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Les concentrés plaquettaires sont utilisés de façon routinière depuisde nombreuses années dans plusieurs spécialités chirurgicales oumédicales. Le principe est de récupérer les cytokines ou facteurs decroissance contenus dans les plaquettes sanguines ou Thrombocytesaprès la centrifugation du sang total. Plusieurs protocoles ont étéproposés selon le type de centrifugation et le type de tubes : PRP,PRGF et PRF.

La technique du PRF a mis plusieurs années à s’imposer et elle estaujourd’hui considérée comme la plus simple, la moins onéreuse etla plus efficace. Les résultats cliniques du PRF sont principalementliés à la libération prolongée des facteurs de croissance mais aussià la présence de la fibrine polymérisée obtenue à la fin de la centri-fugation.

Cependant, les récentes avancées en biologie cellulaire vont nouspermettre de proposer une amélioration des propriétés de cesconcentrés « sanguins » autologues en utilisant les propriétés decertaines cellules sanguines. L’impact ou le rôle des cellulesblanches présentes dans le sang, jusqu’à présent complètementnégligé, va peut-être devenir prépondérant grâce à la découvertedu rôle fondamental joué par ces cel-lules et en particulier les Monocytesdans la néo-angiogenèse et la crois-sance osseuse.

L’interdiction par l’ANSM de l’utilisa-tion des anciens tubes pour le PRF carnon conformes à règlementation desdispositifs médicaux nous a conduits àconcevoir un nouveau tube et à pro-poser en même temps nouveau proto-cole : A-PRF™ ou Advanced PRF™

A. LE PRF OU PLATELET RICH FIBRIN™A la fin du siècle dernier, les travaux de Marx [1] mettent enlumière la possibilité de récupérer des cytokines ou facteurs decroissance en concentrant le sang autologue par centrifugation.C’est la naissance du PRP ou Platelet Rich Plasma. L’accent est missur les facteurs libérés par les plaquettes sanguines ouThrombocytes. En 2001, la technique du PRF ou Platelet Rich Fibrinest décrite [2], avec comme différence, la possibilité de concentrerles plaquettes dans un caillot de fibrine, en supprimant les anticoa-gulants. La centrifugation sans anticoagulants permet de récupérerle caillot de fibrine qui renferme les plaquettes et donc ses facteursde croissance que sont entre autres, le PDGF, les TGF Beta et leVEGF. La fibrine jouant un double rôle : réservoir de cytokines etmatrice de cicatrisation cellulaire.

Ce réservoir constitué par la fibrine (fibrinogène coagulé) va per-mettre une libération prolongée de facteurs de croissance, décritedans plusieurs articles scientifiques [3]. Cette libération prolongéepermet d’obtenir un effet plus puissant dans la mesure où les cyto-

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Advanced Platelet Rich Fibrin™ ou A-PRF™ : Un nouveau « Gold Standard » dans les concentrés sanguins ?

Joseph CHOUKROUN1, Shahram GHANAATI2, Alain SIMONPIERI3, RedaBENKIRAN4, Stéphane ADDA5, Gianluigi CACCIANIGA6, Alexandre-Amir AALAM7,Samy TUNCHEL8, Alberto BLAY9, Mario MARCONE10

1. MD, Centre Anti Douleur, Nice

2. MD, Institute of Pathology, Repair-Lab, JohannesGutenberg University, Mainz, Allemagne

3. DDS, Exercice privé à Marseille

4. DDS, Exercice privé à Cannes

5. DDS, Exercice privé à Menton

6. DDS, Assistant Professor, Université Milan Bicocca, Milan, Italie

7. DDS, Assistant Professor, USC university, Los Angeles, USA

8. DDS, Exercice privé, Sao Paulo, Brésil

9. DDS, Exercice privé, Sao Paulo, Brésil

10. DDS, Exercice privé, Montréal, Canada

kines libérées lentement stimulent de manière plus importante lescellules avoisinantes. A l’image d’une perfusion continue. C’est unedes propriétés les plus intéressantes du PRF. Mais le PRF apporteaussi de la fibrine qui joue le rôle de matrice cellulaire, c.à.d. uncomposant qui se remplit de cellules et qui va donner naissance àun nouveau tissu. Car la fibrine ne se résorbe pas, elle se trans-forme, du moins en partie. Ainsi, de nombreuses indications ont puêtre décrites comme l’utilisation dans les greffes osseuses, les sinuslifts, les comblements d’alvéole ou la stimulation de la cicatrisationgingivale. [4] [5] [6] A ce jour, plus de 180 articles internatio-naux ont été publiés sur le PRF, dont 52 depuis le début de l’année2013.

B. LE RÔLE DES CELLULES BLANCHES ETDES MONOCYTES

Les leucocytes peuvent être divisés en deux grandes catégories : lesgranulocytes et les agranulocytes.

1. GRANULOCYTES: éosinophiles, neutrophiles et basophiles.

•Les éosinophiles sont conçus pour attaquer les parasites et ilsjouent également un rôle dans les réactions allergiques.

•Les neutrophiles, eux, attaquent les bactéries et les champignons

•Tandis que les basophiles jouent un rôle dans l’activité immuni-taire.

Chez une personne ayant un niveau normal de leucocytes, environ50 à 60 % sont des neutrophiles, composés de 1 à 4 % d’éosino-philes et moins de 2 % de basophiles.

2. AGRANULOCYTES : MONOCYTES ET LYMPHOCYTES

• Les lymphocytes représentent environ 20-40% du nombre total de

leucocytes. Les lymphocytes comprennent les lymphocytes B, les

lymphocytes T ainsi que des cellules tueuses naturelles, faisant tous

partie du système immunitaire.

•Les monocytes constituent 2 à 9 % de la numération des globules

blancs. Ils sont conçus pour offrir des antigènes aux lymphocytes

afin de stimuler les réponses immunitaires. Ces cellules finissent

alors par se transformer en macrophages. Ces cellules jouent un

rôle majeur dans les phénomènes inflammatoires qui sont les pre-

miers pas de la cicatrisation.

Dans les différentes tech-

niques de concentrés pla-

quettaires, il ressort que le

taux de cellules blanches est

différent. Dans les PRP, il

varie de 0 à 50% et dans le

PRF, il est relativement fixe :

au-dessus de 50%

Dès 2002, de nombreux

auteurs ont décrit la possi-

bilité de libération des fac-

teurs de croissance comme le VEGF ou le PDGF par les cellules

blanches. Weibrich [7] Dohan [8]

3. INCIDENCE DES MONOCYTES

Jusqu’en 2010, le rôle de chaque type de lignée de cellulesblanches dans les concentrés plaquettaires n’est pas précisé,puisque leur spécificité n’est pas encore tout à fait définie. A partirde 2011, le rôle des cellules blanches commence à être décrit.DAVIS [9] insiste sur les effets stimulants des métallo-protéinaseslibérées par les cellules blanches, avec comme corollaire unemeilleure et plus rapide néo angiogenèse.

Omar et Thomsen [10] vont démontrer que les monocytes sont lespremiers à envoyer des signaux positifs pour la stimulation des cel-lules progénétrices osseuses. Cet effet est capital, car il va immédia-tement déclencher une cascade de réactions qui vont aboutir à l’os-téogénèse.

Peu après, la découverte de récepteurs aux BMP dans les mono-cytes va aller dans ce sens [11] : les monocytes sont sensibles, viades récepteurs spécifiques, à ces protéines puissantes que sont lesBMP et qui sont capables non seulement de stimuler l’ostéogénèsemais aussi de nombreuses autres processus biologiques comme lacroissance d’organes etc. Vicky [12] va démontrer comment lesmonocytes vont induire la différenciation des cellules mésenchyma-teuses en ostéoblastes fonctionnels permettant la production rapided’os nouveau.

Il devient alors évident que la présence des monocytes devient unobjectif prioritaire, si l’on veut accroitre la stimulation osseuse parle PRF. En biologie, il n’est pas rare que lorsqu’une cellule possèdedes récepteurs à une molécule, elle peut aussi synthétiser la mêmemolécule ou une substance équivalente. Nous allons immédiate-ment nous diriger vers cette hypothèse pour tenter de récupérer desBMP synthétisées et libérées par les Monocytes. Pirraco [13], vien-dra confirmer il y a peu, cette théorie en démontrant la productionde BMP par les monocytes et les macrophages.

C. LES MONOCYTES ET LE PRFL’analyse histologique des caillots de PRF a permis de faire uneconstatation surprenante : les monocytes sont à la frontière ducaillot de fibrine et des globules rouges. En effet, on ne retrouveque peu de monocytes dans la fibrine. Cela est vraisemblablement

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dû à la vitesse de centrifugation qui pousse ces cellules blanches, lesplus grosses, vers l’extrémité du caillot.

Nous avons alors entrepris une série de tests, réduisant progressive-ment la vitesse de centrifugation pour arriver finalement à la meilleurevitesse qui est 1500 tours/mn Dans cette configuration, la totalité desmonocytes se retrouvent également répartis dans le caillot de fibrine,mais nous obtenons également une meilleure répartition des plaquettessanguines, qui à l’origine, étaient concentrées également dans l’extré-mité inférieure du caillot. (image 2 Monocytes dans le PRF et le A-PRF)

Mais nous avons également tenu compte du temps nécessaire pourobtenir l’activation de certains monocytes en macrophages. Il fallaitégalement allonger le temps de coagulation dans le tube, ce qui a étéobtenu grâce à l’utilisation d’un composite en verre spécial qui a per-mis de ralentir la formation du caillot. Ce nouveau protocole portera lenom de Advanced PRF™ ou A-PRF™

D. LES NOUVEAUX TUBES A-PRF 10 ETLA RÉGLEMENTATION EUROPÉENNE

L’ANSM nous notifie dès le mois de juin 2012, l’interdiction d’utiliserdes tubes qui sont des DM-DIV (dispositifs médicaux de diagnostic invitro, réservés à l’usage des laboratoires pour les analyses sanguines)et donc non homologués pour la récupération des concentrés plaquet-taires appliqué en thérapeutique humaine. Ceci nous oblige donc àproduire des DM (Dispositifs Médicaux), certifiés selon la directive CE93/42. La conception du nouveau protocole et du nouveau tube vont

donc aller de pair : utiliser des tubes règlementaires et inclure la tota-lité des monocytes dans le caillot de fibrine final.

Les nouveaux tubes ont été fabriquésselon notre cahier des charges et ontété certifiés comme dispositifs médi-caux (DM) selon la directive euro-péenne CE 93/42. La paroi est uncomposite spécial à base de verre. Ilssont conditionnés dans un emballagestérile individuel. La durée de validitédu tube est de 2 ans à compter de ladate de stérilisation. Ils portent le nomde A-PRF 10. (image 3)

E. LES RÉSULTATS

1. DOSAGE DES CYTOKINES

Les tests biologiques ont été réalisés aux USA (Clarion ResearchLab, Clarion university, Pennsylvanie) et en Allemagne (RepairLab, Johannes Gutenberg university, MAINZ). Ces résultats serontpubliés très prochainement. Il a été effectué également une com-paraison de la libération des cytokines entre le PRP, le PRF et le A-PRF, ainsi que l’analyse comparée de la néo vascularisation obte-nue avec le PRF et le A-PRF.

Les résultats vont confirmer notre hypothèse cellulaire : le A-PRFlibère toutes les cytokines déjà présentes dans le PRF mais le VEGFest libéré en plus grande quantité par le A-PRF (significatif) maisnous avons trouvé également des BMP 2, et 7. La surprise a été deretrouver des BMP dans l’exsudat : 50% des BMP immédiatementdisponibles sont dans l’exsudat récolté dans la PRF Box..

2. PROTOCOLE D’ANALYSE CLINIQUE : Les premières études cli-niques ont porté sur la cicatrisation des sites d’extraction. C’est lemoyen le plus simple pour mettre en évidence le type de cicatrisa-tion et de pouvoir la comparer avec celle du PRF, avant de passerà l’étude histologique de la gencive et de l’os obtenu.

Le A-PRF est évidemment utilisé comme seul biomatériau de com-blement afin d’évaluer simplement le potentiel du nouveau concen-tré sanguin.

Pour le PRF, la cicatrisation des tissus mous est accélérée mais lorsquele PRF est exposé, il est rapidement recouvert par une couche de cel-lules épithéliales et s’ensuit une épithélialisation progressive.

Avec le A-PRF, la cicatrisation est réellement différente : plusrapide, avec une croissance propre des lambeaux tout à fait origi-nale.

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CICATRISATION GINGIVALE ET OSSEUSE

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deux cas cliniques, la reconstruction est parfaite malgré l’absencede mur vestibulaire. Pour l’instant, nous ne pouvons pas avancerd’hypothèse précise à l’origine de ce phénomène : Sont-ce les BMPdans le caillot qui en sont responsables ou bien la couverture de lazone par la gencive ou les deux ? D’autres études, plus approfon-dies, seront nécessaires pour essayer d’expliquer ce phénomènesurprenant et intéressant.

F. LES NOUVELLES PISTES DE RECHERCHEEN INGÉNIERIE CELLULAIRE

Avoir approché de près les mécanismes cellulaires nous a permisd’approcher de près les « CCN proteins», protéines impliquéesdans les communications cellulaires intimes. On savait que les cel-lules communiquaient entre elles afin d’organiser au mieux les pro-cessus de réparation ou de cicatrisation. Ces communications sontgérées par le « CCN protein » Ces protéines sont au nombre de 6.Les fonctions de ces protéines est aussi d’organiser la matrice extra-cellulaire si précieuse pour la croissance vasculaire. Or il ressort,selon des travaux très récents, que les fonctions biologiques de cesCCN sont fortement dépendantes du microenvironnement et dumoment où elles s’y trouvent. [15]. Les proteines « CCN » sont pro-duites en partie par les plaquettes sanguines et participent aucontrôle de la prolifération cellulaire, l’adhésion et la migration descellules. Il devient évident que nous devons aller vers plus deconnaissances sur les relations entre les cytokines, les BMP et les «CCN », si nous voulons continuer à améliorer les propriétés desconcentrés sanguins dans tous les processus de cicatrisation tissu-laires et osseux.

CONCLUSION

La mise en application des principes biolo-giques physiologiques reste la voie la plusefficace pour améliorer les processus inflam-matoires et la cicatrisation. La présence demonocytes permet une cicatrisation plusrapide avec une reconstitution d’un tissu gin-gival d’excellente qualité et d’épaisseur sur-prenante. La fermeture rapide de la plaie etla présence de fibrine enrichie dans l’alvéolepermet d’obtenir une reconstitution rapidede l’alvéole osseuse, sans résorption. La pré-sence de BMP libérées de manière régulièreet lente peut expliquer cette ossificationrapide sans perte de volume.

Les monocytes jouent manifestement un rôlenon négligeable dans la revascularisation dutissu lésé ou greffé. Nous ne sommes qu’audébut de cette nouvelle voie de recherche.Pour cela d’autres études seront nécessairespour améliorer nos connaissances et validercette théorie.

Résultats : Nos résultats sont en total accord avec ceux deKamazoe, qui a amélioré sensiblement les résultats du PRP enrajoutant des leucocytes [14].

a. Cicatrisation gingivale : Dans tous les cas cliniques quenous avons réalisés, nous sommes immédiatement surpris par larapidité de la croissance gingivale précoce. Au lieu de voir le PRFse recouvrir progressivement par un nouvel épithélium, c’est tout lelambeau qui progresse, en entier, pour recouvrir la fibrine exposée.D’ailleurs, on voit bien les points de suture se détendre au fil desjours, prouvant la progression des deux berges gingivales.

Le bourgeonnement des bords gingivaux est très rapide, avec unvolume gingival remarquable. Il en est de même pour la gencivekératinisée.

Tous les cas cliniques réalisés selon le même protocole, ont cicatriséde la même manière et différemment du PRF classique. La présencede monocytes influe manifestement sur les premiers jours de la cica-trisation. Les membranes de A-PRF sont remplacées par de la gen-cive de manière plus précoce, notamment dans les allongementsvestibulaires. Images (15 et 16)

b. Cicatrisation osseuse : Dans les cas cliniques que nous pré-sentons, les parois osseuses ne sont pas toujours présentes. Le com-blement est réalisé uniquement avec du A-PRF. La croissanceosseuse dans ces alvéoles est très rapide et permet de maintenir levolume de la crête osseuse malgré l’absence de paroi vestibulaire.Il est classique de ne pas avoir de reconstruction complète de lacrête vestibulaire lorsqu’une paroi osseuse est défaillante. Dans ces

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