Microorganismos benéficos en la industria alimentaria 2013-1
AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS BENÉFICOS DEL SUE
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AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS BENÉFICOS DEL
SUELO DE LA GRANJA FAZ - UNP
Elera Ojeda Rosario Nelly1 Guerra Delgado Marco Sergio1 , 1Docentes de la Escuela Profesional de Medicina Veterinaria. Facultad de Zootecnia. UNP
[email protected]; [email protected]
MODALIDAD POSTER
RESUMEN
El presente trabajo de investigación tuvo como objetivo iniciar estudios de aislamiento de
microorganismos con actividades enzimáticas de interés industrial con capacidad amilolítica,
lipolítica, antimicrobiana y capacidad de síntesis de melanina a partir de una muestra de suelo
de la granja FAZ-UNP. El método microbiológico empleado constó de cinco etapas: (i)
dilución de la muestra; (ii) cultivo en medios de cultivo generales; (iii) cultivo en medios
específicos, para la selección de grupos de organismos; (iv) conteo; e (v) identificación
taxonómica, mediante la evaluación de parámetros bioquímicos, como la fermentación de
diferentes substratos. Para el aislamiento de las cepas amilolíticas se utilizaron medios
modificados con almidón y la positividad frente al test de lugol, utilizando medios CZAPEK,
PCA (plate count agar) y MRS (Man Rogosa Sharpe). Las cepas amilolíticas fueron
identificadas, purificadas y crío conservadas, obteniendo un total de 100 cepas nativas, de
estas, 9 cepas pertenecieron a los géneros Bacillus sp ,Clostridium sp y Kurthia sp. Se
recuperaron tres cepas correspondientes a Bacillus megatherium, Bacillus licheniformis y
Brevibacterium sp. con actividad celulolítica. Los microorganismos mostraron 88,6% de
actividad para degradar materia orgánica a las 36 horas. La capacidad lipolítica no pudo ser
detectada en los microorganismos aislados. La capacidad de síntesis de melanina se encontró
en: Aeromonas, Mycobacterium leprae, Bacillus, Pseudomonas aeruginosa, P. putida,
Streptomyces antibioticus, Fasciola gigantita, Aspergillus niger, Candida albicans, Exophiala
(Wangiella) dermatitidis y Penicillium marneffei. Los hongos que sintetizan melanina son
resistentes a algunos antimicóticos como Aspergillus niger resistente a la Anfotericina B,
Candida albicans y Exophiala dermatitidis, resistentes a la Anfotericina B y Fluconazol y
Penicillum marneffei resistente a seis antimicóticos; mientras que las bacterias y helminto,
productores de melanina, encontrados mostraron ser sensibles a diferentes antimicrobianos y
antiparasitarios, respectivamente.
Palabras claves: suelo, Bacillus, Clostridium, Kurthia sp. amilolíticas, lipolítica, melanina.
ABSTRACT
This research work was to begin these studies of isolation of enzymatic activities of industrial
interest with capability amilolític, lipolytic, antimicrobial and capacity for synthesis of
melanin of a sample of the FAZ-UNP farm soil micro-organisms.The microbiological method
consisted of five stages: (i) the sample dilution; (ii) culture media general culture, providing
the conditions for growth for all micro-organisms of the sample; (iii) cultivation in specific
medias for selecting groups of organisms; (iv) count; and (v) taxonomic identification through
a review of biochemical parameters, as the fermentation of different substrates. For the
isolation of amilolítics strains were growth on starch modified media and positivity to lugol
test using CZAPEK, PCA (plate count agar) and modified MRS (Man, Rogosa, Sharpe)
medias. Strains obtained amilolítics were duly purified, kid preserved and identified
biochemically, obtaining a total of 100 native strains, 9 strains belonging to the genus Bacillus
sp, Clostridium sp. and Kurthia sp. Also recovered three strains for Bacillus megatherium,
Bacillus licheniformis and Brevibacterium sp. with celulolític activity. Fixed
microorganisms were 88,6% of activity to degrade organic matter to 36 hours. Lipolytic
capacity could not be detected in the isolated microorganisms. Melanin synthesis capacity was
found in: Aeromonas, Mycobacterium leprae, Bacillus, Pseudomonas aeruginosa, P. putida,:
Streptomyces antibioticus, Fasciola gigantita and fungis, Aspergillus niger, Candida
albicans, Exophiala (Wangiella) dermatitidis, Penicillium marneffei. The fungi synthesized
melanin are resistant to some antifungals such as Aspergillus niger resistant to Amphotericin
B, Candida albicans and Exophiala dermatitidis, resistant to Amphotericin B and fluconazole
and Penicillum marneffei resistant six antifungal; while bacteria and helminth, producing
melanin, found were shown to be sensitive to different antimicrobials and anti-parasitary,
respectively.
key words: soil, Bacillus, Clostridium, Kurthia sp. amilolítics, lipolytic, melanin.
INTRODUCCIÓN
Algunas de las enzimas extracelulares producidas por los microorganismos son usadas en la
industria farmacéutica, alimenticia y textil. Estas actividades enzimáticas son: La amilolítica;
que la produce la enzima amilasa y tiene diversas funciones industriales tanto en el área
alimenticia como en la producción de combustibles. Los usos más importantes son: La
obtención de jarabes de maltosa y glucosa, obtención de fructosa a través de la hidrólisis del
almidón. La actividad lipolítica degrada lípidos, la cual sirve para la creación de detergentes y
mejor absorción de grasas. La síntesis de melanina, es útil en proyectos genéticos para
solucionar casos en los que éste pigmento no es producido por el individuo o su síntesis es
alterada, se usa sobre todo en la cosmetología, en cremas bloqueadoras y bronceadoras. La
actividad antimicrobiana es usada en la producción de medicamentos en el área farmacéutica.
De las enzimas microbianas también se obtienen los antibióticos que matan o inhiben el
crecimiento de otros organismos y se emplean como tratamiento de enfermedades infecciosas.
Los antibióticos comerciales útiles están producidos primordialmente por hongos
filamentosos y bacterias del grupo de los actinomicetos (Gonzalez y col. 2005).
En países latinoamericanos cuya biodiversidad microbiana del suelo se desconoce, así como
las alteraciones provocadas por el impacto ambiental, en un escenario de trabajo con recursos
e infraestructura limitada; los estudios de la calidad del suelo, a través de la evaluación de las
alteraciones en la estructura de los ecosistemas microbianos, deberían iniciarse, con el objeto
de registrar dicha biodiversidad, en términos taxonómicos. Porque en un futuro no muy lejano
esta será una nueva forma de valoración económica de los suelos, dada su potencialidad en
recursos biotecnológicos. Los cuales sólo podrán ser capitalizados por cada país si son
estudiados en un contexto nacional y no por empresas transnacionales. El suelo representa la
fuente más importante de microorganismos benéficos y se estima que sólo el 1% de los
microorganismos presentes en este ambiente han sido aislados y caracterizados. A partir de
éstos se han identificado especies capaces de producir compuestos de interés industrial.
Es por ello que este trabajo de investigación tuvo como objetivo iniciar estos estudios de
aislamiento de microorganismos con actividades enzimáticas de interés industrial con
capacidad amilolítica, lipolítica, antimicrobiana y capacidad de síntesis de melanina a partir
de una muestra de suelo del Centro Productivo de la Granja de la Facultad de Zootecnia de la
Universidad Nacional de Piura.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se eligieron 7 muestras al azar del exterior de los corrales. El aislamiento e identificación de
los microorganismos de las muestras de suelo tomadas del Centro Productivo de la granja de
la Facultad de Zootecnia de la Universidad Nacional de Piura.se realizó en el laboratorio de
Nutrición Fisiológica de la misma Facultad y Universidad.
El método microbiológico desarrollado en el estudio del suelo constó de siete etapas: En la
primera se tomaron aproximadamente 100 g.de muestras de suelo con guante estéril,
previamente identificadas; en la segunda, se realizaron diluciones seriadas y plaqueo en agar
nutritivo, se incubaron a 30ºC por 24 horas hasta observar crecimiento. A partir del
crecimiento en placas se procedió a realizar el conteo de las colonias que aparecieron en las
cuadrículas del Counter coult de Queboc. En la tercera, se aislaron 100 colonias a partir de las
muestras por dilución y se sembraron en agar nutritivo por el método de estrías sobre agar. En
la cuarta, se subcultivó las muestras de suelo sembradas e incubadas inicialmente en Caldo
triptosa (medio de cultivo de enriquecimiento) en agar común. En la quinta, se sembró en
medios selectivos, para la selección de grupos de organismos se obtuvieron un banco de 100
colonias que se evaluaron en estos medios de cultivo selectivos, para la detección de las
actividades de interés industrial. En la sexta etapa, se realizó la identificación taxonómica
mediante la evaluación de parámetros bioquímicos, como la fermentación de diferentes
substratos evaluándose: la actividad amilolítica en el medio agar nutritivo con almidón
soluble al 1%, la actividad lipolítica en medio agar con aceite de oliva al 1% emulsificado, la
actividad antimicrobiana contra una bacteria Gram-positiva, la síntesis de melanina: agar con
tirosina y sulfato de cobre, la capacidad enzimática, usando un sustrato y la enzima, con el fin
de identificar los microorganismos con la mayor capacidad enzimática. Finalmente se
conservaron las cepas obtenidas, previa confirmación de su pureza.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
100 cepas tuvieron actividad amilolítica interesante con almidón y la positividad frente al test
de lugol. La actividad lipolítica salió negativa, pero con actividad de síntesis de melanina
positiva. Se seleccionaron 9 para su respectiva identificación, las cuales se presentan en la
Tabla 1.
Tabla 1. Selección de algunas cepas amilolíticas aisladas de la granja FAZ-UNP
Nº de
colonias
Descripción Lugol Tipo de M.O
1 Colonias irregulares, amarillas en forma
de abanico
+ Bacilos grampositivos
20 Colonias regulares, medianas, blancas y
brillantes
+ Bacilos grampositivos
41 Colonias medianas, planas, regulares y
blancas
+ Bacilos grampositivos
73 Colonias pequeñas, blancas y cremosas + Bacilos gramnegativos
113 Colonias irregulares, pequeñas y blancas + Bacilos grampositivos
119 Colonias regulares, brillantes y cremosas + Bacilos grampositivos
121 Colonias irregulares, grandes y blancas + Bacilos gramnegativos
130 Colonias irregulares, medianas y blancas + Bacilos gramnegativos
166 Colonias regulares, medianas y cremosas + Bacilos gramnegativos
Las cepas amilolíticas pertenecían a los géneros Bacillus sp, Clostridium sp y Kurthia sp.,
siendo el primero el más predominante dentro de las cepas seleccionadas.
Tabla 2: Clasificación de las cepas amilolíticas seleccionadas según género.
Nº de coloniaPruebas bioquímicas
Género
Oxidasa Catalasa Citrato SIM TSI
1 - + + - + Bacillus sp.
20 - + + + + Bacillus sp.
41 - + - + + Bacillus sp.
73 - + + - + Bacillus sp.
113 - + - + - Kurthia sp.
119 - + + + + Bacillus sp.
121 - - + + - Clostridium sp.
130 - + + + - Bacillus sp.
166 + + + + + Bacillus sp.
Las bacterias mas abundantes en el suelo son pequeños bacilos cocoides de morfología
variable, que dan lugar a pequeñas colonias en medios con agar. En los cultivos jóvenes
predominan los bacilos Gramnegativos, mientras que en cultivos viejos sobre sustrato
favorable, el predominio es de cocos Grampositivos (Sánchez y col, 2005).
Winogradsky clasificó los microorganismos del suelo en autóctonos o indígenas y zimógenos
o fermentadores. Los zimógenos suelen ser escasos y florecen abundantemente cuando se
añade una determinada cantidad de materia orgánica y luego desaparecen al terminarse ésta
(García, 2005).
Las bacterias del suelo son extremadamente resistentes a la sequía, desaparecen las formas
vegetativas pero se mantienen las formas esporuladas. Azotobacter sobrevive tras 30 años de
almacenamiento en seco. Los suelos húmedos son desfavorables para muchas bacterias. El
factor restrictivo es el oxígeno y no el exceso de agua (Sullivan, 2007).
Las temperaturas óptimas para el desarrollo bacteriano se encuentran situadas entre los 25-35º
C. La escala de pH que normalmente toleran las bacterias es la comprendida entre los valores
de 4 y 10. En suelos ácidos los hongos se desenvuelven mejor y la competencia por el
alimento hace descender el número de bacterias. Durante el verano seco y cálido baja la
población microbiana, mientras que en otoño aumenta otra vez; en invierno queda inactiva y
se reanima en la primavera (Sullivan, 2007).
Las modificaciones de la fuente de carbono del medio estándar seleccionado utilizando
almidón, glucosa y dextrina en una cantidad de 1 g/L permitieron establecer que el
comportamiento de las cepas seleccionadas cuando utilizamos un medio de cultivo con
almidón o dextrina como fuente de carbono es similar a la obtenidas por Sánchez y col.
(2005); quiénes realizaron la electroforesis de las muestras de fermentaciones realizadas,
observando que las proteínas presentes en el medio de cultivo modificado con almidón son
exactamente las mismas que se expresan en el medio de cultivo modificado con dextrina.
Existen muchos factores como la temperatura, la deshidratación, la purificación, la
congelación etc., que pueden desnaturalizar las proteínas y enzimas. La actividad de las
enzimas depende de la concentración de éstas en el medio fermentado. Sin embargo, los
protocolos utilizados para la determinación de las actividades, tanto, de amiloglucosidasa
como alfaamilasa requieren de una concentración mínima de enzimas para llevar a cabo con
éxito la cuantificación del microorganismo, y que estimulen la expresión de la enzima
amilolítica AMG (Sánchez y col., 2005).
Otras bacterias abundantes del suelo son los bacilos esporulados, que constituyen usualmente
un 25% del total. Los correspondientes al género Bacillus alcanzan valores medios en suelos
del 15 %. Las bacterias nitrificantes como Nitrosomonas y Nitrobacter también se encontraron
y representan menos del 1 % de la población. Se recuperaron también tres cepas
correspondientes a Bacillus megatherium, Bacillus licheniformis y Brevibacterium sp. con
actividad celulolítica. Los microorganismos inmovilizados mostraron 88,6% de actividad para
degradar materia orgánica a las 36 horas. La actividad de las enzimas depende de la
concentración de éstas en el medio fermentado.
La melanina es responsable de la coloración de plantas y animales; se encuentra en los ojos, el
cabello, la piel, el plumaje, la cáscara de los huevos, la cutícula de los insectos, la tinta de los
cefalópodos, en la pared y citoplasma de microorganismos. En los humanos tambíén se ha
encontrado en neuronas y hepatocitos. En la tabla 3, se listan los MO encontrados.
Tabla 3. Síntesis de melanina de microorganismos aislados del suelo de la granja FAZ-
UNP
Tipo de MO Nº encontrado
Aeromonas 63
Mycobacterium leprae 68
Bacillus 70
Pseudomonas aeruginosa, P. putida 72
Streptomyces antibioticus, 96
Fasciola gigantita 5
Aspergillus niger 202
Candida albicans 151
Exophiala (Wangiella) dermatitidis 11
Penicillium marneffei 15
Tabla 4. Resistencia a los antimicóticos, inducida por diferentes tipos de hongos productores
de melanina.
Microorganismo Antifúngico
Aspergillus niger Anfotericina B
Candida albicans Anfotericina B, Fluconazol
Exophiala (Wangiella) dermatitidis Anfotericina B, Fluconazol
Penicillium marneffei Anfotericina B, Fluconazol, Ketoconazol,
Itraconazol, Miconazol, Flucitosina
La presencia de melanina en muchos microorganismos genera mayor resistencia a los
compuestos antimicrobianos y principalmente a los antimicóticos. En el presente estudio se ha
encontrado que los hongos que sintetizan melanina son resistentes a algunos antimicóticos
como es el caso de Aspergillus niger resistente a la Anfotericina B, Candida albicans y
Exophiala dermatitidis, resistentes a la Anfotericina B y Fluconazol y Penicillum marneffei
resistente a seis antimicóticos (Tabla 4); mientras que las bacterias, protozoos y helmintos
mostraron ser sensibles a diferentes antimicrobianos y antiparasitarios, respectivamente
Uran (2008) encontró que, en general, las células melánicas presentaban menor
susceptibilidad que las células nativas (no melánicas) a antimicóticos como ketoconazol,
fluconazol, itraconazol, sulfametazol y anfotericina B; esta última es el antimicótico menos
efectivo sobre las células melánicas, dando dos explicaciones para estos resultados: una, que
la melanina disminuye la permeabilidad de la pared celular, o dos, que la melanina disminuye
el daño de la membrana celular causado por los medicamentos. Sin embargo, no todos ellos
parecen ser resistentes, como es el caso de E. dermatitidis en el que la presencia o ausencia de
melanina no interfiere con la actividad antimicótica.
Finalmente, Gonzáles y col. (2005) han propuesto un modelo de cómo la melanina presente
en la pared de C. neoformans, uno de los hongos más estudiados en este aspecto, forma una
especie de malla que puede presentar dos tipos de poros, unos pequeños que permitirían el
paso de moléculas hasta del tamaño de los anticuerpos y otros que serían inaccesibles para
moléculas de tamaños mayores como los antimicóticos.
El método microbiológico clásico que se empleó en este estudio del suelo, originalmente
desarrollado para muestras acuosas, constó de cinco etapas: (i) dilución de la muestra; (ii)
cultivo en medios de cultivo generales, que proporcionan las condiciones de crecimiento para
todos los microorganismos de la muestra; (iii) cultivo en medios específicos, para la selección
de grupos de organismos; (iv) conteo; e (v) identificación taxonómica, mediante la
evaluación de parámetros bioquímicos, como la fermentación de diferentes substratos
(Parkinson et al., 1971; Schinner et al., 1996). Su empleo en el estudio de suelos se realizó
con ciertos reparos, ya que se asumía que sus premisas no se cumplían totalmente. Primero,
porque el supuesto de una dilución homogénea de la muestra en el caso de los suelos es irreal,
ya que nunca se logra alcanzar dicha condición; segundo, debido a que los organismos están
estrechamente unidos a las partículas del suelo, no se puede lograr una dilución representativa
de todas las especies; y tercero, las condiciones del medio de cultivo general, no aseguran el
crecimiento de todos los microorganismos presentes en la muestra de suelo, ya que las
condiciones aeróbicas, así como las concentraciones de los substratos, no son las óptimas
para todas las comunidades microbianas.
CONCLUSIONES
Se logró obtener un cepario de 100 cepas amilolíticas, de las cuales 9 presentaron mayor
actividad amilolítica y pertenecen a los géneros Bacillus sp , Clostridium sp y Kurthia sp. Se
recuperaron también tres cepas correspondientes a Bacillus megatherium, Bacillus
licheniformis y Brevibacterium sp. con actividad celulolítica, lo cuales degradaron la materia
orgánica a las 36 horas. La capacidad lipolítica no pudo ser detectada en los microorganismos
aislados.
La capacidad de síntesis de melanina se encontró en las bacterias: Aeromonas,
Mycobacterium leprae, Bacillus, Pseudomonas aeruginosa, P. putida, Streptomyces
antibioticus, en el helminto: Fasciola gigantita y en los hongos: Aspergillus niger, Candida
albicans, Exophiala (Wangiella) dermatitidis, Penicillium marneffei. Se ha encontrado que
los hongos que sintetizan melanina son resistentes a algunos antimicóticos como Aspergillus
niger resistente a la Anfotericina B, Candida albicans y Exophiala dermatitidis, resistentes a
la Anfotericina B y Fluconazol y Penicillum marneffei resistente a seis antimicóticos;
mientras que las bacterias, protozoos y helmintos, productores de melanina, encontrados
mostraron ser sensibles a diferentes antimicrobianos y antiparasitarios, respectivamente
Los microorganismos que se lograron aislar del suelo de la granja FAZ-UNP no causan
ningún peligro al medio ambiente, ni a los seres humanos y animales. Estos microbios
benéficos consumen las sustancias que causan la putrefacción, malos olores y enfermedades,
eliminando la mayoría de microbios patógenos por medio de la exclusión competitiva.
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Inglés: © NCAT 2004.Español: © NCAT 2007.