Presentacin de PowerPoint

ADN RECOMBINANTE (rADN)Universidad de Carabobo.Facultad de ciencias de la salud.Escuela de Medicina Dr. Witremundo Torrealba.Departa de Fisiologa y Bioqumica.Profesora: Fabiola Sarco-Lira.

Seminaristas: Rosa ReyesYannay Valera Alba VsquezLaura Velasco

ObjetivosExplicar en forma general cmo se obtiene un ADN recombinante:

Principales enzimas usadas en la obtencin del ADN recombinante: Sistema de restriccin/Modificacin.

Proceso general para el clonamiento de genes.

ADN recombinante Es una molcula que proviene de la unin artificial de dos fragmentos de ADN, provenientes de dos organismos distintos que normalmente no se encuentran juntos.Es el conjunto de tcnicas que permiten aislar un gen de un organismo, para su posterior manipulacin e insercin en otro diferente.

Tecnologa de ADN recombinante Clonacin Un clon es una copia idntica. Este termino originalmente se aplico al aislamiento y reproduccin de una clula para crear una poblacin de clulas idnticas.

La clonacin de ADN comporta la separacin de un gen especifico a de un fragmento de ADN de un cromosoma mucho mayor y su unin a una pequea molcula de ADN portador , para poder replicarse este ADN modificado miles o millones de veces.

Tipos de clonacin La clonacin molecular puede realizarse por dos procesos:

Etapas del procedimiento de clonacin:

Enzimas de Restriccin Tambin llamadas nucleasas de restriccin, endonucleasas restriccin o enzimas restrictivas. Enzima de restriccin Enzima de restriccin Son del tipo endodesoxirribonucleasas Las nucleasas tiene capacidad de escindir los enlaces fosfodister de la cadena polinucleotidica de los cidos nucleicos

FOSFODIESTERASASNomenclatura de las enzimas de Restriccin Se nombran con tres letras tomadas del gnero y la especie de la bacteria de donde se aislaron

Seguida por una letra ms, que identifica el serotipo

finalmente, por un nmero romano en caso de que en una variante hayan varias enzimas con distinta variabilidad

ECO RI

(Escherichia coli) cepa RY13

HAE III

(Haemophilus aegyptius)

Enzimas de Restriccin Su especificidad puede analizarse con respecto a tres criterios:

Escisin en posiciones internas o terminales en la estructura primariaLas exonucleasas hidrolizan enlaces fosfato en los que participa el nucletido terminal Las endonucleasas solo hidrolizan enlaces internos de la cadena. ( no afectan los nucletidos terminales)Enzimas de Restriccin Actuacin sobre uno de los dos tipos de enlace fosfoster Nucleasas TIPO A actan sobre los enlaces fosfato formados con el OH3

Dan lugar a extremos 3OH y 5P

Nucleasas TIPO B actan sobre los enlaces fosfato formados con OH5

Dan lugar a extremos 3P y 5`OHReconocimiento de nuclesidos, bien por la pentosa o bien por la base nitrogenada (Slo en algunas nucleasas)

Sistema de Metilacin - Restriccin

El conjunto formado por la endonucleasa de restriccin y la metilasa correspondiente se conoce como sistema de metilacinEl DNA de la bacteria es metilado de forma especifica. La metilacin de las bases impide la unin de la enzima de restriccin. Mecanismo de defensa: Por el contrario, un ADN no metilado, puede ser degradado por la enzima de restriccin; por la carencia de grupos metilos Tipos de enzimas de Restriccin

Accin de las enzimas de Restriccin tipo IISon las restrictasas ms simples. El sitio de restriccin es a la vez lugar de reconocimiento y de hidrlisis. Se hidrolizan de forma muy especifica enlaces fosfoster del DNA, uno en cada hebra, generndose dos fragmentos de restriccin Enzima de restriccinEnzima de restriccinExtremos cohesivos Extremos romosAlgunas enzimas cortan ambas hebras justo en el centro de simetra Otras enzimas cortan cada hebra en puntos distintosFragmentos con bases desapareadasFragmentos con bases no desapareadas Ligasas La unin de los extremos escindidos ocurre mediante enzimas ligasas (ADN ligasas), dando una molcula de ADN de doble hebra.

El enlace covalente que se forma se llama enlace fosfodiester, ocurre un consumo de energa .

La ligasa requiere un grupo 5 P para su actuacin

los fragmentos de ADN originados son tiles para iniciar la clonacin celular o acelular, para el anlisis de ADN.

Vector de clonacin Es una molcula de ADN de tamao pequeo, fcil de aislar y caracterizar con secuencia y mapa de restriccin conocidos.De fcil introduccin en la clula anfitriona y una vez all con capacidad de replicacin autnoma.

Segn funcin de la clonacin AMPLIFICACIN Y EXPRESIN, encontraremos: VECTORES DE CLONACIN:-Ampliar ADN de inters.

-vectores de insercin o vectores de clonacin.VECTORES DE EXPRESIN:-Facilitan la expresin.

-requieren inserto auxiliar.

Tipo de vectorTamao del inserto que admiteMtodo de propagacinPlsmidos normales0-10 KBReplicacin propia del fago.Bacterifagos, por insercin (fago )0-10 KBReplicacin propia del fago.

Bacterifagos, por sustitucin (fago )9-23 KBReplicacin a modo de plsmido.Csmidos30-44 KbBacterifago P170-100 KbPACs (cromosomas artificiales de P1)130-150 KbBACs (cromosomas artificiales de bacteria)Hasta 300 KbYACs (cromosomas artificiales de levadura)0,2-1 MBCLONACIN CELULAR DE ADN

En un enfoque experimental puede describirse la clonacin en siete etapas:

2 de preparacin de muestra4 sucesivas de clonacin propiamente dicha(Y segn sea el caso) 1 de expresin

Se parte de clulas nucleadasSe eliminan molculas acompaantes ARN (Hidrolisis alcalina)Protenas ( con proteasas)Enzimas (fenol / agua)Se precipita y se concentra el ADN (con etanol y sales) Uso de ENZIMAS DE RESTRICCIN FRAGMENTO que se va a clonarEs necesario un Inserto Auxiliar que contenga regulacin para expresin Primera Etapa:Preparacin del ADN

Luque- Biologa Molecular e Ingeniera Gentica, Editorial Harcourt, Edicin en Espaol, 2000, pag 209. Segunda Etapa:Preparacin del Vector

Tercera Etapa: preparacin del rADNunin del ADN al vector

Cuarta Etapa:Incorporacin del rADN

Quinta Etapa:Propagacin Celular

Sexta Etapa:Seleccin de Clulas que han incorporado el ADN de inters

Sptima Etapa:Expresin del ADN clonado (opcional)

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