AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR Y BIOLÓGICA …

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AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIOacuteN MOLECULAR Y BIOLOacuteGICA DE CEPAS NATIVAS DE Bacillus thuringiensis PARA EL CONTROL DE

Tuta absoluta (Meyrick Lepidoptera Gelechiidae) INSECTO PLAGA DEL TO-MATE (Lycopersicon esculentum)

Recibido Septiembre 10 de 2009Aceptado Marzo 15 de 2010

Correspondencia del autor Universidad Jorge Tadeo Lozano javierhernandezutadeoeduco

RESUMEN

Se recolectaron 28 muestras de suelo en 14 municipios en Colombia Se aislaron bacilos esporulados que se caracterizaron microscoacutepicamente cuantificando cristales Los aislamientos positivos para cristales se sometie-ron a una caracterizacioacuten bioquiacutemica por medio de electroforesis de proteiacutenas totales (SDS-PAGE) Las cepas positivas para la presencia de genes cry1 fueron sometidas a dos rondas de M-PCR con 2 mezclas de oligonu-cleoacutetidos reconociendo 6 genes especiacuteficos Se aislaron 99 bacilos esporulados nativos que presentaron cristales con formas amorfas bipiramidal cuadradas redondas y triangulares Se observaron bacilos con 1 2 3 y 4 for-mas de cristal establecieacutendose 18 perfiles diferentes Por SDS se evidenciaron bandas de proteiacutenas de 28 hasta 150 kDA clasificaacutendose en 7 por su posible actividad bioloacutegica lo que originoacute 28 perfiles diferentes 35 bacilos esporulados presentaron genes cry1 y en estos se detectaron por M-PCR los genes cry1Aa cry1Ab cry1Ac cry1B cry1C y cry1D en el 76 26 21 35 32 y 88 respectivamente De acuerdo a estas caracterizaciones se seleccionaron 10 aislamientos nativos como promisorios para el control de Tuta absoluta y se retaron contra larvas de 2do instar de este insecto plaga Los bacilos nativos ZBUJTL39 y ZCUJTL11 presentaron una mejor actividad bioloacutegica que la cepa de referencia Bt var kurstaki HD1 El bacilo nativo ZCUJTL11 presentoacute una CL50 de 24 microgml (Plt005) La metodologiacutea estandarizada selecciona las cepas de acuerdo a su actividad bio-loacutegica potencial como un paso previo a los ensayos bioloacutegicos Este resultado es promisorio para posteriores investigaciones en ingenieriacutea geneacutetica de tomate para la obtencioacuten de cultivares autorresistentes a Tuta absoluta

Palabras claves Bacillus thuringiensis Tuta absoluta Lycopersicum esculentum SDS-PAGE PCR Ensayos bioloacutegicos

L Ramiacuterez1 N Ramiacuterez1 L S Fuentes2 J Jimeacutenez2 J Hernaacutendez3

1 Microbiologiacutea Industrial Facultad de Ciencias Pontificia Universidad Javeriana 2 Investigadores CIIA Universidad Jorge Tadeo Lozano

3 Profesor-Investigador Universidad Jorge Tadeo Lozano javierhernandezutadeoeduco

ISOLATION AND MOLECULAR CHARACTERIZATION AND BIOLOGICAL NATIVE STRAINS OF Bacillus thuringiensis FOR CONTROL Tuta absolute (Meyrick Lepidoptera Gelechiidae) INSECT

PEST OF TOMATO (Lycopersicon esculentum)

Aislamiento y caracterizacion de Bacillus thuringiensis Ramirez et al

Rev Asoc Col Cienc(Col) 22 73-96 2010

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Revista de la Asociacioacuten Colombiana de Ciencias Bioloacutegicas

ABSTRACT

Were collected 28 soil samples in 14 municipalities in Colombia Sporulated bacillus were isolated characteri-zed microscopically by quantifying crystals Isolates positive for crystals were subjected to biochemical charac-terization by electrophoresis of total proteins (SDS-PAGE) The strains positive for the presence of cry1 genes were subjected to two rounds of M-PCR with two oligonucleotide mixtures recognizing specific genes 6 99 bacillus were isolated forms filed with amorphous crystals bipiramidal square round and triangular Bacillus were observed with 1 2 3 and 4 forms of glass with 18 different profiles For SDS showed protein bands of 28 to 150 kDa in 7 classified by their potential biological activity resulting in 28 different profiles 35 sporulated ba-cillus showed cry1 genes and these were detected by M-PCR gene cry1Aa cry1Ab cry1Ac cry1B cry1C and cry1D in 76 26 21 35 32 and 88 respectively According to these characterizations 10 isolates were selected as promising for the control of Tuta absoluta and challenged against the 2nd instar larvae of this insect pest Strain ZBUJTL39 and introduced ZCUJTL11 better biological activity that the reference strain Bt var kurstaki HD1 strain ZCUJTL11 presented a LC50 of 24 mg ml (P lt005) The methodology selected strains according to their potential biological activity as a preliminary step to biological tests this result is promising for further research into genetic engineering of tomato cultivars to obtain resistant to Tuta absoluta

Keywords Bacillus thuringiensis Tuta absoluta Lycopersicum esculentum SDS-PAGE PCR biological tes-ting

INTRODUCCIOacuteN

El tomate (Lycopersicon esculentum Millano) es uno de los cultivos maacutes importantes en Colombia esta hor-taliza presenta gran demanda en la dieta alimenticia y genera empleo e ingresos no soacutelo en el campo sino tambieacuten en la agroindustria Las variedades maacutes culti-vadas son Milano y Chonto que se producen entre 600 y 1200 msnm (1) En Colombia la superficie destinada a este cultivo fue aproximadamente de 15881 hectaacutereas (ha) con una produccioacuten de 420419 toneladas (ton) y un rendimiento de 265 tonha en el antildeo 2006 (wwwagronetgovco)

Esta solanaacutecea es afectada por una gran cantidad de pla-gas y enfermedades dentro de las cuales se destaca el dantildeo causado por las larvas de Tuta absoluta (Lepidop-tera Gelechiidae) El cogollero del tomate Tuta absolu-ta es considerado una de las plagas de gran importancia econoacutemica del tomate en Colombia (Corporacioacuten Co-lombiana de Investigacioacuten Agropecuaria CORPOICA http intranetcorpoicaorgco) el dantildeo causado por T absoluta en plantas de tomate representa un 27- 43 (2) debido a que afecta directamente la produccioacuten del cultivo Este dantildeo es causado por larvas de la plaga que minan el follaje y los tallos de las plantas y atacan las hojas joacutevenes ramas perforando ademaacutes flores y frutos (3 1) lo que ocasiona un debilitamiento gradual en la planta disminuyendo su potencial productivo

Para el control de T absoluta los agricultores utilizan principalmente insecticidas quiacutemicos que ocasionan efectos nocivos al ambiente generacioacuten de resistencia aparicioacuten de residuos quiacutemicos en los alimentos conta-minacioacuten de las aguas eliminacioacuten de la fauna beneacutefica y problemas para la salud humana Como alternativa para el control sostenible de plagas se encuentra el Manejo Integrado de Plagas (MIP) uno de los componentes del MIP es el control bioloacutegico de plagas del cual hace parte el uso de microorganismos entomopatoacutegenos que ha logrado gran desarrollo a nivel mundial debido a los avances en su industrializacioacuten y presenta un menor impacto ecoloacutegico

Dentro de los entomopatoacutegenos mas utilizados se en-cuentra la bacteria Bacillus thuringiensis (Bt) domi-nando el 90 del mercado mundial de bioplaguicidas (4) Bt es una bacteria aeroacutebica Gram positiva que se caracteriza por la produccioacuten de cristales paraesporales compuestos por Proteiacutenas Insecticidas de Cristal ICPacutes (del ingles Insecticidal Crystal Proteins) (5) Bt posee alta especificidad sobre larvas de insectos de los orde-nes lepidoacuteptera diacuteptera y coleoacuteptera (6) recientemente se comproboacute su efecto sobre individuos de himenoacutep-tera hemiptera maloacutefaga ortoacuteptera y otros grupos de organismos como nemaacutetodos aacutecaros protozoarios (4) babosas y caracoles (7) Ademaacutes otras toxinas no insec-ticidas ni hemoliacuteticos que presenta Bt han mostrado ac-tividad sobre ceacutelulas canceriacutegenas humanas (8 9) Bt


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es altamente inocua para plantas mamiacuteferos aves anfi-bios y reptiles (9) e inclusive otros insectos beneacuteficos

Debido a la importancia que tiene el control de insectos plaga del orden lepidoacuteptero y la necesidad eminente de proponer alternativas para el control de T absoluta la buacutesqueda en Colombia de nuevos genes cry que codi-fiquen para nuevas y novedosas delta-endotoxinas con un espectro de accioacuten maacutes amplio continuacutea siendo un proyecto de gran intereacutes En este trabajo se aislaron y caracterizaron cepas de B thuringiensis con genes es-peciacuteficos de la familia cry1 con actividad anti lepidoacutep-tera a partir de suelos en los que se cultiva tomate en cuatro departamentos de Colombia Cundinamarca en los municipios de Susa y Chiacutea Boyacaacute en los munici-pios de Villa de Leyva Sutamarchaacuten Raquiraacute y Santa Sofiacutea Huila en el municipio de Garzoacuten y Santander en los municipios de Piedecuesta Los Santos Lebrija Betulia Floridablanca Rionegro y Giroacuten Se identifi-caron genes especiacuteficos para poder seleccionar bacilos nativos esporulados y estimar su potencial sobre larvas de 2do instar de T absoluta para de esta manera identi-ficar bacilos nativos potenciales para el control de esta plaga Adicionalmente se conformoacute un banco de bacilos nativos esporulados caracterizados a nivel molecular de acuerdo a la presencia de genes cry1 como un paso pre-vio a la realizacioacuten de ensayos bioloacutegicos que permiten confirmar la efectividad de un aislamiento nativo en el control de una determinada plaga

MATERIALES Y MEacuteTODOS

La presente investigacioacuten se llevoacute a cabo en los La-boratorios de Biologiacutea Molecular y de Entomologiacutea Centro de Investigaciones y Asesoriacuteas Agroindustriales (CIAA) de la Universidad Jorge Tadeo Lozano (UJTL) ubicados en Bogotaacute y en Chiacutea Cundinamarca respecti-vamente ademaacutes se realizaron experimentos puntuales en el Laboratorio Nacional de Diagnoacutestico Fitosanitario y Anaacutelisis Molecular del Instituto Colombiano Agrope-cuario (ICA) y en el Laboratorio de Epidemiologiacutea Mo-lecular del Instituto de Biotecnologiacutea de la Universidad Nacional en Bogotaacute (IBUN)

Cepas de Referencia

Para la estandarizacioacuten de la metodologiacutea y como con-trol positivo se utilizaron cepas de referencia de Bt var kurstaki HD1 aislada del producto comercial Di-pelreg que presenta los genes cry1Aa cry1Ab cry1Ac cry1Ia3 cry2Aa cry2Ab y Bt var aizawai HD137 que

presenta los genes cry1Aa cry1Ba cry1Ca cry1Da del producto comercial Xentarireg ambos de la casa comer-cial Valent Bioscience

Obtencioacuten de muestras de suelo aacuterea de estudio

Las muestras de suelos se obtuvieron de diferentes re-giones productoras de tomate dentro del territorio Co-lombiano Cundinamarca en los municipios de Susa y Chiacutea Boyacaacute en los municipios de Villa de Leyva Sutamarchaacuten Raquiraacute y Santa Sofiacutea Huila en el mu-nicipio de Garzoacuten y Santander en los municipios de Piedecuesta Los Santos Lebrija Betulia Floridablan-ca Rionegro y Giroacuten Las muestras se recolectaron en campo abierto por duplicado

Procesamiento de las muestras

Un gramo de suelo se transfirioacute a nueve mililitros de PBS (0002 M NaH2PO4H2O 0008 M Na2HPO4 an-hidro 002 M Na2HPO4 12H2O 015 M NaCl) y se incubaron a 30ordmC por 4 horas Luego se realizoacute un cho-que teacutermico a 80ordmC durante 10 minutos para recuperar uacutenicamente microorganismos esporulados (10) Se pre-pararon tres diluciones seriadas (10-110-2 y 10-3) de las cuales se sembraron 100 microl en cajas de petri en medio de cultivo Luria Bertani (LB) (10 gl triptona10 gl NaCl 5 gl extracto de levadura 13 gl de agar) y se incubaron a 30degC durante 24 horas La seleccioacuten de las colonias cultivadas en LB se basoacute en las caracteriacutesti-cas macroscoacutepicas de las mismas teniendo en cuenta que las colonias tiacutepicas de B thuringiensis son grandes irregulares blancas cremosas y opacas Una vez selec-cionadas las colonias que por sus caracteriacutesticas podriacutean corresponder al microorganismo de intereacutes se realizoacute una siembra por agotamiento en agar LB y se incubaron a 30degC por 24 horas

Caracterizacioacuten microscoacutepica de losaislamientos nativos

Se realizaron caracterizaciones microscoacutepicas inicial-mente con una coloracioacuten de Gram de un cultivo de 24 horas de incubacioacuten en medio LB con el fin de confir-mar las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y la clasificacioacuten seguacuten el fundamento de eacutesta tincioacuten de cada una de las cepas en estudio Posteriormente se realizoacute una tincioacuten diferencial (safranina-verde de malaquita) de las colo-nias aisladas que se incubaron en agar LB durante siete diacuteas a 30degC para evidenciar la presencia de esporas y cristales los cuales se cuantificaron mediante observa-



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cioacuten en microscopio oacuteptico Nikon (100X) asignando

(+) 1-10 cristales y esporas por campo oacuteptico(++) 10-20 cristales o esporas por campo oacuteptico(+++) Maacutes de 20 cristales oacute esporas por campo oacuteptico (11)

Las cepas que presentaron maacutes de 20 cristales por cam-po oacuteptico se les realizoacute un segundo anaacutelisis mediante observacioacuten y registro fotograacutefico en microscopio con-traste de fase (400X)

Caracterizacioacuten Bioquiacutemica SDS-PAGE

Se empleo la metodologiacutea de Laemmli (1970) Para ello se realizoacute un ldquogel de separacioacutenrdquo al 148 y el ldquogel compactadorrdquo al 5 El corrido electroforeacutetico se llevoacute a cabo en una caacutemara de electroforesis vertical Mini-PROTEAN TETRA-BIO RAD y se utilizoacute el Marca-dor de peso molecular de Proteiacutenas ldquoBROAD RANGE Proteiacuten Molecular Weight Markertrdquo (Promega USA) Los corridos electroforeacuteticos se llevaron a cabo a 200 voltios durante 60 minutos y los geles se tintildeeron con solucioacuten colorante de Azul de Coomassie R-250 al 01 durante una hora a 150 rpm en el SHAKER marca LAB-LINEreg ORBIT ENVIRON-SHAKER para pos-terior lavado y decoloracioacuten del fondo durante 4 horas en metanol aacutecido aceacutetico (40-10) Una vez decolo-rados los geles se determinoacute el peso molecular de las bandas de proteiacutenas presentes en cada muestra seguacuten el marcador de peso molecular utilizado Estos perfiles de proteiacutenas totales fueron comparados con los perfiles de las cepa de referencia B thuringiensis var kurstaki HD1

-Obtencioacuten de extractos crudos Los aislamientos na-tivos y la cepa de referencia se sembraron en el medio de cultivo LB modificado (10 gl de triptona 10 gl NaCl 5 gl extracto de Levadura 4 gl sulfato de Amonio 13 gl agar) (12) y se incubaron a 30degC durante 7 diacuteas Toda la biomasa celular se resuspendioacute en agua desti-lada desionizada y posteriormente los extractos crudos fueron sonicados a una amplitud del 36 con 12 pulsos por 120 segundos utilizando el equipo ldquoSonics Vibra Cell 750 Wrdquo (Laboratorio de Epidemiologiacutea Molecu-lar en el Instituto de Biotecnologiacutea de la Universidad Nacional en Bogotaacute IBUN) Finalmente se realizoacute el procedimiento descrito por Laemmli (1970) Se mezclo 12 del extracto crudo de proteiacutena y el buffer Laemmli se coloco en bantildeo mariacutea en ebullicioacuten durante 10 minu-tos y se sirvieron 20 microl de cada una de las muestras en

los pozos del gel

Caracterizacioacuten Molecular

-Extraccioacuten de ADN Para la obtencioacuten de ADN plas-miacutedico y ADN total de buena calidad para ser utilizado en la caracterizacioacuten molecular por PCR se utilizaron los kit ldquoExtraccioacuten por Kit Ultra CleanTM 6 minuts mini plasmid prep kit para ADN plasmidico y Kit Ultra CleanTM Microbial DNA Isolation Kitrdquo para ADN gene-ral de la casa comercial fabricante (Bio-Line USA) 1 microl de ADN obtenido de cada aislamiento esporulado se sembroacute en el gel

-Amplificacioacuten por PCR de genes cry1 Se utilizoacute la Reaccioacuten en Cadena de la Polimerasa PCR (del Poly-merase Chain Reaction) Para llevar a cabo esta reac-cioacuten se seleccionaron pares de oligonucleoacutetidos re-portados previamente para la amplificacioacuten por PCR de fragmentos de los genes de las familias cry1 (13) que reconoce los genes cry1Aa cry1Ab cry1Ad cr-y1Ac cry1Ae cry1Af cry1Ba cry1Bb cry1Bc cry-1Ca cry1Cb cry1Da cry1Db cry1Ea cry1Fa cry1Eb cry1Fb cry1G cry1Ha cry1Ia cry1Ib cry1Ja cry1Jb y cry1K con peso que variacutean entre 543- 594 pb Para la amplificacioacuten por PCR de genes cry1 se utilizoacute ADN extraiacutedo de la cepa de referencia Bt var kurstaki HD1 y de los bacilos nativos esporulados aislados -Amplificacioacuten por PCR de genes cry1 especiacuteficos Los aislamientos nativos esporulados positivos para la presencia de genes cry1 fueron sometidos a dos rondas de PCR muacuteltiple a partir de 2 mezclas de 6 oligonu-cleoacutetidos cada una reconociendo 3 genes especiacuteficos en cada reaccioacuten de PCR Los oligonucleoacutetidos que se emplearon en la PCR muacuteltiple fueron disentildeados en secuencias conservadas para cada gen especiacutefico (14) que reconoce los genes cry1Aa cry1Ab cry1Ac cry1B cry1C y cry1D Las condiciones preliminares de am-plificacioacuten para la Mezcla A fueron Una denaturacioacuten inicial a 94degC por 5 minutos para 35 ciclos de ampli-ficacioacuten (con un ciclo que consistiacutea en la denaturacioacuten a 94degC por 1 minuto hibridacioacuten a 55degC por 1 minuto elongacioacuten a 72degC por 1 minuto) y una elongacioacuten final a 72degC por 10 minutos

Para la Mezcla B las condiciones de amplificacioacuten fue-ron Una denaturacioacuten inicial a 94degC por 5 minutos para 35 ciclos de amplificacioacuten (con un ciclo que con-sistiacutea en la denaturacioacuten a 94degC por 1 minuto hibri-dacioacuten a 55degC por 1 minuto elongacioacuten a 72degC por 1


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minuto) y una elongacioacuten final a 72degC por 10 minutos

-Electroforesis de ADN en gel de agarosa Para evi-denciar la presencia de los genes amplificados cry1 por PCR se realizoacute una electroforesis en gel de agarosa al 10 y para los genes amplificados cry1 especiacuteficos se realizoacute una electroforesis en gel de agarosa al 3 am-bas en tampoacuten TBE 05 X y se corrioacute en una caacutemara Horizontal Gel XL Ultra V-2 Labnet International Los productos amplificados se tintildeeron con buffer de carga azul de bromofenol y se sembraron 10 microl en cada pozo La electroforesis se llevoacute a cabo a 100 voltios durante 60 minutos y los productos de amplificacioacuten se fotogra-fiaron en el fotodocumentador ldquoUVP Gel-Doc-ITTM Imaging Systemrdquo (UVP LSC USArdquo)

Cuantificacioacuten de Proteiacutenas de Extractos Crudos

-Obtencioacuten de Extractos crudos Para la obtencioacuten de esporas y cristales de los aislamientos nativos seleccio-nados para el bioensayo los bacilos se cultivaron en 100 ml de medio de cultivo leche peptonizada modificada (triptona 10 g dextrosa 10 g extracto de levadura 2 g MgSO47H2O 03 g FeSO47H2O 20 mg ZnSO47H2O 20 mg MnSO4 20 mg 1 litro de agua pH 72) con agitacioacuten a 340 rpm en el Shaker ldquoLAB-LINEreg Or-bit Environ-Shakerrdquo a 28degC durante 72 horas hasta su completa autolisis (15)

Los 100 ml de las muestras se trasladaron a tubos nal-gene se adicionoacute 4 microl de 100 mM de PMSF (Fluoruro de fenilmetiacutel sulfonilo) y 5 ml de agua destilada de-sionizada se agitaron en voacutertex por 10 segundos y se centrifugaron a 10000 rpm por 10 minutos La centri-fugacioacuten se repitioacute tres veces lavando solo con agua destilada desionizada para eliminar los residuos del me-dio de cultivo Seguidamente se adicionoacute a la muestra 2936 microl de Carbonato de Sodio (CaCO3) 60 microl de DTT (Ditiotreitol reductor de di-sulfuros) y 4 microl de PMSF y se dejaron en shaker a 200 rpm a temperatura ambien-te durante toda la noche finalmente el sobrenadante se pasoacute a tubos eppendorf de 15 ml y se centrifugoacute a 14000 rpm por 15 min (4degC) para eliminar los residuos de Carbonato de Sodio (amortiguador que permite la solubilizacioacuten de las proteiacutenas totales) DDT y PMSF (17 16) El sobrenadante se colocoacute en un tubo eppen-dorf nuevo y se guardoacute (4degC) para su posterior anaacutelisis

-Cuantificacioacuten de Proteiacutenas totales en los extrac-tos crudos por teacutecnica de Bradford Para cuantificar las concentraciones de proteiacutena total en los extractos

crudos de los aislamientos nativos se realizoacute el proce-dimiento de cuantificacioacuten de proteiacutena basado en una curva de albuacutemina seacuterica bovina (BSA) Las concen-traciones empleadas para el control fueron de 100-1000 microgml-1 de BSA preparado seis diluciones Para el anaacute-lisis del extracto crudo se tomoacute 01 ml y se transfirieron a tubos de 16 x 100 mm seguacuten la metodologiacutea descrita por Bradford (1976)

Caracterizacioacuten bioloacutegica

-Criacutea de Tuta absoluta Las etapas en las que se desa-rrollo la criacutea fueronObtencioacuten siembra y trasplante de plantas Las semillas de tomate variedad Milano tropic (Impulse-millas) se sembraron en bandejas con celdillas de 15 cm de profundidad conteniendo turba (material orgaacuteni-co) y se colocaron por 5 diacuteas en cuarto oscuro a una temperatura de 23-25degC para acelerar la germinacioacuten Posteriormente se dejaron a temperatura ambiente en el semillero por tres semanas y despueacutes las plantas de-sarrolladas se trasplantaron a materas de 18 cm de alto

Criacutea del insecto plaga Tuta absoluta La criacutea de T ab-soluta se realizoacute en jaulas de 80 cm de largo por 60 cm de ancho y 60 cm de profundidad utilizando velo suizo En la primera jaula se colocaron tres plantas de tomate con aproximadamente 60 adultos asiacute se aumen-toacute la produccioacuten de huevos del insecto Al siguiente diacutea los huevos puestos por las hembras adultas se pasa-ron a otra jaula y a partir de este momento se conta-ron de 8-13 diacuteas para encontrar huevos maduros listos para eclosionar obteniendo larvas de diferentes insta-res Las plantas que conteniacutean pupas fueron retiradas y colocadas en caacutemaras de emergencia para adultos El procedimiento se repitioacute ciacuteclicamente durante todo el experimento Las condiciones de temperatura de las caacute-maras de criacutea variaban dependiendo de las condiciones climaacuteticas externas

Monitoreo de condiciones ambientales Se llevoacute un registro de las condiciones ambientales (Temperatura y Humedad relativa)

Monitoreo sanitario de las plantas Durante todo el periacuteodo de los experimentos se monitoreo frecuente-mente la presencia de otras plagas o enfermedades y se realizaron las limpiezas sanitarias pertinentes

-Condiciones del bioensayo Los experimentos se rea-lizaron en condiciones controladas en cuarto de criacutea a



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temperatura de 21 plusmn 2degC humedad relativa 70 plusmn 10 y fotoperiodo 12 h LO La lectura del bioensayo se rea-lizoacute diariamente contando el nuacutemero de larvas vivas y muertas para cada uno de los tratamientos evaluados

-Seleccioacuten de Aislamientos nativos para la realizacioacuten del Bioensayo Los individuos del insecto plaga utili-zado en el bioensayo fueron larvas de 2do instar de Tuta absoluta De acuerdo a la metodologiacutea estandarizada se escogieron hojas de tomate fenoloacutegicamente iguales y se lavaron con agua se secaron con papel absorbente previo a los ensayos bioloacutegicos Para la evaluacioacuten de los tratamientos se empleoacute un disentildeo completamente al azar (CA) con tres repeticiones Cada repeticioacuten estaba constituida por una unidad experimental que conteniacutea 3 larvas de Tuta absoluta sobre 7 hojas de tomate iguales En cada bioensayo se incluyoacute un testigo absoluto (hoja y larvas) un control positivo hojas tratadas con la cepa de referencia (HD1) y tratamientos con bacilos nativos esporulados En cada bioensayo se utilizoacute 3 unidades con 21 larvas por unidad experimental (triplicado) para un total de 63 larvas por tratamiento

Los ensayos se realizaron comparando la actividad toacutexica de los extractos crudos de bacilos nativos espo-rulados como factor de mortalidad sobre larvas de T absoluta

Inicialmente se realizaron bioensayos discriminatorios ldquoEvaluacioacuten de bacilos nativos preseleccionadosrdquo con una concentracioacuten igual para todos los tratamientos (ex-tracto crudo de cepas nativas esporuladas) 08 microgml a fin de identificar los bacilos nativos esporulados de mayor potencial patogeacutenico sobre larvas de Tuta abso-luta La mortalidad corregida se determinoacute mediante la formula de Henderson y Tilton que permite cuantificar y corregir la mortalidad originada por el tratamiento con relacioacuten a la obtenida en el testigo La mortalidad se evaluoacute cada 24 h por 8 diacuteas Se contoacute el nuacutemero de larvas vivas y muertas (utilizando el criterio de larvas inmoacuteviles o con cambio de color para calificarlas como muertas) y se determinoacute el porcentaje de mortalidad corregida de los bacilos nativos esporulados en cada bioensayo Los conteos de mortalidad se realizaron uti-lizando un estereoscopio ADVANCED OPTICAL La mortalidad corregida se sometioacute a un Anaacutelisis de Va-rianza (ANOVA) y prueba de comparacioacuten de medias de Tukey

-Determinacioacuten de la concentracioacuten letal 50 (CL50) Para determinar la concentracioacuten letal 50 se partioacute de

una suspensioacuten de extracto crudo de bacilos nativos es-porulados con una concentracioacuten estaacutendar para todos los bacilos a evaluar A partir de esta concentracioacuten ini-cial alta se realizaron 6 diluciones seriadas (08 microgml 16 microgml 24 microgml 32 microgml 4 microgml y 48 microgml) que se evaluaron como tratamientos La mortalidad se registroacute como se indicoacute anteriormente Para el anaacutelisis de regresioacuten se utilizo la transformacioacuten PROBIT utili-zando el programa computacional Biostat 2007

Por ultimo se llevo a cabo una prueba de confirmacioacuten para determinar si la muerte de las larvas era produci-da o no por la accioacuten de los bacilos nativos esporula-dos o por efecto de la manipulacioacuten o de otro agente patoacutegeno externo Esta prueba consistioacute en realizar un macerado de las larvas muertas de las diferentes dosis evaluadas el macerado se resuspendioacute en 1 ml de agua destilada esteacuteril y 100 microl de esta suspensioacuten se incuboacute en agar LB a 30degC por 24 horas luego se determinoacute macroscoacutepicamente la presencia de colonias de B thu-ringiensis

Conformacioacuten de un banco de Bacilos Nativos Es-porulados

Una aliacutecuota de 50 microl de un cultivo liacutequido de cada uno de los aislamientos nativos se utilizoacute para impregnar un tira de papel filtro previamente esterilizado dentro de una ampolleta color aacutembar que inmediatamente des-pueacutes se selloacute al calor con un mechero esto se realizoacute por triplicado para cada una de las cepas Despueacutes es-tas ampolletas se guardaron en el refrigerador a 4degC hasta su nueva utilizacioacuten El coacutedigo asignado a cada ampolleta estuvo compuesto por la zona muestreada que correspondiacutea al departamento (ZC zona Cundina-marca ZB zona Boyacaacute ZH zona Huila y ZS zona Santander) seguido de las iniacuteciales de la Universidad Jorge Tadeo Lozano (UJTL) y el nuacutemero de la cepa (1) El cual variaba dependiendo del departamento y la cantidad de cepas


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RESULTADOS Y DISCUSIONES

Aislamiento de cepas a partir de muestras de suelo en 4 departamentos de Colombia

Se recolectaron 28 muestras de suelo de 14 municipios de Colombia en los departamentos de Cundinamarca Boyacaacute Huila y Santander Se escogioacute como fuente de aislamientos de bacilos nativos esporulados muestras de suelo debido a que este es uno de los lugares en donde se ha encontrado e identificado mayor cantidad de cepas de B thuringiensis (18) ya que las esporas son arrastradas por el viento y el agua donde una vez enterradas conservan su viabilidad al estar protegidas de la radiacioacuten ultra violeta (16) Sin embargo Schnepf y Whiteley (1985) argumentan que la amplia distribu-

cioacuten de B thuringiensis en el ambiente no solo se debe a factores abioacuteticos sino tambieacuten a que los insectos que ingieren esporas de B thuringiensis y mueren a causa de la infeccioacuten liberan al medio ambiente la forma ve-getativa de estas bacterias que posteriormente esporu-lan y permanecen en este estado vegetativo hasta que pueda encontrar condiciones apropiadas para su multi-plicacioacuten

De las 28 muestras analizadas se aislaron 99 aislamien-tos nativos que presentaron colonias caracteriacutesticas del geacutenero Bacillus sp las colonias presentaron color cre-ma borde irregular y redondeado

La Tabla 1 presenta el nuacutemero de aislamientos de baci-los nativos esporulados aislados a partir de las muestras de suelo analizadas de los diferentes municipios

Tabla 1 Departamento municipio y nuacutemero de aislamientos nativos a partir de las muestras de suelo analizadas



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Silvia (1999) reporta que las caracteriacutesticas del suelo son importantes y que no todos los microorganismos esporulados tienen los mismos requerimientos ambien-tales para llevar a cabo la transicioacuten del estado de espo-rulacioacuten a la fase vegetativa lo que influye en la faci-lidad para recuperarlos Asiacute por ejemplo en los suelos francos arcillosos y arenosos se dice que se encuentran la mayoriacutea de bacilos esporulados mientras que en los suelos de composicioacuten limo se encuentra en menor can-tidad No obstante es necesario conocer las caracteriacutesti-cas fiacutesico quiacutemicas (pH materia orgaacutenica textura entre otros) de los suelos y los factores climaacuteticos de las zo-nas muestreadas para poder entender mejor que relacioacuten podriacutea existir entre la presencia de estos microorganis-mos y el suelo del cual fueron aislados (19) Variable que en la presente investigacioacuten no fue estudiada

Caracterizacioacuten microscoacutepica

La caracterizacioacuten microscoacutepica por tincioacuten de Gram confirmoacute la presencia de bacilos esporulados Gram po-sitivos como caracteriacutestica de los aislamientos lo cual indicoacute que estas posiblemente pertenecen al genero Ba-cillus sp (20) La morfologiacutea observada de los bacilos esporulados fue variable encontrando aislamientos con formas diferentes desde bacilos largos cortos y con for-macioacuten en cadena su grosor tambieacuten varioacute indicando la diversidad de los asilamientos obtenidos Por lo tanto fue necesario visualizar la forma y nuacutemero de cristales por campo oacuteptico para cada uno de los 99 aislamientos Esta caracteriacutestica es fundamental en la especie Bacillus thuringiensis Para llevar a cabo este procedimiento los 99 bacilos nativos esporulados se tintildeeron con safranina-verde de malaquita en donde las esporas se tintildeen de verde y los cristales de rojo (11 21) La cuantificacioacuten de cristales se realizoacute evaluando tres campos oacutepticos bajo microscopia oacuteptica y seguacuten la clasificacioacuten reali-zada se encontroacute que en 50 (50) bacilos nativos espo-rulados se presentaron entre 1 a 10 cristales por campo oacuteptico10 (10) de los bacilos nativos presentaron en-tre 10 a 20 cristales por campo oacuteptico Y uacutenicamente un bacilo nativo esporulado presento maacutes de 20 cristales Ademaacutes se encontraron 38 (38) bacilos nativos es-porulados que presentaron las tres clasificaciones del conteo en los tres campos evaluados

Por lo anterior fue necesario agrupar los bacilos nativos esporulados de acuerdo a la forma del cristal observa-do en cada uno Estableciendo 18 grupos o perfiles I)

Amorfa II) Amorfa bipiramidal y redonda III) Amor-fa y cuadrada IV) Amorfa y redonda V) Amorfa re-donda y cuadrada VI) Bipiramidal VII) Bipiramidal y redonda VIII) Bipiramidal y triangular IX) Cuadrado X) Cuadrado bipiramidal y triangular XI) Cuadrado redondo y bipiramidal XII) Cuadrado redondo bipira-midal y amorfo XIII) Redondo XIV) Redondo amor-fo y triangular XV) Redondo bipiramidal y triangular XVI) Redondo y triangular XVII) Triangular y XVIII) Triangular amorfo y bipiramidal (Figura 1)

De acuerdo a los resultados presentados anteriormente se puede concluir que los bacilos nativos esporulados presentan diversidad en el ambiente y esta diversidad de los cristales proteicos se debe posiblemente a la ca-pacidad de B thuringiensis de llevar a cabo intercambio intra e interespeciacutefico de informacioacuten geneacutetica median-te un proceso tiacutepico a nivel bacteriano llamado conju-gacioacuten con lo que podriacutean intercambiar genes especiacute-ficos que codifican para las proteiacutenas Cry que son las que conforman los cristales paraesporales los bacilos nativos esporulados utilizados en este estudio contienen entre 4 a 6 genes cry diferentes lo que apoya esta idea (22)

Anteriormente se relacionaba la forma del cristal pre-sente en los aislamientos nativos con su actividad bioloacute-gica potencial (6) de esta forma los cristales redondos se han asociado con actividades insecticidas frente al orden diacuteptero (23 24) los cuadrados contra insectos diacutepteros y lepidoacutepteros (25) las formas bipiramidales se han asociado con actividades en contra de insectos coleoacutepteros y lepidoacutepteros (26 27) Sin embargo Maacuter-quez et al (1996) afirma que la correlacioacuten entre la forma del cristal y su actividad bioloacutegica frente a deter-minado tipo de insecto no se cumple debido a que la visualizacioacuten del cristal depende del medio de cultivo en donde se cultivan las cepas

Si se tienen en cuenta estas apreciaciones en el presen-te estudio se presentaron bacilos con actividades poten-ciales frente a insectos lepidoacutepteros diacutepteros y coleoacutep-teros en una sola cepa que conteniacutea cuatro formas de cristal esto puede confirmarse con las caracterizaciones bioquiacutemicas y moleculares y pruebas bioloacutegicas para encontrar si existe tal relacioacuten


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Figura 1 Aislamientos con una forma de cristal y se observan asociaciones de 23 y4 formas de cristales en bacilos esporulados nativos

Caracterizacioacuten Bioquiacutemica

Para la determinacioacuten del perfil electroforeacutetico de pro-teiacutenas totales de los bacilos nativos esporulados se empleoacute la teacutecnica de electroforesis en geles de polia-crilamida en condiciones denaturantes (SDS-PAGE) Las proteiacutenas Cry de B thuringiensis pueden llegar a conformar hasta el 25 del peso seco de ceacutelulas espo-ruladas (28 26) por lo tanto la teacutecnica de SDS-PAGE de extractos crudos en fase estacionaria de crecimiento permite establecer la presencia y abundancia relativa de las proteiacutenas del cristal que son de gran importancia potencial dada la alta variabilidad de proteiacutenas insecti-cidas del cristal con actividad bioloacutegica diferentes (11)

Con el meacutetodo empleado para la obtencioacuten de extractos crudos se aumento la esporulacioacuten en los bacilos nativos esporulados y con el siguiente tratamiento realizado al utilizar toda la biomasa y realizar tres lavados consecu-tivos para ser procesadas en un sonicador se mejoroacute la solubilizacioacuten de cristales y la lisis bacteriana y por lo tanto el revelado de bandas en los geles tentildeidos de los bacilos nativos esporulados Este meacutetodo fue estandari-zado y escogido para caracterizar los 99 bacilos nativos

esporulados aislados

En la Figura 2 se observa la presencia de bandas con pesos moleculares similares a la Proteiacutenas Cry Ademaacutes al adicionar una proporcioacuten mayor del buffer de carga se aumentoacute la unioacuten del SDS a la proteiacutenas aumentando de esta forma las cargas negativas en las proteiacutenas y por ende mejoroacute el corrido electroforeacutetico de las proteiacutenas resultado que directamente influye en el revelado de es-tas (29)

-Electroforesis en geles de poliacrilamida de los ex-tractos crudos de los bacilos nativos esporulados

En la Figura 2 se observan las proteiacutenas totales reve-ladas a partir de los bacilos nativos esporulados En el carril 4 se pueden ver dos bandas bastantes gruesas pa-recidas a las bandas que revela la cepa de referencia HD1 (carril 2) que revela la proteiacutena Cry1 y Cry2 en 135 y 70 kDa respectivamente En todos los carriles de la Figura 2 se revelan bandas de proteiacutenas de bajo peso molecular Por medio de la caracterizacioacuten bioquiacutemica de los 99 bacilos nativos esporulados evaluados se en-controacute que las proteiacutenas totales visualizadas en los geles



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de poliacrilamida presentaron pesos que variacutean entre 28-150 kDa por lo tanto se realizoacute una clasificacioacuten en siete (7) grupos de acuerdo a su posible actividad bioloacutegica sobre insectos plaga (30) tomando como base que las proteiacutenas Cry representan entre el 25 al 30 de proteiacutena total (28 26) esta clasificacioacuten se establecioacute de la siguiente forma

El grupo I constituido por bandas electroforeacuteticas de proteiacutenas cuyo peso molecular variacutea entre 10-20 kDa peso no asociado a ninguna proteiacutenas Cry conocida El grupo II con bandas electroforeacuteticas de proteiacutenas con pesos moleculares de 25-30 kDa asociado a proteiacutenas Cyt (Proteiacutenas Citoliacuteticas) con actividad frente a in-sectos lepidoacutepteros y diacutepteros (31) El grupo III con bandas proteicas de pesos moleculares de 35-50 kDa asociado a proteiacutenas Cry1 Cry3 Cry6 Cry34 Cry35 y Cyt1A con actividad bioloacutegica frente a insectos le-pidoacutepteros coleoacutepteros himenoacutepteros y a organismos como nematodos y aacutecaros (32 33) El grupo IV con bandas electroforeacuteticas de pesos moleculares de 60-75 kDa asociado a proteiacutenas Cry2 y Cry3 con actividad bioloacutegica dual frente a insectos lepidoacutepteros diacutepteros y coleoacutepteros respectivamente (33 34) El grupo V con bandas electroforeacuteticas de proteiacutenas de pesos molecula-res de 80-85 kDa asociado a proteiacutenas Cry1Ia con acti-vidad bioloacutegica frente a insectos lepidoacutepteros y diacutepteros (34) El grupo VI con bandas electroforeacuteticas de pro-

teiacutenas de pesos moleculares de 100-150 kDa asociado con proteiacutenas Cry1 Cry32Aa con actividad bioloacutegica frente a insectos lepidoacutepteros y actividad dual frente a coleoacutepteros (6) y del tipo Cry4 con actividad frente a diacutepteros (32 33) El grupo VII constituido para aquellos bacilos nativos esporulados que no revelaron bandas de proteiacutenas

Con la determinacioacuten de los perfiles electroforeacuteticos de proteiacutenas se puede evidenciar la diversidad de ais-lamientos nativos (16) y esta comparacioacuten de bandas proteicas permite identificar una posterior relacioacuten con su actividad bioloacutegica

Tambieacuten se encontraron bacilos nativos esporulados que revelaron una proteiacutena a su patroacuten electroforeacutetico o que revelaron maacutes de una proteiacutena a su patroacuten elec-troforeacutetico Por lo tanto fue necesario realizar una cla-sificacioacuten en donde se agruparan individualmente cada proteiacutena o grupo de proteiacutenas con los respectivos baci-los nativos y con el grupo que presento su posible acti-vidad bioloacutegica para esta clasificacioacuten solo se tuvieron en cuenta las proteiacutenas prominentes En la Tabla 2 se identifican los 28 grupos encontrados

Esta diversidad de proteiacutenas presentes en los 99 baci-los nativos esporulados puede ser coherente si se tiene en cuenta que existen muchas cepas de B thuringien-

Figura 2 Perfil electroforeacutetico de proteiacutenas SDS-PAGE en cepas de referencia Bt var kurstaki HD1 y algunos bacilos nativos esporulados Carril 2) Bt var kurstaki HD1 carriles 3 4 5 6 7 y 8) bacilos nativos esporulado MP) Marcador de peso molecular Proteiacutenas BROAD RANGE


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sis que producen inclusiones cristalinas que contienen mezclas de delta-endotoxinas Por ejemplo Bt var kurstaki HD1 contiene 3 Cry1 (130-140 Kda) y 2 Cry2 (70 Kda) en el mismo cristal proteiacuteco (35) Bt var israe-liensis presentan genes que codifican para las proteiacutenas Cry4 Cry11 y Cyt1A en el mismo cristal proteico (11) (Tabla 2)

La presencia de los bacilos nativos esporulados y su clasificacioacuten con el perfil electroforeacutetico de proteiacutenas tambieacuten fue independiente del lugar de origen ya que se encontraron bacilos nativos esporulados con maacutes de un grupo de clasificacioacuten en las distintas regiones mues-treadas

Ellis et al (2002) Porcar y Juarez (2003) afirman que las proteiacutenas de bajo peso molecular en donde se clasifi-can la mayoriacutea de los aislamientos (Tabla 2) pueden ser un grupo uacutenico debido a su actividad sineacutergica ya que el sinergismo brinda la actividad antagoacutenica de las delta endotoxinas en algunas especies de insectos y puede ser un criterio para seleccionar las cepas que pueden controlar al insecto lepidoacuteptero Tuta absoluta y otro tipo de plagas que pueden afectar los cultivos agriacutecolas

Tabla 2 Relacioacuten entre los pesos moleculares de las proteiacutenas reveladas en cada uno de los bacilos nativos esporula-dos y elo los grupos de actividad bioloacutegica establecidos

Perfilelectroforeacutetico de

Proteiacutenas(Bandas en kDa)

Nuacutemero deBacilos nativos

esporulados

Gruposup1 conposible actividad

bioloacutegica

28 5 II

35 3 III

50 5 III

75 1 IV

130 1 VI

1020 1 I

1075 1 IIV

283550 12 IIIII

283550100150 1 IIIIIVI

28355075 100 6 IIIIIIV

28355085 1 IIIIIV

283575 2 IIIIIIV

283585 1 IIIIIV

2850 4 IIIII

285075 1 IIIIIIV

2875 4 IIIV

2875100 1 IIIVVI

2880 2 IIV

355075 24 III IV

3550100150 2 IIIVI

355075100150 4 IIIIVVI

35507585 1 IIIIVV

3575 2 IIIIV

3585 2 IIIV

5075100 1 IIIIVVI

75100 2 IVVI

75100150 1 IVVI

NP 8 VII



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-Extraccioacuten de ADN Los genes que codifican para las proteiacutenas Cry son generalmente de origen plasmiacutedico sin embargo algunas investigaciones han encontrado estos genes en el ADN total bacteriano (5) En el pre-sente estudio se obtuvo ADN general y plasmiacutedico de los 99 bacilos nativos esporulados Se observaron ban-das de ADN de alto peso molecular visibles en gel de

agarosa al 1 (Figura 3) El ADN total bacteriano se di-ferencia del ADN plasmiacutedico porque posee mayor peso molecular y por lo tanto presenta menor velocidad de migracioacuten en el gel de agarosa (Figura 3 a) (36) La calidad del ADN es un factor determinante para obtener buenos resultados cuando se lleven a cabo las reaccio-nes de amplificacioacuten por PCR (37)

Figura 3 a) ADN general de bacilos nativos esporulados (1-11) con el meacutetodo Kit ULTRA CLEA-MTMMicrobial isolation Kit b ADN plasmiacutedico Bacilos nativos esporulados (1-11) con el meacutetodo Kit ULTRA CLEAMTMMicrobial isolation Kit Gel de agarosa al 1 tentildeida en bromuro de etiacutedio

Amplificacioacuten de genes cry1 en bacilos nativos espo-rulados

Se caracterizaron 99 bacilos nativos esporulados a tra-veacutes de la mezcla del ADN genoacutemico y plasmiacutedico (05 microl de cada uno) (Figura 4) con la mezcla se busco que los genes que no se encuentran el ADN genoacutemico se presenten en el ADN plasmiacutedico debido a que Schnepf et al (1998) sugieren que la mayoriacutea de los genes cry1 se encuentran en el plaacutesmido y Porcar y Juaacuterez-Peacuterez (2004) que se encuentran en el ADN total bacteriano No obstante se identificaron 35 bacilos nativos esporu-lados con presencia del gen cry1 (Tabla 3) En la Figura 4 se observan bandas con pesos moleculares que variacutean entre 543 y 594 pb

En el presente estudio en los 99 bacilos nativos espo-rulados aislados el 354 presentaron genes pertene-cientes a la familia de genes cry1 Resultado similar a lo observado por Ben-Dov et al (1996) en un estudio realizado en Israel Kazakihstan y Uzbekistan donde re-portaron la presencia de genes cry1 en un 335 de 215 aislamientos En paiacuteses como Filipinas y Nueva Zelan-

da los aislamientos de suelos positivos para la presencia de genes cry1 se encuentran entre un 24-45 (38 39) Sin embargo en diferentes lugares del mundo como Taiwan China y Mexico En donde se ha reportado con detalle la caracterizacioacuten en teacuterminos del contenido de genes cry (40 13 41 42 43) En Taiwaacuten encontraron que de 225 aislamientos analizados el 982 conte-niacutean genes de la familia cry1 (41) Gao et al (2008) en China al analizar 570 aislamientos encontraron un porcentaje del 465 de aislamientos que presenta-ron genes de la familia cry1 Bravo et al (1998) en Meacutexico reportaron en 246 aislamientos analizados que el 496 presentaban genes cry1 Lo que sugiere que posiblemente en los 99 bacilos nativos esporulados ais-lados en el presente estudio presenten genes diferentes a la familia cry1

En la tabla 3 se presenta el nuacutemero y porcentaje de ba-cilos nativos esporulados que presentaron fragmentos amplificados de genes cry1 en cada uno de los munici-pios en donde se realizoacute el muestreo


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Figura 4 Amplificacioacuten de fragmentos por PCR de genes cry1 utilizando los oligonu-cleoacutetidos universales Bravo et al (1998) 2) Bt var kurstaki HD1 3) Control Negativo carril 4-11 bacilos nativos esporulados 411 24 39 57 75 76 77 MP) Marcador de peso molecular Hypper Ladder II Gel de Agarosa al 1 tentildeido en Bromuro de Etiacutedio

Tabla 3 Porcentaje de cepas con presencia del gen cry1 por municipio en cada departamento



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Amplificacioacuten de genes cry1 especiacuteficos en bacilos nativos esporulados

Los 35 bacilos nativos esporulados que se caracteriza-ron a traveacutes del ADN genoacutemico y plasmiacutedico los cuales previamente habiacutean amplificado fragmentos de genes cry1 fueron analizados en dos rondas de PCR muacuteltiple (M-PCR)

En la primera reaccioacuten mezcla A se amplificaron ban-das en los diferentes bacilos nativos esporulados con pesos moleculares de 246 216 y 180 pb aproximados

que pertenecen a los genes cry1Aa cry1Ab y cry1Ac (Mezcla A) indicando la diversidad de estos genes ademaacutes se observa en todos los carriles que el frag-mento de 246 pb que identifica el gen cry1Aa es el de mayor presencia en los aislamientos y el gen cry1Ac de 180 pb se presenta en menor nuacutemero de bacilos nativos esporulados evaluados (Figura 5) adicionalmente la banda inespeciacuteficas de 517 pb que se presentan tam-bieacuten estuvo presente en el estudio realizado por Ceroacuten et al (1994) quienes disentildearon los oligonucleoacutetidos para esta reaccioacuten

Figura 5 Productos de la amplificacioacuten por PCR de genes especiacuteficos cry1 en cepas de referencia y cepas nativas utilizando la mezcla A de oligonucleoacutetidos cry1Aa cry1Ab y cry1Ac con pesos moleculares en pb de 246 216 y 180 pb Carril 2) Bt var kurstaki HD1 Carril 3) Control negativo Carril 4 5 6 7 8 9 10 11 12 y 13) bacilos nativos esporula-dos 4 9 11 14 24 57 61 75 76 y MP) Marcador de peso molecular Hyper Ladder II Gel de Agarosa al 3 tentildeido con bromuro de etiacutedio

Con la segunda reaccioacuten mezcla B se identificaron bandas con pesos moleculares de 367 130 y 290 pb pertenecientes a los genes cry1B cry1C y cry1D tam-bieacuten se identifica la gran diversidad de estos genes en

los bacilos nativos esporulados evaluados identifican-do el gen cry1C en el fragmento de 130 pb en la mayo-riacutea de bacilos nativos esporulados evaluados (Figura 6)


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Figura 6 Productos de la amplificacioacuten por PCR de genes especiacuteficos cry1 en cepas de referencia y cepas nativas utilizando la mezcla B de oligonucleoacutetidos cry1Ba cry1Ca y cry1Da con pesos moleculares en pb de 367 130 y 290 pb Carril 2) Bt var aizawai HD137 3) Control negativo Carril 4 5 6 7 8 9 10 11 12 y 13) bacilos nativos esporulados 11 14 24 49 61 75 76 77 y 86 MP) Marcador de peso molecular Hyper Ladder II Gel de Agarosa al 3 tentildeido en bromuro de etiacutedio

Adicionalmente se encontroacute que de los 35 bacilos nativos esporulados 29 bacilos presentaron diferentes perfiles de genes observando aislamientos desde 1 has-ta 5 genes cry1 especiacuteficos por lo que fue necesario realizar agrupaciones encontrando los siguientes grupos de genes cry1 especiacuteficos I) cry1Aa II) cry1Aa Ab Ac B III) cry1Aa Ab Ac B Ca IV) cry1Aa Ab Ac C V) cry1 Aa Ab B C VI) cry1Aa Ab B D VII) cry1Aa Ac B C VIII) cry1Aa Ac C D IX) cry1Aa B X) cry1Aa C XI) cry1Aa C D XII) cry1Ab XIII) cry1C XIV) bacilos nativos esporulados que amplifi-caron cry1 pero no la mezcla de oligonucleoacutetidos rea-lizada (NA)

Ademaacutes la presencia de los bacilos nativos esporula-dos y su clasificacioacuten con el perfil de genes encontra-dos tambieacuten fue independiente del lugar de origen ya que se encontraron bacilos nativos esporulados con maacutes

de un grupo de clasificacioacuten en las distintas regiones muestreadas (Tabla 4)

Los genes maacutes ampliamente distribuidos son los genes cry1 los cuales presentan actividad contra insectos le-pidoacutepteros (41) En el presente estudio se encontroacute que los genes ampliamente distribuidos en los bacilos nati-vos esporulados analizados son los genes cry1Aa con un 76 seguido del gen cry1B con un 35 cry1C con un 32 cry1Ab con un 26 cry1Ac con un 21 y cry1D con un 88 Estos resultados concuerdan con los resultados obtenidos por Chack et al (1994) quie-nes encontraron en 225 aislamientos nativos evaluados la presencia de genes cry1Aa cry1Ab cry1Ac en un 564 En Meacutexico Bravo et al (1998) encontraron en 496 aislamientos evaluados la presencia de los genes cry1Aa cry1Ab cry1Ac en un 197



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Tabla 4 Perfil de genes cry1 especiacuteficos identificados en bacilos nativos esporulados en cada uno de los municipiosmuestreados

Seleccioacuten de bacilos nativos para el montaje de bioensayos contra Tuta absoluta

La relacioacuten entre la caracterizacioacuten microscoacutepica bio-quiacutemica y molecular pueden ser complementarios de-bido a que son herramientas que permiten identificar si los aislamientos obtenidos de distintas fuentes de recoleccioacuten pertenecen a B thuringiensis y pueden presentar actividad bioloacutegica frente a una plaga deter-minada Por ejemplo la forma de los cristales de las diversas cepas de B thuringiensis ha sido relacionadas con su actividad bioloacutegica aunque esta uacuteltimamente ha sido cuestionada (44) sin embargo en la caracteriza-cioacuten bioquiacutemica y de acuerdo con el perfil electrofo-reacutetico que presente se puede determinar si los crista-les observados tienen la presencia de pesos similares a las proteiacutenas Cry que se pueden clasificar con posible actividad frente a un orden de insecto y por uacuteltimo la caracterizacioacuten molecular que indica la probabilidad de que los genes cry que se identifiquen mediante la prue-ba de PCR se esteacuten expresando activamente en una cepa determinada (11) Para la seleccioacuten de los bacilos nativos esporulados a evaluar bioloacutegicamente se tuvo en cuenta el nuacutemero de cristales que tuvieran en los conteos entre 10-20 y maacutes de 20 cristales por campo oacuteptico Esta caracteriacutestica es muy importante porque los cristales estaacuten compuestos

por las proteiacutenas Cry y son estas las que desarrollan en principio la toxicidad que se aumenta con la entrada de esporas al hemocele de la larva El nuacutemero y peso de proteiacutenas ya que las toxinas Cry1 estaacuten relacionadas con pesos de 130-135 kDa y las toxinas Cry2 tambieacuten activas contra insectos lepidoacutepteros poseen pesos entre 60-70 kDa Y por uacuteltimo el nuacutemero y tipo de genes cry1 presentes Los bacilos nativos seleccionados (Tabla 13) presentan 2 o maacutes formas de cristal eligiendo preferen-cialmente la forma redonda yo bipiramidal (ocho ba-cilos) que seguacuten la literatura presenta actividad frente al orden lepidoacuteptera ademaacutes de otras formas de cristal como redondas amorfas y triangulares para relacionar la posible actividad insecticida y las formas de cristal potenciales para el control de Tuta absoluta

Se seleccionaron bacilos que por su perfil electroforeacuteti-co hubieran revelado entre 2 a 5 proteiacutenas clasificadas en grupos con actividades potenciales contra insectos lepidoacutepteros y que estuvieran relacionadas por peso con las proteiacutenas Cry de las cepas de referencia Bt var kurstaki y Bt var aizawai que en los ensayos prelimi-nares mostraron alta toxicidad contra larvas de la polilla del tomate Cuatro aislamientos revelaron 5 bandas de proteiacutenas dos revelaron cuatro uno revelo tres y por uacuteltimo tres revelaron uacutenicamente 2 bandas de proteiacutena (Tabla 13)


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La caracterizacioacuten molecular mediante PCR permitioacute seleccionar aislamientos que conteniacutean entre 4 a 5 ge-nes cry1 Seis aislamientos presentaron el gen cry1C que de acuerdo a investigaciones previas es el gen que codifica una toxina Cry activa bioloacutegicamente a esta plaga ademaacutes de otras combinaciones de genes (45) (Tabla 13) Los genes maacutes presentes en todas las cepas fueron el gen cry1Aa (en nueve de los aislamientos) el cry1Ab (en seis aislamientos) y los genes cry1Ac y cry1B (en cinco aislamientos) En total se selecciona-ron 9 perfiles de genes diferentes que podriacutean mostrar la respuesta bioloacutegica de coacutemo estaacuten actuando las toxinas codificadas contra larvas de 2do instar de Tuta absoluta

De acuerdo al criterio anterior se seleccionaron 10 bacilos nativos esporulados (ZCUJTL9 ZCUJTL11 ZBUJTL24 ZBUJTL39 ZSUJTL57 ZSUJTL75 ZSUJTL76 ZSUJTL77 ZSUJTL86 y ZSUJTL96) con el fin de identificar su posible actividad frente al insecto plaga del tomate T absoluta

Obtencioacuten y cuantificacioacuten de proteiacutenas totales de los extractos crudos

Para obtener la mayor produccioacuten de esporas y crista-les en los 10 bacilos nativos esporulados seleccionados se realizoacute el procedimiento descrito por Ramos et al (2004) Se empleoacute el medio de cultivo leche peptoniza-da modificada en el que los bacilos nativos esporulados obtienen con la triptona y dextrosa los requerimientos de carbono y energiacutea necesarios para su crecimiento con el extracto de levadura los aminoaacutecidos esencia-

les para su desarrollo y esporulacioacuten (46) Las sales MgSO47H2O FeSO47H2O ZnSO47H2O MnSO4 permiten aumentar la produccioacuten de las δ -endotoxinas (16) que con la agitacioacuten a 340 rpm a 28degC durante 72 horas facilitoacute la autolisis de la ceacutelula liberando las esporas y los cristales en gran cantidad (15) que final-mente se cuantificaron en una curva de albuacutemina de suero bovina (47) (Anexo 5) La ecuacioacuten de la recta para esta regresioacuten fue ldquoy=00008x - 00052rdquo y el coefi-ciente de correlacioacuten (R2) para esta ecuacioacuten fue 099

Con esta curva se correlacionoacute las lecturas de absorban-cia a 595 nm registradas para las distintas concentracio-nes de proteiacutena total de los bacilos nativos selecciona-dos y la cepa de referencia Bt var kurstaki HD1

Caracterizacioacuten Bioloacutegica

Tuta absoluta posee un alto potencial reproductivo produciendo entre 10-12 generaciones por antildeo El ciclo bioloacutegico se completa en 29-38 diacuteas dependiendo de las condiciones ambientales El desarrollo se da hasta en 76 diacuteas a 14degC 39 a 197degC y 23 a 271degC (48) Obser-vaciones en campo coinciden con estas descripciones sin embargo las jaulas mantenidas en el CIAA estaacuten sometidas a temperaturas variables altas durante el diacutea y muy bajas durante la noche condicioacuten que prolonga el desarrollo de las larvas llegando a estar entre 50-60 diacuteas

-Bioensayos discriminatorios para la evaluacioacuten de bacilos nativos esporulados preseleccionados

Figura 7 Mortalidad de las larvas de Tuta absoluta tratadas con los diferentes extractos crudos de los bacilos nativos espo-rulados prueba de Tukey 95 de confianza Tratamientos con la misma letra no presentan diferencias significativas



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La concentracioacuten utilizada para este bioensayo fue 08 microg proteiacutena totalml dosis de referencia teniendo en cuenta los resultados obtenidos por Pitre et al (2008) quien determinoacute la CL50 para la cepa de referencia Bt var kurstaki HD1 con un valor de 0846 microg de proteiacutenacm2 sobre larvas de primer instar de Tecia solanivora insecto lepidoacuteptero

La evaluacioacuten de los bacilos nativos seleccionados mos-troacute un incremento en la mortalidad de las larvas de Tuta absoluta a medida que aumentaban los diacuteas despueacutes de la aplicacioacuten (DDA) del extracto crudo La mayor mor-talidad de larvas despueacutes de 6 DDA se obtuvo con el bacilo nativo esporulado ZBUJTL39 con un porcentaje de mortalidad del 427 seguido del bacilo nativo es-porulado ZCUJTL11 que presentoacute una mortalidad de 3633 y el bacilo nativo esporulado ZBUJTL24 con un porcentaje de mortalidad de 2378 Con la cepa utilizada como control positivo HD1 (cepa regenera-da desde el producto comercial Dipel) se presentoacute una mortalidad de 2939 (Figura 7) En el tratamiento tes-tigo se evidencioacute una mortalidad de las larvas de 694 lo que indica que la mortalidad de los tratamientos co-rrespondientes a los diferentes bacilos nativos esporula-dos se debe probablemente a la aplicacioacuten del extrac-to crudo de los aislamientos evaluados en el presente bioensayo debido a que un porcentaje mayor del 10 de mortalidad en el testigo absoluto en bioensayos con insectos del orden lepidoacuteptera es un criterio para inva-lidar la prueba (49)

Teniendo en cuenta estos resultados se puede sugerir que la actividad biocontroladora que presenta el bacilo nativo esporulados ZBUJTL39 es mayor a la presenta-da por la cepa de referencia (HD1) Lo anterior posi-blemente se debe a que este microorganismo presenta mayor afinidad por este insecto (Tuta absoluta) ademaacutes de estar mejor adaptado a las condiciones medioam-bientales de nuestro paiacutes El bacilo nativo esporulado

ZCUJTL11 tambieacuten presentoacute porcentajes de mortali-dad superiores a la cepa de referencia no obstante en la prueba de comparacioacuten de Tukey no presentoacute diferen-cias significativas con HD1 (Figura 7) lo que sugirioacute la realizacioacuten de ensayos de concentracioacuten letal 50 para determinar el verdadero potencial que presentan estos bacilos nativos esporulados sobre el control de Tuta ab-soluta

Con los resultados preliminares obtenidos se selec-cionaron los bacilos nativos esporulados ZCUJTL11 y ZBUJTL39 para ser utilizados en la determinacioacuten de la concentracioacuten letal 50 debido a que presentaron mortalidades significativamente superiores a la cepa de referencia HD1 y a los demaacutes bacilos nativos esporula-dos ademaacutes de presentar un alto potencial para su utili-zacioacuten en el control de la plaga

Concentracioacuten Letal 50 (CL50)

Se utilizoacute como dosis de referencia el valor utilizado en la evaluacioacuten de las cepas preseleccionadas el cual fue de 08 microgml debido a que a esta concentracioacuten no se obtuvieron mortalidades del 100 A partir de este dosis se manejaron intervalos de 08 unidades hasta la concentracioacuten 48 microgml El bioensayo contoacute con un testigo absoluto y el control positivo correspondiente a la cepa de Bt var kurstaki HD1

Los resultados de mortalidad obtenidos con las diferen-tes dosis de los bacilos nativos esporulados evaluados fueron sometidos a un anaacutelisis Probit con el programa Bioestat 2007 Para todos los bacilos nativos esporula-dos evaluados el valor de P fue mayor a 005 lo que permite aceptar la hipoacutetesis propuesta que sugiere que existe una correlacioacuten lineal entre la dosis y la respuesta evaluada correspondiente a la mortalidad de las larvas (Figura 8) (Tabla 5)


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Figura 8 Mortalidades obtenidas en la evaluacioacuten dosis- respuesta de los bacilos nativos esporulados sobre larvas de T absoluta a bacilo nativo 11 b bacilo nativo 39 c Cepa de referencia HD1



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Tabla 5 Concentraciones letales 50 (CL50) de las cepas nativas y de referencia Cepa 11 Cepa 39 y Bt var kurstaki HD1 sobre larvas de 2do instar de Tuta absoluta con liacutemites de confianza al 95

En el presente estudio se identificaron insectos con co-loraciones grises oscuras y negras ubicadas en la par-te media del intestino y en los uacuteltimos segmentos del cuerpo sintomatologiacutea que produce los aislamientos de B thuringiensis (Figura 9) Este resultado se corroboro con la prueba de efectividad donde se observaron co-lonias tiacutepicas de los bacilos nativos esporulados eva-luados y se establecioacute que la muerte de las larvas no fue producida por un efecto de la manipulacioacuten agente antimicrobiano o alguacuten microorganismo externo

Esta coloracioacuten es ocasionada por los tejidos necrosa-dos debido al incremento de la actividad secretora de las ceacutelulas del epitelio intestinal dantildeo mecaacutenico a la ruptura de las ceacutelulas epiteliales al deterioro de las ceacute-lulas columnares y basales y a la posterior separacioacuten de estas de las ceacutelulas y microvellos intestinales e inva-sioacuten de los fluidos intestinales en la hemolinfa y flaci-dez corporal (50)

Figura 9 Larva de Tuta absoluta muerta debido a intoxica-cioacuten con el complejo espora-cristal (extracto crudo)

La identificacioacuten del bacilo nativo ZCUJTL11 es de gran importancia para el cultivo del tomate en Colom-bia ya que abre la posibilidad del control bioloacutegico de Tuta absoluta apoyando las acciones integradas de MIP para este lepidoacuteptero plaga El estudio para la produc-cioacuten de un biopesticida basado en este bacilo debe ha-cerse con miras a brindarle una posible solucioacuten a la comunidad de campesinos y agricultores que viven de este cultivo tan importante para el Paiacutes Las caracteriacutes-ticas sobresalientes de este bacilo que presentoacute cristales bipiramidales y romboidales iguales a los producidos por la cepa de referencia Bt variedad kurstaki HD1 Pro-dujo tres bandas de proteiacutenas sobresalientes con pesos de 35 50 y 75 kDa La proteiacutena de 75 kDa puede estar relacionada con toxicidad hacia insectos lepidoacutepteros plaga ya que las protoxinas de 125-135 kDa se clivan en proteiacutenas toxicas activas de 60 a 80 kDa Los genes cry identificados en este bacilo fueron cry1Aa cry1Ab cry1Ac cry1Ba y cry1Ca al parecer el gen cry1Ab esta relacionado con toxicidad sobre larvas de Tuta absoluta En un trabajo previo Theodoluz et al (2003) evaluando proteiacutenas Cry1Ab recombinantes observoacute DL50 entre 10 y 182 microgml lo que confirma el potencial biocontro-lador del aislamiento ZCUJTL11 con el que se obtuvo una DL50 de 24 microgml de extracto crudo de proteiacutenas totales Es de anotar que si el bioensayo se realiza con proteiacutenas recombinantes de este aislamiento nativo la DL50 estariacutea muy por debajo de este valor obtenido

Adicionalmente se conformo un banco de cepas de Ba-cilos esporulados la cual se encuentra almacenado en la Universidad Jorge Tadeo Lozano El banco de cepas se registroacute como bacilos Gram positivos esporulados debido a que es necesario establecer si son o no son ais-lamientos de Bacillus thuringiensis Para lo anterior se sugiere realizar la prueba del antiacutegeno flagelar (H) o una PCR en tiempo real con el fin de establecer correcta-mente su especie


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Conclusiones

-La caracterizacioacuten microscoacutepica de aislamientos de B thuringiensis por medio de tinciones diferenciales como la safranina y el verde de malaquita permiten re-conocer la forma tamantildeo y cantidad relativa de esporas y cristales identificando las diferentes morfologiacuteas de cristal

-Al parecer la forma del cristal es dependiente del me-dio de cultivo en el que se cultive los bacilos y ademaacutes es independiente de su actividad bioloacutegica frente a un insecto plaga

-La metodologiacutea SDS PAGE permite identificar bandas de proteiacutenas con pesos moleculares similares a las pro-

teiacutenas Cry a partir de extractos crudos de aislamientos nativos y con esto predecir la actividad bioloacutegica po-tencial de acuerdo a grupos establecidos -La amplificacioacuten por PCR con la utilizacioacuten de oli-gonucleoacutetidos universales disentildeados en zonas de alta homologiacutea de los genes permitioacute la identificacioacuten de genes de la familia cry1 en aislamientos nativos espo-rulados

-La amplificacioacuten por PCR muacuteltiple utilizando oligo-nucleoacutetidos especiacuteficos disentildeados en zonas hipervaria-bles de los genes permitioacute la identificacioacuten de los genes cry1Aa cry1Ab cry1Ac cry1Ba cry1Ca y cry1Da en aislamientos nativos esporulados

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ABSTRACT

Were collected 28 soil samples in 14 municipalities in Colombia Sporulated bacillus were isolated characteri-zed microscopically by quantifying crystals Isolates positive for crystals were subjected to biochemical charac-terization by electrophoresis of total proteins (SDS-PAGE) The strains positive for the presence of cry1 genes were subjected to two rounds of M-PCR with two oligonucleotide mixtures recognizing specific genes 6 99 bacillus were isolated forms filed with amorphous crystals bipiramidal square round and triangular Bacillus were observed with 1 2 3 and 4 forms of glass with 18 different profiles For SDS showed protein bands of 28 to 150 kDa in 7 classified by their potential biological activity resulting in 28 different profiles 35 sporulated ba-cillus showed cry1 genes and these were detected by M-PCR gene cry1Aa cry1Ab cry1Ac cry1B cry1C and cry1D in 76 26 21 35 32 and 88 respectively According to these characterizations 10 isolates were selected as promising for the control of Tuta absoluta and challenged against the 2nd instar larvae of this insect pest Strain ZBUJTL39 and introduced ZCUJTL11 better biological activity that the reference strain Bt var kurstaki HD1 strain ZCUJTL11 presented a LC50 of 24 mg ml (P lt005) The methodology selected strains according to their potential biological activity as a preliminary step to biological tests this result is promising for further research into genetic engineering of tomato cultivars to obtain resistant to Tuta absoluta

Keywords Bacillus thuringiensis Tuta absoluta Lycopersicum esculentum SDS-PAGE PCR biological tes-ting

INTRODUCCIOacuteN

El tomate (Lycopersicon esculentum Millano) es uno de los cultivos maacutes importantes en Colombia esta hor-taliza presenta gran demanda en la dieta alimenticia y genera empleo e ingresos no soacutelo en el campo sino tambieacuten en la agroindustria Las variedades maacutes culti-vadas son Milano y Chonto que se producen entre 600 y 1200 msnm (1) En Colombia la superficie destinada a este cultivo fue aproximadamente de 15881 hectaacutereas (ha) con una produccioacuten de 420419 toneladas (ton) y un rendimiento de 265 tonha en el antildeo 2006 (wwwagronetgovco)

Esta solanaacutecea es afectada por una gran cantidad de pla-gas y enfermedades dentro de las cuales se destaca el dantildeo causado por las larvas de Tuta absoluta (Lepidop-tera Gelechiidae) El cogollero del tomate Tuta absolu-ta es considerado una de las plagas de gran importancia econoacutemica del tomate en Colombia (Corporacioacuten Co-lombiana de Investigacioacuten Agropecuaria CORPOICA http intranetcorpoicaorgco) el dantildeo causado por T absoluta en plantas de tomate representa un 27- 43 (2) debido a que afecta directamente la produccioacuten del cultivo Este dantildeo es causado por larvas de la plaga que minan el follaje y los tallos de las plantas y atacan las hojas joacutevenes ramas perforando ademaacutes flores y frutos (3 1) lo que ocasiona un debilitamiento gradual en la planta disminuyendo su potencial productivo

Para el control de T absoluta los agricultores utilizan principalmente insecticidas quiacutemicos que ocasionan efectos nocivos al ambiente generacioacuten de resistencia aparicioacuten de residuos quiacutemicos en los alimentos conta-minacioacuten de las aguas eliminacioacuten de la fauna beneacutefica y problemas para la salud humana Como alternativa para el control sostenible de plagas se encuentra el Manejo Integrado de Plagas (MIP) uno de los componentes del MIP es el control bioloacutegico de plagas del cual hace parte el uso de microorganismos entomopatoacutegenos que ha logrado gran desarrollo a nivel mundial debido a los avances en su industrializacioacuten y presenta un menor impacto ecoloacutegico

Dentro de los entomopatoacutegenos mas utilizados se en-cuentra la bacteria Bacillus thuringiensis (Bt) domi-nando el 90 del mercado mundial de bioplaguicidas (4) Bt es una bacteria aeroacutebica Gram positiva que se caracteriza por la produccioacuten de cristales paraesporales compuestos por Proteiacutenas Insecticidas de Cristal ICPacutes (del ingles Insecticidal Crystal Proteins) (5) Bt posee alta especificidad sobre larvas de insectos de los orde-nes lepidoacuteptera diacuteptera y coleoacuteptera (6) recientemente se comproboacute su efecto sobre individuos de himenoacutep-tera hemiptera maloacutefaga ortoacuteptera y otros grupos de organismos como nemaacutetodos aacutecaros protozoarios (4) babosas y caracoles (7) Ademaacutes otras toxinas no insec-ticidas ni hemoliacuteticos que presenta Bt han mostrado ac-tividad sobre ceacutelulas canceriacutegenas humanas (8 9) Bt


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