 0.368 15 0.701 0.413 20 0.766 0.476 25 0.793 0.491 30 0.883 0.495 35 0.905 0.501 40 0.973 0.551 45 0.988 0.663 50 1.091 0.726 55 1.268 0.848 60 1.371 1.006 65 0.988 1.285 70 0.525 0.341

20

Lampiran 4 Kinetika enzim GDH E. coli terimobilisasi zeolit [Glukosa]

(mM) Ip (µA) 1/[Glukosa] (mM-1)

1/ Ip (µA-1)

[Glukosa]/ Ip (mM/µA)

Ip /[Glukosa] (µA/mM)

5 0.456 0.200 2.189 10.948 0.091 10 0.605 0.100 1.652 16.528 0.060 15 0.701 0.066 1.425 21.376 0.046 20 0.766 0.050 1.304 26.085 0.038 25 0.793 0.040 1.260 31.513 0.031 30 0.883 0.033 1.132 33.963 0.029 35 0.905 0.028 1.105 38.674 0.025 40 0.973 0.025 1.027 41.097 0.024 45 0.988 0.022 1.011 45.532 0.022 50 1.091 0.020 0.916 45.800 0.021 55 1.268 0.018 0.788 43.365 0.023 60 1.371 0.016 0.729 43.741 0.022

(a) (b) (c)

Alur Lineweaver-Burk (a), Hanes (b), dan Eadie-Hofstee (c) Kinetika enzim GDH sel bakteri E. coli terimobilisasi mengikuti alur Lineweaver-Burk:

Asumsi Imaks app = vmaks app dan berdasarkan persamaan garis y = 7.3446x + 0.8319, maka :

maka Imaks app = 1.202

maka KMapp = 8.828

21

Lampiran 5 Kinetika enzim GDH E. coli terimobilisasi tanpa zeolit

[Glukosa] (mM) Ip (µA) 1/[Glukosa]

(mM-1) 1/ Ip

(µA-1) [Glukosa]/ Ip

(mM/µA) Ip /[Glukosa]

(µA/mM) 5 0.243 0.200 4.110 20.550 0.048 10 0.368 0.100 2.715 27.151 0.036 15 0.413 0.066 2.419 36.293 0.027 20 0.476 0.050 2.100 41.999 0.023 25 0.491 0.040 2.033 50.844 0.019 30 0.495 0.033 2.020 60.606 0.016 35 0.501 0.028 1.993 69.762 0.014 40 0.551 0.025 1.812 72.503 0.013 45 0.663 0.022 1.507 67.842 0.014 50 0.726 0.020 1.376 68.804 0.014 55 0.848 0.018 1.178 64.835 0.015 60 1.006 0.016 0.993 59.600 0.016

(a) (b) (c)

Alur Lineweaver Burk (a), Hanes (b), dan Eadie-Hofstee (c) Kinetika enzim GDH sel bajteri E. coli terimobilisasi mengikuti alur Lineweaver- Burk:

Asumsi I maks app = vM app dan berdasarkan persamaan garis y = 14.9205x + 1.2499, maka :

maka Imaks app = 0.800

maka KMapp = 11.937

22

Lampiran 6 Stabilitas aktivitas GDH E. coli imobilisasi pada suhu kamar

Waktu (jam)

Aktivitas GDH E. coli Dengan Zeolit Tanpa Zeolit

Ip (A) (%) Ip (A) (%) 0 1.483 100.00 1.298 100.00 2 1.268 85.51 0.958 73.81 4 1.191 80.34 0.928 71.50 6 1.178 79.44 0.920 70.86 8 1.151 77.64 0.863 66.49 10 1.106 74.61 0.845 65.09 12 1.045 70.45 0.831 64.06 14 0.965 65.06 0.773 59.56 16 0.938 63.26 0.748 57.64 18 0.906 61.12 0.640 49.30 20 0.725 48.88 0.456 35.18 22 0.721 48.65 0.325 25.03 24 0.621 41.91 0.316 24.39

Lampiran 7 Stabilitas aktivitas GDH E. coli imobilisasi pada suhu 4 ºC

Waktu (jam)

Aktivitas GDH E. coli Dengan Zeolit Tanpa Zeolit

Ip (A) (%) Ip (A) (%) 0 2.025 100.00 1.303 100.00 2 1.816 89.71 1.016 78.01 4 1.793 88.56 0.958 73.53 6 1.780 87.90 0.955 73.28 8 1.720 84.94 0.921 70.72 10 1.678 82.88 0.918 70.46 12 1.560 77.04 0.868 66.62 14 1.510 74.57 0.813 62.40 16 1.478 73.00 0.783 60.10 18 1.388 68.56 0.738 56.65 20 1.366 67.49 0.513 39.38 22 1.218 60.16 0.501 38.49 24 1.176 58.11 0.476 36.58

23

RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di kota Sukabumi, Jawa Barat pada tanggal 17 Juni 1989.

Penulis merupakan anak pertama dari 2 bersaudara pasangan Ir Tata R Taswanda dan Tini Herawati.

Tahun 2007 penulis lulus dari SMA Negeri 1 Cisaat Sukabumi dan pada tahun yang sama diterima di Program Keahlian Analisis Kimia, Direktorat Program Diploma Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis lulus pada tahun 2010 dan melanjutkan ke Program Alih Jenis Departemen Kimia IPB.

Tahun 2010 penulis melaksanakan kegiatan praktik kerja lapangan di Balai Besar Pengembangan Budidaya Air Tawar (BBPBAT), Sukabumi dengan judul laporan “Validasi Metode Penentuan Residu Ciprofloxacin Sampel Udang secara ELISA”. Penulis pernah menjadi asisten praktikum Kimia Anorganik pada tahun 2010/2011; Kimia Industri pada tahun 2010/2011; Analisis Komponen Aktif dan Uji Aktivitas pada tahun 2010/2011; Kepustakaan Kimia pada tahun 2010/2012, serta Keselamatan Kerja dan Pengenalan Bahan pada tahun 2011/2012, di D3 Analisis Kimia IPB.