Agilent 1100 Agilent 1100 纯化系统纯化系统

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制备液相的操作制备液相的操作

• 分析型液相与制备型液相的区别

•（半）制备液相方法的建立

• 制备液相操作技巧及注意事项

• Agilent 1100 样品纯化解决方案介绍

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HPLCHPLC 术语术语

> 5 mL/min5~10 mm半制备液相色谱

1.5 ~ 5 mL/min3~5 mm常规液相色谱

500 ~ 1500 µL/min2 ~ 3 mm小口径（窄口径）液相色谱

100 ~ 500 µL/min1 ~2 mm微孔液相色谱

1 ~100 µL/min0.1~ 1mm毛细管液相色谱

< 50 nL/min< 20 µm开管液相色谱 ( 纳流液相色谱 )

典型流速柱内径种类

> 10 mL/min> 10mm制备液相色谱

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高压制备与中高压制备与中 // 常压制备的比较常压制备的比较

高压制备1. 可使用与分析柱相同的细粒径填料，柱效高，组分分离

度高；2. 分离重现性好；3. 节约分析时间及成本。

中 / 常压制备1. 只能使用较粗的填料，柱效低，对组分的分离度有限；2. 分离影响因素多（柱装填的均匀性，柱效，填料质量

，流量稳定性及准确性等）；3. 时间消耗多。

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分析液相与制备液相的比较分析液相与制备液相的比较

分析型液相目的 : 组分的定性定量

低流速 (< 2 ml/min)

色谱柱内径小 (< 5 mm)

系统管路 (0.12 ～ 0.17 mm I.d)

流通池光程 (5~10 mm)

制备型液相目的 : 组分的分离纯化半制备液相流速较低 (< 10 ml/min)

柱内径较小 (< 10 mm)

制备液相高流速 (> 10 ml/min)

柱内径大 (> 10 mm)

系统管线（ 0.5mm, I.d)

低流速将导致更大的扩散流通池光程 (3 、 0.3 或 0.06 mm)

避免检测器的饱和，灵敏度降低，便于增加进样量

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纯化过程纯化过程

复杂样品纯化

不同的组分群

目标组分达到一定含量及纯度要求

高压制备分离纯化

Y

N

溶剂提取结晶常压和 / 或中压色谱分离

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液相制备的工作步骤液相制备的工作步骤

1 优化分析方法 :对目标制备组分的分离度控制在 1.5 ～ 3 之间

min5 10 15 20 25 30

mAU

0

50

100

150

200

250

300

分离度 1.5 ~ 3

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色谱柱的过载Vinj

Vinj

Vinj Vinj

Vinj

样品分析

体积过载

浓度过载

2 在分析柱上进行过载试验在分析柱上进行过载试验

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分析柱上的过载试验分析柱上的过载试验

Column 3 x 150 mm Zorbax SB-C18, 5 µmMobile Phases Water = A

Acetonitrile = BFlow Rate 0.6 ml/minIsocratic 10 % BUV Detector DAD: 270 nm/16 (Reference 360 nm/100)

Standard cell (Pathlength 10 mm)Oven Temperature AmbientStop Time 15 min

进样量

0.025 µg each0.25 µg each2.5 µg each25 µg each250 µg each

min2 4 6 8 10 12 14

mAU

0

1000

2000

3000

4000

5000

500 µg each

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制备制备放大的计算放大的计算

分析柱：Zorbax SB-C18 3x150 mm, 5 µm流速 : 0.6 ml/min进样量 : 500 µg

V1 = 分析柱的流速 = 0.6 ml/min

x1 = 分析柱最大上样量 = 500 µg

r1 = 分析柱内径 = 1.5 mm

V2 = 制备柱的流速＝？x2 = 制备柱最大上样量 =?

r2 = 制备柱内径 =10.6mm

CL = 柱长比 = 1

22

21

2

1

r

r

V

V

LCr

x

r

x 12

2

22

1

1

制备柱 : Zorbax SB-C18 21.2x150 mm, 5 µm流速 : ~30 ml/min进样量 :25 mg

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制备制备放大试验放大试验

min0 2 4 6 8 10

mAU

0

500

1000

1500

2000

Column 21.2 x 150 mm Zorbax SB-C18, 5 µmMobile Phases Water = A

Acetonitrile = BFlow Rate 25 ml/minIsocratic 10 % BUV Detector DAD: 270 nm/16 (Reference 360 nm/100)

Preparative cell (Pathlength 3 mm)Oven Temperature AmbientStop Time 15 min

影响硅胶填料反相色谱柱性能的参数影响硅胶填料反相色谱柱性能的参数

•硅胶类型： 不定形硅胶，球形硅胶 柱容量，充填均匀度 •硅胶纯度： 金属含量，填料酸性 峰形•填料颗粒尺寸：粒径大小分布，均匀度 充填均匀度，流速相关性•填料孔径： 7 ～ 12nm ， 30nm 适用的化合物分子量范围•键合密度： 含碳量 容量因子，保留时间•键合方式： 键合相修饰 选择性，水性流动相的耐受性•柱填料量： 柱床实密性 柱容量 •封端技术： 屏蔽硅醇基， 碱性化合物的峰形，选择性 消除二次化学平衡效应因此，并非所有 C18 柱都相同，

分析柱和制备柱应选择相同的填料！！

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产量

纯度 通量

制备参数的关系制备参数的关系

10 min

产量：进样量，组分收集参数设定

浓度，体积，样品溶解性能，组分含量，回收率，柱容量

30 min

纯度：分离度柱效，进样量，分离条件

6 min

通量：分析时间分离条件，样品复杂程度

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制备产率制备产率

可使用 3.0~50mm 内径的色谱柱，分析和制备在同一套系统上完成，便于方法的建立和转换；每次进样“产量”与多种因素相关，用户可通过多次进样，以及累积收集功能，获得纯度及产率满意的纯化合物。

产量＝样品浓度进样体积组分含量收集回收率累积次数 样品浓度：化合物的溶解性能（溶剂、温度、样品纯度等） 进样体积：柱容量，流通池设计 收集回收率：分离条件，组分收集触发参数的设定 累积次数：分析时间，容器的容量

梯度延迟体积梯度延迟体积

min0 5 10 15 20 25

0

200

400

600

800

1000mAU

梯度起点

高压混合梯度 低压混合梯度

滞后时间

延迟体积：二元泵 400uL 四元泵 1000uL

Vdelay=Vmixer+Vpre-column

建议：测定不同系统的延迟体积，并通过调节梯度的起始时间，以便在不同仪器上获得重现的色谱图

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柱前延迟体积的影响柱前延迟体积的影响

min0 2 4 6 80

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600梯度曲线

23

4

51100 制备泵

min0 2 4 6 8

0

200

400

600

800

1000

1200 相对延迟

32

其它制备泵梯度曲线

因此，在不同系统之间进行方法转换，需分别测定系统延迟体积因此，在不同系统之间进行方法转换，需分别测定系统延迟体积

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柱后延迟体积对自动组分收集的影响柱后延迟体积对自动组分收集的影响

UV 检测器

MS 检测器

组分收集器

由于管线连接的不同长度，流分到达组分收集器的时间将与信号被检测的时间（保留时间）存在不同的滞后，如果根据保留时间收集将导致组分收集的错误甚至缺失，因此，进行延迟体积的校正是非常必要的。

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Calc Delay Vol. 384L

延迟体积的自动计算及校正延迟体积的自动计算及校正

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min0 1 2 3 4 5 6

mAU

0

500

1000

1500

2000

2500 4.2

44

4.8

00

254nm

min0 1 2 3 4 5 6

mAU

0

500

1000

1500

2000

3.2

76

4.2

42

4.8

20

205nm

检测波长影响检测波长影响

分离度 组分交叉收集 严重干扰组分纯度及产率

波长选择不当

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用户应用实例用户应用实例

min0 2 4 6 8 10

mAU

0

500

1000

1500

2000

2500

6.4

23

7.1

68

Inj. 10mg/mL, 150uL分析柱： Zorbax XDB C18 4.6250mm进样量： 10mg/mL150 L

min0 1 2 3 4 5 6

mAU

0

500

1000

1500

2000

2500 4.2

44

4.8

00

254nm制备柱： Zorbax XDB C18 21.2150mm进样量： 40mg/mL400 L

分析进样量： 1.5mg

制备进样量：20mg

或相同浓度进样体积：

2mL

溶解度及进样体积限制

每次进样 16mg

理论计算

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样品纯化技巧以及注意事项样品纯化技巧以及注意事项•尽量采用浓度过载方式上样：有利于防止因样品在柱头

扩散而降低柱效；•所有连接管线，尤其柱后管线尽可能短，避免不必要的

峰扩散，影响收集效率；• 采用装填细粒径填料的制备柱（ 7m 或 5m ），保证良好的柱效，高分离效能，缩短分析时间；

• 准确设定组分收集的触发参数，避免因收集位点的偏移影响组分纯度及产率；

•采用高质量的溶剂作为流动相：防止溶剂中带入不可知的杂质；

•注意所有容器的洁净度，防止不可预知的杂质污染。