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Tesis Doctoral
Incorporación de Bacillus coagulans a productos
derivados de cereales
Manuel López Cabanillas Lomelí
Directora: Dra. Blanca Edelia González Martínez
Tutora: Dra. Marta Capellas Puig
Doctorado en Ciencia de los alimentos
Departamento de Ciencia animal y de los alimentos
Facultad de Veterinaria
Universitat Autònoma de Barcelona
2017
Tesis Doctoral
Incorporación de Bacillus coagulans a productos
derivados de cereales
Autor: Manuel López Cabanillas Lomelí
Directora: Dra. Blanca Edelia González Martínez
Tutora: Dra. Marta Capellas Puig _______________
Doctorado en Ciencia de los alimentos
Departamento de Ciencia animal y de los alimentos
Facultad de Veterinaria
Universitat Autònoma de Barcelona
Resumen: Incorporación de Bacillus coagulans a productos de panificación ________________________________________________________________________________________
RESUMEN
El papel de la dieta en el ser humano es el proporcionar suficientes nutrientes para satisfacer las necesidades metabólicas, además de brindar una sensación de satisfacción y bienestar. Hoy en día se sabe que los alimentos que consumimos juegan un papel importante en la modulación de diversas funciones fisiológicas de nuestro organismo. Las personas actualmente se preocupan más por los alimentos que consumen y sus beneficios a la salud que producen, por lo que gracias al avance del conocimiento sobre los que los alimentos pueden aportar, surgen los alimentos funcionales donde una de las categorías con mayor demanda y aceptación son los productos que contienen microorganismos beneficios a la salud, denominados alimentos con probióticos.
La mayoría de los alimentos con probióticos se encuentran en el sector de lácteos, pero existe un segmento importante de la población que no los consume, por lo que el desarrollo de productos derivados de cereales con probióticos puede ser una alternativa para ellos.
El objetivo de la investigación fue probar la factibilidad de la incorporación de microorganismos probióticos, específicamente Bacillus coagulans (Ganeden®) a una barra de cereal rellena de fruta y a una galleta de avena, y evaluar la sobrevivencia en condiciones de vida de anaquel.
Se realizó una caracterización de la cepa de B. coagulans (Ganeden®) mediante pruebas: microbiológicas básicas, de funcionalidad, de inocuidad y de identificación molecular, posteriormente se analizaron los flujos de elaboración a nivel industrial de los productos para determinar la forma de incorporación de los microorganismos probióticos. Posterior al proceso tecnológico se evaluó en las diferentes fases de elaboración de los productos (ingredientes secos, masa, masa fermentada y producto terminado) la sobrevivencia del B.
coagulans incorporado, La sobrevivencia en la vida de anaquel en seis meses almacenados a temperatura ambiente y bajo condiciones de abuso de temperatura también fueron evaluadas.
En la presente investigación se comprobó la pureza, las características funcionales y de inocuidad del microorganismo utilizado B. coagulans (Ganeden®), así mismo se realizó una identificación con métodos moleculares hasta el nivel de especie, lo que da certeza del consumo en el caso de que el desarrollo llegara al mercado.
De los productos a los que se les incorporó el microorganismo probiótico en esta investigación, la galleta de avena presentó mejor sobrevivencia, ya que no se observa reducción en el contenido de microorganismos en los 6 meses estudiados, mientras que la barra de cereal con relleno de fruta presentó una reducción de medio ciclo logarítmico en el mismo tiempo, por lo que se considera que es factible en un futuro el poder escalar de forma industrial el proceso estudiado y poner a disposición del consumidor una nueva opción de productos derivados de cereales con probióticos.
Resumen: Incorporación de Bacillus coagulans a productos de panificación ________________________________________________________________________________________
ABSTRACT
The role of diet in humans is to provide enough nutrients to satisfied metabolic needs, in addition to provide a sense of satisfaction and well-being. Today we know that the food we eat plays an important role in modulating physiological functions of our body. People nowadays are more concerned with the foods they eat and their health benefits, so thanks to the advance of the knowledge that food can provide functional foods arise where one of the categories with the highest demand and acceptance are products containing microorganisms with health benefits, called food with probiotics.
Most probiotic foods are in the dairy sector, but there is a large segment of the population that does not consume them, so the development of probiotic-based cereal products may be an alternative for them.
The objective of the research was to test the feasibility of incorporating probiotic microorganisms, specifically Bacillus coagulans (Ganeden®) into a fruit-filled cereal bar and an oatmeal cookie, and to evaluate survival in shelf-life conditions.
A characterization of the B. coagulans strain (Ganeden ®) was carried out through basic microbiological, functional, safety and molecular identification tests, followed by an analysis of the industrial processing flows of the products to determine the way of incorporation of probiotic microorganisms. Subsequent to the technological process, the survival of B. coagulans was evaluated in the different stages of product processing (dry ingredients, dough, fermented dough and finished product). The survival during its shelf life during six months stored at room temperature and under conditions of temperature abuse were also evaluated.
In the present investigation, the purity, functional and safety characteristics of the microorganism used B. coagulans (Ganeden®) were verified, as well as an identification with molecular methods up to the species level, which gives certainty of the consumption in the case this development reach to the market.
Of the products to which the probiotic microorganism was incorporated in this research, the oat cracker presented better survival, since there was no reduction in the content of microorganisms in the 6 months studied, while the cereal bar filled with fruit presented a reduction of half log cycle at the same time, so it’s considered that in the future may be feasible to scale the process in an industrial way and to make available to the consumer a new choice of products derived from cereals with probiotics.
Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
5
Contenido 1. Introducción, hipótesis, objetivos y plan de trabajo ................................................ 9
2. Antecedentes ............................................................................................................................ 11
1.1 Probióticos ................................................................................................................................. 12
1.2. Probióticos en uso alimentario .................................................................................................. 13
1.3. Mercado de probióticos ............................................................................................................. 15
1.4. Efectos benéficos de los probióticos a la salud .......................................................................... 17
1.5. Diferentes cepas probióticas ...................................................................................................... 19
1.6. Perspectivas de los alimentos con probióticos .......................................................................... 22
1.7. Abordajes moleculares para la identificación bacteriana .......................................................... 23
1.8. Dosis de probióticos ................................................................................................................... 25
1.9. Sobrevivencia de los probióticos ................................................................................................ 26
1.10. Micro encapsulación de microorganismos .............................................................................. 29
1.11. Matriz del alimento .................................................................................................................. 31
1.12. Evaluación de la seguridad ....................................................................................................... 36
1.13. Bacillus...................................................................................................................................... 36
1.13.1. Bacillus coagulans ................................................................................................................. 37
1.13.1.1 Beneficios del B. coagulans ................................................................................................ 39
1.13.1.2. Mecanismos de acción para B. coagulans ......................................................................... 40
1.14. Alimentos derivados de cereales con probióticos ................................................................... 42
3. Metodología ............................................................................................................................... 45
3.1 Caracterización de la cepa de Bacillus coagulans. ...................................................................... 46
3.1.1. Pruebas de microbiología básica. ...................................................................................... 46
3.1.1.1. Morfologia de las colonias ............................................................................................ 46
3.1.1.2. Tinción de Gram y morfología de las bacterias. ........................................................... 46
3.1.1.3. Tinción de esporas. ....................................................................................................... 47
3.1.1.4. Motilidad. ..................................................................................................................... 47
3.1.1.5. Características bioquímicas. ......................................................................................... 47
3.1.1.6. Esporulación y germinación. ........................................................................................ 47
3.1.1.7. Curva de crecimiento de Bacilus coagulans ................................................................. 48
3.1.2 Pruebas de Funcionalidad. ....................................................................................................... 48
3.1.2.3. Tolerancia a condiciones de acidez y sales biliares ...................................................... 49
3.1.3. Pruebas de inocuidad ...................................................................................................... 50
Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
6
3.1.4. Identificación molecular de Bacillus coagulans............................................................... 51
3.1.5. Microorganismos ............................................................................................................. 51
3.1.6. Extracción de ADN. .......................................................................................................... 52
3.2. Incorporación del probiótico en el proceso industrial del producto ......................................... 53
3.2.1. Análisis de los productos seleccionados.......................................................................... 53
3.3. Sobrevivencia del probiótico durante el proceso de elaboración ............................................. 56
3.4. Sobrevivencia del probiótico durante la vida de anaquel del producto .................................... 57
3.5. Análisis estadístico. .................................................................................................................... 57
4. Resultados y discusión .......................................................................................................... 58
4.1. Caracterización de las cepas ...................................................................................................... 58
4.1.1 Morfología ........................................................................................................................ 58
4.1.3. Motilidad. ........................................................................................................................ 59
4.1.4. Características bioquímicas ............................................................................................. 60
4.1.5. Capacidad de germinación .............................................................................................. 62
4.1.6. Curva de crecimiento de Bacilus coagulans .................................................................... 63
4.2. Pruebas de Funcionalidad. ......................................................................................................... 66
4.2.1. Actividad antimicrobiana ................................................................................................. 67
4.2.2. Tolerancia a condiciones de acidez y sales biliares. ........................................................ 68
4.3. Pruebas de Inocuidad. ................................................................................................................ 69
4.3.1. Prueba de resistencia a los antibióticos. ......................................................................... 69
4.4. Identificación molecular de Bacillus coagulans ......................................................................... 69
4.4.1. Identificación molecular de una cepa de referencia de Bacillus coagulans.................... 69
4.5. Especificidad respecto a otros probióticos. ............................................................................... 70
4.6. Especificidad respecto a patógenos. .......................................................................................... 71
4.7. Identificación molecular de cepas Ganeden. BC 9M-E y BC-15M ................................. 72
4.8. Sobrevivencia del probiótico durante el proceso de elaboración. ............................................ 73
4.8.1. Barras de cereal con relleno de fruta. ............................................................................. 73
4.8.2. Galleta de avena con pasas ............................................................................................. 77
4.9. Sobrevivencia de probióticos en productos almacenados por seis meses bajo condiciones
normales de almacenamiento. ......................................................................................................... 79
4.10. Comparación de sobrevivencia de probióticos a seis meses y en condiciones de
almacenamiento con abuso de temperatura. ................................................................................... 81
5. Conclusiones ............................................................................................................................ 83
6. Referencias ................................................................................................................................ 84
Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
7
Lista de tablas Tabla 1 Especies de bacterias acido lácticas comúnmente utilizadas en preparaciones ................. 20
Tablas 2 Lista de cepas probióticas utilizadas en aplicaciones comerciales ..................................... 21
Tablas 3 Algunos productos probióticos no lácteos desarrollados .................................................. 22
Tablas 4 Criterios deseables para la selección de probióticos en aplicaciones comerciales ............ 23
Tabla 5 Características de las cepas usadas en este trabajo. ........................................................... 46
Tabla 6 Secuencias de oligonucleótidos utilizadas ........................................................................... 51
Tabla 7 Descripción de los productos seleccionados para la adición de probióticos con la cantidad
deseada y características de la materia prima. ................................................................................. 56
Tabla 8 Descripción del muestreo. (Número de muestras en cada etapa de producción) ............. 57
Tabla 9 Metabolismo de carbohidratos de las cepas de B. coagulans. ............................................ 61
Tabla 10 Recuperación de células vegetativas de las diferentes cepas de Bacillus coagulans
(UFC/ml de suspensión de esporas) .................................................................................................. 63
Tabla 11 Actividad antimicrobiana de B. coagulans contra patógenos ............................................ 67
Tabla 12 Sobrevivencia de B. coagulans a condiciones de acidez y sales biliares expresadas en Log
UFC/mL y porcentaje de recuperación ............................................................................................. 69
Tabla 13 Contenido de microorganismos totales (Log UFC/g) en ingredientes secos de barra de
cereal con relleno de fruta. ............................................................................................................... 74
Tabla 14 Contenido de microorganismos totales (Log UFC/g) en masa, masa fermentada y
producto terminado (barra de cereal con relleno de fruta). ............................................................ 75
Tabla 15 Contenido de microorganismos totales (Log UFC/g) en ingredientes secos de ................ 77
Tabla 16 Contenido de microorganismos totales (Log UFC/g) en masa y producto terminado en
galleta de avena. ............................................................................................................................... 78
Tabla 17 Promedio de microorganismos que se encontró al finalizar las pruebas de sobrevivencia a
seis meses de almacenamiento y en condiciones de hot-pack. ....................................................... 81
Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
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Lista de figuras
Figura 1 Consumo de probióticos y beneficios a la salud (Adaptado de Parvez, Malik, Ah Kang &
Kim, 2006) ......................................................................................................................................... 18
Figura 2 Aspectos cualitativos de alimentos probióticos (Tripathi & Giri, 2014) ............................. 32
Figura 3 Factores que afectan la viabilidad de los probióticos (Tripathi & 2014) ............................ 33
Figura 4 Esquema general del proyecto de investigación ................................................................ 45
Figura 5 Diagrama de flujo de elaboración de galleta de avena ....................................................... 55
Figura 6 Diagrama general de flujo del proceso de elaboración de barra con relleno de fruta ....... 55
Figura 7 Morfología de las colonias de B. coagulans ........................................................................ 58
Figura 8 Endosporas de las cepas de estudio en comparación con una cepa de Bacillus subtillis. .. 59
Figura 9 Imágenes de los patrones de fermentación de carbohidratos de las cepas de B. coagulans
en las galerías de API® 50 CHTM ....................................................................................................... 62
Figura 10 Curvas de crecimiento de las cepas de B. coagulans utilizando el parámetro de densidad
óptica. ................................................................................................................................................ 65
Figura 11 Curvas de crecimiento de las cepas de B. coagulans utilizando el parámetro de Cuenta de
células viables por mL en agar MRS .................................................................................................. 66
Figura 12 Electroforesis en gel de agarosa al 3.5% visualizados con Br. Et. Carril 1: Hiperleader II,
Carril 2: producto amplificado de 262pb de la cepa de referencia ATCC® 7050 TM de B.
coagulans, Carril 3: Control negativo, Carril 4: Pro. ampli c. de B.coagulans ................................... 70
Figura 13 Electroforesis en gel de agarosa al 3% visualizado con Br. Et. C.1: Hyperleader II, C.2:
Producto amplificado de B. coagulans ATCC® 7050 TM de 262pb como control positivo, C.3:
Lactobacillus plantarum, C.4: Lactococcus lactis subsp. lactis, C.5: Bifi.adolescentis, C.6 Lact.
Rhamnosus, C.7. Bifi. Longum, C.8. Control negativo ....................................................................... 71
Figura 14 Electroforesis en gel de agarosa al 3% visualizado con Br. Et. C.1: Hyperleader II
(BIOLINE) de 2000 pb, C.2: Producto amplificado de B. coagulans ATCC® 7050 TM de 262pb como
control positivo, C.3: Salmonella enteritidis var. Typhimurium (ATCC 13311), C ............................. 72
Figura 15 Electroforesis en gel de Agarosa al 3.5% visualizados con Br. Et. Carril 1: Hiperleader V,
Carril 2: Producto amplificado de B. coagulans (BC-15M), Carril 3: Control negativo, Carril 4:
Producto amplificado de B. coagulans (BC-9M-E). ........................................................................... 73
Figura 16 Contenido de microorganismos probióticos en las etapas del proceso de Barras de cereal
con relleno de fruta. .......................................................................................................................... 76
Figura 17 Contenido de microorganismos probióticos en las etapas del proceso de Galletas de
avena. ................................................................................................................................................ 78
Figura 18 Sobrevivencia de Probióticos en Barras de cereal con relleno de fruta por seis meses. .. 79
Figura 19 Sobrevivencia de Probióticos en Galletas de avena con pasas por seis meses. ............... 80
Figura 20 Comparativo de sobrevivencia de probióticos en los diferentes productos por 6 meses 81
Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
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1. Introducción, hipótesis, objetivos y plan de trabajo
En la actualidad se sabe que los alimentos que consumimos juegan un papel
importante en la modulación de diversas funciones fisiológicas de nuestro
organismo. Las personas actualmente se preocupan más por los alimentos que
consumen y sus beneficios a la salud que producen, por lo que gracias al avance
del conocimiento sobre lo que los alimentos pueden aportar, surgen los alimentos
funcionales donde una de las categorías con mayor demanda y aceptación son los
productos que contienen microorganismos beneficios a la salud, denominados
alimentos con probióticos.
La mayoría de los alimentos con probióticos se encuentran en el sector de lácteos,
pero existe un segmento importante de la población que no los consume, por lo que
el desarrollo de productos derivados de cereales con probióticos puede ser una
alternativa para ellos.
Hipótesis
Bacillus coagulans puede ser incorporado a los productos derivados de cereal y sobrevivir
durante el proceso de elaboración y la vida de anaquel.
Objetivo general
Incorporar el probiótico Bacillus coagulans en alimentos a base de cereales
horneados como galletas y barras, y evaluar la sobrevivencia del probiótico durante
la vida de anaquel de los productos.
Objetivos específicos
1. Caracterizar la cepa del microorganismo probiótico a incorporar (Bacillus
coagulans).
2. Diseñar la estrategia de incorporación del probiótico en un proceso industrial de
producción de productos de panificación con cereales horneados.
Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
10
3. Evaluar la sobrevivencia del probiótico durante las diferentes etapas del proceso
de elaboración en los productos.seleccionados.
4. Analizar la sobrevivencia del probiótico durante la vida de anaquel de los
productos a temperatura ambiente durante 6 meses y en condiciones de abuso
de temperatura.
Para el desarrollo de la investigación se establecieron cuatro fases., la primera en
donde se caracterizó la cepa de Bacillus coagulans con pruebas de microbiológicas,
de funcionalidad como probiótico, inocuidad, e identificación precisa de la especie.
La segunda consistió en determinar la estrategia de incorporación del probiótico en
el proceso industrial de los productos. En la tercera se realizaron las pruebas de
sobrevivencia del probiótico durante el proceso de elaboración y por último se
estudió la sobrevivencia en la vida de anaquel del producto.
Antecedentes: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
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2. Antecedentes
El papel principal de la dieta en el ser humano es proporcionar suficientes nutrientes
para satisfacer los requerimientos metabólicos, mientras que proporciona al
consumidor una sensación de satisfacción y bienestar. Sin embargo, el
conocimiento reciente apoya la hipótesis de que, además de satisfacer las
necesidades nutricionales, la dieta puede modular diversas funciones fisiológicas y
puede desempeñar papeles perjudiciales o beneficiosos en algunas enfermedades
(Koletzko et al., 1998).
Estos conceptos son particularmente importantes a la luz del aumento del costo de
la atención de la salud, el aumento constante de la esperanza de vida y el deseo de
las personas mayores de mejorar la calidad de vida (Roberfroid, 2007). Es por ello
que la creciente preocupación por los hábitos alimentarios y su relación con la salud
y la longevidad ha estimulado el desarrollo de un gran número de estudios en el
campo de la ciencia alimentaria y la nutrición (Martinez, Bedani, & Saad, 2015).
Los alimentos funcionales son el resultado de los avances de la ciencia , el concepto
de alimentos funcionales ha estado examinando compuestos bioactivos y/o aditivos
alimentarios que pueden ejercer efectos beneficiosos sobre la composición y/o
actividad de la microbiota intestinal, una clase importante de alimentos funcionales
ha recibido una atención considerable: probióticos y prebióticos. Microbiota, un
término utilizado para reemplazar el nombre anterior de la microflora intestinal, es
un ecosistema formado por nichos diferenciados compuestos por una gran
diversidad de especies y cepas bacterianas (Aureli et al., 2011; Laparra & Sanz,
2010).
Los seres humanos son colonizados desde el nacimiento por bacterias, que forman
un complejo y dinámico consorcio de microorganismos conocidos como microbiota.
En general, esta comunidad microbiana compleja supera a las células somáticas y
Antecedentes: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
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germinales del huésped y contiene colectivamente una variabilidad genética
significativamente mayor que la del genoma del huésped (Bäckhed, Ley,
Sonnenburg, Peterson, & Gordon, 2005)
1.1 Probióticos
La palabra "probiótico" significa "para la vida" (del griego __o β'ιoς, pro bios). Los
trabajos de Metchnikoff (Metchnikoff, 1907) y Tissier (Tissier, 1907) fueron los
primeros en hacer sugerencias científicas sobre el uso probiótico de bacterias,
incluso cuando la palabra "probiótico" no fue acuñada hasta 1960, para nombrar
sustancias producidas por microorganismos que promovieron el crecimiento de
otros microorganismos (Lilly & Stillwell, 1965). Otras definiciones siguieron, con
Fuller siendo la primera en señalar la naturaleza microbiana de los probióticos
redefiniendo la palabra "probiótico" como "un suplemento alimentario microbiano
vivo que afecta beneficiosamente al animal huésped mejorando su equilibrio
intestinal"(Fuller, 1989). Havenaar y Huis in't Veld (1992) amplió la definición como
"un cultivo monocultivo o mixto viable de bacterias que, cuando se aplica a animales
o al hombre, beneficia al huésped mejorando las propiedades de la flora
autóctona"(Havenaar & Huis, 1992). Guarner y Schaafsma, 1998 dieron una
definición más reciente como "microorganismos vivos, que cuando se consumen en
cantidades adecuadas, confieren un efecto sobre la salud del huésped"(Guarner &
Schaafsma, 1998).
Los probióticos son definidos por la Organización Mundial de la Salud como
"microorganismos vivos que, cuando se administran en cantidades adecuadas,
confieren un beneficio para la salud al huésped"(Araya, Morelli, Reid, Sanders, &
Stanton, 2002). En todo el mundo, existen numerosas cepas de probióticos usadas
en suplementos dietéticos y alimentos, pero la mayoría son inestables a temperatura
ambiente, no soportan los tratamientos térmicos y necesitan ser liofilizados o
encapsulados a través de procedimientos especiales para que permanezcan viables
durante la fabricación, el almacenamiento y la exposición al ácido del estómago y a
Antecedentes: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
13
la bilis en el intestino (Gilliland, 1990). Por consiguiente, para la mayoría de los
probióticos, sólo un porcentaje muy pequeño del material de partida es realmente
viable en el final de la vida útil. Bacillus coagulans es una notable excepción que,
debido a su capacidad esporular, sobrevive sin manipulación especial y prolifera en
el medio gastrointestinal (Jurenka, 2012).
Las bacterias probióticas se introducen a menudo como suplementos dietéticos
vivos, pero también están presentes como microbiota viva en alimentos fermentados
para consumo humano. Los mecanismos moleculares por los cuales los probióticos
afectan beneficiosamente a la salud humana incluyen el fortalecimiento de la barrera
intestinal, la modulación de la respuesta inmune y el antagonismo de los patógenos
mediante la producción de compuestos antimicrobianos o la competencia por sitios
de unión a la mucosa (Ventura & Perozzi, 2011)
En alimentos fermentados se han utilizado con anterioridad probióticos como parte
del proceso, sin embargo, cada vez más se añaden como suplementos. Además
hay también una tendencia creciente en el uso de probióticos como nutracéuticos,
estando disponible en diversas formas, tales como en cápsulas. Esta tendencia
cambiante en el suministro de probióticos puede conducir a una reducción de la
eficacia funcional debido a la exclusión del efecto sinérgico potencial de los
alimentos (Ranadheera, Baines, & Adams, 2010).
El consumo de microorganismos probióticos y de ingredientes prebióticos es una
alternativa prometedora para influir de manera beneficiosa en la ecología
microbiana intestinal, manteniendo la homeostasis intestinal y controlando la
disbiosis y, en consecuencia, mejorando la salud (Martínez et al., 2015).
1.2. Probióticos en uso alimentario
Para el uso en alimentos, se documentaron criterios importantes para los
probióticos, en particular que no sólo debían ser capaces de sobrevivir al paso a
través del tracto digestivo, exhibiendo tolerancia a ácidos y bilis, soportando
Antecedentes: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
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enzimas digestivas, sino que también tener la capacidad de proliferar en el intestino.
Los probióticos deben ser capaces de ejercer sus beneficios en el huésped. Por lo
tanto, la capacidad de permanecer viable en el sitio de destino y esta eficacia debe
ser verificada para cada cepa. En 2002, un grupo de trabajo conjunto FAO/OMS
elaboró Directrices para la evaluación de los probióticos en los alimentos (Araya et
al., 2002). Se recomendó adoptar oficialmente la definición FAO / OMS de
probióticos y utilizar y adoptar las directrices en el informe de este grupo de trabajo
como requisito previo para denominar una cepa microbiana "probiótica".
Los requisitos mínimos necesarios para el probiótico incluyen: (I) la evaluación de
la identidad de la cepa (género, especie, nivel de cepa); (II) ensayos in vitro para
detectar posibles cepas probióticas: resistencia a la acidez gástrica, ácidos biliares
y enzimas digestivas, actividad antimicrobiana contra bacterias potencialmente
patógenas, etc.; (III) evaluación de la seguridad: requisitos para demostrar que una
cepa probiótica es segura y sin contaminación en su forma de suministro; (IV)
estudios in vivo para corroborar los efectos sobre la salud en el huésped objetivo
(Araya et al., 2002).
Gupta & Garg, 2009 sugieren una dosis de 5 mil millones de unidades formadoras
de colonias (UFC) durante al menos 5 días (5 × 109 UFC / día) para tener beneficios
a la salud; los probióticos pueden estar disponibles en alimentos y suplementos
dietéticos (cápsulas, tabletas y polvos). En los alimentos probióticos y suplementos,
las bacterias pueden haber estado presentes originalmente o ser añadidos durante
la preparación. Los probióticos deben sobrevivir a los ácidos gástricos y biliares para
alcanzar el tracto intestinal, colonizar el epitelio huésped y exhibir un efecto
beneficioso. La mayoría de las formas convencionales de probióticos de tipo
lactobacilos no poseen la capacidad de formación de esporas y, por lo tanto, son
inactivadas por la bilis y el pH gástrico bajo. Además, los probióticos seleccionados
para uso comercial deben sobrevivir a la fabricación industrial y el almacenamiento
para asegurar la viabilidad a largo plazo y la actividad biológica (V. Gupta & Garg,
2009). La mayoría de las células de lactobacilos convencionales mueren a 70°C,
Antecedentes: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
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mientras que las bacterias que forman ácido láctico que contienen esporas no
muestran una disminución en las células viables, incluso después de calentar en
solución salina a 85°C durante 30 min (Iannitti & Palmieri, 2010).
Los probióticos se incluyen tradicionalmente en los productos lácteos (Stanton et
al., 2002), aunque algunos productos fermentados no lácteos también están en el
mercado. Estos productos tienen en común que deben ser almacenados y
transportados a temperaturas refrigeradas y tienen una vida útil bastante corta. Para
evitar estas limitaciones, los probióticos se han incluido en los suplementos
dietéticos. Sin embargo, un enfoque alternativo sería incluir probióticos en una
matriz de alimentos secos o de humedad intermedia (Molin, 2001).
1.3. Mercado de probióticos
El mercado mundial de alimentos y bebidas funcionales ha crecido de 33.000
millones de dólares en 2000 a 176.700 millones de dólares en 2013, lo que
representa el 5% del mercado global de alimentos y es el motor del crecimiento de
la industria alimentaria en su conjunto (Granato, Branco, Nazzaro, Cruz, & Faria,
2010; Hennessy, 2013). Se ha estimado que los alimentos probióticos comprenden
entre 60% y 70% del mercado total de alimentos funcionales (Holzapfel, 2006;
Kołożyn-Krajewska & Dolatowski, 2012; Stanton et al., 2002).
Sin embargo, teniendo en cuenta la alta prevalencia de la intolerancia a la lactosa,
se han desarrollado en los últimos años diferentes productos probióticos no lácteos
como productos vegetarianos, productos a base de cereales, jugos de frutas,
productos a base de soja, postres a base de avena, productos de confitería,
cereales para el desayuno y para los bebés (Anekella & Orsat, 2013; M. Chen &
Mustapha, 2012; Granato et al., 2010; S. Gupta & Abu-Ghannam, 2012;
Mortazavian, Khosrokhavar, Rastegar, & Mortazaei, 2010; Noorbakhsh, Yaghmaee,
& Durance, 2013; Rivera-Espinoza & Gallardo-Navarro, 2010; Yk & Salminen,
1995).
Antecedentes: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
16
Los productos que contienen probióticos son comunes en Japón y Europa desde
hace varias décadas (Sanders, 1999). Una revisión del mercado del yogur en
Europa muestra que los yogures probióticos constituyen el 13% del mercado en el
Reino Unido y Alemania, y el 20% del mercado en Dinamarca (Fonden et al., 1999).
Un estudio de fabricantes de alimentos, minoristas y productores de ingredientes
realizado por Leatherhead Research en el Reino Unido proyectó un crecimiento del
60% en alimentos funcionales en estos países y un crecimiento de 78% en los
EE.UU. en los próximos 15 años. Si estas proyecciones son exactas, los alimentos
en los estantes de los supermercados estadounidenses que contienen cultivos
probióticos aumentarán (Fonden et al., 1999)
El mercado global de ingredientes, suplementos y probióticos ha tenido una
evolución importante a nivel global, presentó un valor de mercado de 14.900
millones de dólares en 2007 y alcanzó los 16.000 millones de dólares en 2008. Las
estimaciones apuntan a un total de 19.600 millones de dólares en ventas para el
2013, una tasa de crecimiento anual compuesta del 4.3% (Granato et al., 2010).
Los probióticos del género Lactobacillus representaron la mayor proporción, el
61.9% de la ventas totales en 2007 (Food Processing, 2009). Las aplicaciones de
alimentos probióticos se encuentran principalmente en productos lácteos, yogures,
kéfir y bebidas con cultivos, que representan las categorías principales. Los
productos del yogurt representaron la mayor parte de ventas un 36,6%, con una alta
aceptación sensorial (De Almeida et al., 2009; De Almeida et al., 2008; Zoellner et
al., 2009). La aplicaciones de alimentos emergentes incluyen probióticos: helados,
barras de nutrición, cereales para el desayuno, formula infantil y otros más (Adriano
G da Cruz, Antunes, Sousa, Faria, & Saad, 2009; Gomes , Buriti, de Souza, Faria,
& Saad, 2009).
Antecedentes: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
17
Los productos probióticos no lácteos tienen una gran importancia mundial debido a
la tendencia actual del vegetarianismo ya una alta prevalencia de intolerancia a la
lactosa en muchas poblaciones alrededor del mundo. Sin embargo, no hay duda de
que el sector lácteo, fuertemente vinculado a los probióticos, es el mayor mercado
de alimentos funcionales, representando casi el 33% del amplio mercado, mientras
que los cereales superan el 22% (Intl, 2006). Un total de 78% de las ventas actuales
de probióticos en el mundo de hoy se entregan a través de yogur. Los jugos de
frutas, postres y productos a base de cereales que contienen probióticos pueden
ser otros medios adecuados para suministrar probióticos (Cargill, 2009).
De acuerdo a ño publicado en Euromonitor 2012, el crecimiento del segmento de
alimentos probióticos ha sido notable en la última década con predominio de los
productos lácteos, como el yogur, el helado, el queso y la leche, los jugos y las
bebidas y las formulaciones para lactantes (Euromonitor, 2012).
1.4. Efectos benéficos de los probióticos a la salud
Los probióticos proporcionan una serie de beneficios para la salud, principalmente
a través del mantenimiento de la microbiota intestinal normal, la protección contra
los patógenos gastrointestinales (Gilliland, 1990), el aumento del sistema
inmunológico (D'Aimmo, Modesto, & Biavati, 2007; Lourens-Hattingh & Viljoen,
2001), reducción del nivel de colesterol sérico y de la presión arterial, actividad anti-
carcinogénica, mejor utilización de los nutrientes y valor nutricional mejorado de los
alimentos (Rasic, 2003) (Fig. 1).
Antecedentes: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
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Figura 1 Consumo de probióticos y beneficios a la salud (Adaptado de Parvez, Malik, Ah Kang & Kim, 2006)
Las aplicaciones terapéuticas de los probióticos incluyen la prevención de la diarrea
infantil, las enfermedades urogenitales, la osteoporosis, la alergia alimentaria y las
enfermedades atópicas; reducción de la diarrea; alivio del estreñimiento e
hipercolesterolemia; control de enfermedades inflamatorias intestinales; y
protección contra el cáncer de colon y de vejiga (Lourens-Hattingh & Viljoen, 2001;
Mattila-Sandholm et al., 2002; Salminen, 1996; Venturi et al., 1999).
Existen varias evidencias que apoyan aplicaciones clínicas potenciales de
probióticos en la prevención y el tratamiento de trastornos gastrointestinales,
urogenitales y enfermedades respiratorias (Gardiner et al., 2002). Mann & Spoerry
(1974) descubrieron que los niveles de colesterol en el suero sanguíneo disminuían
significativamente al beber yogur fermentado con cepas silvestres de Lactobacillus
sp. (Mann & Spoerry, 1974). Harrison et al., (1975) informaron de la disminución de
los niveles de colesterol sérico mediante el consumo de fórmula infantil añadida con
células de Lactobacillus acidophilus. (Harrison, Peat, & Heese, 1975).Del mismo
modo, Gilliland (1990) y Gill & Guarner (2004) mostraron el control de los niveles de
Antecedentes: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
19
colesterol sérico en experimentos humanos adultos. (Gilliland, 1990, Gill & Guarner
2004).
1.5. Diferentes cepas probióticas
La relevancia de la identificación fiable y la tipificación de las cepas utilizadas en
aplicaciones probióticas siguen aumentando debido a las dos razones principales.
En primer lugar, está claro que el uso de cepas probióticas ya no está estrictamente
restringido a las aplicaciones de alimentos en las que la historia de uso seguro en
los alimentos fermentados (tradicionales) era un argumento importante para la
importancia de la clasificación correcta de los probióticos. En los últimos años, sin
embargo, los probióticos también se utilizan cada vez más en aplicaciones
bioterapéuticas y farmacéuticas, dirigidas a grupos de pacientes específicos, cada
uno con sus propios perfiles de riesgo clínico.
En la actualidad, el uso inadecuado de los métodos de identificación se considera
como la principal causa de la designación incorrecta de las cepas probióticas (Huys
et al., 2006). Muchos microorganismos diferentes se han utilizado como probióticos,
principalmente cepas de los géneros bacterianos Lactobacillus y Bifidobacterium,
pero también cepas de Escherichia coli, Saccharomyces boulardii o Bacillus
coagulans, junto con otros bacilos formadores de esporas. Por su naturaleza
formadora de esporas, estos últimos organismos poseen viabilidad y estabilidad
mejoradas en comparación con otras cepas bacterianas probióticas. La capacidad
de soportar procesos a alta temperatura, tales como hornear y hervir, representando
así una elección ideal para el desarrollo de productos funcionales a base de
cereales (Cutting, 2011).
Aunque una amplia variedad de géneros y especies de microorganismos se
consideran probióticos potenciales (Holzapfel, 1998, Shah & Ravla, 2004), los
utilizados comercialmente en alimentos probióticos son predominantemente
bacterias de los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium (Tablas 1 y 2). La principal
Antecedentes: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
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razón de ser ambos géneros tiene una larga historia de uso seguro y se consideran
como GRAS (generalmente reconocido como seguro)
Tabla 1 Especies de bacterias acido lácticas comúnmente utilizadas en preparaciones
Bacteria probiótica Cepa Lactobacillus sp.
L. acidophilus, L. casei, L. delbrueckii ssp., L. cellobiosus, L. curvatus, L. fermentum, L. lactis, L. plantarum, L. reuteri, L. brevis
Bifidobacterium sp.
B. bifidum, B. adolescentis, B. animalis, B. infantis, B. thermophilum, B. longum
Enterococcus sp. Ent. faecalis, Ent. faecium
Streptococcus sp
S. cremoris, S. salivarius, S. diacetylactis, S. intermedius
Fuente: Tripathi M.K. & Giri S.K (2014) Para el año 2004 se encontraban disponibles varias decenas de cepas probióticas,
en la tabla 2 se presentan las casas comerciales y las cepas probióticas ofrecidas.
Antecedentes: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
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Tablas 2 Lista de cepas probióticas utilizadas en aplicaciones comerciales
Fuente/ producto Cepa Chr. Hansen
L. acidophilus LA1/LA5 L. delbrueckii ssp. Bulgaricus Lb12 L. paracasei CRL431 B. animalis ssp. lactis Bb12
Danisco
L. acidophilus NCFMs L. acidophilus La L. paracasei Lpc B. lactis HOWARUTM/Bl
DSM Food Specialties
L. acidophilus LAFTIs L10 B. lactis LAFTIs B94 L. paracasei LAFTIs L26
Nestle L. johnsonii La1 Snow Brand Milk L. acidophilus SBT-20621 Products Co. Ltd. B. longum SBT-29281 Institute Rosell
L. rhamnosus R0011 L. acidophilus R0052
Yakult
L. casei Shirota B. breve strain Yaku B. lactis HN019 (DR10) L. rhamnosus HN001 (DR20)
Probi AB L. plantarum 299V L. rhamnosus 271
Danone L. casei Immunitas B. animalis DN173010 (Bioactiva)
Essum AB
L. rhamnosus LB21 Lactococcus lactis L1A
Biogaia L. reuteri SD2112 Morinaga Milk Industry Co. Ltd. B. longum BB536 Lacteol Laboratory L. acidophilus LB Medipharm L. paracasei F19 Fuente: Holm, 2003; Shah, 2004.
De hecho, las endosporas del género Bacillus son una forma de duración muy
estable y muestran una alta estabilidad durante el procesamiento y almacenamiento
del producto alimenticio (Bader, Albin, & Stahl, 2012). En 2008 el microorganismo
B. coagulans se reconocio por la Administración de Alimentos y Medicamentos de
los Estados Unidos de Norteamérica (FDA) como producto Reconocido
Generalmente Como Seguro por su siglas en inglés (GRAS) después de la
evaluación de estudios toxicológicos (Endres et al., 2011). Además, la especie B.
coagulans se incluye en la lista de agentes biológicos de presunción de seguridad
(QPS) que pueden añadirse a los alimentos (Panel EFSA, 2013).
Antecedentes: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
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1.6. Perspectivas de los alimentos con probióticos
La viabilidad futura y el éxito de los alimentos funcionales en el mercado dependen
de varios elementos. La cuestión clave es la aceptación por parte de los
consumidores de dichos productos. Para que los consumidores acepten pagar el
costo asociado con los alimentos funcionales, deben ser convencidos por sus
afirmaciones de salud a través de mensajes claros, veraces e inequívocos.
Para este propósito, se deben realizar nuevos estudios para: probar ingredientes,
explorar más opciones de medios que aún no se han utilizado industrialmente,
reingeniería de productos y procesos, y demostrar que los consumidores
intolerantes a la lactosa y vegetarianos demandan nuevos productos probióticos
nutritivos y sabrosos. (Granato et al., 2010).
En la década pasada se han desarrollado en forma importante las diferentes
categorías de alimentos disponibles en el mercado, con características específicas
que aportan beneficios a la salud. Los alimentos con probióticos no lácteos han
ocupado un lugar en esta categoría, en la siguiente tabla se muestran algunos de
ellos.
Tablas 3 Algunos productos probióticos no lácteos desarrollados
Productos Pudines a base de cereal Yogurt a base de cereal de arroz Bebida a base de avena Productos de avena Yosa (pudin de avena y cereales) Bebida a base de maíz; malta Boza (cereales fermentados) Bebida fermentada probiótica de trigo, centeno, mijo, maíz y otros cereales Mahewu (bebida de maíz fermentado) Bebida probiotica fermentada a base de maíz, sorgo, malta de mijo
Fuente: Granato et al., 2010
La selección de las cepas probióticas adecuadas en dosis adecuadas es el primer
requisito para desarrollar un producto alimenticio probiótico. La viabilidad durante
Antecedentes: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
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las operaciones de procesamiento y almacenamiento, la supervivencia durante el
tránsito intestinal y los beneficios potenciales para la salud de los consumidores
son los criterios principales para seleccionar cepas adecuadas de especies
probióticas bacterianas (Talayar & Kailasapathy, 2004).
La sobrevivencia de las bacterias contra diferentes factores perjudiciales durante el
procesamiento y el desarrollo del producto es específica de especies y cepas
(Tamime, Saarela, Sondergaard, Mistry, & Shah, 2005).En términos de robustez de
los organismos probióticos, los lactobacilos son generalmente más fuertes que las
Bifidobacterias (Mättö, Alakomi, Vaari, Virkajärvi, & Saarela, 2006; Ross, Desmond,
Fitzgerald, & Stanton, 2005).
Se han reconocido y sugerido numerosos criterios para la selección de organismos
probióticos adecuados (Mattila-Sandholm et al., 2002; Ouwehand, Kirjavainen,
Shortt, & Salminen, 1999; G. Reid, 1999). La Tabla 4 muestra algunas de las
características tecnológicas y fisiológicas de las cepas probióticas como criterios
deseables para la selección de probióticos en aplicaciones comerciales.
Tablas 4 Criterios deseables para la selección de probióticos en aplicaciones comerciales
Criterio Propiedad Seguridad Ausencia de patogenicidad e infectividad
Factores de virulencia (toxicidad, actividad metabólica y propiedades intrínsecas, i.e., resistencia a antibióticos)
Tecnológico
Cepas genéticamente estables Viabilidad deseada durante el procesamiento y almacenamiento Buenas propiedades sensoriales Producción a gran escala Resistencia a los fagos
Funcional Tolerancia a ácido gástrico Tolerancia a billis Adhesión a superficie de la mucosa
Fisiológico Immunomodulación Actividad antagonista Metabolismo de colesterol Metabolismo de lactosa Antimutagénica y propiedades anticarcinogénicas
Fuente: Shah, 2006; Morelli, 2007. 1.7. Abordajes moleculares para la identificación bacteriana
Antecedentes: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
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El método considerado actualmente como el "patrón oro" para la delineación y
descripción de nuevas especies bacterianas es la re asociación ADN-ADN pero no
es práctico en la identificación rutinaria de cultivos bacterianos. Por lo tanto, se
prefieren otros métodos moleculares siempre que ofrezcan suficiente
reproducibilidad experimental y una resolución taxonómica apropiada y que utilicen
bases de datos de identificaciones actualizadas y fácilmente disponibles y validadas
(Huys et al., 2013). El uso de enfoques moleculares para la identificación de
especies utilizadas en aplicaciones probióticas se cubre con gran detalle en varios
artículos de revisión (Holzapfel, Haberer, Geisen, Björkroth, & Schillinger, 2001;
Holzapfel et al., 1998; Ward & Roy, 2005). El análisis secuencial de la parcial o
completa del gen 16S ribosomal ARN (ARNr) es ahora común como la primera
herramienta para utilizar para el posicionamiento taxonómico de microorganismos
probióticos (Yeung, Sanders, Kitts, Cano, & Tong, 2002).
Es un hecho bien conocido que las especies de Bacillus tienen la capacidad de
formar esporas cuando las condiciones de crecimiento no están a su favor y pueden
permanecer en la fase latente por muchos años. Sin embargo, cuando las
condiciones de crecimiento son favorables, tales como: contenido de nutrientes
específicos, pH, temperatura y humedad, pueden causar que las esporas produzcan
células vegetativas a través del proceso de germinación (Nicholson, Munakata,
Horneck, Melosh, & Setlow, 2000). Bacillus coagulans (anteriormente conocido
como Lactobacillus sporogenes) es un microorganismo Gram positivo con forma de
varilla, de 0,9 por 3,0 a 5,0 μm de tamaño, microaerofílico y produce L (+) ácido
láctico predominantemente. El uso seguro y eficaz de muchas cepas de B.
coagulans como probiótico tanto en animales como en seres humanos ha sido bien
documentado (Cutting, 2011; Jurenka, 2012; Monograph, 2002).
Por lo tanto, existe la necesidad de una cepa probiótica termoestable que pueda
soportar duras condiciones de fabricación y proporcionar un conteo viable suficiente
y deseado durante el transporte, almacenamiento y permanezca hasta el momento
del consumo.
Antecedentes: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
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1.8. Dosis de probióticos
La dosis suficiente de microorganismos probióticos para producir efectos benéficos
para la salud puede variar dependiendo de la cepa y del producto. En general, los
productos que contienen microorganismos probióticos deben tener un número
mínimo de células viables, con una eficacia comprobada establecida en ensayos
clínicos en seres humanos, estimada entre 106 y 108 unidades formadoras de
colonias por gramo (UFC / g) de producto final o 108 - 1010 CFU / d (considerando
100 g o 100 ml del alimento ingerido) (Champagne, Ross, Saarela, Hansen, &
Charalampopoulos, 2011).
Un número similar de células probióticas viables (109 UFC) por ración, consumido
diariamente, también es recomendado por Health Canada (Champagne et al., 2011)
así como el Ministerio de Salud Italiano (2013) (Ministerio della Salute, 2013)
recomienda dosis de 108-1010 UFC / d (considerando 100 g o 100 ml del alimento
ingerido).
Los beneficios para la salud de los probióticos sólo pueden obtenerse cuando el
alimento contiene el mínimo necesario de microorganismos viables en el momento
del consumo. La industria alimentaria en general ha adoptado el nivel mínimo
recomendado de 106 UFC/ml en el momento del consumo (Boylston, Vinderola,
Ghoddusi, & Reinheimer, 2004; K Kailasapathy & Rybka, 1997).
También se ha indicado que los productos probióticos deben ser consumidos
regularmente con una cantidad aproximada de 100 g/día con el fin de aportar
alrededor de 109 células viables en el intestino (Karimi, Mortazavian, & Da Cruz,
2011).
Antecedentes: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
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1.9. Sobrevivencia de los probióticos
Los lácteos son los alimentos más estudiados en este tema, un factor clave en la
selección de un iniciador probiótico adecuado es su capacidad para sobrevivir al
ambiente ácido del producto fermentado final (in vitro) y las condiciones adversas
del tracto gastrointestinal (in vivo). La supervivencia de las bacterias probióticas in
vitro podría estar influenciada por los metabolitos formados por el iniciador como el
ácido láctico y el ácido acético, el peróxido de hidrógeno y las bacteriocinas
(Saarela, Mogensen, Fonden, Mättö, & Mattila-Sandholm, 2000). Aunque existen
diferencias entre las especies y las cepas específicas, los lactobacilos generalmente
se consideran intrínsecamente resistentes (Kashket, 1987), especialmente a
valores de pH superiores a 3,0 (Hood & Zoitola, 1988). De las diversas bacterias
probióticas, L. casei y L. plantarum parecen tener vidas de anaquel más largas que
L.acidophilus, L. reuteri y que las diferentes especies de bifidobacterias en la leche
cultivada (Yk & Salminen, 1995).
La seguridad, la eficacia y la funcionalidad de los probióticos son dependientes de
la cepa ya que cada cepa es genéticamente única. Los datos de una cepa no se
pueden utilizar para soportar una cepa cercana, sino que cada cepa necesita ser
estudiada para demostrar las afirmaciones (Fares et al, 2015). Las condiciones de
procesamiento durante la producción pueden conducir a pérdidas significativas de
viabilidad probiótica debidas a lesiones celulares inducidas por calor, mecánica u
osmótica (Bustos & Bórquez, 2013; Fu & Chen, 2011).
La selección de las cepas probióticas debe dirigirse a los efectos deseados
mostrados por los microorganismos de interés, soportados por ensayos in vitro e in
vivo, cuando se ensayan solos o se incorporan en una matriz alimenticia o una
preparación farmacéutica. Para la producción y el procesamiento industrial a gran
escala se deberían caracterizar adecuadamente y adecuarse a cada tipo de
producto en el que se entregarán, incluida la alta viabilidad durante todo el período
Antecedentes: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
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de almacenamiento y la evidencia científica para declaraciones de propiedades
saludables específicas (Martinez et al., 2015).
En los últimos años se han investigado varias estrategias para superar estos
obstáculos de procesamiento para establecer la máxima viabilidad de los
probióticos a lo largo de todo el ciclo de producción, incluyendo el almacenamiento
del producto, la distribución en el mercado y también durante el consumo, es decir,
bajo condiciones del jugo gástrico y las sales biliares intestinales. La
microencapsulación de probióticos en matrices de pulverización o liofilizadas y la
inclusión de probióticos en microcápsulas basadas en biopolímeros son la vías más
comunes para la producción de bacterias probióticas viables en sistemas
alimentarios reales (Burgain, Gaiani, Linder, & Scher, 2011; Dianawati, Mishra, &
Shah, 2013; Fritzen-Freire et al., 2012; Malmo, La Storia, & Mauriello, 2013;
Soukoulis, Behboudi-Jobbehdar, Yonekura, Parmenter, & Fisk, 2014; Yonekura,
Sun, Soukoulis, & Fisk, 2014).
El contenido de grasa, la concentración y el tipo de proteínas, los azúcares y el pH
del producto son algunos factores que podrían afectar el crecimiento y la
supervivencia de los probióticos en los alimentos. Por lo tanto, la formulación del
producto puede manipularse para ayudar a su eficacia. Los alimentos, en particular
los productos lácteos, se consideran un vehículo ideal para suministrar bacterias
probióticas al tracto gastrointestinal humano (Ross et al., 2005; Ross, Fitzgerald,
Collins, & Stanton, 2002). En la actualidad las bacterias probióticas se incorporan
principalmente en productos lácteos como queso, yogur, helado y otros postres
lácteos. Las limitaciones de los productos lácteos, como la presencia de alérgenos
y la necesidad de instalaciones de almacenamiento en frío, así como la creciente
demanda de nuevos alimentos y sabores, han iniciado una tendencia en el
desarrollo de productos probióticos no lácteos (Lavermicocca, 2006).
Antecedentes: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
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La supervivencia de las cepas probióticas durante el tránsito gástrico también está
influenciada por las propiedades fisicoquímicas del soporte alimentario utilizado. La
capacidad tamponadora y el pH del medio portador son factores significativos, ya
que las formulaciones alimentarias con pH entre 3,5 y 4,5 y alta capacidad
tamponadora aumentarían el pH del tracto gástrico y, por lo tanto, aumentarían la
estabilidad de la cepa probiótica (Kaila Kailasapathy & Chin, 2000; Zárate, Chaia,
González, & Oliver, 2000).
Sobre la base de lo anterior, el pH final óptimo y las concentraciones de ácido láctico
y ácido acético en el producto de cereal fermentado en relación con las propiedades
de cada cepa probiótica específica tienen que ser investigadas con el fin de
maximizar la viabilidad durante el almacenamiento. Además de la estabilidad
intrínseca de cada cepa, se ha señalado que la inclusión de fuentes de energía de
metabolización lenta, como la arginina, la fructosa, el ácido cítrico y el ácido málico,
presentes en los productos de cereales, tienen efecto de aumentar la viabilidad del
probiótico al proporcionar energía (Lee & Salminen, 1995).
Además, se ha demostrado que los extractos de malta, trigo y cebada presentan un
efecto protector significativo sobre la viabilidad de las cepas de L. plantarum y L.
acidophilus de origen humano en condiciones ácidas que imitan el estómago, esta
afirmación se basa en experimentos con dietas experimentales, los efectos positivos
podrían atribuirse principalmente a la presencia de azúcares solubles en los
extractos de cereales y, en menor medida, al contenido de nitrógeno derivados de
amino libre, dependiendo de la cepa (Charalampopoulos et al., 2012). Sin embargo,
la mayoría de ellos pierden la viabilidad durante la fabricación y el almacenamiento
de alimentos funcionales (alimentos horneados, bebidas, conservas de frutas)
debido a la alta temperatura u otras condiciones de fabricación severas. Por lo tanto,
estos probióticos requieren encapsulación mediante procedimientos especiales
para conservar su viabilidad durante la fabricación, almacenamiento y exposición a
condiciones no favorables como ácido y bilis presentes en el sistema gastrointestinal
(Soukoulis et al., 2014; Zhang, Huang, Ananingsih, Zhou, & Chen, 2014).
Antecedentes: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
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1.10. Micro encapsulación de microorganismos
La microencapsulación es el proceso de encerrar las células recubriéndolas con una
sustancia apropiada de una manera que resulta en la liberación de células
apropiadas en el medio intestinal (Mortazavian et al., 2008). La microencapsulación
ayuda a segregar las células del entorno circundante. Los materiales utilizados para
encapsular células probióticas incluyen diferentes polisacáridos tales como
alginatos, gomas vegetales y microbianas, quitosan, almidón, K-carragenano,
acetato ftalato de celulosa, gelatina, proteínas de leche y grasas (Burgain et al.,
2011; Iannitti & Palmieri, 2010).
Para la microencapsulación de las células probióticas, los hidrogeles insolubles en
agua basados en proteínas se aplican como una alternativa prometedora que se ha
aplicado con éxito. (Annan, Borza, & Hansen, 2008; Heidebach, Först, & Kulozik,
2009). Muchas revisiones han demostrado el potencial de la microencapsulación
para mejorar la supervivencia de los probióticos durante el procesamiento y el
almacenamiento en productos alimenticios o en el tránsito gastrointestinal
(Mohammadi, Mortazavian, Khosrokhavar, & da Cruz, 2011; Heidebach, Leeb,
Först, & Kulozik, 2010; Sun & Griffiths, 2000).
Las células probióticas han sido microencapsuladas con éxito para preservarlas de
factores perjudiciales durante el procesamiento y almacenamiento, tales como pH
bajo y alta acidez (Shah & Ravla, 2004), (Steenson, Klaenhammer, & Swaisgood,
1987), oxígeno molecular en el caso de microorganismos anaeróbicos (Sunohara et
al., 2000), las sales biliares (Lee & Heo, 2000), bacteriófagos y agentes
antimicrobianos químicos (Sultana et al., 2000). Además, la microencapsulación
puede ayudar a mejorar y estabilizar las propiedades sensoriales (Gomes &
Malcata, 1999) y la inmovilización de las células para su distribución homogénea en
todo el producto (Krasaekoopt, Bhandari, & Deeth, 2003).
Antecedentes: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
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Diversos estudios han reportado el efecto de la microencapsulación sobre la
supervivencia de los probióticos durante el proceso de calentamiento,
Mansouripour (2013) (Mansouripour, Esfandiari, & Nateghi, 2013), observó que
cepas encapsuladas con alignato mostraron más supervivencia y menos pérdida en
comparación a cepas sin encapsular sometidas a 65ºC durante máximo 1 h, sin
embargo, cuando los cultivos o microencapuslados con alginatos se expusieron a
los mismos 65ºC durante 30 min de tratamiento, los valores de D65Cº aumentaron
dos veces (11-21 min) (Ding & Shah, 2007), resultados similares fueron reportados
por Mandal y colaboradores (2006). Era notable que las pérdidas de viabilidad de
cultivos libres y microencapsulados fueran muy similares después de 60 minutos de
incubación a 65ºC (Mandal, Puniya, & Singh, 2006).
Esto sugiere que las bacterias microencapsuladas fueron protegidas a través de la
reducción de la transferencia de calor a las células, una protección que era sólo
temporal. Un resultado de esta propiedad es que la microencapsulación podría
encontrar aplicaciones en procesos que usan periodos de calentamiento cortos. Se
desconoce cómo las células microencapsuladas raccionarían a 73 ° C durante 16 s
en condiciones actuales del proceso de pasteurización de la leche. Sin embargo,
los datos de Chen y colaboradores (2007) sugiere que la supervivencia podría ser
satisfactoria debido a que algunos cultivos microencapsulados con gellan-alginato
expuestos a 75 ° C durante 1 min presentaron pérdidas menores de 0,5 log CFU /
mL (M. J. Chen, Chen, & Kuo, 2007)
Por lo tanto, a menos que la encapsulación pueda prevenir la mortalidad celular,
sólo los probióticos que sintetizan un compuesto bioactivo termoestable durante la
fermentación pueden ser útiles en la fabricación de productos de panificacción
(Goger et al., 2008; Kedia, Wang, Patel, & Pandiella, 2007). Las cepas de
probióticos Bacillus podrían adaptarse mejor a aplicaciones de panificación.
Hay otros alimentos en los que la microencapsulación proporcionó una mayor
supervivencia durante el calentamiento en productos como lo son galletas (Reid,
Antecedentes: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
31
Champagne, Gardner, Fustier, & Vuillemard, 2007), salchichas secas y chocolate
(Muthukumarasamy & Holley, 2006).
El proceso de encapsulación produce una protección relativa y una viabilidad
mejorada durante el proceso de calor.
1.11. Matriz del alimento
La adición de carbohidratos, glicerol y manitol influye en los alimentos. Por regla
general, la reducción de la aw mejora la estabilidad de los probióticos durante el
almacenamiento. En cereales y polvos, el aw debe estar entre 0,1 y 0,2 (Ishibashi
et al., 1985), particularmente si el producto se va a almacenar a temperatura
ambiente. Esto típicamente representa de 2 a 8% de humedad en el polvo.
Hasta la década pasada la inclusión de probióticos en una matriz de alimentos secos
tendría ventajas, pero esto recibió poca atención, Ouwehand y colaboradores en el
2004 demostraron que el Bifidobacterium lactis Bb-12 está presente en las heces
después del consumo de una barra de cereal a base de avena que contiene 5 x 109
B. lactis Bb-12 (Ouwehand, Kurvinen, & Rissanen, 2004).
Las propiedades tecnológicas asociadas con la incorporación de cepas probióticas
en los productos alimenticios se presentan en la Fig. 2. Los materiales de embalaje
utilizados y las condiciones de almacenamiento en las que se almacenan los
productos son importantes para la calidad de los productos que contienen
probióticos.
Antecedentes: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
32
Figura 2 Aspectos cualitativos de alimentos probióticos (Tripathi & Giri, 2014)
La composición de los alimentos, los tipos de material de envasado y el ambiente
de almacenamiento (temperatura de almacenamiento, contenido de humedad de
los polvos, humedad relativa, contenido de oxígeno y exposición a la luz, entre otros)
influyen significativamente en la supervivencia de los probióticos (Mattila-Sandholm
et al., 2002).
Se han hecho varios intentos para mejorar la viabilidad de los probióticos en
diferentes productos alimenticios durante su producción hasta el momento del
consumo. Los factores presentados en la figura 3 han sido identificados con efecto
en la viabilidad de los probióticos incluyen los parámetros intrínsecos de los
alimentos (pH, acidez titulable, oxígeno molecular, actividad del agua, presencia de
sal, azúcar y otros). Productos químicos que pueden estar presentes como peróxido
de hidrógeno, bacteriocinas, aromatizantes artificiales y agentes colorantes);
parámetros de procesamiento (tratamiento térmico, temperatura de incubación,
velocidad de enfriamiento de los materiales de envasado del producto y métodos de
almacenamiento, y escala de producción); y parámetros microbiológicos (cepas de
probióticos y proporción de inoculación) (Tripathi & Giri, 2014).
Antecedentes: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
33
Ingredientes y aditivos alimentarios
Los ingredientes de los alimentos pueden ser protectores, neutrales o perjudiciales
para la estabilidad probiótica (Mattila-Sandholm et al., 2002), por lo que la
compatibilidad de los probióticos con diferentes ingredientes alimenticios
desempeña un papel importante en su supervivencia. Los aditivos generalmente
utilizados en la industria alimenticia incluyen diferentes tipos de azúcares,
edulcorantes, sales, compuestos aromáticos (diacetil, acetaldehído y acetoina),
aromatizantes o colorantes naturales o artificiales, nisina (un antibiótico del tipo
polipeptídico), natamicina, lisozima y nitrito.
Estos aditivos podrían afectar drásticamente el crecimiento y la viabilidad de las
bacterias probióticas utilizadas para los productos fermentados y no fermentados
(Vinderola, 2002). Los niveles más altos de ciertos ingredientes pueden inhibir el
crecimiento de probióticos durante el almacenamiento Boylston et al., 2004; Lee &
Salminen, 2009)
Viabilidad de
probióticos
en alimentos
Condiciones de fermentación: Medio de fermentación
pH y acidez Temperatura
Oxígeno disuelto
Operaciones de procesamiento
(secado, congelado y
descongelación)
Empaque y condiciones de
almacenamiento
Ingredientes de los alimentos
Microoencapsulación
Figura 3 Factores que afectan la viabilidad de los probióticos (Tripathi & 2014)
Antecedentes: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
34
Calentamiento
La sensibilidad de las bacterias probióticas (Lactobacillus y Bifidobaterias) al
calentamiento es tal que los fabricantes prefieren añadir los cultivos después del
tratamiento térmico. Esta práctica es una preocupación por razones de seguridad y
deterioro. Idealmente, los cultivos probióticos podrían añadirse a la leche y los jugos
antes de la pasteurización y sobrevivirían a la etapa de calentamiento. Por lo tanto,
la sensibilidad de las bacterias probióticas al calor es una característica que merece
atención especial (Champagne, 2009).
Hay afirmaciones de que algunas cepas de la familia Bacillus poseen propiedades
probióticas. Dado que el Bacillus produce endosporas resistentes al calor, parecen
apropiados en procesos que llevan una etapa de calentamiento por debajo de 100ºC
(Belvis et al., 2006). Desafortunadamente estos cultivos están lejos de estar tan bien
documentados como las bifidobacterias o los lactobacilos en cuanto a efectos sobre
la salud. Por lo tanto, su atractivo es actualmente limitado, incluso en esta situación
tecnológica.
Las células de Bacillus que han sido sometidas a un estrés térmico leve, por ejemplo
52oC durante 15 min, sintetizan los componentes de resistencia al estrés (De
Angelis et al., 2004; Prasad, McJarrow, & Gopal, 2003). Estas células son
posteriormente más resistentes a las condiciones de calentamiento letal (Saarela et
al., 2004).
Contenido de oxígeno y potencial redox
El contenido de oxígeno y el potencial redox están entre los factores importantes
que afectan la viabilidad de los probióticos, especialmente durante el período de
almacenamiento (Lee & Salminen, 2009). El oxígeno molecular es perjudicial para
la supervivencia y el crecimiento de los probióticos del género BIfidibacterium, ya
que la mayoría de las especies son estrictamente anaeróbicas y sacaroclasticas (De
Vuyst, 2000) (Holzapfel et al., 2001). El oxígeno afecta a los probióticos de tres
maneras: (i) es directamente tóxico para algunas células, (ii) ciertos cultivos
Antecedentes: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
35
producen peróxidos tóxicos en presencia de oxígeno y (iii) los radicales libres
producidos por la oxidación de componentes (por ejemplo, grasas) son tóxicos para
las células probióticas (Korbekandi, Mortazavian, & Iravani, 2011).
Contenido de humedad / actividad del agua
El contenido de humedad de los productos probióticos es otro factor que influye en
la estabilidad de la vida útil de las bacterias vivas por ejemplo. El almacenamiento
en presencia de oxígeno y humedad fue perjudicial para la supervivencia bacteriana
en un cultivo (Önneby et al., 2013). La cantidad de agua que queda después del
secado afecta no sólo a la viabilidad de las bacterias tal como se determina
inmediatamente después del proceso, sino también a la tasa de pérdida de
viabilidad durante el almacenamiento posterior
Temperatura de almacenamiento
La viabilidad de las bacterias probióticas durante el almacenamiento está
inversamente relacionada con la temperatura de almacenamiento (Gardiner et al.,
2000). Los productos alimenticios probióticos deben almacenarse preferiblemente
a una temperatura de 4-5°C (Mortazavian et al., 2007a).
PH y acidez titulable
La supervivencia de los probióticos durante el almacenamiento se ve
considerablemente afectada por el pH y la acidez titulable de los productos
(Mortazavian et al., 2010). Un valor de pH muy bajo aumenta la concentración de
ácidos orgánicos no disociados en productos fermentados, mejorando así el efecto
bactericida de estos ácidos. Las bebidas como los zumos de frutas con bajos
valores de pH poseen un desafío significativo para los probióticos (Tripathi &Giri,
2014)
Aspectos de embalaje
Diferentes aspectos del envasado, como el tipo y grosor de los materiales de
envasado, el gas (O2, CO2 y vapor de agua) y la permeabilidad a la luz a través del
Antecedentes: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
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material, y la técnica de envasado (sistemas de envasado modificados, activos/
inteligentes) podrían influir en la supervivencia de los probióticos (Korbekandi et al.,
2011). La temperatura y la humedad relativa de la atmósfera pueden afectar a la
permeabilidad al gas del material de envasado, afectando así la viabilidad (Cruz et
al., 2007).
1.12. Evaluación de la seguridad
En general, los microorganismos utilizados en la producción de fermentación
alimentaria tienen un largo historial de uso seguro y se conocen a menudo como
microorganismos GRAS (generalmente reconocidos como seguros). (Holzapfel et
al., 1998). Este es el caso de la mayoría de Lactobacilos y Bifidobacterias (Leroy &
De Vuyst, 2004; Moreno, Sarantinopoulos, Tsakalidou, & De Vuyst, 2006; Wessels
et al., 2004). En Europa, existe el concepto de presunción de seguridad calificada
(QPS) con una lista de microorganismos que pueden considerarse seguros para su
uso. Los microorganismos destinados al consumo humano están regulados en la
UE en el contexto de la nueva regulación de los alimentos (Reglamento (CE) Nº
258/97;http://ec.europa.eu/food/food/biotechnology/novelfood/index_en.Htm).
Para establecer pautas de seguridad para los microorganismos probióticos, un
grupo de trabajo FAO/OMS recomendó que las cepas probióticas se caracterizan
por una serie de pruebas que incluyen resistencia a antibióticos, actividades
metabólicas, producción de toxinas, actividades hemolíticas, infectividad en
modelos animales inmunocomprometidos, efectos secundarios en humanos y los
resultados adversos en los consumidores (Araya, Morelli, Reid, Sanders, & Stanton,
2002).
1.13. Bacillus
Las especies de Bacillus se han utilizado como probióticos durante al menos 50
años, uno de los primeros productos en los que fue utilizado es el producto italiano
conocido como Enterogermina, registrado en Italia en 1958 como suplemento
Antecedentes: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
37
medicinal. El interés científico en las especies de Bacillus como probióticos, sin
embargo, sólo ha ocurrido en las últimas decadas y tres revisiones principales han
cubierto el campo (Hong & Cutting, 2005; Mazza, 1994; M. Sanders, Morelli, &
Tompkins, 2003). De las especies que se han examinado más extensamente se
encuentran Bacillus subtilis, Bacillus clausii, Bacillus cereus, Bacillus coagulans y
Bacillus licheniformis. Las esporas que son termoestables tienen una serie de
ventajas sobre otros no formadores de esporas tales como Lactobacillus spp. A
saber, que el producto puede ser almacenado a temperatura ambiente en una forma
desecada sin ningún efecto deletéreo sobre la viabilidad. Una segunda ventaja es
que la espora es capaz de sobrevivir al pH bajo de la barrera (Barbosa, Serra, La
Ragione, Woodward, & Henriques, 2005; Spinosa et al., 2000) lo cual no es el caso
de todas las especies de Lactobacillus (Tuohy et al., 2007) Así que en principio una
dosis especificada de esporas puede almacenarse indefinidamente sin refrigeración
y de tal manera que las bacterias ingeridas llegarán intactas al intestino delgado.
Las cepas de Bacillus como probiótico están ganando interés cada vez mayor
porque su capacidad de formación de esporas tiene obvias ventajas en relación con
la estabilidad y la viabilidad del producto probiótico cuando este contiene esporas
en lugar de células vegetativas. El uso de esporas de Bacillus como probiótico
implica el consumo directo de altas concentraciones de células viables. Uno de los
productos comerciales producidos en Europa y comercializados en la Unión
Europea, es Bactisubtil, que contiene esporas de B. cereus, (Sanders et al., 2003).
1.13.1. Bacillus coagulans
Esta especie se etiqueta a menudo, incorrectamente, como Lactobacillus
sporogenes que es un nombre de especie no reconocido. El origen de esta especie
para su uso en probióticos proviene de la India, donde una serie de fabricantes
producen B. coagulans como ingrediente alimentario para la exportación y
reetiquetado en Europa y los EE.UU. B. coagulans, secreta una bacteriocina, la
coagulina, que tiene actividad contra un amplio espectro de microorganismos
entéricos (Hyronimus, Le Marrec, & Urdaci, 1998). Una cepa, etiquetada como
Antecedentes: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
38
Ganeden BC30, ha obtenido el estatus de GRAS por la FDA en los Estados Unidos.
La cepa comercializado por Ganeden, como Ganeden BC30it se está utilizando en
una serie de productos como Sustenex y también se está incorporando en los
alimentos donde las esporas pueden sobrevivir a los tratamientos térmicos suaves
utilizados para esterilizar los alimentos (Cutting, 2011).
Bacillus coagulans es un bacilo gram-positivo, microaerofílico, productor de
esporas. Fue originalmente aislado y descrito en 1932 por Horowitz y Wlassowa y
llamado Lactobacillus sporogenes (L. sporogenes) (Gilliland ,1998) En 1957, el
organismo fue reclasificado en el Manual de Bacteriología Determinativa de Bergey
basado en sus propiedades bioquímicas y la nomenclatura correcta actual es
Bacillus coagulans (B. coagulans) (Bergey, 1993).
B. coagulans MTCC 5856 ha mostrado resisitencia al calor, esta propiedad puede
atribuir a su fase inactiva, es decir, esporas. La espora o endospora es una fase
metabólicamente latente de varias especies de Bacillus y se forma en el proceso
denominado "esporulación", que suele inducirse en condiciones adversas para el
microorganismo como niveles reducidos de nutrientes en el medio ambiente (Drigot,
2002).
En un estudio realizado por Majeed y colaboradores en 2014 reporto que
B. coagulans MTCC 5856 es estable durante el procesamiento y las respectivas
condiciones de almacenamiento de alimentos horneados, bebidas, aceite vegetal,
jarabe concentrado de glucosa e incluso en café elaborado (Majeed et al., 2014).
B. coagulans MTCC 5856 tiene una historia de varios años de uso seguro y eficaz
como ingredientes dietéticos en diversas gamas de productos tales como cápsulas,
tabletas, yogur congelado y recientemente en pan. La preparación de esporas de
B. coagulans se añade actualmente a los alimentos previstos a niveles de 108 a 2 x
109 ufc / porcion (Majeed & Prakash, 1998; Majeed & Kamarei, 2012; Majeed et al.,
2014).
Antecedentes: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
39
Farmacocinética
Después de la administración oral, B. coagulans llega al estómago en forma de
esporas, donde se expone a la acción del estómago y a un pH ácido que hace que
el revestimiento de esporas absorba agua, se hinche y comience el proceso de
germinación. Al llegar al duodeno, las esporas germinan y se multiplican
rápidamente. Las estimaciones sugieren que la duración media del tiempo entre la
dosificación oral y la germinación es 4-6 horas, (Ghandi, 1988) con
aproximadamente el 85 por ciento del material de partida que llega al tracto
intestinal. Después de la germinación, B. coagulans es metabólicamente activo en
los intestinos, produciendo L (+) ácido láctico levógiro, la forma más fácilmente
metabolizada en la síntesis de glucógeno por el cuerpo (es decir, la forma isómera
que no se esperaría que contribuyera a la acidosis metabólica) B. coagulans se
considera un probiótico colonizante transitorio, indicando que sólo ocupa residencia
temporal en los intestinos humanos.) Las esporas de B. coagulans se excretan
lentamente a través de las heces durante aproximadamente siete días después de
suspender la administración (Jurenka, 2012).
1.13.1.1 Beneficios del B. coagulans
En personas con problemas gastrointestinales se encontró que B. coagulans MTCC
5856 disminuyó los síntomas clínicos como distención abdominal, vómitos, diarrea,
dolor abdominal y frecuencia de heces en un ensayo clínico aleatorizado
multicéntrico que en sus conclusiones sugiere a este microorganismo como de uso
seguro y efectivo en el manejo de la diarrea, en el síndrome del intestino irritable
(Majeed et al., 2014).
Recientes estudios han demostrado que los probióticos apoyan una función
digestiva e inmunológica saludable, ayudan a la absorción de proteínas y
disminuyen la inflamación. (Jäger et al., 2016)
Antecedentes: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
40
Bacillus coagulans produce enzimas digestivas (Wang & Gu, 2010) que son activas
bajo condiciones intestinales (proteasas alcalinas, etc.) y se ha demostrado que
estas proteasas digieren proteínas más eficientemente que las proteasas
endógenas humanas solas (Minevich et al., 2015). Bacillus coagulans GBI-30, 6086
mejora la salud de las células del revestimiento intestinal mejorando la absorción de
nutrientes, incluyendo minerales, péptidos y aminoácidos, disminuyendo la
inflamación y estimulando el desarrollo óptimo del área de absorción de las
vellosidades (Kimmel, Keller, Farmer, & Warrino, 2010). B. coagulans ha mostrado
efectos significativos como terapia complementaria para aliviar los síntomas de la
artritis reumatoide (Mandel, Eichas, & Holmes, 2010).
1.13.1.2. Mecanismos de acción para B. coagulans
A pesar de la naturaleza transitoria de este organismo en el tracto digestivo, se
piensa que produce un cambio en el ambiente intestinal en apoyo de una flora
gastrointestinal compleja. Se presume que es un resultado de la mejora de la
ecología gastrointestinal reponiendo la cantidad de los microorganismos
obligatorios deseables y antagonizando con los microorganismos patógenos.
(Gilliland,1999; Adami & Cavazzoni, 1999)
B. coagulans in vitro ha mostrado producir bacteriocinas (Majeed & Prakash, 1998)
y ácidos grasos de cadena corta que nutren la mucosa de la colonia. "Las
bacteriocinas son péptidos producidos por algunas cepas de bacterias que inhiben
el crecimiento de otras bacterias. La coagulina, una sustancia con actividad de
bacteriocina (Hyronimus et al., 1998) y la lactosporina, una proteína antimicrobiana
única con un resto lipídico (Riazi, Wirawan, Badmaev, & Chikindas, 2009).
Los bioensayos in vitro también han demostrado que los componentes de la pared
celular y el sobrenadante de ciertas cepas de B. coagulans influyen en la inflamación
del intestino a través de la modulación de las citoquinas, la inhibición de las especies
reactivas del oxígeno y mejorando la fagocitosis mejorad (Kodali & Sen, 2008).La
Antecedentes: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
41
investigación en humanos también ha mostrado que el consumo de B. coagulans
GBI- -6086 aumentó la respuesta del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) a
adenovirus en 250 por ciento sobre la línea de base después de 30 días de
tratamiento. También se observó un aumento de 1.709 por ciento en la respuesta
del TNFα a la gripe A, pero no se observó ningún efecto para otras cepas de
influenza (Baron, 2009). La actividad antifúngica de B. coagulans también se ha
demostrado in vitro contra las especies de Fusarium, posiblemente el mecanismo
es que B. coagulans posee una actividad significativa de la ß galactosidasa (lactasa)
in vitro y también puede tener actividad de ácido deshidrogenasa láctica,
potenciando así la digestibilidad de la lactosa en aquellos que son intolerantes (Kim
YM, 1985; Majeed & Prakash, 1998). B. coagulans asimila e incorpora colesterol en
su estructura celular, se une al colesterol en el intestino y puede inhibir la enzima
productora de colesterol 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima reductasa (HMG-CoA
reductasa) )(Mohan, Arora, & Khalilullah, 1990).
Seguridad de B. coagulans
La seguridad de las especies de Bacillus ha sido ampliamente revisada en otros
lugares (de Boer Sietske & Diderichsen, 1991; Ishibashi & Yamazaki, 2001; Logan,
2004).
En 2008 la cepa de B. coagulans GanedenBC30 fue la primera cepa de Bacillus que
recibió la aprobación GRAS por la Federal Drug Administration (FDA). En Europa,
dependiendo sea su uso han sido aprobados diferentes tipos de Bacillus, B. subtillis
ha sido aprobado para ser usado como un suplemento, y en Reino Unido el B. clausii
se encuentra en el producto medicinal denominado Enterogermina® y B. cerus
IP5832 (Bactisubtil®) registrado como medicina para uso específico de prevención
de diarrea en niños (Cutting. 2011).
Los resultados de evaluación de seguridad toxicológica de Ganeden BC30
reportados por Endres y colaboradores en 2009 indican que B. coagulans no
demuestra efectos mutagénicos, clastogénicos o genotóxicos. Además, los
Antecedentes: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
42
resultados de los estudios agudos y de toxicidad oral subcrónica de 90 días en ratas
resultaron en la conclusión de un NOAEL (Non Observed Adverse Effects Level)
mayor de 1000 mg/kg por día. Dado que la concentración de la masa celular
utilizada en el estudio de 90 días fue de 1.36 x 1011 UFC/g, esto corresponde a 95.2
x 1011 UFC para un humano de 70 kg y puesto que la dosis humana sugerida está
en el intervalo de 100 x 106 a 3 x 109 UFC, esto da un factor de seguridad que oscila
entre 3,173 y 95,200 veces (Endres et al., 2009).
Basado en procedimientos científicos y respaldados por el historial de uso,
GanedenBC30TM se considera seguro para el consumo humano en forma continua
(Endres et al., 2009).
B. coagulans está actualmente disponible en productos comerciales probióticos,
incluyendo Ganeden BC30 (B. coagulans GBI-30, 6086), una preparación probiótica
patentada que se considera segura para el consumo humano y se ha asociado al
alivio de los síntomas gastrointestinales de dolor el síndrome de intestino irritable
(Dolis, 2009, Hun, 2009).
De acuerdo a Julie & Jurenka, 2012 las dosis diarias de B. coagulans varían entre
100 millones y 5 mil millones de UFC/día. Actualmente, para B. coagulans GBI-30-
6086 suministrados en cápsulas, una recomendación de dosificación típica es de
100 mg 2-3 veces al día, con cada 100 mg que contiene aproximadamente 1.5
billones de unidades formadoras de colonias (Jurenka, 2012) .
1.14. Alimentos derivados de cereales con probióticos
El desarrollo de productos probióticos no lácteos es un desafío para la industria
alimentaria en su esfuerzo por utilizar los abundantes recursos naturales
produciendo productos funcionales de alta calidad. A este respecto, se han
desarrollado alimentos para bebés que contienen probióticos o formulaciones de
confitería añadiendo las cepas como aditivos (Saarela et al., 2000). En los últimos
Antecedentes: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
43
años, también se han investigado cereales sobre su posible uso en el desarrollo de
alimentos funcionales. Los cereales se cultivan más del 73% de la superficie total
cosechada en el mundo y contribuyen con más del 60% de la producción mundial
de alimentos que proporcionan fibra dietética, proteínas, energía, minerales y
vitaminas necesarias para la salud humana. Las posibles aplicaciones de cereales
o componentes de cereales en las formulaciones alimentarias funcionales podrían
ampliarse (Charalampopulos et al., 2002).
Según Jousse, (2008). El desarrollo de nuevos productos es un desafío constante
para la investigación científica y aplicada, y se ha observado que el diseño de
alimentos es esencialmente un problema de optimización para generar mejor la
formulación. Uno de los aspectos a considerar de suma importancia en la
composición de los alimentos es la sinergia entre los ingredientes y la forma como
algunos de ellos y/o los aditivos alimentarios pueden interactuar con los
microorganismos probióticos presentes.
Los cereales pueden considerarse fuentes importantes de ingredientes funcionales,
ya que contienen, especialmente en las capas externas de granos, sustancias
bioactivas principalmente polifenoles con actividades protectoras relacionadas con
la reducción de la incidencia de cardiopatía coronaria, diabetes y cáncer (Hemery
et al., 2007). De hecho, el beneficio potencial para la salud de los polifenoles está
asociado con la protección contra el estrés oxidativo el cual que puede dar lugar a
una inflamación crónica y a una posible resistencia a la insulina (Willcox et al., 2004).
Los múltiples efectos beneficiosos de los cereales pueden explotarse de diferentes
maneras, lo que conduce al diseño de nuevos alimentos derivados de cereales o
ingredientes de cereales que pueden dirigirse a poblaciones específicas. Los
cereales se pueden utilizar como sustratos fermentables para el crecimiento de
microorganismos probióticos. Los principales parámetros que deben considerarse
son la composición y procesamiento de los granos de cereales, la formulación del
sustrato, la capacidad de crecimiento y la productividad del cultivo iniciador, la
estabilidad de la cepa probiótica durante el almacenamiento, las propiedades
Antecedentes: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
44
organolépticas y el valor nutricional del producto final. (Charalampopoulos et al.,
2002).
Metodología: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
45
3. Metodología En la figura 4 se presenta en forma esquematizada las cuatro diferentes etapas de
la metodología empleada en la investigación
Figura 4 Esquema general del proyecto de investigación
FASE 1
Caracterización de la cepa de Bacillus coagulans
Pruebas de microbiología básica Morfología de las colonias
Morfología bacteriana Tinción de esporas Motilidad Características bioquímicas de
(B. coagulans) Condiciones de esporulación Condiciones de germinación Curva de crecimiento
Pruebas de funcionalidad como probiótico
Sobrevivencia a condiciones de acidez in vitro
Sobrevivencia en presencia de sales biliares in vitro
Actividad antimicrobiana sobre microorganismos
Pruebas de inocuidad Prueba de resistencia a antibióticos.
Identificación precisa del microorganismo
Identificación hasta el nivel de especie con pruebas moleculares (PCR en punto final)
FASE 2. Estrategia de incorporación del probiótico en el proceso industrial del producto
FASE 3. Sobrevivencia del probiótico durante el proceso de elaboración
FASE 4. Sobrevivencia del probiótico durante la vida de anaquel del producto
Análisis de los productos seleccionados para la incorporación del probióticos
Análisis del proceso de producción
Análisis de contenido de probióticos en: Masa del producto Masa fermentada Producto terminado
Sobrevivencia por 6 meses a 25°C Sobrevivencia en condiciones de vida de anaquel
acelerada o condiciones de abuso de temperatura
Metodología: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
46
3.1 Caracterización de la cepa de Bacillus coagulans.
Se tomó como base las Guías internacionales propuestas por la FAO y la
Organización Mundial de la Salud en el año 2002 (Araya et al., 2002).
Esta etapa del proyecto fue desarrollada en los laboratorios de Alimentos y de
Genética y Biología Molecular del Centro de Investigación de Nutrición y Salud
Pública de la Universidad Autónoma de Nuevo León, Monterrey, México.
Se analizaron tres cepas, dos de ellas fueron cepas comerciales de la marca
Ganeden ® (OH, EE.UU) y una adquirida de American Type Culture Collection
(ATCC) (VA, EE.UU), en la tabla 5 se describen las características de las cepas.
Tabla 5 Características de las cepas usadas en este trabajo.
Código Descripción Característica Fuente
BC-9M-E Ganeden ® BC30 9 x 109 UFC/g Encapsulada Ganeden ®
Ganeden ® BC-15M Ganeden ® BC30 1.5 x 1010 UFC/g No encapsulada
ATCC Cepa de referencia de Bacillus coagulans ATCC® 7050 TM
No encapsulada American Type Culture Collection (ATCC)
La metodología empleada para cada una de las pruebas se describe a
continuación:
3.1.1. Pruebas de microbiología básica. 3.1.1.1. Morfologia de las colonias
Las cepas fueron analizadas después de 48 horas de crecimiento a 37° C en cajas
petri con agar soya tripticaseina (AST) (Difco Laboratorios. Detroit, MI. EE.UU),
previa dilución seriada con tampon de fosfatos (SIGMA-ALDRICH, MO, EE.UU) (0.3
mM) pH 7.2 (NOM 110-SSA1. 1994). Se constató que las colonias presentaran las
características descritas en el Manual de Bergey (Logan, 2009).
3.1.1.2. Tinción de Gram y morfología de las bacterias.
Se realizó una tinción de Gram de las tres cepas de estudio y se observaron al
microscopio óptico (CARL ZEIISS, México) con objetivo de 100x con aceite de
Metodología: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
47
inmersión para comprobar las características de bacterias del género Bacillus.
(Logan, 2009).
3.1.1.3. Tinción de esporas.
Se realizó de acuerdo al método descrito por Scheaffer y Fultton (1993) el cual
consiste en una tinción con dos colorantes, el verde de malaquita y la safranina, las
endoesporas de Bacillus no perdieron el colorante de la primera tinción con el agua
de lavado, mientras que esto si sucede con las formas vegetativas, las cuales
quedaron teñidas con el segundo colorante (Schaeffer & Fulton, 1933).
3.1.1.4. Motilidad.
Las cepas de estudio fueron colocadas en caldo soya tritpicaseina (CST)
(Laboratorios Difco) y se mantuvieron 24 horas a 37° C para su crecimiento. Tubos
con 4 ml de medio MIO (Motilidad Índol Ornitina) (DIBICO, México) se inocularon
por picadura en el centro de la columna de agar con un asa estéril. Los tubos fueron
incubados a 37° C por 24 horas (Ederer & Clark, 1970).
3.1.1.5. Características bioquímicas.
Para conocer las características bioquímicas de las diferentes cepas de B.
coagulans se utilizó la técnica rápida denominada API® 50 CHTM (bioMeriux, Marcy-
l'Étoile, Francia). Se inocularon las cepas en CST y se incubaron a 37° C por 18
horas, los cultivos se ajustaron a una densidad óptica de 1 Abs (espectrofotómetro
Evolution 300, Thermo Electron corporation, MA, EE.UU) utilizando agua estéril
Posteriormente, 1 ml de este cultivo se agregó a un tubo con el medio CHB/E de
API (bioMeriux, Marcy-l'Étoile, Francia), se homogenizó y la suspensión bacteriana
se distribuyó en los 50 tubos de las galerías, las cuales se incubaron a 37° C por
48 horas (Logan y Berkeley 1984).
3.1.1.6. Esporulación y germinación.
La capacidad de formación de esporas se analizó como lo describe Palop y col.
(1997) se inocularon por estría las cepas de estudio en cajas petri con AST, las
Metodología: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
48
cajas fueron incubadas bajo condiciones de estrés (5 días a 52°C) para obtener la
esporulación total de las bacterias. Las esporas fueron recolectadas de la superficie
del cultivo por flotación usando como medio agua estéril. Estas suspensiones
fueron transferidas a frascos estériles y almacenados a 0°C.
La suspensión de esporas fue purificada mediante tratamiento térmico a 70°C
durante 30 minutos para la eliminación de las células vegetativas. La formación de
esporas fue corroborada mediante la observación de las mismas al microscopio
óptico.
El proceso de germinación o activación de las esporas del probiótico se realizó
siguiendo el método descrito por Hitchins (1968) ); consiste en colocar las muestras
de suspensión de esporas en condiciones óptimas de cultivo. Para esto se
realizaron diluciones decimales en agua estéril para después ser sembrados en
cajas petri con (AST) e incubadas a 35°C por 24horas (Hitchins, 1968.
3.1.1.7. Curva de crecimiento de Bacilus coagulans
Se analizaron las curvas de crecimiento de estas cepas de microorganismos. Con
este propósito, se prepararon 400 ml de caldo soya tripticaseína (ST) y se
esterilizaron en autoclave. El medio fue inoculado con B. coagulans hasta obtener
una absorbancia de 0.01 a 600 nm con cada cepa del probiótico en fase logarítmica.
El medio inoculado se incubó a 37° C con agitación ininterrumpida. Cada hora se
tomaron 600 µl para medir densidad óptica a 600 nm y cada 3 horas se tomó 1 ml
(espectrofotómetro Evolution 300, Thermo Electron corporation, MA, EE.UU) para
realizar conteo celular en agar soya tripticaseína. Se decidió el uso de los
parámetros densidad óptica y cuenta en placa debido a que el uso del primero tiene
la desventaja de cuantificar la masa celular por lo que no distingue entre
microorganismos vivos o muertos (Epstein & Grossowicz, 1969).
3.1.2 Pruebas de Funcionalidad. 3.1.2.1. Tolerancia a la acidez.
Se utilizó como referencia la metodología propuesta por por Chou y Weimer (1999)
con algunas modificaciones que a continuación se describen. Se inocularon las
cepas en (CST) estéril previamente ajustado el pH a 3.5 por 90 minutos. Los cultivos
Metodología: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
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fueron incubados a 37° C, por 24 horas, tomando una alícuota de cada cultivo, los
cuales se pasaron a soluciones de agua peptonada (DIFCO Laboratorios), se
realizaron diluciones y se tomó 1mL de las diluciones de 10-4 a 10-6 de las cepas
BC-9M-E y de las diluciones decimales10-5 a 10-7 de la cepa BC-15M y de la cepa
de referencia ATCC para cultivarlas en agar ST; se incubaron a 37° C por 24 h.
Cada experimento se realizó por triplicado (Chou & Weimer, 1999).
3.1.2.2. Tolerancia a sales biliares.
Se inocularon las cepas pasando una alícuota de 100 µl de cada cultivo a tubos con
agua peptonada al 1%, con 0.2% de sales biliares (oxgall DifcoTM) se incubaron por
180 minutos a 37° C. Se realizaron diluciones y tomó 1 mL de las diluciones 10-3 a
10-5 de las cepas de BC-9M-E y de las diluciones 10-4 a 10-6 de la cepa BC-15M y
de la cepa de referencia ATCC para cultivarlas en agar ST; se incubaron a 37° C
por 24 h. Cada experimento se realizó por triplicado (Lankaputhra & Shah, 1995).
3.1.2.3. Tolerancia a condiciones de acidez y sales biliares
También se realizó una prueba combinada (acidez y sales biliares) después de la
prueba de tolerancia a acidez a 37°C por 90 min, una muestra del cultivo del
probiótico fue neutralizada con NaOH estéril (1N) hasta alcanzar un pH de 6.8 y
transferida a una solución de agua peptonada con sales biliares (0.2%) para lograr
una mayor similitud con el proceso de digestión monogástrica utilizando las
condiciones antes descritas (Chou & Weimer, 1999).
3.1.2.4. Actividad antimicrobiana.
La actividad antimicrobiana se evaluó al medir los halos de inhibición que generaron
las diferentes cepas de B. coagulans en cajas de agar Luria (Difco Laboratorios.)
que contenían los microorganismos patógenos de prueba (Salmonella typhi,
Staphylococcus aureus, Salmonella enteritidis, Listeria monocytogenes, Bacillus
cereus y Escherichia coli) tomando como base la metodología descrita por Tagg et
al., (1976) y realizando algunas modificaciones que a continuación se describen.
Los microorganismos probióticos se cultivaron en caldo MRS (Difco Laboratorios)
a 37°C por 48hrs, posteriormente se ajustaron los cultivos a una densidad óptica
Metodología: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
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de 1.0 con un espectofotómetro (Beckman Coulter DU 640, CA, EE.UU) a una
longitud de onda de 600nm. La suspensión se centrifugó para obtener el
sobrenadante. Por otro lado, se cultivaron los microorganismos patógenos en caldo
soya tripticasa por 24 horas, los cultivos se ajustaron a una densidad óptica de 0.1
con el equipo y las condiciones ya descritas. Una muestra de 100 µl de cada uno
de los cultivos de microorganismos patógenos fue colocada en cajas Petri estériles
y mezclado con agar Luria (SIGMA-ALDRICH) una vez solidificado el agar se
realizaron perforaciones de 5 mm de diámetro. En cada orificio se colocaron de 50
a 200 µl del sobrenadante del probiótico, y se permitió que el sobrenadante se
difundiera en el agar. Las cajas fueron incubadas en posición invertida por 24 horas
a 37°C y revisadas posteriormente para determinar la inhibición del crecimiento de
los microorganismos patógenos. La cepa se consideró positiva cuando se observó
un halo de inhibición de al menos 2 mm medido a partir del borde del orificio.
3.1.3. Pruebas de inocuidad 3.1.3.1. Prueba de resistencia a los antibióticos.
Una vez aislado y purificado el microorganismo probiótico de los productos de
Ganeden® y de un cultivo de la cepa de referencia, se tomaron con una asa 5
colonias de cada una de las cepas de estudio y se inocularon de forma
independiente en 5 ml de caldo Mueller-Hillton (Difco Laboratorios) para ser
incubados a 35°C hasta que apareció una ligera turbidez. Posteriormente se
preparó el medio agar Muller-Hillton con un pH entre 7.2 y 7.4, y se colocaron en
cajas petri. Para inocular el agar se utilizó un hisopo estéril de algodón el cual se
humedeció con la suspensión microbiana, se estrió en tres direcciones sobre la
totalidad de la superficie de agar y se dejó secar. Una vez seco se tomaron los
multidiscos (Multidiscos combinados BIO-RAD 71080380, CA, EE.UU) se
colocaron en el medio presionándolos ligeramente para asegurar el contacto con la
superficie. Se incubaron las cajas petri a 35°C por 18 horas, y se midió el halo de
inhibición en mm.
Las cepas se clasificaran en Resistentes (R), Intermedias (I) o Sensibles (S), de
acuerdo a las especificaciones del fabricante: Amikacina (≥17mm), Ampicilina (≥17
mm), Cefalotina (≥18 mm), Ceftriaxona (≥21 mm), Cloranfenicol (≥18 mm),
Dicloxacilina (≥13 mm), Enoxacina (≥18 mm), Eritromicina (≥23 mm), Gentamicina
Metodología: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
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(≥15 mm), Netilmicina (≥15 mm), Penicilina (≥23 mm) y Trimetoprim-
Sulfametoxasol (≥16 mm) (BIO RAD, 2017).
3.1.4. Identificación molecular de Bacillus coagulans
Para confirmar la presencia de Bacillus coagulans en los productos Ganeden®, se
utilizó la técnica de PCR de punto final; se tomó como base la metodología descrita
por Hidaka et al., (2010). Para la amplificación se utilizaron los oligonucleótidos que
corresponden a un segmento del gen para el ARNr 16S. Para confirmar que los
oligonucleótidos corresponden al segmento señalado de B. coagulans se realizó
una búsqueda en las bases internacionales de datos de genes (Blast; Gen Bank).
La búsqueda en el GenBank arrojó que los oligonucleótidos amplifican un segmento
de 262 pares de base del gen que codifica para el RNA 16S de B. coagulans y de
otros 2 Bacillus de especie no reportada, pero que presumiblemente son cepas del
mismo microorganismo.
En la tabla 6 se describen los oligonucleótidos empleados para la identificación
molecular.
Tabla 6 Secuencias de oligonucleótidos utilizadas
Bacteria Oligo Secuencia Locación
Bacillus coagulans BACO186 F GCATGGAGGAAAAAGGAA
16S rRNA BACO447 R CCCGGCAACAGAGTTTTA
Fuente: Hidaka, Horie, Akao, & Tsuno, 2010
Para la amplificación se utilizaron los oligonucleótidos que corresponden a un
segmento del gen para el RNAr 16S, los cuales fueron corroborados en el programa
Gene Bank y Blast Gene Bank y Blast (www.ncbi.nih.gov/genbank y
www.ncbi.nih.gov/BLAST)(Blast; GenBank).
3.1.5. Microorganismos Cepa de referencia. Para la identificación molecular se utilizó la cepa de referencia de Bacillus
coagulans ATCC® 7050 TM; se activó tomando 0.1 gr de la cepa, se resuspendió en
caldo de cultivo ICC BD (Bioxon, México) y se incubó a 37°C por 48 hrs.
Metodología: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
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Cepas de prueba de Bacillus coagulans.
Fueron aisladas del producto comercial Ganeden ®, el probiótico se aisló mediante
su cultivo en agar MRS previa dilución en tampon de fosfatos 0.3 mM, pH 7.2 y se
incubó a 37°C por 48 hrs, se tomaron colonias aisladas y se resembraron por estría
en tres campos nuevamente en agar MRS para su posterior identificación.
Microorganismos probióticos.
Para comprobar la especificidad de los oligonucleótidos de B. coagulans, se utilizó
ADN de 5 cepas comerciales de probióticos (L. plantarum, Lactococcus lactis
subsp. lactis, Bifidobacterium animalis, Lactobacillus casei subsp. rhamnosus y
Bifidobacterium longum) almacenados a -20°C, estas cepas fueron proporcionadas
por la empresa Lacti lab de México (Nuevo León, México). Las cepas liofilizadas
fueron activadas y mantenidas a 4º C en agar Man-Rogosa-Sharp (MRS)
Microorganismos patógenos.
Para las pruebas de especificidad de los oligonucleótidos también se utilizaron
cepas de referencia de los siguientes microorganismos: Salmonella enteritidis var.
Typhimurium (ATCC 13311), S. enteritidis var. Enteritidis (ATCC 13076), Bacillus
cereus (ATCC 13061), Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Listeria
monocytgenes (ATCC 7644), Escherichia coli (ATCC 4350). Las cepas fueron
activadas en (CST) y se incubaron a 37°C por 48 hrs, posteriormente se
resembraron por estría en tres campos en agar MRS.
3.1.6. Extracción de ADN.
Para la extracción de ADN se utilizó el kit comercial DNAzol ® (OH, EE.UU). Se
tomó 1 ml de la cepa extraída de Ganeden ® y se centrifugó a 6000g durante 4
min., se decantó el sobrenadante y el precipitado se resuspendió en 400 μl de buffer
Tampon de Extracción 1X (TE Buffer) - pH 8, con agitación en el vortex hasta lograr
una suspensión homogénea, el ADN extraído se refrigeró a 4° C durante toda la
noche y finalmente se almacenó a -20°C.
Metodología: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
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3.1.6.1. Condiciones de amplificación
La mezcla de reacción se realizó en un volumen final de de 25 µl que contenía: 4
µl de ADN bacterial, 0.5 U Taq polimerasa (Bioline, UK), 2.5 µl Buffer 10X, 1 µl MgCl
50mM, 2.5 µl DNTP´s 10 pmol/µl, 0.3µl de cada primer y 13.9 µl de H2O (Hidaka,
Horie, Akao, & Tsuno, 2010).
La PCR se llevó a cabo en un termociclador marca AXYGEN modelo MAXYGEN-
GRADIENT (CORNING, MA, EE.UU) programado para 30 ciclos. En cada ciclo la
desnaturalización fue a 94°C por 20 seg, la alineación fue de 48°C por 20 seg y la
extensión fue a 72°C por 40 seg. La extensión final fue a 72°C por 5 min al finalizar
los 30 ciclos. En todas las corridas se utilizó agua ultra pura estéril en reemplazo
de ADN como control negativo (Sambrook & Russell, 2001; Sudha, Chauhan, Dixit,
Babu, & Jamil, 2010).
El producto amplificado se analizó en un gel de agarosa al 3.5% utilizando un buffer
de carga Tris-acetato-EDTA en una cámara de electroforesis MINI-SUB-GT (BIO-
RAD) y fuente de poder POWER PAC-300 (BIO-RAD), aplicando energía de 20
voltios/5 min y 80 voltios/45 min.
3.2. Incorporación del probiótico en el proceso industrial del producto 3.2.1. Análisis de los productos seleccionados
Los productos seleccionados para la incorporación del probiótico B. coagulans
fueron:
A. Galleta con avena y pasas.
Los ingredientes para la elaboración de este producto son los siguientes: Harina de
trigo, harina de avena de grano entero, azúcar, grasa vegetal (contiene TBHQ,
palmitato de ascorbilo, tocoferoles), hojuelas de avena de grano entero, pasas,
inulina, huevo, lecitina de soya, sal yodada, almidón, monoesterato de glicerol,
estearoil, lactilato de sodio.
Metodología: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
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B. Barra de cereal con relleno de fruta.
Los ingredientes para la elaboración de este producto son los siguientes: relleno de
futa, almidón modificado, dextrosa, glicerina, ácido cítrico, pectina, sal yodada,
aceite vegetal, harina de avena de grano entero, harina de trigo, hojuelas de avena
endulzadas, almidón modificado, grasa vegetal (contiene TBHQ, palmitato de
ascorbilo, tocoferoles), lactilato de sodio, solidos de leche, gluten de trigo, azúcar,
jarabe de maíz de alta fructosa, salvado, lecitina de soya, metabisulfito de sodio,
goma xantana.
La selección de estos productos comerciales se realizó considerando su
composición, la factibilidad para incorporar los probióticos, el proceso de
producción disponible para realizar el proyecto y las preferencias de consumo de
estos productos.
3.2.2. Análisis del proceso de producción
Se analizaron las operaciones unitarias en los procesos de producción de los
productos seleccionados para determinar la mejor manera de incorporación de los
probióticos. Se seleccionó la incorporación del probiótico en los ingredientes secos
a través de un proceso de mezclado. El mezclado de las barras de cereales se llevó
a cabo en el Lote 1 en una mezcladora tipo Artesa y en el Lote 2 y Lote 3 en
mezcladora de Listón. El proceso de mezclado de las galletas de averna se realizó
en una mezcladora de Listón. Los ingredientes secos adicionados con el probiótico
fueron analizados en tres tiempos diferentes (10, 20 y 30 minutos) de mezclado
para determinar cuál era el más adecuado para una mejor dispersión.
A continuación se presentas los esquemas generales de producción de productos
seleccionados. Figura 5 y 6.
Metodología: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
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Figura 5 Diagrama de flujo de elaboración de galleta de avena
Figura 6 Diagrama general de flujo del proceso de elaboración de barra con relleno de fruta
Formado con tecnología de corte de alambre
Horneado. Horno con 7 zonas de contol de temperatura con banda lisa
Enfriamiento natural
Empaque con paqueteras tipo flow pack
Mezclado de ingredientes líquidos
Amasado por batch amasadora horizontal
Ingredientes secos * Probióticos (B.coagulans)
Mezclado de ingredientes secos y probióticos
Metodología: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
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En la tabla 7 se muestran las cantidades de probiótico calculadas que se
incorporaron a los diferentes productos, así como las características del probiótico
liofilizado (Ganeden®).
Tabla 7 Descripción de los productos seleccionados para la adición de probióticos con la cantidad deseada y características de la materia prima.
Producto Contenido calculado de probiótico(UFC/g)
Tamaño de la porción(g)
Características del liofilizado Concentración
(UFC/g) Presentación
Barra de cereal con relleno de fruta.
5 X 108 50 1 x 109 Encapsulado
Galleta de avena con pasas.
1 X 109 60 1.5 x 1010 No encapsulado
En cada uno de los lotes en los diferentes tiempos de mezclado se determinó el
contenido de microorganismos probióticos (B. coagulans) mediante la técnica
propuesta por el proveedor (Ganeden®) la cual consiste en una cuenta en placa en
(AST) incubado a 37 ºC por 48 h. Posteriormente fueron obtenidas muestras en las
diferentes etapas del proceso de producción (masa, masa fermentada y producto
terminado).
También se evaluaron productos sin la adición de B. coagulans como control
negativo, para determinar la cantidad de microorganismos que contenía el producto
en su forma original ya que la metodología empleada (recomendada por el
proveedor), no es selectiva para B. coagulans y permite el crecimiento de una gran
variedad de microorganismos.
3.3. Sobrevivencia del probiótico durante el proceso de elaboración
El producto terminado fue analizado en su contenido de microorganismos
probióticos para determinar la supervivencia del mismo durante el proceso de
horneado en las barras y las galletas. En estos productos se hicieron muestreos en
tomando producto de la banda de horneado en diferentes tiempos y lugares para
determinar la homogeneidad de esta operación unitaria (tabla 8).
Metodología: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
57
Tabla 8 Descripción del muestreo. (Número de muestras en cada etapa de producción).
Producto Etapas de producción
Ingredientes secos
Masa Masa fermentada
Producto terminado
Barra de cereal con relleno de fruta.
5* 3*
3 3 3 tiempos1 y 3 lugares2
Galleta de avena con pasas.
3** 3 3 3 tiempos1 y 3 lugares2
* Mezclado en artesa, ** Mezclado en listón, 1 Inicio, medio y fin, 2 Sur, centro y norte 3.4. Sobrevivencia del probiótico durante la vida de anaquel del producto
Para el análisis de sobrevivencia durante la vida de anaquel a seis meses, los
productos fueron conservados a temperatura ambiente (20-25ºC) y cada 10 días se
tomó una muestra de cada uno de tres lotes independientes elaborados; se analizó
la presencia del probiótico mediante la técnica propuesta por el proveedor
(Ganeden®) que consiste en la determinación de cuenta en placa en (AST) a 37ºC
por 48 h.
Para el análisis de sobrevivencia en vida de anaquel acelerada o almacenada en
condiciones de abuso de temperatura los productos fueron conservados a
temperatura de 48ºC y humedad relativa de 85% (en una bodega de diseñada para
tal fin en la planta de producción) por 9 semanas, cada semana se tomó una
muestra de los 2 productos, se cuantificó la presencia del probiótico mediante la
determinación de cuenta en placa en (AST) a 37ºC por 48 h.
3.5. Análisis estadístico.
De cada uno de los productos se elaboraron tres lotes independientes. El análisis
estadístico se realizó mediante el programa computacional SPSS V.22 (IBM,
Illinois, EE.UU) y contiene estadística descriptiva como la media (M) y el error
estándar (Es) e inferencial (análisis de varianza con un 95% de confiabilidad) previa
comprobación de normalidad y homocedasticidad.
Resultados y discusión: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
58
4. Resultados y discusión
4.1. Caracterización de las cepas
Las pruebas de microbiología básica permitieron identificar las características
generales de las cepas y la pureza de las mismas.
4.1.1 Morfología
Se observaron colonias con apariencia brillante, blancas, no viscosas, de 1 a 2 mm
de diámetro, con un borde completo (Figura 7) Estos resultados son similares a los
encontrados por Sarles & Hammer (1932) quienes, al revisar la morfología de B.
coagulans, se encontraron colonias de redondas a ovaladas, blancas no viscosas
y de diferentes diámetros y observaron colonias más pequeñas bajo la superficie
del agar, pero con características similares (Sarles & Hammer, 1932).
4.1.2. Tinción de Gram.
En todas las cepas se observaron bacilos cortos Gram positivos, sin embargo,
dentro de los mismos frotis también se encontraron bacterias gram negativas, esta
peculiaridad ha sido reportada en la literatura señalando que Bacillus coagulans
tiende a presentarse como bacteria Gram negativa cuando se encuentra en la fase
estacionaria (Fujiwara, 2004).
Figura 7 Morfología de las colonias de B. coagulans
Resultados y discusión: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
59
4.1.2.1. Tinción de esporas.
Se observó que todas las cepas analizadas muestran una endospora esférica con
localización terminal y deformante de la célula por lo que se denomina como palillo
de tambor (figura 8).
Figura 8 Endosporas de las cepas de estudio en comparación con una cepa de Bacillus subtillis.
La formación de esporas de B. coagulans queda evidenciada al mostrar la forma
característica de palillo de tambor, resultado esperado al tomar como referencia el
estudio realizado por Sarles & Hammer (1932), donde encontraron formación de
esporas en posición subterminal (Sarles & Hammer, 1932).
4.1.3. Motilidad.
Las cepas Ganeden BC-9M-E, BC-15M y ATCC7050 mostraron motilidad positiva,
manifestada por una opacidad del medio de crecimiento que progresó lateralmente
respecto a la línea de inoculación. Bacillus coagulans ha sido reportado en la
literatura como una bacteria flagelada y en consecuencia con motilidad (Fujiwara,
2004) esta prueba muestra un resultado positivo al observarse turbidez del medio
de cultivo.
Endospora de Bacillus subtillis *
Endospora de cepa BC-9M-E **
Endospora de cepa BC-15M **
Endospora de cepa ATCC7050 **
* microbeonline.com ** Imágenes propias
Resultados y discusión: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
60
4.1.4. Características bioquímicas
En la tabla 9 se observa que las dos cepas del estudio (Ganeden®) muestran
resultados iguales mientras que la cepa de referencia ATCC presenta un patrón
diferente en 15 de las 50 pruebas (30%). Cabe señalar que los resultados iguales
en las diferentes cepas de B. coagulans de Ganeden® proporcionan confianza de
la pureza y estabilidad del microorganismo en el producto.
Algunas de las diferencias encontradas con respecto a la cepa de referencia fueron
para el metabolismo de azucares simples como L-arabinosa, D-ribosa y D-xilosa
dando positivo para las cepas de Ganeden® en contraste con la cepa de referencia.
También se encontraron diferencias en la utilización de algunas pentosas como
L-rhamnosa y disacáridos como D-celobiosa D-lactosa y gentiobiosa, también en
azucares alcoholes como el xilitol, D-manitol y D-arabitol. El grupo donde se
encontraron más diferencias es los glucósidos (azucares complejos) ya que la cepa
ATCC dio resultados negativos en metil-α D-glucosido, amigdalina, arbutina,
esculina y salicina.
Resultados y discusión: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
61
Tabla 9 Metabolismo de carbohidratos de las cepas de B. coagulans.
Test Componente activo Cepas de B. coagulans
BC-9-M-E BC-15M ATCC
GLY Glicerol + + + ERY Eritritol - - -
DARA D-Arabinosa - - - LARA L-Arabinosa + + - RIB D-Ribosa + + -
DXYL D-Xilosa + + - LXYL L-Xilosa - - - ADO D-Adonitol - - - MDX Β Metil-D-Xiloxido - - - GAL D-Galactosa + + + GLU D-Glucosa + + + FRU D-Fructosa + + + MNE D-Manosa + + + SBE L-Sorbosa - - - RHA L-Rhamnosa + + - DUL Dulcitol - - - INO Inositol - - - MAN D-Manitol + + - SOR D-Sorbitol - - - MDM α Metil- D-Manosido - - - MDG Α Metil-D-Glucocido + + - NAG N-Acetil-Glucosamina + + + AMY Amigdalina + + - ARB Arbutina + + - ESC Esculina + + - SAL Salicina + + - CEL D-Celobiosa + + - MAL D-Maltosa + + + LAC D-Lactosa + + - MEL D-Melibiosa + + + SAC D-Sacarosa + + + TRE D-Trehalosa + + + INU Inulina - - - MLZ D-Melezitosa - - - RAF D-Rafinosa + + + AMD Almidón + + +
GLYG Glucógeno - - - XLT Xilitol + + - GEN Gentiobiosa + + - TUR D-Turanosa + + + LYX D-Lixosa - - - TAG D-Tagatosa - - -
DFUC D-Fucosa - - - LFUC L-Fucosa - - - DARL D-Arabitol + + - LARL L-Arabitol - - - GNT Gluconato potásico + + + 2KG 2-Cetogluconato potásico - - - 5KG 5-Cetogluconato potásico - - -
+ Componente expresado como positivo, - Componente expresado como negativo.
Las diferencias entre los resultados de B. coagulans de las cepas de Ganeden® y
la cepa de referencia ATCC son normales dada la variabilidad entre cepas de la
misma especie como ha sido reportado por Nakamura en 1988 quien encontró
variaciones similares a las reportadas en el presente estudio al analizar 22 cepas
utilizando la misma técnica. En la figura 9 se presentan las imágenes de las galerías
de API de las cepas analizadas (Nakamura, Blumenstock, & Claus, 1988).
Resultados y discusión: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
62
B. coagulans 9M-E
Figura 9 Imágenes de los patrones de fermentación de carbohidratos de las cepas de B. coagulans en las galerías de API® 50 CHTM
4.1.5. Capacidad de germinación
La capacidad de esporulación le permite a Bacillus coagulans sobrevivir los
extremos de calor, la acidez del estómago y los ácidos biliares tiene una mayor
estabilidad y una mayor vida útil de anaquel, además de presentar una capacidad
de supervivencia durante varios días en el intestino cuando se consume por vía oral
y sin repetir la ingesta.
Esta capacidad de formación de esporas es relevante para su incorporación en
alimentos con tratamiento térmico ya que le permitirá una mayor capacidad de
sobrevivencia a los procesos a los que se someta el alimento, así como permanecer
viable por largos periodos de tiempo en almacenamiento. La formación de esporas
fue corroborada mediante la observación de las mismas al microscopio óptico.
Los resultados de la germinación de esporas de las diferentes cepas estudiadas se
muestran en la tabla 10.
B. coagulans BC-15M B. coagulans ATCC7050
Resultados y discusión: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
63
Tabla 10 Recuperación de células vegetativas de las diferentes cepas de Bacillus coagulans (UFC/ml de suspensión de esporas)
Cepa Código Células viables (UFC/mL) *
B. coagulans ATCC7050 ATCC 1.8 x 10 3 B. coagulans BC-15 Millones BC-15M 3.0 x 10 2 B. coagulans BC-9 Millones esporulada BC-9M-E 8.5 x 10 2
*Valores promedio de 3 repeticiones
Los resultados muestran que todas las cepas de B. coagulans poseen la capacidad
de formar esporas bajo condiciones de estrés, así como la capacidad de germinar
al colocarlas en las condiciones optimas de cultivo.
Los resultados de recuperación de las esporas de las cepas de B. coagulans de
Ganeden® son similares entre sí y con la cepa de referencia.
4.1.6. Curva de crecimiento de Bacilus coagulans
La curva del crecimiento bacteriano resulta de la representación gráfica de la
determinación periódica del número de células viables por mililitro que existen en
un líquido inoculado con células microbianas provenientes de un cultivo que ha
crecido previamente hasta la saturación (Madigan, Martinko, & Parker, 2003). Ya
que el efecto benéfico de B. coagulans como probiótico depende de su cantidad,
se analizaron las curvas de crecimiento de estos microorganismos. Se decidió el
uso de los parámetros densidad óptica y cuenta en placa debido a que el uso del
primero tiene la desventaja de cuantificar la masa celular por lo que no distingue
entre microorganismos vivos o muertos.
Dicha curva se divide en fases, a continuación se describen las más relevantes.
Fase de Rezago o fase Lag.
Este periodo consiste en la adaptación de las células microbianas a su nuevo
ambiente, se caracteriza por un crecimiento nulo o cero ya que en este lapso de
tiempo se forman las enzimas y los metabolitos intermedios hasta alcanzar las
concentraciones necesarias para reiniciar el crecimiento.
Resultados y discusión: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
64
Fase Exponencial o fase Log.
Como el nombre lo indica, en esta fase las células se encuentran en un estado de
crecimiento sostenido o exponencial constante. Se sintetiza nuevas células del
microorganismo a una tasa constante y la masa aumenta de manera exponencial.
Lo anterior continua hasta que uno o más nutrimentos se agoten, o hasta que se
acumule tal cantidad de metabolitos tóxicos que se inhiba el crecimiento.
Fase Estacionaria Máxima.
Ante el agotamiento de nutrimentos en el medio o la acumulación de metabolitos
tóxicos el crecimiento cesa por completo después de un periodo de decrecimiento
en la tasa de crecimiento, lo cual corresponde a la fase de retraso.
No obstante, por lo general en esta fase se puede observar recambio celular, lo
cual se debe a que, aunque existe una pérdida lenta de células por muerte, dicha
pérdida se compensa exactamente por la formación de nuevas células a través de
crecimiento y división. Así, la cifra de células viables se mantiene constante, aunque
en realidad en el conteo aumente poco a poco el número de células, si se cuentan
también las muertas.
En la figura 10 se muestran las curvas de crecimiento utilizando el parámetro de
densidad óptica expresado como la absorbancia a 600 nm con respecto al tiempo.
Todas las cepas analizadas muestran las tres fases descritas anteriormente.
Resultados y discusión: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
65
Figura 10 Curvas de crecimiento de las cepas de B. coagulans utilizando el parámetro de densidad óptica.
En la figura anteriores se observan graficas sigmoideas con una fase lag de 0 a 2
horas, seguida de una fase logarítmica que alcanza su máximo valor a las 23 horas
en la cepa de referencia (ATCC) y la cepa comercial que se encuentra encapsulada
(Cepa BC-9M-E) mientras que la cepa comercial no encapsulada (Cepa BC-15M)
el valor máximo se alcanza hasta las 28 horas a partir de la cual inicia la fase
estacionaria.
Es de señalar que la cepa comercial no encapsulada presentó valores inferiores de
densidad óptica afectando el tiempo de generación y la velocidad máxima de
crecimiento. Son muchos los factores que pueden afectar el tiempo de generación,
es probable que el proceso de encapsulación tenga algún efecto en la vitalidad de
los microorganismos, o que se requiera mayor tiempo para que se liberen los
microorganismos del encapsulado, quizá también el mayor contenido de UFC/g de
producto haya agotado los elementos nutritivos del sistema.
Los resultados presentados aquí de los tiempos coinciden con lo reportado por
Khurshed (2003) para una cepa de B. coagulans quien analizó diferentes cepas del
genero Bacillus (Khurshed, 2003).
Resultados y discusión: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
66
Las curvas de crecimiento utilizando el parámetro de células viables expresado
como logaritmo de UFC/ml se muestran en la figura 11.
Figura 11 Curvas de crecimiento de las cepas de B. coagulans utilizando el parámetro de Cuenta de células viables por mL en agar MRS
La curva de crecimiento de las cepa de referencia tuvieron una fase lag de 3 horas,
seguidas de una fase logaritmica que concluyó a las 23 horas donde se alcanzó
una concentración arriba de 9 Log de UFC/ml.
En cambio, las cepas comerciales BC-9M-E y BC-15M mostraron curvas de
crecimiento un tanto diferentes, la cepa BC-9M-E tiene una mayor pendiente en la
etapa inicial de la fase logarítmica y alcanza la concentración máxima de 9 Log
UFC/ml a las 21 horas. mientras que la cepa de BC-15M alcanza una concentración
máxima de 8 Log de UFC/ml. Los resultados de la cinética con recuentos
bacterianos son consistentes con los valores de la densidad óptica.
4.2. Pruebas de Funcionalidad.
Estas pruebas son necesarias cuando se trabaja con microorganismos probióticos
ya que permiten identificar la interacción de éstos con los componentes del
alimento, así como con otros microorganismos presentes en el producto como las
levaduras.
Resultados y discusión: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
67
4.2.1. Actividad antimicrobiana
Las cepas de B. coagulans no mostraron actividad antimicrobiana contra los
patógenos Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Salmonella enteritidis,
Bacillus cereus y E. coli; en cambio, si se encontró un efecto inhibitorio contra
Listeria monocytogenes, en la tabla 11 se muestra el efecto dosis dependiente del
sobrenadante del probiótico.
Tabla 11 Actividad antimicrobiana de B. coagulans contra patógenos
Resultado negativo, Valores en mm de inhibición.
Se puede observar que la cepa ATCC 7050 y BC-15M mostraron mayores halos de
inhibición con un diámetro de 5 milímetros con un volumen de sobrenadante de 200
µl, mientras que la cepa menos activa fue la Cepa de Ganeden® BC-9M con un
diámetro de 2 mm.
Este dato es de gran relevancia, dada la importancia de que este probiótico tiene la
capacidad de inhibir a un patógeno que sobrevive en refrigeración y puede ser una
mortalidad de más de un 30% y que además es difícil de eliminar por otros métodos
de conservación (Madigan et al., 2003). Resultados similares han sido encontrados
por otros autores donde se ha reportado que B. coagulans produce una proteasa
Cepa
Patógeno
B. coagulans Ganeden® BC30-9
billones UFC/g
B. coagulans Ganeden® BC30-15
billones UFC/g
Cepa de referencia ATCC 7050 de B. coagulans
50 µl 100 µl 200 µl 50 µl 100 µl 200 µl 50 µl 100 µl 200 µl
S. enteritidis - - - - - - - - - S. tiphy - - - - - - - - - S. aureus - - - - - - - - - Listeria monocytogenes - - 2 - - 5 - - 5
B. cerus - - - - - - - - - E. coli - - - - - - - - -
Resultados y discusión: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
68
sensitiva antibacterial (bacteriocina) llamada coagulina y que actúa contra
patógenos, entre ellos Listeria (Hyronimus et al., 1998).
4.2.2. Tolerancia a condiciones de acidez y sales biliares.
Estas pruebas permiten evaluar si el microorganismo es capaz de sobrevivir en el
tracto gastrointestinal utilizando condiciones in vitro, ya que es necesario que el
probiótico llegue hasta el colon para ejercer su efecto benéfico en la salud de los
individuos.
Los resultados se muestran en la tabla 12 donde se observa que las cepas de
Ganeden® se comportan diferente a la cepa de referencia ATCC, ya que las
primeras presentan un porcentaje de recuperación a la acidez entre un 82 y 90%,
en cambio la cepa ATCC presenta mayor sensibilidad (56%).
Con respecto a las pruebas de sensibilidad a sales biliares, las cepas de Ganeden®
muestran porcentajes de recuperación en un rango de 79 a 81%; mientras que la
cepa de referencia no muestra sensibilidad a las sales biliares. Las marcadas
diferencias entre las cepas de Ganeden® y la de referencia se explican como una
variación en el perfil metabólico ya evidenciado en las pruebas de caracterización
bioquímica descrito anteriormente.
Cabe señalar que la literatura muestra que todas las cepas de probióticos tienen
sensibilidad a estas condiciones en diferente grado, por lo que es recomendable
utilizar cepas con tolerancia a estas condiciones y en cantidades de 100 millones
de microorganismos por gramo o mililitro de alimento.
Resultados y discusión: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
69
.
Tabla 12 Sobrevivencia de B. coagulans a condiciones de acidez y sales biliares expresadas en Log UFC/mL y porcentaje de recuperación
Cepa C
uent
a in
icia
l
Acid
ez
% d
e re
cupe
raci
ón
Sale
s bi
liare
s
% d
e re
cupe
raci
ón
Com
bina
do
% d
e re
cupe
raci
ón
BC-9M-E 7.3+0.05 6.00+0.20 82.2a 5.92+0.07 81.1a 5.70+0.13 78.0a
BC-15M 7.15+0.21 6.43+0.02 90.0a 5.67+0.24 79.3a 6.27+0.37 87.3a
ATCC 7050 5.75+0.03 3.23+0.4 56.2b 7.87+0.12 136.9b 4.95+0.19 86.0a
Superíndices diferentes indican diferencia significativa en la columna
4.3. Pruebas de Inocuidad. 4.3.1. Prueba de resistencia a los antibióticos.
Las cepas de B. coagulans de Ganeden® y la cepa de referencia fueron analizadas
en su capacidad de resistencia a antibióticos y se clasificaron en Resistentes (R),
Intermedias (I) o Sensibles (S), a los diferentes antibióticos probados, de acuerdo
a las especificaciones del fabricante. Todas las cepas analizadas mostraron ser
sensibles a los antibióticos Amikacina, Ampicilina, Cefalotina, Ceftriaxona,
Cloranfenicol, Dicloxacilina, Enoxacina, Eritromicina, Gentamicina, Netilmicina,
Penicilina y Trimetoprim-Sulfametoxasol debido a que presentan un halo de
inhibición en crecimiento mayor o igual al establecido por el kit de multidiscos
combinados.
4.4. Identificación molecular de Bacillus coagulans
Para confirmar la presencia de B. coagulans en las cepas de Ganeden® se utilizó
la técnica de PCR de punto final.
4.4.1. Identificación molecular de una cepa de referencia de Bacillus coagulans.
En la Figura 12 se muestran los resultados obtenidos del ensayo de PCR para la
identificación molecular de la cepa de referencia ATCC® 7050 TM de B. coagulans,
se muestra el producto amplificado de 262 pb.
Resultados y discusión: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
70
Figura 12 Electroforesis en gel de agarosa al 3.5% visualizados con Br. Et. Carril 1: Hiperleader II, Carril 2: producto amplificado de 262pb de la cepa de referencia ATCC® 7050 TM de B. coagulans, Carril 3: Control negativo, Carril 4: Pro. ampli c. de B.coagulans
Se puede afirmar que la cepa de referencia ATCC 7050 corresponde como
B. coagulans al mostrar un producto amplificado de 262 pb que codifica para un
fragmento del RNA 16S de B. coagulans.
4.5. Especificidad respecto a otros probióticos.
En la Figura 13 se muestran los resultados obtenidos del ensayo de PCR utilizando
los oligonucleotidos específicos para amplificar el segmento del gen del ARNr 16S
de B. coagulans, con el objetivo de comprobar su especificidad aplicados a otra
especie de bacterias (L. plantarum, Lactococcus lactis sbsp. lactis,
Bifidobacterium adolescentis, Lactobacillus casei subsp. rhamnosus y longum).
Resultados y discusión: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
71
Figura 13 Electroforesis en gel de agarosa al 3% visualizado con Br. Et. C.1: Hyperleader II, C.2: Producto amplificado de B. coagulans ATCC® 7050 TM de 262pb como control positivo, C.3: Lactobacillus plantarum, C.4: Lactococcus lactis subsp. lactis, C.5: Bifi.adolescentis, C.6 Lact. Rhamnosus, C.7. Bifi. Longum, C.8. Control negativo
De acuerdo a los resultados obtenidos se puede concluir que los oligonucleotidos
utilizados para amplificar el segmento del gen del ARNr 16S de B. coagulans, son
específicos ya que no amplifican al probarlos con el DNA de otras especies de
probióticos.
4.6. Especificidad respecto a patógenos.
En la Figura 14 se muestran los resultados obtenidos del ensayo de PCR utilizando
los oligonucleotidos específicos para amplificar el segmento del gen del ARNr 16S
de B. coagulans, con el objetivo de comprobar su especificidad respecto a otros
patógenos.
Resultados y discusión: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
72
Figura 14 Electroforesis en gel de agarosa al 3% visualizado con Br. Et. C.1: Hyperleader II (BIOLINE) de 2000 pb, C.2: Producto amplificado de B. coagulans ATCC® 7050 TM de 262pb como control positivo, C.3: Salmonella enteritidis var. typhimurium (ATCC 13311), C.4 Bacillus cerus (ATCC13061), C.5 Staphylococus aureus (ATCC6538), C.6. Listeria monocytogenes (ATCC7644), C.7. Escherichia coli (ATCC4350) y C.8. Control negativo.
De acuerdo a los resultados obtenidos se puede concluir que los oligonucleotidos
utilizados para amplificar el segmento del gen del ARNr 16S de B. coagulans, son
específicos una vez que han sido aplicados a organismos patógenos.
4.7. Identificación molecular de cepas Ganeden. BC 9M-E y BC-15M
En la Figura 15 se muestran los resultados obtenidos del ensayo de PCR utilizando
los oligonucleotidos específicos para amplificar el segmento del gen del ARNr 16S
de B. coagulans. En el carril 1 se puede observar el marcador de talla molecular, y
en los carriles subsecuentes se presentan los productos amplificados que migran
entre los 250 y 275 pb ya que corresponden al producto amplificado de 262 pb.
Resultados y discusión: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
73
Figura 15 Electroforesis en gel de Agarosa al 3.5% visualizados con Br. Et. Carril 1: Hiperleader V, Carril 2: Producto amplificado de B. coagulans (BC-15M), Carril 3: Control negativo, Carril 4: Producto amplificado de B. coagulans (BC-9M-E).
Los productos amplificados corresponden al segmento génico del ARNr 16S del
B. coagulans, y con su visualización se logró identificar por método molecular al
microrganismo B. coagulans en las muestras analizadas de Ganeden®.
4.8. Sobrevivencia del probiótico durante el proceso de elaboración.
Los resultados se presentan por tipo de producto, analizando primeramente los
ingredientes secos, la masa, y la masa fermentada (solo en barras de cereal) y
finalmente producto terminado.
4.8.1. Barras de cereal con relleno de fruta. 4.8.1.1. Ingredientes secos.
El promedio de microorganismos en los diferentes tiempos de mezclado (10, 20 y
30 min) no fue significativamente diferente entre los lotes (L1 F= 2.462 P=0.094; L2
F=0.082 P=0.921 y L3 F=2.232 P=0.123). El mínimo valor encontrado expresado
en log de UFC/g fue 6.33 en el lote 3 a los 20 minutos y el máximo fue 7.21 en el
lote 2 a los 20 min, aunque los valores fueron más homogéneos a mayor tiempo de
mezclado. Cabe señalar, que para el lote 1 se utilizó una mezcladora tipo artesa
mientras que los demás se mezclaron en una tipo listón.Tabla 13.
Resultados y discusión: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
74
Tabla 13 Contenido de microorganismos totales (Log UFC/g) en ingredientes secos de barra de cereal con relleno de fruta.
Tiempo de mezclado
Lote 10 20 30 Control
1* 6.88 ± 0.43a 7.05 ± 0.40a 7.15 ± 0.32 2.50 ± 0.18a
2** 7.18 ± 0-36a 7.21 ± 0.33a 7.15 ± 0.31 2.72 ± 0.20a
3** 6.36 ± 0.52b 6.33 ± 0.68b 6.75 ± 0.40 2.14 ± 0.12a
Total *** 6.82 ± 0.53 6.90 ± 0.59 7.04 ± 0.38 2.71 ± 0.17
*N= 20, **N= 12, ***N=44 Superíndices diferentes indican diferencia significativa en la columna
No se encontraron diferencias significativas entre las medias del número de
microorganismos al agrupar en los tres tiempos para cada lote, al analizar cada
tiempo de mezclado si se observan diferencias significativas entre los lotes
analizadas marcadas en la tabla 13 con subíndices. Lo que indica que el mezclado
es un punto crítico para la distribución de los microorganismos incorporados.
Es importante destacar el bajo contenido de microorganismos que se encontraron
en el grupo control con valores entre 2.14 y 2.72 LogUFC/g sin presentar
diferencia significativa entre los lotes.
4.8.1.2. Masa y masa fermentada.
En las muestras obtenidas en estas etapas se encontraron valores superiores de
microorganismos, 6.36 log de UFC/g en la masa y 7.69 log de UFC/g en la masa
fermentada, con respeto a los ingredientes secos. No se encontró diferencia
significativa entre los tres lotes analizados Tabla 14.
Resultados y discusión: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
75
Tabla 14 Contenido de microorganismos totales (Log UFC/g) en masa, masa fermentada y producto terminado (barra de cereal con relleno de fruta).
Lote Masa Control Masa fermentada
Control Producto terminado
Control
1* 6.44 ± 0.37 3.01 ± 0.15a 7.49 ± 0.37 3.40 ± 0.19a 6.21 ± 0.58a 1.91 ± 0.12a
2* 6.15 ± 0.22 2.90 ± 0.16a 7.80 ± 0.40 3.24 ± 0.17a 5.53 ±0.43b 1.52 ± 0.14a
3* 6.50 ± 0.16 3.12 ± 0.12a 7.78 ± 0.83 3.31 ± 0.17a 6.06 ± 0.27a 0.99 ± 0.09a
Total** 6.36 ± 0.30 3.04 ± 0.14a 7.69 ± 0.57 3.32 ± 0.12a 5.93 ± 0.53 1.47 ± 0.11a
*N=36, **N=108 Superíndices diferentes indican diferencia significativa en la columna
El grupo control presento incremento de 0.3 y 0.6 ciclos logarítmicos en la masa y
la masa fermentada respectivamente con respecto a los ingredientes secos. Los
valores en los controles son muy bajos por lo que se podría considerar que tienen
poco impacto en las cuentas de los productos con incorporación de B. coagulans.
4.8.1.3. Producto terminado
El contenido de microorganismos en el producto terminado fue inferior
aproximadamente en un ciclo logarítmico del inicial contabilizado en los
ingredientes secos (6.92 a 5.93 log de UFC/g). Es normal esperar una disminución
del contenido de microorganismos como resultado del proceso térmico en el
producto. Resultados superiores de destrucción se observan en microorganismos
que no poseen la capacidad de esporular.
Al analizar el contenido promedio de microorganismos entre los lotes, se encontró
diferencia significativa (F=22.41 P=0.000). El lote 2 mostró valores inferiores (5.53
± 0.07) a los descritos en el lote 1 y 3 (6.21 ± 0.09 y 6.06 ± 0.04) respectivamente.
El producto terminado fue muestreado al concluir el horneado, se tomaron 3
muestras diferentes (inicio, medio y fin) de la banda de enfriamiento.
Cuando se analizó el contenido de microorganismos en el producto en diferentes
tiempos (inicio, medio y final de cada lote), no se encontró diferencia significativa
(F=1.28 P=0.280); esto indica un buen control de este proceso con respecto al
tiempo.
Resultados y discusión: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
76
Así mismo, se tomaron muestras a lo ancho de la banda para asegurar, que el calor
fuera homogéneo y el efecto sobre los microorganismos fuera similar. Las muestras
se denominaron norte, centro y sur. Al determinar el contenido de microorganismos
según el punto de muestreo en la banda de horneado (norte, centro y sur) no se
encontró diferencia significativa (F=1.42. P=0.244).
Los valores del contenido de microorganismos en el grupo control se redujeron con
el tratamiento térmico en una mayor proporción que en los lotes que contenían
probióticos. Se observaron reducciones de 1.57 y 1.85 ciclos logarítmicos con
respecto a la masa y a la masa fermentada respectivamente. La destrucción en
mayor escala nos sugiere que la mayoría de microorganismos que se encontraban
en el grupo control no poseen la capacidad de esporular.
Los resultados de los promedios en cada etapa del proceso se muestran en la
Figura 16
Figura 16 Contenido de microorganismos probióticos en las etapas del proceso de Barras de cereal con relleno de fruta.
Tipo de muestra
Prod. TerminadoFermentadoMasaPolvo
Lo
g d
e m
icro
org
an
ism
os
8.00
7.50
7.00
6.50
6.00
5.50
Resultados y discusión: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
77
En la figura 16 se observa con claridad que los microorganismos aumentaron su número
cuando se elaboró la masa, las condiciones de humedad son determinantes en este
incremento. También se observa la reducción que se produce por el tratamiento térmico.
4.8.2. Galleta de avena con pasas 4.8.2.1. Ingredientes secos
El promedio de microorganismos en los diferentes tiempos de mezclado (10, 20 y
30 min) fue diferente entre los lotes (L1 F=24.10 P=0.000; L2 F=7.56 P=0.002; L3
F=7.72 P=0.002).
El mínimo valor encontrado fue 6.37 log de UFC/g (L3, a 10 minutos) y el máximo
fue 7.00 log de UFC/g (L1, a 10 minutos) aunque los valores fueron más
homogéneos a mayor tiempo de mezclado en forma importante. Tabla 15.
Los resultados del grupo control al igual que en el producto anterior (barras de
cereal con relleno de fruta) son bajos.
Tabla 15 Contenido de microorganismos totales (Log UFC/g) en ingredientes secos de
Tiempo de mezclado
Lote 10 20 30 Control
1* 7.00 ± 0.30a 6.75 ± 0.17 6.38 ± 0.13a 2.22 ± 0.19
2* 6.38 ± 0.27 b 6.71 ± 0.25 6.64 ± 0.07b 2.05 ± 0,27
3* 6.37 ± 0.11b 6.63 ± 0.25 6.62 ± 0.13b 2.16 ± 0.15
Total ** 6.58 ± 0.38 6.70 ± 0.23 6.55 ± 0.16 2.14 ± 0.21
*N=12,**N=36 Superíndices diferentes indican diferencia significativa en la columna
4.8.2.2. Masa
En las muestras obtenidas en esta etapa se encontraron valores promedio de
microorganismos de (6.37± 0.30) ligeramente inferiores a los encontrados en los
Resultados y discusión: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
78
ingredientes secos (6.61± 0.26). Se encontró diferencia significativa entre los tres
lotes analizados existiendo diferencia en el lote 2 (F=5.87 P=0.007). Tabla 16
Tabla 16 Contenido de microorganismos totales (Log UFC/g) en masa y producto terminado en
galleta de avena.
Lote Masa Control Producto terminado
Control
1* 6.44 ± 0.37a 2.54 ± 0.25 6.09 ± 0.48a 1.43 ± 0.22a
2* 6.15 ± 0.23b 2.18 ± 0.19 6.79 ± 0.30b 1.17 ± 0.25a
3* 6.51 ± 0.17a 2.35 ± 0.42 6.96 ± 0.23b 1.38 ± 0.33a
Total** 6.37 ± 0.30 2.47 ± 0.55 6.61 ± 0.51 1.24 ± 0.21a
*N=12,**N=36 Superíndices diferentes indican diferencia significativa en la columna
4.8.2.3. Producto terminado
Se presenta una diferencia significativa (F=59.24 P=0.000) entre los lotes, los
valores más bajos corresponden al lote 1 mientras que los lotes 2 y 3 son similares.
El contenido de microorganismos en el producto terminado (M=6.62) se mantiene
a los valores encontrados en los ingredientes secos (6.61± 0.26). Los resultados
promedio y su desviación estándar se muestran en la figura 17.
Figura 17 Contenido de microorganismos probióticos en las etapas del proceso de Galletas de avena.
Tipo de muestra
Prod. TerminadoMasaPolvo
Lo
g d
e m
icro
org
an
ism
os
6.70
6.60
6.50
6.40
6.30
Resultados y discusión: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
79
Se observa que el contenido de microorganismos totales es ligeramente menor en
la masa que en los ingredientes secos, esta disminución pudiera ser causada por
un efecto de dilución con el agua adicionada en el proceso de elaboración de la
masa. Cabe hacer mención que la masa de las galletas de avena no lleva
fermentación, y pasa inmediatamente a la etapa de horneado.
4.9. Sobrevivencia de probióticos en productos almacenados por seis meses bajo
condiciones normales de almacenamiento.
En la figura 18 se muestra la sobrevivencia de los microorganismos totales en
barras de cereal con relleno de fruta en los 3 lotes, el promedio de los lotes y la
línea de tendencia para este último.
Se observó una reducción de 1.15 ciclos logarítmicos, ya que inicia con un
contenido de 5.9 (Log UFC/g) y a los tres meses sólo presenta un contenido de
4.75 Log UFC/g. Posteriormente, se observó un incremento paulatino de los
microorganismos totales hasta finalizar con un contenido de 5.1 Log UFC/g. Este
incremento puede ser debido a las características del producto (relleno de la barra,
humedad, etc.) hayan permitido el crecimiento de Bacillus coagulans.
Tiempo (Días)
Log
UFC
/g
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
7.00
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
10
0
11
0
12
0
13
0
14
0
15
0
16
0
17
0
lote 1
lote 2
lote 3
promedio de tres lotes
Figura 18 Sobrevivencia de Probióticos en Barras de cereal con relleno de fruta por seis meses.
Resultados y discusión: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
80
Las barras de cereal con relleno de fruta recién elaboradas contenían 39 millones
de B. coagulans viables en una porción de 2 barras (50 gramos) y a los seis meses
solo contenía 6.8 millones de probióticos.
Las galletas control presentaron valores de microorganismos inferiores a 100
UFC/g en los diferentes tiempos de almacenamiento.
La sobrevivencia de los probióticos en galletas de avena con pasas se muestra en
la figura 19; se incluyen los resultados de cada uno de los 3 lotes, el promedio de
los lotes y la línea de tendencia para éste último. No se observó reducción durante
los seis meses de la vida de anaquel ya que inicia y finaliza con un contenido de
6.4
Log UFC/g. Estos resultados equivalen a consumir más de 150 millones de
microorganismos viables en un paquete de 60 gramos de galleta de avena.
Figura 19 Sobrevivencia de Probióticos en Galletas de avena con pasas por seis meses.
La sobrevivencia a seis meses se presenta en la figura 20 en forma comparativa el
promedio de los diferentes lotes de los productos analizados. Se observó que la
galleta de avena con pasas mantiene el contenido de probióticos incorporados
superior al de las barras de cereal con fruta.
3
3.5
4
4.5
5
5.5
6
6.5
7
7.5
8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
10
0
11
0
12
0
13
0
14
0
15
0
16
0
17
0
lote 1
lote 2
lote 3
promedio de tres lotes
Lineal (promedio de treslotes)
Tiempo (Días)
Log
UFC
/g
Resultados y discusión: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
81
Figura 20 Comparativo de sobrevivencia de probióticos en los diferentes productos por 6 meses
4.10. Comparación de sobrevivencia de probióticos a seis meses y en condiciones de almacenamiento con abuso de temperatura.
Las pruebas de almacenamiento con abuso de temperatura son un método
ampliamente utilizado para la predicción de la estabilidad en la vida útil de los
productos y la calidad de los mismos. Generalmente los resultados de estas
pruebas son extrapolados a los resultados de almacenamiento en condiciones de
temperatura ambiente (20-25 ºC).
En la tabla 17 se muestran los promedios del contenido de microorganismos totales
que sobrevivió al finalizar vida de anaquel a 6 meses y de almacenamiento con
abuso de temperatura.
Tabla 17 Promedio de microorganismos que se encontró al finalizar las pruebas de sobrevivencia a seis meses de almacenamiento y en condiciones de abuso de temperatura.
Producto Prueba (log UFC/g)
Diferencia 6 meses Abuso de temp.
Barra de cereal con relleno de fruta
5.2 4.8 - 0.4
Galleta de avena con pasas 6.4 5.7 - 0.7
Barra de cereal
Resultados y discusión: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
82
Se muestra que en los productos Barras de cereal con relleno de fruta y Galleta de
avena, el contenido de microorganismos fue menor en almacenamiento con abuso
de temperatura que, en las condiciones normales de almacenamiento, por lo que la
prueba de almacenamiento con abuso de temperatura parece subestimar el
contenido de probióticos por lo que es necesario tomar en cuenta a la hora de ser
considerado como predictor.
La sobrevivencia de los microorganismos probióticos depende de diversos factores
tales como las características específicas del género y especie, la matriz en la que
se encuentre (alimento, excipiente, etc.) ya que cada producto tiene características
diferentes de pH, Aw, nutrimentos disponibles, así como las condiciones
ambientales de almacenamiento como temperatura, humedad, tipo de empaque,
presencia de luz, etc.
El Bacillus coagulans incorporado a los productos derivados de cereales presento
comportamientos diferentes, también se observó una diferencia en la sobrevivencia
en la vida de anaquel.
Conclusiones: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
83
5. Conclusiones
1. La cepa de Bacilus coagulans Ganeden® reúne las características
morfológicas, bioquímicas y de crecimiento propias de la espacie. No
presenta resistencia a antibióticos y posee capacidad de formar esporas
cuando se somete a tratamientos térmicos.
2. La identificación molecular comprueba que el B. coagulans Ganeden®
corresponde a la especie de interés solicitada.
3. Es factible incorporar el probiótico B. coagulans Ganeden® en las líneas de
producción de productos derivados de cereales.
4. La estrategia de incorporar el B. coagulans Ganeden® en los ingredientes
secos fue efectiva sin encontrar diferencia en los tiempos de mezclado.
5. El microorganismo adicionado presenta comportamientos diferentes en las
matrices evaluadas. En la barra de cereal con fruta se observa un incremento
en el contenido de microorganismos en la masa y la masa fermentada, para
posteriormente tener una reducción de un ciclo logarítmico en el tratamiento
térmico, efecto contrario se observa en la galleta de avena donde no se
incrementa el número de microorganismos en la masa y tampoco se
presenta una reducción en el producto terminado.
6. La sobrevivencia de los microrganismos en el estudio de vida de anaquel
(seis meses a temperatura ambiente) difiere en las matrices evaluadas, la
galleta de avena presentó mejores resultados (sin disminución en el
contenido de microorganismos). La barra de cereal con relleno de fruta
presento una disminución de 0.5 ciclos logarítmicos.
7. Los productos derivados de cereales pueden ser una opción para la
incorporación de microorganismos probióticos cuando se utilizan
microorganismos resistentes a los tratamientos térmicos.
Referencias: Incorporación de Bacillus coagulans a productos derivados de cereales ________________________________________________________________________________________
84
6. Referencias
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