Agaroz Jel Elektroforezi & İki Boyutlu Jel Elektroforez
-
Upload
06aydin -
Category
Technology
-
view
4.894 -
download
5
Transcript of Agaroz Jel Elektroforezi & İki Boyutlu Jel Elektroforez
Agaroz Jel Elektroforezi
&
İki Boyutlu PAGE Jel
Elektroforezi (2D PAGE)
Mesut Akpunar
Jel elektroforezi, makro molekülleri büyüklük, elekterik yükü, ve diğer fiziksel özellikler temelinde ayıran bir yöntemdir.
Elektroforez (elektrophoresis) terimi yüklü partiküllerin elektrik akımı etkisi altında hareketini açıklamaktadır.
Elektro (electro) elektriğe karşılık gelir, forez (phoresis) anlamı karşıya geçirmek /taşımak olan Yunanca bir kelimedir.
Jel elektroforezi elektrik varlığında hareketlenen moleküllerin jel boyunca karşıya hareket ettiği bir tekniği tanımlar
Birçok biyolojik makromolekül (ör. Amino asitler, peptitler, proteinler,
nükleotidler ve nükleik asitler) iyonlaşabilen gruplara sahiptir ve pH’a bağlı
olarak çözeltide katyon (+) ya da anyon (-) biçiminde elektrik yükü taşıyan
türler olarak bulunurlar.
Elektrik alana maruz kaldıklarında bu moleküller anyon veya katyon
ağırlıkları farklarına göre birbirinden yük\ kütle oranına uygun olarak
ayrılırlar.
Elektroforez Çeşitleri
• a. Agaroz Jel Elektroforez
• b. Sellüloz Asetat Elektroforez
• c. Poliakrilamid Jel Elektroforez
• d. Isoelektrik Odaklama
• e. Iki Yönlü Elektroforez
• f. Kapiller Elektroforez
Agar/Agaroz Jel Elektroforezi
Agaroz jel elektroforezi DNA moleküllerinin ayrımı,
tanımlanması ve saflaştırılması için kullanılan standart bir
yöntemdir.
Teknik -basit, hızlı ve diğer prosedürlerle ayrıştırılamayan DNA
fragmanlarını çözebilme yeteneğindedir.
Ayrıca DNA’nın jeldeki konumu, düşük konsantrasyonlarda
floresan veren Etidyum bromid ile boyayarak belirlemek
mümkündür.
Agaroz jel elektroforezinin fizksel özellikleri
Makromoleküllerin ayrılması iki değişkene bağlıdır; yük ve
kütle.
DNA bir tampon çözeltiye karıştırılıp jele uygulandığı zaman
bu iki değişken birlikte rol oynar.
Bir elekrottan gelen elektrik akımı, molekülleri iterken aynı
anda diğer elektrot molekülleri kendine doğru çeker.
Jeldeki sürtünme kaynaklı ayrım gücü molekülleri
büyüklüklerine göre ayırarak ‘’moleküler elek’’ görevi yapar.
Elektriksel alan altında hareket oranları;
•Alanın gücüne
•Moleküllerin büyüklüğü ve şekline
•Örneklerin göreceli hidrofobitesine
•Moleküllerin içinde hareket ettiği tamponun iyonik kuvveti ve
sıcaklığı
Aynı zaman da yüklü moleküllerin hareketini yavaşlatan,sürtünmeden doğan birde direnç vardır.
Direnç fonksiyonunu etkileyen faktörler;
• Moleküllerin hidrodinamik büyüklüğü
• Molekülün şekli
• Elektrofrez için kullanılan ortamdaki por büyüklüğü
• Tampon yoğunluğu
Agaroz jel elektroforezinin kullanım alanları
Jel elektroforez ile;
Serum proteinleri
Nükleik asitler
Hemoglobin varyantları
Laktat dehidrogenaz ve
kreatinkinaz izoenzimleri
DNA ve RNA calışılabilir
Çalışma Alanları
• PCR
• RFLP
• Jel Ekstraksiyonu
Agaroz jel elektroforez bileşenleri
1. AGAROZ
2. TAMPON ÇÖZELTİ
3. ETİDYUM-BROMÜR
4. MARKER
5. YÜRÜTME TAMPONU
• Deniz yosunundan ekstrakte edilen doğal
bir kolloittir.
• Büyük Por çapına sahiptir
• Çok hassastır ve elle dokunulduğunda
kolayca bozulabilir.
• 200 kDa’dan daha büyük moleküllerin
ayrılmasında kullanılır.
Hazırlanışı:
• Agoroz jel kuru toz halindeki agorozun,
sıvı tampon içine konması ve berraklaşana
kadar kaynatılması ile oluşur.
Agaroz
Belirli büyüklükteki bir DNA parçası agarozun konsantrasyonuna
bağlı olarak Jel içinde farklı hızlarda hareket eder.
•Düşük agaroz konsantrasyonu büyük DNA’ların ayrılmasını
sağlarken
•Yüksek agaroz konsantrasyonu küçük DNA’ların ayrılmasını
kolaylaştırır.
• DNA’nın elektroforetik
hareketliliği tamponun
kompozisyonuna ve iyonik
gücüne göre değişir.
• Tris-borat-EDTA
Elektroforez Tamponu
Hazırlanışı;
• 108gr Tris
• 55 gr Boric asid 900ml distile su içinde çözülür.
• Üzerine 40ml 0,5M pH=8 EDTA eklenir.
• 1 Litreye tamamlanır.
Etidyum-bromür
• EtBr bir interkalasyon ajandır.
• DNA’nın içine kendini çok küçük bir
çizgi halinde yerleştirir orda kalır
• UV ışığının altında parlak bir bant
halinde görülmesini sağlar.
• Ayrıca EtBr, DNA’ya bağlanıp onun
ağırlığını ve sertliğini değiştirdiği gibi
onun hareket kabiliyetini de etkiler.
NOT
• Etidyum bromid güçlü bir mutajen/karsinojendir ve orta düzeyde toksiktir. Etidyum
bromid içeren jellere ve solüsyonlara elle dokunurken mutlaka eldiven giyilmelidir
• Ağırlığı bilinen DNA parçaları içerir.
• DNA’ların büyüklüğünü saptamayı kolaylaştırır.
• 100Bp
• 50Bp
500 bp
100 bp
150bp
50bp
Mark e r
Stoktan Marker hazırlanması;
• 10ml-boya
• 10ml-stok
• 80ml-dH2O
NOT
• -20 de saklıyoruz!....
Bromofenol mavi kullanıyoruz.
Yürütme tamponun üç görev vardır;
• Örneğin yoğunluğunu artırarak DNA nın
kuyuya eşit bir şekilde dağılmasını sağlar
• Örneğe renk katar ve yükleme işlemini
kolaylaştırır
• Elektrik alanında tahmin edilebilir bir hızda
anoda doğru hareket eden örneğe renk
vermek
Yürütme Tamponu
AGAROZ JEL ELEKTROFOREZ AŞAMALARI
ANALİZ
RFLP PCR
Protein moleküllerini, farklı özelliklerine göre birbirinden
ayırmayı sağlayan elektroforez yöntemidir.
Not: Genellikle moleküller önce izoelektrik noktalarına ve
ardından büyüklüklerine göre ayrılırlar.
Bu metotta;
1. boyutta yüke bağlı IEF ve 2. boyutta MA’a bağlı elektroforez kullanılır.
İlk basamak agaroz veya poliakrilamid jel gibi büyük porlu bir ortamda
gerçekleştirilir. Bir pH gradiyenti elde etmek için amfolitler eklenir.
2. boyut için lineer veya gradyent şekilli bir poliakrilamid sıklıkla
kullanılır.
İki Boyutlu PAGE Jel Elektroforezi (2D PAGE)
Güneştutar L.Y., Rodop M.C., ‘’New approaches in electrophoresis’’ Journal of Engineering and Natural
Sciences, 27, 151-160, 2009
2D-PAGE, ilk olarak 1975 yılında O’Farrel ve Klose tarafından
tanımlanmıştır.
Bu yöntemde boyamadan sonra jel üzerinde çok sayıda proteinin varlığını
gösteren noktalar belirir.
Bu noktaların yorumlanabilmesi veya diğer noktalarla karşılaştırılabilmesi için
bilgisayar desteğine ihtiyaç duyulur. Çok sayıda proteinin varlığını
gösterebilen bir yöntemdir.
Protein analizlerinde oldukça güçlü bir yöntem olmasına karşın, deneyin
tamamlanması oldukça uzun bir zaman alır.
Her örneğin ayrı bir jelde yürütülmesi diğer bir dezavantajıdır.
Bu nedenle, birden fazla sayıda protein örneği ile çalışılacağı zaman,
miktarlarının belirlenmesinde ve miktar karşılaştırılmasında her zaman aynı
sonuçları elde etmek mümkün olmayabilir.
Güneştutar L.Y., Rodop M.C., ‘’New approaches in electrophoresis’’ Journal of Engineering and Natural
Sciences, 27, 151-160, 2009
Zaman çizelgesi,
Örnek hazırlanması :2-3 saat
IPG strip rehidrayonu : 22 saat
IFG run : 24 saat
sDs- PAGE : 19 saat
Jel boyama : 13 saat
Toplam : 4 gün
O’Farrell E. coli üzerindeki bir çalışmasında teorik
olarak 7000 polipeptid lekesi tanımlanabileceğini ileri
sürmüştür; ancak, metottaki bazı sınırlamalar nedeniyle
otoradyografi kullanılarak 1100 leke saptanır.
Coomassie boyası kullanılarak yaklaşık 400 polipeptid
saptanabilir. O’Farrell metodunda 1. boyut için β-
merkaptoetanol, 2. boyut için ise SDS kullanılır. Diğer
yazarlar her iki boyut için de SDS kullanmaktadır.
İki boyutlu jel elektroforezi 1975’den beri laboratuvarlarda sıklıkla
kullanılan bir yöntem olmasına rağmen, kanser teşhisinde rutin olarak
kullanılan bir belirteç haline gelememiştir.
Bununla birlikte son yıllarda, 2D-PAGE veya 2D-DIGE’nin kütle
spektrometresiyle birlikte kullanılması, biyolojik belirteçlerin tayininde bu
yöntemlerin önemini daha da artırmıştır.
LMD yöntemi (laser microdissection, LMD) ile dokudan oldukça küçük
bir kesit alınarak (örneğin 1mm2 lik yüzeyden 1µm kalınlıkta) istenilen
hücre grubu elde edilir. LMD yöntemi ile elde edilen hücreler, 2D-PAGE
veya 2D-DIGE ile görüntülenirler.
Güneştutar L.Y., Rodop M.C., ‘’New approaches in electrophoresis’’ Journal of Engineering and Natural
Sciences, 27, 151-160, 2009
Şekil 5. Mide kanserli bir hastadan alınan normal (N) ve tümör dokularından (T) izole
edilmiş epitel hücrelerin 2D-elektroforez profilleri görülmektedir. A ve B noktaları
elektroforezin ardından kesilmiş, tripsin ile yıkılarak kütle sprekrometrsinde Ca11 proteini
tanımlanmıştır. Mide kanserlerinde Ca11 proteininin gen anlatımı azalır.
Güneştutar L.Y., Rodop M.C., ‘’New approaches in electrophoresis’’ Journal of Engineering and Natural
Sciences, 27, 151-160, 2009
İki Boyutlu Floresan Jel Elektroforezi
(2D DIGE)
DIGE, örneğe iki boyutlu jel elektroforezi uygulanmadan önce floresan bir madde ile
işaretlenmesi esasına dayanır. Örneğin 3 farklı floresan boya ile işaretlenebildiği bu
yöntemde, genellikle Cyber boyalar (Cy2, Cy3, Cy5) kullanılır. İşaretlenmiş örnek daha
sonra jel üstüne konularak ayrışması sağlanır. Elektroforezin sonunda jel, kullanılan
boyaların eksitasyon dalga boyunda ışıkla uyarılarak, jel üzerinde protein örnekleri
görüntülenir ve analiz edilir. DIGE analizinin yapılabilmesi için, CeCyder, Delta 2D,
Progeness ve REDFİN gibi bilgisayar programlarından yararlanılır. Bu yöntemin en
büyük avantajlarından biri, birden fazla protein örneğinin çok küçük miktarlarının tek
bir jel üzerinde doğru olarak görüntülenebilmesini sağlayacak duyarlılıkta olmasıdır.
Cyber boyaların duyarlılığını örnek vermek gerekirse, Cy2 boya ile 0.075 ng, Cy3 ve
Cy5 boyaları ile 0.025 ng’lık çok küçük protein miktarlarını ölçme duyarlılığına
sahiptirler.
Klasik elektroforez yönteminde kullanılan gümüş boyalarının duyarlılığı ise, 1 ng’lık
protein örneğini görüntüleyecek kadardır.
Güneştutar L.Y., Rodop M.C., ‘’New approaches in electrophoresis’’ Journal of Engineering and Natural
Sciences, 27, 151-160, 2009
IPG strip rehydration
1. Boyut: IEF run
IPG yıkamaları
Equilibration buffer I
Equilibration buffer II
2. BOYUT: SDS-PAGE
JEL boyaması (Sypro ruby)
Görüntüleme (470 nm)
Örnek Hazırlanması
Örnek Hazırlanması
Uygun protokolün seçilmeli
Taze hazırlanmış doku yada hücreler
Proteaz inhibitörleri
Soğuk zincir
Uzun dönem saklama
Kontaminayon
Eldivenler (keratin)
Non –protein binding sarf malzemeler
Örneğin çözünür hale
getirilmesi
Solubilitation/denaturation buffer
Öncesinde proteinler çeşitli
özelliklerine göre ayrılabilirler
Rotofor,
Kromatografi sitemleri
İZOELEKTİK NOKTA
pH Gradient
Amfolitler: (carrier ampholyte) tüp jeller
Amfoterik moleküllerin karışımı ve örnek ile muamelesi
İmmobilize amfolitler: IPG stripler
Akilamit jele kovalent olarak bağlanırlar
immobilised pH gradient (IPG): Jel plastik bir yüzeyde
IPG strip
Avantajları:
Mekanik olarak güçlüler
pH gradiyenti yer değiştirmez
Daha yüksek miktarda örnek yüklenmesine izin vermektedir
(dehydrated strip)
Dezavantajları:
Membran/hydrofobik proteinlerin görüntülenmesi kötü
olabilir.
Bazı büyük proteinler kaybolabilir.
IEF run
Islak wicks her bir stripin altına,
elektrodun üstüne yerleştirilir.
Başlangıç için ortam sıcakllığı
oda sıcaklığına ayarlanır.
Program özellikleri:
Number of gel: (1-10)
Max voltage:5000 V
Vhold:125 V
Duration: 24 hrs 00 min
Max current: 80 µa/strip
Volt hours: 80,000 Vh
SDS PAGE Run
Tri/Tricine/d buffer
IPG strip
MW (gel worm)
Agarose overlay
silikon spacer
Gasket
Şartlar:
Number of gel: (1-10)
Max voltage: 500 V
Max power: 1600 mW/gel
4ºC (setting 10)
19 hrs
Boyama
Coomassie staining
Orta seviyede sensitivite (36-47 ng)
Specifik değil
Kantitatif değil
Silver staining
Yükek sensitivite (0.5-1.2 ng)
Zaman alıcı
Specifik değil
Negatif boyamada bazı pot benzeri noktalar oluşur.
Fluorecent dye
(SYPRO ruby)
Çok hassas (1-2 ng)
Specifik ve Kantitatif
Pahalı!....
Görüntüleme
UV detection (300 nm)
Mavi ışık (470 nm) 5 min
Fuji imager
PdQuet (BioRad
Densitometry)
Görüntü analizi
Örnekler üçlü
çalışılır
Master jel yapılır
(soft ware)
Differential
ekspresyon analizi
Gradient type (Bio-Rad)
Broad pH range (pH 3-10)
Medium pH range (pH 4-7)
Narrow pH range (pH I)
Boyama yöntemleri
SYPRO Ruby stain Coomassie stainingSilver staining
Farkı görebiliyormusunuz
Spot analiziPDQuest
Easy to use with wizard directed user
interface
Match original gel image and cutter
İmage to account for tearing, shrinking,
swelling of gel during storage
Unprecedented integration for 2D
excision
Qantity One
ID excision tool for cutting
Entire lanes from a gel
Select band from a lane
EXQuest Calibration Wizard
Easy to use calibration for ultimate
precision