Afstudeerscriptie MLO

Door: Patrick van DorstBPV-begeleider Stage begeleider

Proeve van bekwaamheid

Student;Patrick van DorstKerkstraat 164664 BR Lepelstraat

BPV-instelling;IRSPostbus 324600 AA Bergen op Zoom

BPV-begeleiders;Theo van TilbeurghPeter Gijssel

BPV-periode;januari 2008 - juni 2008

Stagedocent;Wim Migchielsen

2


Inhoudsopgave

Verklaring gebruikte afkortingen..............................................................................................................................4Voorwoord................................................................................................................................................................6Methode ontwikkeling Mycotoxines.........................................................................................................................7

Wat zijn Mycotoxines?.........................................................................................................................................7Oorzaken van het ontstaan van mycotoxines.......................................................................................................7

Het onderzoek...........................................................................................................................................................8De loopvloeistoffen..............................................................................................................................................8Instellingen HPLC................................................................................................................................................9Monster voorbereiding.........................................................................................................................................9

De analyse...............................................................................................................................................................10IJklijn..................................................................................................................................................................10De opzuiverings kolommen................................................................................................................................10

De DONprep kolom......................................................................................................................................10De Varian kolom...........................................................................................................................................13

Resultaten................................................................................................................................................................16Figuur 1: De stapgradiënt voor het opschonen van de kolom.......................................................................16Figuur 2: Standaardenreeks...........................................................................................................................16Figuur 3: Verdunde spike oplossing rechtstreeks en door de kolom.............................................................16Figuur 5: Teruggevonden DON.....................................................................................................................16Figuur 5a: Teruggevonden 15A-DON...........................................................................................................17Figuur 6: Verdunde DON oplossing..............................................................................................................17Figuur 7: Verdunde DON oplossing met 2 druppels PEG toegevoegd.........................................................17Figuur 8: Resultaten TP3...............................................................................................................................17Figuur 8a: Resultaten TP4.............................................................................................................................17Figuur 9: Resultaten ter bevestiging Biofarm...............................................................................................18Figuur 10: Verdunde spikeoplossing met oplossing A:................................................................................18Figuur 11: Verdunde spikeoplossing door kolom:........................................................................................18Figuur 11a: Verdunde spike oplossing ingedampt en aangevuld met oplossing A:......................................18Figuur 12: Analyse breimonster op mycotoxines..........................................................................................19Figuur 13: Analyse breimonster waar geen mycotoxines aanwezig zijn......................................................19

Conclusie en Discussie............................................................................................................................................20Bijlage.....................................................................................................................................................................21

Bijlage 1; De ijklijn van DON.......................................................................................................................21Bijlage 2; De ijklijn van 15-A-DON.............................................................................................................21Bijlage 3: spectra van een standaard.............................................................................................................23Bijlage 4; Spikeoplossing in ACN................................................................................................................24Bijlage 5; Spikeoplossing ingedampt en oplossing A...................................................................................24Bijlage 6; Procedure om de DONprep kolom te gebruiken..........................................................................25Bijlage 7: Brei monsters TP3 spectra rechtstreeks en na de kolom...............................................................25Bijlage 8: Brei monsters TP4 spectra rechtstreeks en na de kolom...............................................................26Bijlage 9: Brei 33558 vergeleken met een standaard en monster dat wel DON en 15-ADON bevat...........26Bijlage 10: Brei 03864 vergeleken met een standaard en monster dat wel DON en 15-ADON bevat.........27Bijlage 11: Brei 7661 vergeleken met een standaard en monster dat wel DON en 15-ADON bevat...........27

Samenvatting...........................................................................................................................................................28Nederlands:.........................................................................................................................................................28Engels:................................................................................................................................................................29

Literatuurbronnen:...................................................................................................................................................30Boeken:...............................................................................................................................................................30Internet:..............................................................................................................................................................30

3


Verklaring gebruikte afkortingen

Afkorting Betekenis [15-A-DON] concentratie 15-Acetyl-Deoxynivalenol[DON] concentratie Deoxynivalenol15-A-DON 15-Acetyl-DeoxynivalenolACN AcetonitrileDON DeoxynivalenolH2O MilliQ waterHPLC High Performance Liquid ChromatographyMeOH methanolml millilitermg milligramOpl. oplossingPEG polyethyleenglycolUV Ultraviolet

4


Voorwoord

Op mijn laatste stage, in dit geval het IRS te Bergen op Zoom, moet ik de proeve van bekwaamheid uitvoeren. Hieronder wordt verstaan dat in binnen het IRS moet gaan werken aan methode ontwikkeling.

De opdracht is het ontwikkelen van een methode voor het bepalen van mycotoxines in brei. Brei is gemalen suikerbiet. De mycotoxines waar het om gaat tijdens deze proeve van bekwaamheid zijn: 15-Acetyl- Deoxynivalenol (15-A-DON) en Deoxynivalenol (DON). Dit wordt gedaan met behulp van HPLC analyse en UV-detectie.Hierbij wordt gekeken of het nodig is om het monster voor te bewerken door middel van een opzuiveringskolom of dat het monster rechtstreeks kan worden gemeten. Hierbij wordt naar een tweetal zuiveringskolommen gekeken: DONprep van Biopharm en Bond Elute Mycotoxin Column van Varian. Om de betrouwbaarheid van de metingen zeker te stellen worden er onder andere recovery bepalingen uitgevoerd.Tijdens het gehele project wordt er gewerkt met de onderstaande HPLC apparatuur:

1. Pomp : SP8800 (Spectra Physics - binair)2. Kolom : Inertsil 5ODS-3 (Varian)3. Detector : Spectra Physics UV Spectra 2004. Autosampler : Gilson Model 231

In dit verslag wordt van dag tot dag beschreven welke werkzaamheden er samen met mijn BPV-begeleider heb uitgevoerd om een methode te ontwikkelen voor het onderzoeken van de hoeveelheid mycotoxinen in breimonsters.Graag zou ik Peter Gijssel en Theo van Tilbeurgh willen bedanken voor hun steun aan dit project. Ook de overige medewerk(st)ers wil ik bedanken voor de leuke en leerzame ervaringen die ik heb opgedaan binnen het IRS.

5


Methode ontwikkeling Mycotoxines

Wat zijn Mycotoxines?

Een mycotoxine is een gif dat geproduceerd wordt door een organisme van de schimmelfamilie, zoals paddenstoelen, draadvormige schimmels en gist.De meeste schimmels zijn aëroob, deze hebben zuurstof nodig om te kunnen overleven, en komen overal voor in zeer kleine hoeveelheden vanwege hun sporen. Zodra de juiste luchtvochtigheid en temperatuur daarvoor de gelegenheid biedt, begint de ontwikkeling van de cellen van de schimmels door het consumeren van organisch materiaal, waardoor het mycotoxine niveau stijgt. De gifstoffen zijn enzymen of proteïnen.

Mycotoxines komen in de voedselketen door een schimmelinfectie van landbouwproducten of door het eten van giftige paddenstoelen. Zelfs als het product niet door mensen geconsumeerd wordt blijft het schadelijk voor de gezondheid omdat het waarschijnlijk als veevoeder wordt gebruikt. Mycotoxinen zijn uiterst resistent in de spijsvertering en blijven daardoor in de voedselketen van vlees en zuivelproducten zoals melk en kaas. Temperatuurbehandelingen zoals verhitten en bevriezen hebben geen invloed op het mycotoxine-gehalte.

De FAO (Food and Agriculteral Organisation) in Nederland bekend beter bekend als Voedsel- en Landbouworganisatie schat dat circa 25% van alle voedselproducten in de wereld mycotoxinen bevatten. In de Europese Unie zijn de wettelijke niveaus van een aantal mycotoxinen in voedsel en dierenvoeding vastgesteld door een aantal Europese richtlijnen en Commissieverordeningen.

Oorzaken van het ontstaan van mycotoxines

Er zijn een aantal verschillende oorzaken waardoor er mycotoxines kunnen worden aangetroffen in verschillen landbouw producten. Een aantal oorzaken kunnen onder andere zijn:

Primaire verontreiniging: granen worden al tijdens de teelt door schimmels besmet zoals moederkoorn op rogge, tarwe en gerst. Deze soort van mycotoxinen wordt ook wel genaamd de veld mycotoxinen, en behoort vooral tot de Fusarium mycotoxinen.

Secundaire verontreiniging: opgeslagen levensmiddelen beschimmelen door Aspergillus of Penicillium. Deze soorten van mycotoxines wordt ook wel genoemd de opslag-mycotoxinen; voorbeelden zijn:

o Aflatoxineno Ochratoxine A.

Metabolisme in het dier: vee krijgt beschimmelde levensmiddelen en de mycotoxinen worden gemetaboliseerd. Ze belanden in de eindproducten: melk, eieren, vlees. Een voorbeeld hiervan is aflatoxine M1 wat gevormd wordt in de melk na besmetting met aflatoxine B1.

Schimmelvorming bij bewaring, een voorbeeld hiervan is het bewaren van suikerbieten.

6


Het onderzoek

Het onderzoek naar de methode ontwikkeling voor het bepalen van mycotoxines is begonnen op 26 februari 2008. De bedoeling van de opdracht is het ontwikkeling van een methode voor het bepalen van Mycotoxines in breimonsters.Om het onderzoek goed uit te kunnen voeren moeten er eerst een aantal instellingen bepaald worden, zoals:

1. Wat voor loopvloeistoffen gaan we gebruiken?2. Uit welke vloeistoffen bestaan de loopvloeistoffen?3. Uit welke concentraties bestaan de loopvloeistoffen?4. Wat voor instellingen van de HPLC zijn er nodig om een goed resultaat te verkrijgen?5. Welke extractievloeistof gaan we gebruiken voor het extraheren van de breimonsters?6. Uit welke concentratie bestaat deze extractievloeistof en welke vloeistoffen zijn dit?

Dit moesten we deels zelf uit vinden, maar er stonden ook een aantal instelling op de voorschriften die we hebben gebruikt.

De loopvloeistoffen

Om mycotoxines te meten door middel van de HPLC heb je een loopvloeistof nodig, tijdens het uitvoeren en ontwikkelen van de methode. De beide loopvloeistoffen voor het bepalen van mycotoxines in brei moet bestaan uit een oplossing van H2O/ACN/MeOH. De exacte concentratie moet nog bepaald worden.De eerste oplossing, ook wel oplossing A genoemd, bestond uit 90% H2O /5% ACN /5% MeOH.De tweede oplossing, ook wel oplossing B genoemd, bestond uit 45% H2O /50% ACN /5% MeOH.

Met deze loopvloeistoffen zijn we gaan meten, maar het bleek dat er geen optimale piekvorm te zien was, tevens kwam de hoofdpiek er pas na 24 minuten eruit. Na diverse metingen gedaan te hebben zijn we tot de juiste verhoudingen gekomen voor zowel oplossing A als oplossing B.

Loopvloeistof A: 82,5% H2O /12,5% ACN / 5% MeOH Loopvloeistof B: 15% H2O / 80% ACN / 5% MeOH

Van beide loopvloeistoffen is er 2 liter aangemaakt. Tijdens het gehele onderzoek wordt er gebruik gemaakt van de bovenstaande samenstelling van de loopvloeistoffen. Loopvloeistof A wordt ook vaak in dit verslag oplossing A. Wanneer de vloeistoffen op zijn wordt er uiteraard nieuwe aangemaakt.

7


Instellingen HPLC

Om mycotoxines te kunnen meten door middel van de HPLC zijn er een aantal instellingen nodig. Hiervoor is er een stapgradiënt gemaakt die past bij het meten van mytoxines in de monsters. Een stapgradiënt is een methode waardoor je de samenstelling van de loopvloeistoffen veranderd, en daarmee kan je de te bepalen stoffen beter terug vinden, maar ook kan je hiermee de kolom schoonspoelen voor de volgende meting. De stapgradiënt die we gebruikt hebben voor het opschonen van de kolom staat in figuur 1 van de resultaten. Dit waren de belangrijkste instellingen en benodigd heden om een goede HPLC analyse uit te kunnen voeren voor het bepalen van mycotoxines in breimonsters van suikerbieten.

Monster voorbereiding

Voordat een breimonster geanalyseerd kan worden moet deze eerst voorbereid worden, hiervoor moet het volgende gebeuren. Je weegt op een analytische balans in een buis van 200ml een breitablet af van 15-20gram. Hierna wordt rand schoon gemaakt waar de dop uiteindelijk op de buis wordt geschroefd. Het gewicht van de breitablet schrijf je op en ook het nummer van de betreffende zak waar de brei uitgehaald is. Er kan nu 150ml loopvloeistof

A toegevoegd worden. Nadat de dop stevig is vastgedraaid op de buis, kan deze in de extraheer machine, zie afbeelding 1,voor ongeveer 2uur door middel van rotatie. Vervolgens wordt de buis uit de extraheermachine gehaald en in een daarvoor bestemde rek geplaatst, zodat de extractie buis met daarin het mengsel van brei en de extractie vloeistof 30 minuten de tijd krijgt om uit te zakken.

Afbeelding 1: de extractie machine

8


De analyse

IJklijn

Om je monsters te kunnen gaan meten is het nodig om een ijklijn te maken. Via deze ijklijn kan je dan laten berekenen wat de [DON] en [15-A-DON] van de geanalyseerde breimonsters is. Dit is als volgt gedaan. Eerst is er een stockoplossing gemaakt van 4,40mg DON en 4,20mg 15-A-DON op te lossen in 10 ml ACN. De [DON] 440µg/ml en [15-A-DON] is dan 420µg/ml. Vanuit deze stockoplossing is de spikeoplossing gemaakt. De spikeoplossing is gemaakt door 2ml van de stockoplossing te pipetteren in een maatkolf van 50ml en aan te vullen met ACN. Je krijgt dan een [DON] van 17,6µg/ml. Deze concentratie is de spikeoplossing, hiermee worden de standaarden gemaakt voor de ijklijn.De standaarden die gemaakt zijn voor het maken van de ijklijn staan vermeldt in figuur 2 van het kopje resultaten. De bijbehorende ijklijnen voor DON en 15-A-DON staan onder het kopje bijlage vermeldbijlage 1 en bijlage 2. In bijlage 3, is een deel van een spectra te zien van een standaard.Nadat deze ijklijnen gemaakt waren voor zowel DON als 15-A-DON was het tijd om te beginnen met de recovery van de spikeoplossing. Het blijkt dan wanneer je wilt gaan werken met de spikeoplossing, die gemaakt is van de standaardoplossing en vervolgens aangevuld is met ACN dat je de ACN moet indampen om een betere piekvorming te krijgen, dit is te zien in bijlage 4 en 4. Op 5 is goed te zien dat de piek vorm asymmetrisch van vorm is. Als je de spikeoplossing indampt door middel van de vacuüm rotatie verdamper, hiermee laat je de ACN verdampen en houd je alleen de DON en 15-A-DON over, en er vervolgens oplossing A toevoegt krijg je een goede symmetrische piek vorm.

De opzuiverings kolommen

De DONprep kolom

Om een goede recovery uit te kunnen voeren is de verdunde spikeoplossing eerst rechtstreeks gemeten en vervolgens is er van de verdunde spikeoplossing 2ml door de kolom gedaan om te vergelijken wat het resultaat is. De verdunde spikeoplossing is als volgt verkregen. Er is 5ml spikeoplossing ingedampt in een kolf van 50ml op de vacuümrotatie verdamper, vervolgens is er 25ml oplossing A toegevoerd.

De spike oplossing is dan 5x verdund . Vervolgens is er 2 ml van

deze verdunning is rechtstreeks gemeten, hiermee wordt bedoeld dat de verdunde oplossing niet door de DONprep kolom is gegaan. In afbeelding 2 in de DONprep kolom weergegeven.

Afbeelding 2: DONprep kolom

Ook is er 2ml wel door de kolom gegaan, de procedure hiervan is te lezen in bijlage 6. De resultaten van deze recovery staan in figuur 3 bij de resultaten. De waarden zijn gegeven in area`s, want er was op het moment van meten nog geen ijklijn gemaakt. Deze is naderhand erbij gekomen toen er monsters gemeten werden.

9


Uit de metingen is gebleken dat de opbrengst door gebruik te maken van de kolommen slechts 24% en respectievelijk 33% bedraagt. De vraag was nu, waar is de rest van de DON en 15-A-DON gebleven. Om dit uit te zoeken is er de volgende recovery gedaan.Hierna zijn er 3 breimonsters gemeten om te kijken of er de te analyseren mycotoxines DON en 15-DON aanwezig zijn in het monster. De monsters zijn voorbereid op de wijze van monstervoorbereiding op bladzijde 8 van dit verslag. Nadat de brei 30 minuten tot rust is gekomen is de bovenstaande vloeistof voorzichtig afgeschonken in een filtreerspuit met hierop een dubbele filter het filtraat wordt opgevangen in een aparte kolf. Het eerste monster is als enige door de kolom gegaan, de overige 2 zijn rechtstreeks gemeten zie de onderstaande tabel.

Breimonsters met of zonder DON en 15A DON?

ID nr. inweeg (g)extractie

vloeistof (ml) kolom (ml) opl.A (ml)

Brei A 32904 15,76 150 2 2Brei B 32911 18,52 150 - -Brei C 32902 17,43 150 - -

Figuur 4

Uit het onderzoek bleek dat in geen van de monsters mycotoxines aangetoond konden worden. Deze meting is nogmaals herhaald. De monsters voor dit onderzoek zijn volgens dezelfde richtlijnen voorbereid die beschreven staan op bladzijde 8, alleen is het is plaats van 150ml loopvloeistof A te nemen is er 140ml loopvloeistof A genomen en 10ml van de spikeoplossing (17,6µg/ml). Tevens is er ook een controle standaard meegenomen, in figuur 5 en 5a van de resultaten is te zien wat het resultaat is van dit stukje recovery. Deze monsters zijn door de DONprep kolom gegaan.

Om uit te zoeken waarom er zo weinig van beide DON soorten overblijft nadat deze door de kolom zijn gegaan is er een nieuw onderzoek uitgevoerd. We hebben na bepaalde stappen die in het proces staan voor het opzuiveren van het monster, wanneer deze door de kolom het residu dat overblijft wordt een aantal elke keer in een aparte kolf op gevangen. Om deze daarna te laten analyseren op de HPLC.

Uit de recovery is gebleken dat het gebruiken van de DONprep kolom niet veel betere resultaten heeft opgeleverd. Een extra onderzoek is uitgevoerd om te onderzoeken wat de oorzaak hiervan kan zijn.Allereerst gaan we een nieuw standaard aanmaken door middel van 5ml spike oplossing in te dampen en vervolgens aan te vullen met een pipet van 25ml met MilliQ H2O. We hebben deze verdunning eerst rechtstreeks gemeten, en vervolgens is deze door de kolom gegaan. Iedere keer dat de kolom gespoeld moest worden is het residu opgevangen in een aparte kolf. De eerste opvang was het residu dat overbleef nadat de Combistandaard door de kolom was gegaan, de tweede opvang is na het spoelen van de kolom met H2O. Dit is tevens de laatste, want toen kon er een conclusie getrokken worden waarom er zoveel DON en 15-A-DON er weggespoeld is. Onder het hoofdstuk resultaten en dan figuur 6 is het resultaat van deze proef te vinden.

10


Het bleek na deze meting dat de DON niet aan de eiwitten in de kolom bleven hechten, hierdoor wordt de DON die eigenlijk op de pakking van de kolom moet blijven zitten al aan het begin door de kolom gespoeld wordt.Daarom is er nogmaals een test gedaan, maar dan hebben we PEG (polyethyleenglycol) toegevoegd aan 5ml verdunde spike oplossing. Eerst hebben we rechtstreeks gemeten, en vervolgens hebben we 2ml van dezelfde oplossing gemeten, maar nadat deze door de DONprep kolom is gegaan. Onder het hoofdstuk resultaten en dan in figuur 7 staan de resultaten vermeldt van dit stukje van de recovery.

Uit de resultaten van deze metingen bleek dat er tijdens de eerste opvang vrij veel DON is blijven hangen aan de eiwitten in de kolom. Dit zie je ook aan de gevonden concentratie van de opgevangen vloeistof na de eerste opvang. Er is 48% door gelaten door de DONprep kolom, dan is er door de DONprep kolom 52% vastgehouden.

Wederom een recovery onderzoek uitgevoerd, ditmaal naar het effect van PEG in monsters. Daarvoor is eerst een oplossing van 13g/L in 500ml MilliQ H2O. Dit komt neer op 6,5g per 500ml. Ik heb hiervoor 6,499g afgewogen op een analytische balans en vervolgens kwantitatief overgebracht in een maatkolf van 500ml.Ook zijn er breimonsters voorbereid om gemeten te kunnen worden. Dit waren respectievelijk breimonster TP3 en breimonster TP4. In deze brei mengmonsters is door een extern laboratorium (TLA) DON aangetoond. Van beide monsters is een bepaalde hoeveelheid afgewogen tussen de 15-20 gram, waarna aan deze monsters 150ml PEG/MilliQ mengsel is toegevoegd.

De beide breimonsters zijn daarna 2 uur lang geëxtraheerd en daarna hebben de monsters 30 minuten lang laten uitzakken. Dit gevolgd door een dubbele filtratie. Hierbij is er ongeveer 10ml filtraat verkregen van beide breimonsters.Van beide filtraten is er steeds 1 deel rechtstreeks gemeten en de overige vloeistof is door de kolom gegaan en naar de 1ste opvang, na de 2de opvang, en na de 3de opvang gemeten. De resultaten staan vermeld in figuur 8 en figuur 8a van de resultaten. Het spectra van de rechtstreekse meting en het spectra van na de kolom staat in bijlage 7 vermeld en de spectra van TP4 rechtstreeks en na kolom staat in bijlage 8.Om de [DON] in ppb te bereken maak je gebruik van de onderstaande formule.

Nog steeds komt er minder DON van de kolom dan dat er ingegaan is. De BPV-begeleider Peter Gijssel heeft toen contact opgenomen met de firma Biofarm met de vraag hoe dit komt. De fabrikant van de kolommen had een mail gestuurd met de mededeling dat de DONprep maximaal 2µg/ml wordt vastgehouden door de eiwitten die zich in de kolom bevinden. Vandaar dat er na de 3de zuiveringsstap zo weinig DON wordt teruggevonden, want de eiwitten in de kolom waren verzadigd met DON. Hierdoor werd de overige DON die aanwezig was in de recovery standaard weggespoeld, deze vond je daarom terug in 1ste

Breimonster inweeg (g)

TP3 22,79TP4 20,848

11


opvang. Wat er dus in de 1ste opvang terug gevonden werd was de rest van de DON die niet op de eiwitten konden blijven plakken, omdat deze verzadigd waren.

Om die reden te bevestigen is er vandaag een recovery onderzoek uitgevoerd om te kijken of dit de reden is waardoor er zo`n lage [DON] terug vinden. Het onderzoek is als volgt uitgevoerd:

Allereerst de spikeoplossing (17,6µg/ml) 25x verdund. Dit is gedaan door middel van 2ml van de spikeoplossing te pipetteren in een kolf en vervolgens in te dampen met de vacuümrotatie verdamper, waarna de kolf is aangevuld met 50ml MilliQ H2O. Deze oplossing heeft dan een concentratie van [DON]=0,704µg/ml

Uit de verdunde oplossing is een vial gevuld voor een rechtstreekse meting. Ook is er 2ml van de oplossing gepipetteerd en door een DONprep kolom

gespoeld. Ook van deze methode hebben we 3 vials gevuld en wel de volgende: de 1ste opvang, de 2e opvang en de opvang na de kolom

Deze zijn vervolgens geanalyseerd met de HPLC Ook is er een monster gemeten, dit was monster TP4, deze is afgewogen op

een balans (17,247) en vervolgens opgelost in 30ml verdunde spikeoplossing van 0,704µg/ml, en 120ml MilliQ H2O. Twee uur geëxtraheerd, gevolgd door een dubbele filtratie waarbij minimaal 10ml is verkregen. Ook hiervan zijn weer 4 vials gemeten. De eerste vial is rechtstreeks gemeten, dit is dus het gefiltreerde monster. De overige 3 vials zijn weer van de 1ste opvang, de 2de opvang en opvang na de kolom.

De resultaten van deze recovery staan in het hoofdstuk resultaten in figuur 9. Hieruit is dus gebleken dat het inderdaad zo is dat een DONprep kolom een maximum capaciteit van DON heeft. Ook is het duidelijk geworden dat deze kolom alleen geschikt is voor het bepalen van DON en niet geschikt voor 15-A-DON, want de eiwitten in deze kolom zorgen er alleen voor dat ze binden met DON. 15-A-DON wordt er gewoon doorheen gespoeld. Je kunt bij deze kolom alleen maar 1 soort mycotoxine aantonen, en het kost geld om voor iedere soort mycotoxine een andere kolom aan te schaffen.

De Varian kolom

De tweede kolom die gebruikt is voor het onderzoek komt van Varian en heeft hebben de naam Bond Elute® Mycotoxin. Met deze kolommen gaan zijn er een aantal recoverys uitgevoerd, het zijn dezelfde als bij de voorgaande DONprep kolommen. In afbeelding 3 is de Varian kolom te zien.

Afbeelding 3: De Varian kolom

Allereerst is de theorie bestudeerd van de kolommen die door Varian geleverd zijn. Het is niet nodig om de kolom te spoelen met H2O of MeOH. Dit komt omdat deze kolom een andere eigenschap heeft. De kolom zorgt ervoor dat het monster dat je wilt gaan meten wordt gezuiverd van verontreinigingen, maar deze kolom laat ook meer soorten mycotoxines door. Het is dus alleen een kolom die de onzuiverheden weghaalt. Allereerst valt op dat er een andere voorbewerking van de monsters gedaan moet worden. Er moet tussen de 15-20gram

12


monster ingewogen worden, deze vervolgens 1,5 a 2 uur geëxtraheerd door middel van 100ml ACN/H2O oplossing. In de verhouding van (80/20). Daarna filtreer je minimaal 10ml van de bovenstaande vloeistof. Vervolgens pipetteer je 4ml van dit filtraat door de Bond Elut Mycotoxin kolom. Hierna wordt er 2ml gepipetteerd van het verkregen extract en verdampt. Wanneer dit gebeurd is wordt er 0,5ml van oplossing ACN/H2O (20/80) toegevoegd. Vervolgens kun je dit injecteren. Dit was echter voor het bepalen van mycotoxines door middel van de HPLC/MS. Er is een aanpassing gedaan om deze kolom toch te gebruiken in plaats van 0,5ml oplossing ACN/H2O met een verhouding van 20/80 te gebruiken is er gebruik gemaakt van 2ml oplossing A, zodat dit overeenkomt met de loopvloeistoffen die er gebruikt worden. Het zijn dezelfde als voor de Biofarm kolom.

Omdat deze kolom zowel DON als 15-A-DON doorlaat is er een combistandaard gemaakt, deze bevat [DON]= 17,6µg/ml en voor [15-A-DON]= 16,8µg/ml. Hiermee worden de recovery voor deze kolom uitgevoerd. De DON en 15-A-DON zijn oplost in 100% acetonitrile.De oplossing is te geconcentreerd om te gebruiken voor het onderzoek, daarom is deze oplossing 10x verdund door 10ml te pipetteren in een rondbodem kolf en vervolgens in te dampen door middel van de vacuümrotatie verdamper, in afbeelding 4 is een vacuümrotatie verdamper te zien, hierna is er een aantal milliliter oplossing A (ACN/H2O/MeOH) toegevoegd en even in het trilbad gehouden, zodat de ingedampte DON en 15-A-DON opgelostten. Dit is vervolgens kwantitatief overgebracht in een maatkolf van 100ml en gevuld met oplossing A..

Afbeelding 4: De vacuümrotatie verdamper

De [DON] zou dan moeten zijn: . En voor 15-A-DON zou

dit dan moeten zijn . Om dit te controleren is er

van beide standaarden een analyse verricht deze is in duplo uitgevoerd. De resultaten staan in figuur 10 onder het hoofdstok resultaten. Beide metingen zijn in duplo uitgevoerd om zeker te zijn van de eerste waarde. Uit de resultaten is naar voren gekomen dat de verdunning goed is. Na de controle van de verdunde standaard is, zijn er recoverys uitgevoerd met de Bond Elute®

Mycotoxin kolommen van Varian.

De recovery is als volgt uitgevoerd. Eerst is er 4ml verdunde spikeoplossing in het spuitje gepipetteerd, dit is vervolgens gemeten. Deze resultaten staan in figuur 11 van de resultaten. Ook is er nogmaals 4ml Combistandaard ingedampt en vervolgens aangevuld met oplossing A. Ook deze is door de kolom gegaan. De resultaten zijn te vinden in figuur 11 en 11a.

Na deze recovery is er gekeken of er bij 3 breimonsters waar geen DON en 15-A-DON in hoort te zitten er ook daadwerkelijk geen DON en 15-A-DON aanwezig is. Hiervoor zijn er 3 breimonsters genomen en gemeten. De bijbehorende resultaten staan in figuur 13. De spectra

13


van deze 3 breimonsters zijn vergeleken met zowel een combistandaard als een breimonster waar wel DON en 15-A-DON aanwezig zijn, deze spectra zijn te zien in de bijlage 9/10/11. In deze 3 bijlagen stellen de groene spectra de monsters voor die geen DON en 15-A-DON zouden bevatten. Duidelijk is te zien dat deze monsters een lage [DON] bevatten, maar het is de vraag of ze ook geen 15-A-DON bevatten. Ook in figuur 13 van de resultaten zijn zeer lage [DON] te zien die gemeten zijn door de HPLC, Er zit misschien zo weinig in dat het haast niet te meten is. De licht blauwe lijn van is van de standaard, de 15-A-DON piek ligt op de goede plaats, bij de overige monsters is het de vraag of er wel 15-A-DON aanwezig is of dat het monster verontreiniging is dat in het monster zit. Dit moet nog verder uitgezocht worden door degene die met dit onderzoek verder gaat.

14


Resultaten

Figuur 1: De stapgradiënt voor het opschonen van de kolom

Figuur 2: Standaardenreeks

Figuur 3: Verdunde spike oplossing rechtstreeks en door de kolom

Figuur 5: Teruggevonden DON

Tijd (min) % opl. A % opl. B flow (ml/min)

0,0 100 0 1,07,0 100 0 1,07,1 75 25 1,015,0 75 25 1,015,1 0 100 1,535,0 0 100 1,535,1 100 0 1,045,0 100 0 1,0

Standaard [DON] µg/ml

[15-A-DON] µg/ml

Verdunning

1 0,06 0,055 25ml Std 2 50ml opl. A2 0,12 0,11 25ml Std 3 50ml opl. A3 0,29 0,28 25ml Std 4 50ml opl. A4 0,73 0,7 25ml Std 5 50ml opl. A5 1,83 1,75 25ml Std 6 50ml opl. A6 4,58 4,37 13ml spike 50ml opl. A

Methode DON (area) 15-A-DON (area)

Rechtstreeks 149000 125000Rechtstreeks 2 146000 125000

Kolom 36000 0Kolom 2 45000 0

ID [DON] µg/ml DON (area) recovery DON

CtrlCombi 5,52 149000BreiA+toev. 1,17 42000 61%BreiB+toev. 1,17 47000 68%

15


Figuur 5a: Teruggevonden 15A-DON

ID [15-A-DON] µg/ml

15-A-DON(area)

recovery15A-DON

CtrlCombi 3,36 122000 -BreiA+toev. 1,12 45500 90%BreiB+toev. 1,12 50000 82%

Figuur 6: Verdunde DON oplossing

ID [DON] µg/ml

DON rechtstreeks 3,46DON 1ste opvang 1,82DON 2e opvang 0,58

*DON rechtstreeks is 5ml spike oplossing ingedampt, en vervolgens aangevuld met 25ml MilliQ H2O en daarna gemeten.**DON 1ste opvang is 5ml van de verdunde spike oplossing door de DONprep kolom, zonder wassen met H2O en MeOH.

Figuur 7: Verdunde DON oplossing met 2 druppels PEG toegevoegd

*DON rechtstreeks is 5ml spike oplossing ingedampt, en vervolgens aangevuld met 25ml MilliQ H2O en 2 druppels PEG daarna gemeten**DON 1ste opvang is 5ml van de verdunde spike oplossing met 2 druppels PEG door de DONprep kolom, zonder wassen met H2O en MeOH.

Figuur 8: Resultaten TP3

Breimonster Inweeg TP3 [DON] µg/ml [DON] µg/kg (ppb)

TP3 rechtstreeks 22,790 0,123 809,56TP3 1ste opvang 22,790 <0,02 <150TP3 2de opvang 22,790 <0,02 <150TP3 na kolom 22,790 0,259 681,88

Figuur 8a: Resultaten TP4

Breimonster Inweeg TP4 [DON] µg/ml [DON] µg/kg (ppb)

TP4 rechtstreeks 20,848 0,062 446,08TP4 1ste opvang 20,848 <0,02 <150TP4 2de opvang 20,848 <0,02 <150TP4 na kolom 20,848 0,158 454,52

ID [DON] µg/ml

DON rechtstreeks* 3,333DON 1ste opvang** 1,61

16


Figuur 9: Resultaten ter bevestiging Biofarm

Figuur 10: Verdunde spikeoplossing met oplossing A:

Figuur 11: Verdunde spikeoplossing door kolom:

Figuur 11a: Verdunde spike oplossing ingedampt en aangevuld met oplossing A:

ID [DON] µg/mlTP4 rechtstreeks 0,17

1ste opvang <0,022de opvang <0,02Na kolom 0,15

µg/ml

[DON] 1,81[DON] duplo 1,79[15-A-DON] 1,74

[15-A-DON] duplo 1,76

µg/ml



µg/ml



17


Figuur 12: Analyse breimonster op mycotoxines

Figuur 13: Analyse breimonster waar geen mycotoxines aanwezig zijn

* De [15-A-DON] was niet goed te meten, want het leek in het spectra in bijlage 7/8/9 verplaatst te zijn of het is helemaal niet aanwezig. Dit moet verder onderzocht worden.

Analyse [DON] µg/ml [15-A-DON] µg/ml

1. Breimonster in oplossing A rechtstreeks

0,13 0,33

2. Breimonster in oplossing A na de kolom

0,06 0,22

3. Breimonster in oplossing A met verdunde standaard (1:10)

rechtstreeks

0,74 1,61

4. Breimonster in oplossing A met verdunde standaard (1:10) na de

kolom

0,92 0,72

Analyse [DON] µg/ml [15-A-DON] µg/ml*

Brei nummer 33558 < 0,04 ?Brei nummer 03864 < 0,04 ?Breinummer 7661 < 0,04 ?

18


Conclusie en Discussie

De opdracht was naar mijn idee in het begin leek heel eenvoudig te zijn. Een methode ontwikkelen voor het bepalen van mycotoxines in suikerbieten brei. Dit bleek toch een stuk moeilijker dan ik had gedacht. Gelukkig had ik goede steun aan Peter Gijssel mijn stagebegeleider hier binnen IRS. Hij wist heel veel af van mycotoxines. Ik ben samen met hem begonnen aan het onderzoek. Er was al een voorschrift dit is gebruikt om te dienen als voorbeeld en als richtlijn.Er staat onder andere de voorbewerking in van de breimonsters. Dit is onveranderd gebleven tijdens deze methodeontwikkeling. Wel moesten er veel dingen worden veranderd en uitgezocht worden wat de beste instellingen waren voor het analyseren van mycotoxines. Het optimale punt is nog niet bereikt in deze proef, maar er zijn wel een aantal standaard gegevens nodig om te kunnen beginnen.

De loopvloeistoffen die nodig waren voor het bepalen van de mycotoxines bijvoorbeeld. Er stond in het voorschrift een mobiele fase oplossing bestaande uit H2O en ACN in de verhouding 60/40, dit is aangepast naar de huidige loopvloeistoffen/oplossingen.

Loopvloeistof A (oplossing A): H2O/ ACN/ MeOH (82,5% / 12,5% / 5%)

Loopvloeistof B: H2O/ ACN/ MeOH (15% / 80% / 5%)

Ook is er een aparte stapgradiënt gemaakt om te zorgen dat de kolom van de HPLC mooi schoon is. De stapgradiënt die hierbij hoort staat in figuur 2 van de resultaten. Het volgende probleem was of er voorbereiding nodig is om mycotoxines te bepalen in brei. Het antwoord hierop is ja, want wanneer de brei geëxtraheerd is moet het eerst gefilterd worden alvorens je de vloeistof in een vial doet om te laten analyseren. Zonder voorbewerking van het monster kan er niet kwantitatief geanalyseerd worden. Door gebruik te maken van een zuiverings kolom kan je ervoor zorgen dat de analyse nog nauwkeuriger is, vooral wanneer je de zuiverings kolom van Varian gebruikt. Deze haalt de onzuiverheden uit het mengsel waardoor er een zuiverder extract ontstaat. Tevens is deze kolom geschikt om meerdere soorten mytoxines op te zuiveren. Nog een voordeel van deze kolom is dat er geen maximale concentratie is, maar ook de prijs van een Varian kolom is een stuk lager dan de prijs van een DONprep kolom.De DONprep kolom daarin tegen is meer een kolom die ervoor zorgt dat het filtraat zuiverder wordt, een nadeel van deze kolom dat deze kolom een maximale [DON] heeft van 2µg/ml, maar ook dat deze kolommen specifiek zijn voor DON. Je kan hiermee dus geen andere mycotoxines meten. Verder onderzoek naar een methode voor het goed bepalen van mycotoxines is noodzakelijk.

19


Bijlage

Bijlage 1; De ijklijn van DON

y=3,88x2+2,32x-0,00 r2=0,999988

Bijlage 2; De ijklijn van 15-A-DON

Y=-1,52x2+2,71x-0,00r2=0,9999886

20


Bijlage 3: spectra van een standaard

21


Bijlage 4; Spikeoplossing in ACN

Bijlage 5; Spikeoplossing ingedampt en oplossing A

22


Bijlage 6; Procedure om de DONprep kolom te gebruiken

1 2 3 4 5

1. De DONprep kolom met vloeistof om de enzymen goed te houden2. De aanwezige vloeistof dat dient ter bescherming van de enzymen door de kolom

spoelen en in een spoelkolf opvangen.3. Voeg 2ml monsterextract toe aan de kolom, en vang dit op in een spoelkolf4. Was de kolom met demiH2O en blaas deze goed droog, vang wederom de vloeistof op

in de spoelkolf5. Was de kolom met 2ml MeOH, en van dit op in een rondbodem kolf om dit te

gebruiken voor de vacuümrotatie verdamper.

Bijlage 7: Brei monsters TP3 spectra rechtstreeks en na de kolom

23


Bijlage 8: Brei monsters TP4 spectra rechtstreeks en na de kolom

Bijlage 9: Brei 33558 vergeleken met een standaard en monster dat wel DON en 15-ADON bevat

24




25


Samenvatting

Nederlands:

Op 26 februari 2008 ben ik begonnen met de methode ontwikkeling voor het aantonen van mycotoxines. De opdracht was om te kijken of er een betere, goedkopere en snellere methode te ontwikkelen, want de huidige methode die beschreven staat in het voorschrift voor het gebruik van de DONprep kolom heeft een vrij lange voorbewerking nodig om tot een resultaat te komen.In de afgelopen weken en maanden heb ik onderzoek gedaan naar de mogelijkheid om een methode te ontwikkelen voor het bepalen van mycotoxinen.

De eerste weken van het onderzoek gingen wat stroef, maar hoe langer we er aan bezig waren des te interessanter het werd. Tijdens de methodeontwikkeling zijn er 2 kolommen getest, een van Biopharm en een van Varian. Op beide kolommen zijn er diverse bepalingen uitgevoerd, om te bepalen wat eventueel de beste kolom is voor het bepalen van mycotoxines in suikerbieten brei. Na het doen van vele bepalingen met zowel de kolommen van Varian als die van Biofarm is het vrij duidelijk geworden dat de kolom van Varian het meest geschikt was. Dit komt doordat de monsters weinig voorbewerkt hoeven te worden voordat ze door de kolom gaan, dit scheelt tijd. Een tweede reden om te deze kolom te gebruiken voor het bepalen van mycotoxines is dat deze kolom niet specifiek is voor 1 soort myxotoxine.Voordat je de kolom van Biofarm kan gebruiken moet het monster wel eerst allerlei stappen ondergaan en dit kost tijd, daarbij komt dat deze kolom alleen maar specifiek voor deoxynevalon.

Dus tot dusver kan er geconcludeerd worden dat uit de resultaten is gebleken dat het nodig is om de monsters voor te bewerken en op te zuiveren door middel van een zuiveringskolom, het liefst door een kolom die geen specifieke binding aangaat. Uiteraard moet dit onderzoek verder worden voortgezet om een nieuwe methode te ontwikkelen.

26


Engels:

On the 26th February 2008 I started with the project of developing a method for demonstrating the presence of mycotoxines. The assignment was to look if there is a better, cheaper and faster way to determine mycotoxines, because the current method that is wrote in the prescription for the use of the DONprep column has a quite long treatment needed to get some results.In the past weeks and months I have researched the possibility of developing a method for demonstrating the presence of mycotoxines.

The first weeks of the investigation were difficult, but how longer I was working on it how interesting it became. During the development of de method there were 2 columns tested. One from Biopharm and one from Varian. On both columns were done several experiments, to determine what eventually be the most suitable column is for measuring mycotoxines in pulp from sugar beets. After doing many tests with the column of Varian as well as the column of Biopharm it was clear which was the best to use when you’re going to measure mycotoxines.The best option is then to take the column of Varian, called Bond Elute® Mycotoxin, because this column can’t measure only deoxynivalenol and 15-acetyl-deoxynivalenol, but also other mycotoxines. This is based on several tests during this development of this method. Other reason to use is that the sample doesn’t have to go as much preparation.

Therefore we can make a conclusion out of the results we have made. It’s needed that you pre-treatment on the samples that you’re going to measure and clean up the samples by means of using the purification column. Rather using a column that hasn’t has a specific bond with one type of mycotoxines. This research must be continued further on off course, so that there can be make a whole new and better way to determine several mycotoxines.

27


Literatuurbronnen:

Boeken:

Titel: The mycotoxin factbook, food and feed topicsUitgever: Wageningen Academic PublishersPlaats en jaar uitgave: Nederland 2006

Internet:

1. http://www.gr.nl/pdf.php?ID=189 2. http://www.r-biopharm.com/product_site.php?

language=english&product_id=141&PHPSESSID=3360f64cc7c096e6eb5613557f7c43ca

3. http://www.pdv.nl/lmbinaries/pdf1363_pdf_nl_nl.pdf

28

http://www.pdv.nl/lmbinaries/pdf1363_pdf_nl_nl.pdf

http://www.r-biopharm.com/product_site.php?language=english&product_id=141&PHPSESSID=3360f64cc7c096e6eb5613557f7c43ca



http://www.gr.nl/pdf.php?ID=189

Afstudeerscriptie MLO

Education

Transcript of Afstudeerscriptie MLO