1

Actividad antitermitica de los aceites esenciales extraídos de las hojas de Lippia alba, Minthostachys mollis, Cymbopogon citratus y Psidium caudatum contra Nasutitermes sp. Daniel V. Galindoa, Carlos A. Deviab, Jorge E. Roblesc

aFacultad de Estudios Ambientales y Rurales, Pontificia Universidad Javeriana, 110311, Bogotá Colombia, venagalo@gmail.com, 0057 1 8014682 bFacultad de Estudios Ambientales y Rurales, Pontificia Universidad Javeriana, 110311, Bogotá Colombia, cdevia@javeriana.edu.co cDepartamento de Química, Pontificia Universidad Javeriana, 110311, Bogotá Colombia, jrobles@javeriana.edu.co Abstract Por revisión de fuentes secundarias y aplicación de pautas de selección de especies para control biológico de termitas se escogieron cuatro especies vegetales provenientes de la Flora Colombiana: Lippia alba, Minthostachys mollis, Cymbopogon citratus y Psidium caudatum. De estas se extrajeron los aceites esenciales de las hojas para ser evaluados en su actividad antitermitica en condiciones ambientales controladas alimentando a termitas de la especie Nasutitermes sp. Los cuatro aceites fueron identificados dentro del experimento como factores que disminuyen la supervivencia de las termitas, aunque el mecanismo de acción no se conoce aun claramente. El porcentaje masa/masa de la concentración utilizada de cada aceite en el experimento es del 5% (50 miligramos (mg) de aceite esencial por cada gramo (g) de alimento a las termitas). Todos los aceites mostraron acción antitermítica siendo el obtenido de Cymbopogon citratus el de mas actividad, seguido de Psidium caudatum, Minthostachys mollis y Lippia alba respectivamente. l

Palabras clave Actividad antitermitica, Nasutitermes, Aceites esenciales, Psidium caudatum, Lippia alba, Minthostachys mollis.

1. Introducción Muchos insectos del orden Isóptera (termitas) alrededor del mundo son considerados plagas por las grandes pérdidas económicas que ocasionan al ser la madera su primordial fuente de alimento. Las termitas viven todas en colonias, con castas reproductoras (reyes, reinas y ninfas), soldados y “ayudantes” (trabajadores verdaderos y también estadios inmaduros que asisten a la colonia en alguna extensión) (Bignell et al., 2011). La morfología de las termitas y sus adaptaciones anatómicas son específicas de cada casta, con estructuras que evolucionan independientemente en las castas reproductoras (para permitir la dispersión, la unión de las parejas y la fecundidad), los trabajadores (forrajeo y alimentación, cuidado y alimentación de los inmaduros y construcción de los nidos) y soldados (solo defensa) (Bignell et al., 2011). Son xilófagos (consumidores de madera), constituyendo la celulosa su alimento principal (Borror et al,

2

1989; Camousseight, 1999 en Ramirez & Lanfranco, 2001). A causa de sus hábitos alimenticios y preferencias por material vegetal muerto y vivo relativamente incorrupto, cerca del 10% de las 2700 especies de termitas descritas aproximadamente han sido reportadas como plagas (Wood, 1996). La alimentación de las termitas depende de una simbiosis que existe entre ciertas castas de la colonia y poblaciones de microrganismos, donde tales poblaciones varían dentro de los géneros de Isóptera y las fuentes alimenticias a las que recurren. La microbiota simbiótica del intestino de las termitas juega importantes roles en la digestión de la lignocelulosa y el metabolismo del nitrógeno (Bignell et al., 2011). Las termitas que causan el mayor daño en la agricultura tropical pertenecen a tres de las cuatro subfamilias de las termitas superiores (Familia Termitidae): Termitinae, Nasutitermitinae, Macrotermitinae (Bignell et al., 2011). En Colombia insectos del genero Nasutitermes (subfamilia Nasutitermitinae) ocasionan daños a las maderas tanto de árboles como de construcciones y madera almacenada. Los estudios de las poblaciones de termitas en Colombia no han sido muy numerosos, y no hay un claro conocimiento de su distribución y ecología, mas sin embargo, varios reportes de Nasutitermes en distintas regiones han sido mostrados (Araujo, 1970; Beron, 1983; Galvis, 1978; Galvis et al., 1991; Galvis & Flórez, 1991; Parra & Soto, 1992). Se conoce por observación propia, que en el ecosistema de Bosque Seco tropical en el que se encuentra la ciudad de Honda en el departamento del Tolima (05°11´N 74°44´34”O), existen varias especies pertenecientes a las subfamilias Termitinae y Nasutitermitinae, consideradas plagas por los daños evidentes que ocasionan a la madera que usa la población humana que allí habita. Verma et al (2009) indican varios tipos de métodos de control de termitas: control químico, control físico, control biológico y tecnología de cebos. Estos tipos de métodos hacen parte del MIP (Manejo Integrado de Plagas). Para el control de estos insectos los métodos del Control Químico (pesticidas sintetizados en laboratorio de alta toxicidad) han sido y son los más empleados. Sin embargo, el persistente uso de termicidas químicos es en la actualidad una preocupación ambiental y ha resultado en la necesidad de buscar componentes derivados de plantas como una alternativa de control de termitas (Verma et al., 2009). Los extractos botánicos pueden ser utilizados como insecticidas o pesticidas. “Un insecticida es aquella sustancia o mezcla de sustancias que ejercen una acción biocida debido a la naturaleza de su estructura química” (Ware, 1994 en Rodríguez et al., 2002). “Los pesticidas Botánicos poseen muchas propiedades deseables, como actividad insecticida, repelencia para plagas, disuasivos de la alimentación, regulación del crecimiento de los insectos y toxicidad para las plagas agrícolas” (Prakash & Rao, 1986, 1987; Prakash et al., 1987, 1989, 1900 en Verma et al., 2009). La búsqueda y el uso de este tipo de sustancias botánicas tienen el interés de mitigar los impactos que los métodos del control químico han demostrado causar en el ambiente y en la salud humana por su alta toxicidad. Verma et al. (2009) muestra una recopilación de trabajos que han evaluado la capacidad de control de termitas de distintos aceites esenciales de diferentes especies de plantas. Dentro de estos aceites, los monoterpenos y sesquiterpenos han demostrado en estos trabajos ser componentes activos capaces de causar toxicidad, repelencia y

3

fagodisuasión a termitas de distintos géneros (Nakashima & Shimizu, 1972; Yatagai et al., 1991; Shimanouchi, 1992; Chang et al., 2001; Maistrello et al., 2001; Zhu et al., 2001; Sakasegawa et al., 2003). En la bibliografía consultada Santana et al. (2010) evaluaron la actividad antitermitica de extractos de maderas de Bowdichia virgilioides, Anadenanthera colubrina, y Hymenaea stigonocarpa constatando la presencia de compuestos que procuran a estas maderas una alta resistencia al ataque de las termitas. Ese trabajo utilizó a la termita Nasutitermes corniger para la evaluación de dichos extractos. El presente trabajo también trabaja con una especie del genero Nasutitermes y tiene como objetivo principal evaluar la influencia sobre la supervivencia de termitas de la especie Nasutitermes sp. causada por cuatro aceites esenciales en una sola concentración cada uno, obtenidos de material vegetal proveniente de plantas pertenecientes a la flora colombiana. La búsqueda y elección de las plantas que brindaron los aceites a evaluar se basó en características ecológicas que se explican en la metodología del trabajo. Estas características ecológicas se utilizaron bajo la razón de que recomendar especies promisorias para el control de determinadas plagas, no debe basarse solo en la capacidad de causar daños en los insectos a controlar, sino que debe añadirse la preocupación de utilizar plantas que no ocasionen otros impactos en el ambiente durante su uso.

2. Materiales y métodos 2.1 Selección de material vegetal Después de una revisión bibliográfica sobre los tipos de compuestos de metabolitos secundarios que se estaban evaluando como agentes causantes de toxicidad y repelencia en la alimentación de termitas, principalmente la revisión hecha por Verma et al. (2009), este trabajo se limitó a un solo grupo de dichos metabolitos. Fue entonces enfocado en evaluar aceites esenciales obtenidos de plantas pertenecientes a la flora colombiana principalmente aquellos que presentaban dentro de su composición monoterpenos y sesquiterpenos. La búsqueda y preselección de los aceites evaluados se basó principalmente en la revisión de los 12 tomos de la publicación “Especies Vegetales Promisorias de los países del Convenio Andrés Bello” (Bernal & Correa, 1990), la cual recopila usos, fitoquímica, y otras características de gran cantidad de plantas útiles de Colombia, como también en otros documentos científicos (Castañeda et al., 2007; Celis et al., 2007; Muñoz, 2007; Celis et al, 2008; Vargas & Bottia, 2008). Al haber obtenido de las fuentes mencionadas una lista con las plantas pertenecientes a la flora colombiana que presentaran los metabolitos secundarios escogidos, se procedió a evaluar cada planta según unas características en particular. Rodríguez (1993) al igual que Ahmed & Grainge (1986) indican las características que según ellos debe tener la planta insecticida ideal: a) ser perenne; b) estar ampliamente distribuida y en grandes cantidades en la naturaleza, o que se pueda cultivar; c) usar órganos

4

renovables de la planta (hojas, flores o frutos); d) no ser destruida cada vez que se necesite recolectar material (evitar el uso de raíces y cortezas; e) requerir poco espacio, manejo, agua y fertilización; f) tener usos complementarios (como medicinales); g) no tener alto valor económico; h) ser eficaz en bajas dosis. La determinación de las características para la elección final de las especies se basó en la teoría expuesta por Rodríguez et al. (1993) y Ahmed & Grainge (1986), modificándolas según los objetivos de este trabajo. Las características finales con las que se evaluaron las plantas encontradas en la bibliografía fueron: a) extracción de aceites de hojas, b) origen de la planta con prioridad a plantas nativas; c) habito de la planta con prioridad a hierbas y arbustos; d) rango altitudinal amplio; e) distribución geográfica amplia dentro de Colombia; f) prioridad a plantas que se cultiven, g) usos adicionales, e) características adicionales relevantes. En los resultados se muestran las plantas obtenidas después de la búsqueda y las razones del porque no se escogieron (ver Tabla 1.), al igual que se muestra de manera escrita las razones de la selección de las plantas usadas en esta investigación basadas en las características anteriores (numerales 3.1.1, 3.1.2, 3.1.3, 3.1.4). 2.2 Recolección de material vegetal y extracción de aceites Los cuatro aceites esenciales evaluados se extrajeron de material vegetal recogido perteneciente a 4 especies de plantas. Las especies son Lippia alba, Cymbopogon citratus, Mintostachys mollis y Psidium caudatum. Las primeras tres plantas fueron recolectadas en el municipio de Guavata- Santander (05°58´N 73°42´O) y fincas cercanas a este. El material de Psidium caudatum fue procurado por el Jardín Botánico José Celestino Mutis en Bogotá (4°40´4.37”N 74°5´59.2”O). Los aceites esenciales fueron extraídos mediante destilación por arrastre con vapor. 2.3 Cromatografía de capa fina Se identificaron diferentes compuestos de los cinco aceites esenciales extraidos de las plantas seleccionadas (Lippia alba hojas, Lippia alba flores, Minthostachys mollis hojas, Cymbopogon citratus hojas y Psidium caudatum hojas) utilizando la técnica de cromatografía de capa fina o delgada. La corrida de los componentes se comparó con los reportes en Wagner & Bladt (1984). Para todas las plantas se utilizó el siguiente sistema de cromatografía: a) Una placa de silica gel 60 como fase estacionaria, b) la fase móvil fue Tolueno: Acetato de etilo (93:7) y c) el revelado se realizó con vainillina al 5% p/v en ácido sulfúrico concentrado. En el caso de Minthostachys mollis se empleó un sistema de cromatografía adicional, el cual varia al anterior en lo referente a la fase móvil, pues fue utilizada una mezcla de Hexano/éter (20:3) para determinar los compuestos presentes en el aceite.

5

2.4 Experimento de actividad antitermitica La especie de termita utilizada para la evaluación de la toxicidad fue identificada hasta género utilizando la clave de soldados procurada por Vargas (2004). Termitas de la especie Nasutitermes sp. fueron recolectadas en el municipio de Honda- Tolima, lugar donde también se llevó acabo el ensayo de toxicidad. El método de “no-elección” (no- choice) descrito por Kang et al. (1990) fue utilizado con algunas modificaciones para evaluar la actividad termicida de los aceites esenciales escogidos. Muestras de 12.5 mg de cada aceite esencial fueron aplicadas a discos de 0.25 g de papel de filtro Whatman No. 3, utilizando 200 µl de acetona para procurar que el aceite cubriera la totalidad de la superficie del papel. Esta concentración corresponde a 50 mg de aceite esencial por cada gramo (g) de papel de filtro Cada disco de papel fue colocado en una caja plástica de Petri de 9 cm de diámetro, y se adicionaron 20 termitas obreras de Nasutitermes sp, conformando esto una parcela. Las parcelas se mantuvieron en escotofase continua, a una temperatura entre 24°C y 28°C, y una humedad relativa de 70±10%. Se construyeron 3 parcelas por aceite esencial y 3 parcelas para el control para una totalidad de 15 parcelas. El control consistía en discos de papel sin aplicación de ningún aceite esencial. Todos los días se agregaban 0.5 ml de agua a un algodón limpio, el cual era colocado en el interior de cada caja de Petri. Como modificación especial se añadió yeso en el fondo de las cajas de Petri, para evitar que las termitas se resbalaran y murieran por no poder pararse de nuevo y gastar bastante energía intentándolo. El papel y el agua constituían el único alimento de las termitas. Además, se hicieron perforaciones en las tapas de las cajas para permitir el intercambio de gases y diariamente se contaban las termitas muertas y se extraían los cadáveres. En la Figura 1. se muestra un diagrama que permitirá aclarar mejor la metodología usada en el experimento.

6

Figura 1. Diagrama explicativo del experimento de actividad antitermitica

2.5 Análisis estadístico Los datos recolectados del ensayo de actividad antitermitica (Numero de termitas sobrevivientes en n días) fueron sometidos a análisis de varianza (ANOVA de un factor) usando el programa SPSS para Windows (versión 19.0.0). La existencia de diferencias significativas (P <0.05) entre las parcelas se midió aplicando el contraste de Tukey para muestras de idéntico tamaño. Las comparaciones de las medias de supervivencia de las parcelas que se muestran en los resultados (Ver Tabla 4) para determinar las diferencias significativas entre los ensayos y el control, corresponden a los datos recogidos los días 3, 4, 5, 6 y 7 después del montaje de las parcelas.

3. Resultados y discusión

3.1 Especies seleccionadas y no seleccionadas 3.1.1 Lippia alba

7

Arbusto de hasta 2 metros de altura originaria de Brasil y distribuida naturalmente en Colombia. Su rango altitudinal es de 0-1800 msnm. Según ejemplares depositados en el Herbario Nacional Colombiano esta especie ha sido coleccionada en los departamentos de Cundinamarca Magdalena, Santander, Guajira, San Andrés y Providencia y Meta. Es una planta cultivable. Esta especie se ha empleado como estomacal y antiespasmódica en infusión teiforme; también se ha usado como sedante, desinfectante, diaforética y emenagoga (García, 1992). Se toma como bebida a partir de la infusión de las hojas con leche y azúcar (Programa Iberoamericano CYTED, 1995).

3.1.2 Minthostachys mollis Hierba o subarbusto de 0.30 a 2 metros de altura nativa de Suramérica. Su rango altitudinal es de 1000-3400 msnm. Según ejemplares depositados en el Herbario Nacional Colombiano esta especie ha sido coleccionada en los departamentos de Cundinamarca, Santander, Quindío, Risaralda, Nariño, Magdalena, Putumayo, Cauca, Boyacá y Tolima. Es una planta cultivable. “Las hojas en Argentina se usan en infusión, como digestivas, antiespasmódicas, antidiarreicas, contra el cólera y vómitos. Esta planta también se usa par aromatizar y fabricar licores. En Bolivia, la infusión de las hojas se emplea para problemas de digestión, gastritis, cólicos, flatulencias, es carminativa, se usa para regularizar la menstruación, y en caso de temblores nerviosos y palpitaciones del corazón. El cocimiento se usa contra dolores musculares y reumatismo. Además las hojas y las ramas se usan como condimento” (Gupta, 1992). “El uso mas conocido tiene que ver con la preservación de la papa en condiciones de almacenamiento; se ha señalado que los campesinos de la sierra peruana la han utilizado desde hace muchos años con este fin, igualmente ha tenido uso como condimento y preservativo de alimentos. En Colombia es utilizada en forma similar por los campesinos del altiplano cundiboyacense” (Rincon & Guisa, 2007).

3.1.3 Cymbopogon citratus Hierba de hasta 2 metros originaria de la India y Ceilán. Su rango altitudinal es de 0- 3000 msnm. Según ejemplares depositados en el Herbario Nacional Colombiano esta especie ha sido coleccionada en los departamentos de Cundinamarca, Meta, Amazonas, Tolima, Caldas, Cauca, Córdoba y Boyacá. Es una planta ampliamente cultivable. “El rizoma de esta especie en forma de infusión es usado como aromático y tónico; este mismo rizoma es empleado para limpiar los dientes; restregándolos en él varias veces, se dice que evita las caries dentales. Por destilación se adquiere un aceite volátil, utilizado como estimulante y diaforético. También la infusión de sus hojas se emplea para el paludismo” (García Barriga, 1974 en Correa & Bernal, 1990). La esencia de "limoncillo" es muy empleada en perfumería de jabones y también como repelente de insectos, especialmente los mosquitos (Gonzalez, 1984 en Correa & Bernal, 1990). De esta especie se obtiene un aceite esencial, cuyo sabor a "limón" se debe al citral contenido en un 80% y que se usa para perfumes, sales de baño, cosméticos, y jabones de tocador (Aldave & Mostacero, 1988 en Correa & Bernal, 1990).

8

3.1.4 Psidium caudatum Arbol de 10 a 20 metros de altura nativo del Norte de Suramérica. Su rango altitudinal es de 400 a 2600 msnm. Según ejemplares depositados en el Herbario Nacional Colombiano esta especie ha sido coleccionada en los departamentos de Cundinamarca, Meta, Santander, Norte de Santander, Cesar y Boyacá. Es un árbol que se acostumbra a cultivar en varias regiones del país por su belleza ornamental y los frutos aromáticos comestibles.

3.1.5 Especies no seleccionadas

La Tabla 1. muestra las especies encontradas en la publicación “Especies Vegetales Promisorias de los países del Convenio Andrés Bello” (Bernal & Correa, 1990 y en los otros documentos científicos consultados (Castañeda et al., 2007; Celis et al., 2007; Muñoz, 2007; Celis et al, 2008; Vargas & Bottia, 2008) de las cuales existen registros de la presencia de aceites esenciales principalmente con monoterpenos y sesquiterpenos. En la Tabla 1 también se enuncian las razones del porque no se dio prioridad a las demás plantas para escogerlas y ser sometidas al experimento de actividad antitermítica, aunque sin entrar en muchos detalles se señalan las plantas que merecen atención al momento de seguir con este tipo de investigaciones.

Planta preseleccionada Razones por las que no se escogió

Recomendada para ser investigada

Schinus Terebenthifolius

Poca información sobre su distribución y rango altitudinal, Árbol, planta invasora en varios países

Annona reticulata Prioridad a plantas que no se reconozcan aún como insecticidas X

Artemisia vulgaris Planta Introducida

Clibadium Surinamense Difícil recolección por ser planta silvestre X

Tagetes erecta Ya se ha evaluado su acción antitermitica

Tagetes filifolia Difícil recolección en la época en que se realizó el trabajo X

Tagetes lucida Difícil recolección en la época en que se realizó el trabajo X

Tagetes minuta Difícil recolección en la época en que se realizó el trabajo X

Tanacetum parthenium Planta Introducida

Bixa Orellana Componentes del aceite esencial muy específicos

Bursera Graveolens Aceite en la resina del árbol

Cyperus rotundus Hierba naturalizada, invasora y alelopática

9

Croton funckianus No se encontró información del aceite esencial X

Lepechinia bullata Difícil recolección por ser planta silvestre X

Mentha piperita Planta Naturalizada

Mentha pulegium Planta introducida, y porque puede ser reemplazada por Minthostachys mollis

Mentha spicata Planta Introducida, y porque puede ser reemplazada por Lippia alba

Minthostachys mollis Escogida

Salvia leucantha Poca Información en general X

Salvia officinalis Planta Naturalizada

Salvia palaefolia Se recolectó, pero se consiguió poco rendimiento del aceite esencial X

Salvia Sclarea Planta Introducida

Salvia Splendens Poca Información en general

Myrica pubescens No se encontraron reportes en el Herbario Nacional Colombiano X

Psidium caudatum Escogida

Cymbopogon citratus Escogida

Cymbopogon nardus Prioridad a Cymbopogon citratus X

Aloysia triphylla Menor cantidad de citral que Cymbopogon citratus X

Lippia alba Escogida Tabla 1. Plantas preseleccionadas, razones principales del porque no fueron escogidas para ser evaluadas en el experimento de acción antitermítica y plantas recomendadas a ser investigadas.

3.2 Rendimiento y composición de los aceites Los rendimientos de los aceites extraídos con destilación por arrastre de vapor se muestran en la siguiente tabla:

Tabla 2. Rendimiento de extracción del aceite esencial de las plantas seleccionadas en peso húmedo

Planta

Peso material

Vegetal Para

Extraccion (g)

Peso Aceite

Arrastrado

(g)

Rendimiento

(%)

Minthostachys

Mollis 296,8 2,6458 0,891442049

Lippia alba Hojas 328,8 0,3849 0,117062044

Cymbopogon

citratus 375,6 1,3488 0,359105431

Lippia alba Flores 58,85 0,1286 0,218521665

Psidium Caudatum 568,65 1,8331 0,322359975

10

Lippia alba estaba en etapa de floración cuando se hizo la recolección del material vegetal, aunque por medio de la cromatografía en capa delgada se comprobó la similaridad entre los aceites extraídos de las hojas y las flores de esta planta (ver Figura 2). Las demás especies no estaban en época de floración. La diferencia más importante entre los aceites extraídos de los dos órganos de la especie Lippia alba (hojas y flores), son los valores de los volúmenes de los aceites, donde se demuestra que la mayor cantidad de aceite de esta planta estaba presente en las hojas con volúmenes de 0,38 mL y 0,16 mL para hojas y flores respectivamente, aunque se reconoce que había mas aceite concentrado en la menor masa de los órganos de las flores.

Figura 2. Separación de compuestos de Lippia alba mediante Cromatografía de capa delgada después de calentamiento. La separación de la izquierda corresponde al aceite de las hojas y la de la derecha al

aceite de las flores

Se pudieron identificar los compuestos Carvona (Rf: 0,4565), Limoneno (Rf: 0,82), Citronelal (Rf: 0,65) y Cineol (Rf: 0,39) en el aceite de las hojas de Lippia alba. En el aceite de las flores se identificaron los mismos compuestos con pequeñas variaciones

11

en los valores Rf: Carvona (Rf: 0,4565), Limoneno (Rf: 0,84), Citronelal (Rf: 0,65) y Cineol (Rf: 0,39). Vargas & Bottia (2008) mediante cromatografía de gases identificaron los compuestos mayoritarios de plantas de Lippia alba recogidas en el municipio de Bolívar- Santander indicando la presencia de carvona (38% del total del aceite) y limoneno (28,7% del total del aceite). En la cromatografía del aceite esencial de las hojas de Minthostachys mollis se identificó el compuesto Piperitona con un Rf: 0,71 en el primer sistema de Tolueno/Acetato de etilo y un Rf: 0,46 en el segundo sistema de Hexano/éter (ver Figura 3). Para Cymbopogon citratus se pudieron identificar los compuestos Citral con un Rf de 0,48 y la presencia de alcoholes terpénicos cuyos valores Rf varían de 0,2 A 0,4 (ver Figura 3).

Figura 3. Separación de compuestos de Minthostachys mollis (izquierda) y Cymbopogon citratus

(derecha) mediante Cromatografía de capa delgada después de calentamiento. La separación del aceite de Psidium caudatum se muestra en la Figura 4. Los valores Rf de los compuestos identificados para Psidium caudatum fueron 0,84 para Anetol, 0,56 para Eugenol, 0,43 para Citral y 0,28 para Mentol.

12

Figura 4. Separación de compuestos de Psidium caudatum mediante Cromatografía de capa delgada

después de calentamiento. 3.3 Actividad Antitermitica de los aceites La supervivencia de las termitas que se registró para cada uno de los ensayos se muestra en la Figura 5. en términos de porcentaje de las medias, donde se puede apreciar que en el día 10 después del montaje la supervivencia en todos los ensayos fue de cero a excepción del control al que no se le agregó ningún aceite al papel de filtro.

13

Figura 5. Media de la supervivencia de los ensayos expresada en porcentaje (%) contra n días

El control en la experimentación mostró un comportamiento diferente al de los demás ensayos, al llegar a una supervivencia del 0% hasta el día 15 después de haber hecho el montaje de las cajas de Petri. Los ensayos donde la mortalidad total ocurrió mas rápidamente fueron aquellos a los que se les impregno a los papeles de filtro aceite esencial de Cymbopogon citratus y Psidium caudatum, llegando a una supervivencia de 0% a los 5 y 6 días respectivamente. Sin embargo la Tabla 3 muestra que dentro del ensayo perteneciente a Psidium caudatum la desviación estándar es muy grande, indicando gran variación de comportamiento entre las parcelas del ensayo. En esos mismos días (5 y 6) los ensayos que contenían los aceites de Minthostachys mollis y Lippia alba aunque muestran una supervivencia más alta, presentan una disminución de más del 80% de la población de las termitas.

Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7

Control 11±0,94 10,8±0,81 10±1,24 9±0,81 7,6±1,69

Lippiia alba 10±2,44 4,66±3,39 3,66±2,62 2,66±1,88 2±1,41

Minthostachys mollis 10,66±1,88 8,66±3,39 4±1,41 1,33±1,24 0,33±0,47

Cymbopogon citratus 8,66±1,88 0,33±0,47 0 0 0

Psidium caudatum 7,66±4,02 3,33±2,86 0,66±0,94 0 0 Tabla 3. Promedio de termitas que sobreviven (n=3) con desviaciones estándar en los días 3, 4, 5, 6, 7

después del montaje.

0

20

40

60

80

100

120

Dia0

Dia1

Dia2

Dia3

Dia4

Dia5

Dia6

Dia7

Dia8

Dia9

Dia10

Dia11

Dia12

Dia13

Dia14

Dia15

Sup

erv

ive

nci

a (%

)

Días después del montaje

Control

Lippia Alba

Mintostachysmollis

Cymbopogoncitratus

Psidiumcaudatum

14

Aunque el análisis estadístico muestra que desde el día 1 después del montaje la diferencia entre las medias de los distintos ensayos con el control es mayor que la diferencia de las medias al interior de cada ensayo (existen diferencias significativas), es desde el día 3 al 7 cuando estas diferencias se hacen mas pronunciadas. El análisis de Tukey durante esos días (3-7) calculó las diferencias significativas entre los ensayos tal y como lo muestra la Tabla 4.

Tabla 4. Diferencias significativas calculadas con el contraste de Tukey para muestras de idéntico tamaño (P <0.05). DHS= Diferencia honestamente significativa o diferencia mínima necesaria para poder rechazar la hipótesis nula. Los valores señalados con un asterisco (*) muestran las comparaciones que resultaron en diferencias significativas.

Las comparaciones de las medias tal como los muestra la Tabla 4. indican que las medias de los ensayos de las plantas Lippia alba, Cymbopogon citratus y Psidium caudatum poseen diferencias significativas con el control ya desde el día 3 después del montaje, mientras que Mintostachys mollis comienza a mostrar dichas diferencias desde el día 4 en adelante. El análisis de Tukey también permitió observar que las comparaciones de las medias entre los ensayos a los cuales se les impregnó los papeles de filtro con aceites esenciales desde el día 3 al día 7 no presentaron diferencias significativas. Esto último aclara el hecho de que los 4 aceites a la concentración estudiada afectan sin grandes diferencias estadísticas entre ellos la supervivencia de las termitas. Con los resultados del contraste de Tukey (ver Tabla 4) para muestras de idéntico tamaño, se comprueba que los aceites esenciales aplicados a los ensayos son la causa de la diferencia en la supervivencia de las termitas comparándolos con el ensayo de control.

15

En la Figura 5 se entiende que el experimento no mantiene una supervivencia muy elevada incluso en el control, que muestra una media de seis termitas en el día 9, es decir, el 70% de las termitas incluidas en las parcelas del control han muerto después de nueve días. No obstante, ninguna media en los ensayos con aceites en el día 7 tiene un valor mayor a dos (2) individuos. El orden en que los diferentes ensayos llegan a una mortalidad total desde el que lo logra en menor tiempo al que lo logra en mayor tiempo es: Cymbopogon citratus > Psidium caudatum > Minthostachys mollis > Lippia alba Hojas > Control. Esto puede traducirse en que los componentes que pertenecen al aceite extraído de Cymbopogon citratus aceleran en mayor medida la mortalidad de termitas obreras de la especie Nasutitermes sp. con respecto a los componentes de los otros tres aceites, aunque recordando que estadísticamente no hay diferencias significativas entre ellos. Hay que aclarar que la influencia de los aceites sobre la mortalidad de las termitas puede deberse a la sinergia entre los compuestos que los componen, y no necesariamente se le debe atribuir solo a los componentes mayoritarios. Sin embrago, Cheng et al. (2004) examinaron la actividad antitermitica del aceite esencial de la hojas de la especie Calocedrus formosana, al igual que la acción antitermitica de sus principales componentes por separado, encontrando que el T- muurolol y el β-cariofileno causaban la mayor mortalidad a termitas de la especie Coptotermes formosanus. De la misma manera Cheng et al. (2001) demostraron que los compuestos cedrol y α-cadinol pueden ser considerados los factores responsables de la alta resistencia de la madera de la especie Taiwania cryptomerioides a las termitas. Trabajos como estos que determinen la acción insecticida tanto de los aceites esenciales como de cada uno de los compuestos que contienen por separado estos aceites son necesarios, buscando mostrar claramente dichas comparaciones.

Ciertamente, puede considerarse que la acción de los diferentes componentes activos de los aceites son el factor dentro del montaje que incrementa la mortalidad de las termitas en el experimento, notándose en la variación de comportamiento que se muestra en la Figura 5. Sin embargo, el experimento de acción antitermitica no aclara hasta el momento el mecanismo con que intervienen los componentes activos de los aceites en esa mortalidad. De hecho, varias pueden ser las formas en que actúan estos aceites esenciales sobre las termitas. Es de esperarse que la alimentación con los papeles impregnados de aceite aceleren la mortalidad de las termitas, mas hay que caer en cuenta que otros factores pueden influir. Se percibió que los olores que los aceites esenciales emanaban se mantuvieron durante todo el experimento, y puede que sean el argumento de que la inhalación de dichos compuestos volátiles pudo afectar en algún porcentaje la mortalidad de las termitas. De esta manera la vía de intoxicación no es totalmente clara, y en realidad dentro de los objetivos del trabajo se necesitaba evaluar la acción de los aceites al ser ingeridos y actuar en el intestino de los insectos, por lo cual pensar algunas modificaciones adicionales al experimento seria prioritario si estas son posibles. Los trabajos que han evaluado a acción antitermitica de otros aceites esenciales, por lo general no mencionan esta posible influencia de la inhalación de los componentes volátiles de los aceites con los que están trabajando en la mortalidad de las termitas.

16

Es preciso reiterar que el número de repeticiones en cada ensayo se vio limitado por lo engorroso del proceso que resultó el traslado de las termitas de la colonia a las cajas de Petri, pues en realidad son insectos muy frágiles y pequeños, para traslados que buscan un mínimo de perjuicios en su salud. De hecho, puede que se hayan ocasionado dichos perjuicios a la salud que en un principio son imperceptibles y a medida que pasa el tiempo progresan, afectando así también la mortalidad de las termitas. También se observó luchas entre los individuos que terminaban en la muerte de un individuo y el debilitamiento del otro. Todas estas indeseables influencias sobre la supervivencia de los insectos pueden ser contrarrestados con el montaje de un número mayor de repeticiones de cada ensayo y con mayor numero de insectos dentro de las parcelas, mas en la practica ese proceso tiene que ser preparado con tiempo de sobra, puesto que los lugares y la especie de termitas imponen condiciones muy difíciles. Con todo esto se logra aclarar que el diseño experimental brinda resultados que determinan a los aceites como factores mayoritarios en las diferencias de supervivencia en los distintos ensayos, pero no logra aclarar otros puntos como las vías de intoxicación y otras causas de muerte que pueden suceder al interior de las parcelas.

4. Conclusiones El trabajo demostró que los 4 aceites esenciales evaluados poseen una buena actividad antitermitica a la concentración estudiada, y conociendo las buenas características ecológicas que presentan las plantas de donde provienen deben ser tenidos en cuenta para continuar su investigación como agentes promisorios para el control biológico de las termitas. Lo anterior a razón de que los cuatro aceites mostraron una influencia muy parecida sobre la supervivencia de las termitas de la especie Nasutitermes sp. (El análisis de Tukey no mostró diferencias significativas entre los ensayos con aceites esenciales) alimentadas con los papeles de filtro a una concentración de 50 mg/g. Es necesario establecer nuevos trabajos en los que se evalúe la actividad antitermitica de los aceites en concentraciones más bajas con el fin de determinar la Dosis media letal, como también la actividad antitermitica de los compuestos por separado que componen los aceites para dar comparaciones que aclaren más la relación de estos con las termitas. De igual manera, es conveniente replantear el experimento con el fin de evaluar más de cerca la acción termicida de los aceites al ser ingeridos estos por vía oral.

5. Agradecimientos Agradezco a todas las personas que con su ayuda permitieron facilitar el proceso, generando mejores condiciones para que el trabajo se pudiera llevar acabo. De estas personas mi madre Doris Patricia Londoño Pinilla fue pieza fundamental, lo mismo que el profesor y director de la tesis Carlos Devia, quien con buenos consejos y dedicación me ayudo a ver cosas que la experiencia no me había brindado, además de poner a disposición su casa en Honda para llevar a cabo una parte del experimento. A los diferentes miembros de la familia Devia les agradezco su hospitalidad y atención. El

17

profesor Jorge Robles fue incondicional y muy servicial en todo lo referente a la dimensión de laboratorio y química del trabajo. A los jurados de tesis Ángela Amarillo y Alberto Villa les agradezco sus buenas y precisas correcciones, además de los valiosos consejos que recibí por parte de ellos.

6. Bibliografía ABADÍA, J. C, ARCILA, A. 2009. Termitas en el cultivo de limón en los departamentos de Atlántico y Magdalena, Colombia. Boletín del museo de Entomología de la Universidad del Valle 10(2), 36-46. AHMED, S. & GRAINGE, M. 1986. Potential of the Neem tree (Azadirachta indica) for pest control and rural development . Economic Botany, 40(2), 201-209. ARAUJO, R. 1970. Termites of the Neotropical Region. Biology of the termites. London: Academic press. BERON, W. 1983. Daños y control de termitas. In: COLOMBIA, U. N. D. (ed.) Seminario Forestal. Medellín- Colombia. BIGNELL, D., ROSIN, Y. & LO, N. 2011. Biology of Termites- A modern Synthesis, New York, Springer. CARLINI, C. R. & GROSSI-DE-SA, M. F. 2002. Plant toxic proteins with insecticidal properties. A review on their potentialities as bioinsecticides. Toxicon, 40, 1515-1539. CASTAÑEDA, M., MUÑOZ, A., MARTÍNEZ, J. & STASHENKO, E. 2007. Estudio de la composición química y la actividad biológica de los aceites esenciales de diez plantas aromáticas colombianas. Scientia Et Technica, XIII, 165-166. CELIS, Á., MENDOZA, C., PACHÓN, M., CARDONA, J., DELGADO, W. & CUCA, L. 2008. Extractos vegetales utilizados como biocontroladores con énfasis en la familia Piperaceae. Una revisión. Agronomía Colombiana, 26, 97-106. CELIS, C., RIVERO, P., ISAZA, J., STASHENKO, E. & MARTÍNEZ, J. 2007. Estudio comparativo de la composicíon y actividad biológica de los aceites esenciales extraídos de Lippia alba, Lippia origanoides y Phyla dulcis. Scientia Et Technica, XIII, 103-105. CHANG, S.-T., CHENG, S.-S. & WANG, S.-Y. 2001. Antitermitic activity of essential oils and componentes from taiwania (Taiwania cryptomerioides). Journal of Chemical Ecology, 27, 714-724. CHENG, S.-S., CHANG, S.-T., WU, C.-L., CHANG, H.-T. & KAO, Y.-T. 2004. Antitermitic and antifungal activities of essential oil of Calocedrus formosana leaf and its composition Journal of Chemical Ecology, 30, 1957-1967.

18

CORREA, J. & BERNAL, H. 1990. Especies Vegetales Promisorias de los países del Convenio Andrés Bello, Bogotá. SECAB. CYTED. 1995. 270 plantas medicinales Iberoamericanas, Bogotá, CYTED. FANG, R. E. A. 2010. Insecticidal activity of essential oil of Carum carvi fruits from China and its main components against two grain Storage insects. Molecules, 15, 9391-9402. GALVIS, C. 1978. Actividad de los Termites en algunos suelos de la región de San Martín, Meta, Colombia. In: SOCOLEN (ed.) V Congreso de Entomología. Ibagué- Colombia. GALVIS, C., FLÓREZ, E. & RÍOS, O. 1991. Zoogeografía de termites (comejenes) en Colombia y sus repercusiones en la Economía nacional, Provincia Zoogeográfica Pacífico-Centro Americana. Cespedesia, XVIII, 157-159. GALVIS, C. & FLÓREZ. E. 1991. Zoogeografía de termites (comejenes-Isópteros) en Colombia y sus repercusiones en la Economía nacional, Provincia Zoogeográfica de San Andrés y Providencia. Cespedesia, XVIII, 161-163 GARCÍA, H. 1992. Flora medicinal de Colombia: botánica médica, Bogotá, Tercer Mundo. GUISA, D. & RINCÓN, L. 2007. Estudio del efecto antimicrobiano del aceite esencial de Minthostachys mollis combinado con inactivación térmica, sobre cepas de Listeria monocytogenes y Bacillus cereus. Microbiólogo industrial, Pontifica Universidad Javeriana. GUPTA, M. 1992. Plantas medicinales Iberoamericanas, Panamá, CYTED. HENDERSON, G. & LAINE, R. A. 2001. Effects of nootkatone and a borate compound on formosan subterranean termite (Isoptera: Rhinotermitidae) and its symbiont protozoa. Journal of Entomogical Science, 36, 229-236. MESA, A., MONTIEL, J., MARTÍNEZ, C., ZAPATA, B., PINO, N., BUENO, J. G. & STASHENKO, E. 2007. Actividad in vitro anti-candida y anti-Aspergillus de aceites esenciales de plantas de la familia Piperaceae. Scientia Et Technica, XIII, 247-249. VERMA, M., SHARMA, S. & PRASAD, R. 2009. Biological Alternatives for termite control: A review. International Biodeterioration & Biodegradation, 63, 959-972. MAISTRELLO, L., HENDERSON, G. & LAINE, R. A. 2001. Effects of nootkatone and a borate compound on formosan subterranean termite (Isoptera: Rhinotermitidae) and its symbiont protozoa. Journal of Entomogical Science, 36, 229-236. MUÑOZ, A., BOTTIA , E., CARDENAS, C., PATIÑO, J., DIAZ, O., MARTINEZ, J., KOUZNETSOV, V. & STASHENKO, E. 2007. Estudio comparativo sobre la capacidad

19

de atrapamiento del catiónradical ABTS+. por los aceites esenciales de especies aromáticas con alto contenido de trans-anetol y estragol. Scientia Et Technica, XIII, 117-120. NAKASHIMA, Y. & SHIMIZU, K. 1972. Antitermitic activity of Thujopsis dolabrata var Hondai. III. Components with a termicidal activity. . Miyazaki Daigaku Nogakubu Kenkyu Hokobu, 19, 251-259. PARRA, G. & SOTO., L. 1992. Aspectos ecológicos de los Termites de la región andina de Colombia. Cespedesia, 19. RAMIREZ, J. C. & LANFRANCO, D. 2001. Descripción de la biología, daño y control de las termitas: especies existentes en Chile. Bosque, 22, 77-84. RODRIGUEZ, H. 1993. Fitoinsecticidas en el combate de insectos "Bases prácticas de la agroecología en el desarrollo centroamericano". Módulo II: Manejo de plagas en el sistema de producción orgánica. San Martín Zapotitlan, Retalhuelu. RODRIGUEZ, D., SILVA, A., LAGUNES, A. & RODRIGUEZ, J. C. 2002. Insecticidas vegetales: una vieja y nueva alternativa para el manejo de plagas. Manejo Integrado de Plagas y Agroecología 66, 4-12. SAKASEGAWA, M., HORI, K. & YATAGAI, M. 2003. composition and antitermitic activities of essential oils from Melaleuca species. Journal of Wood Science, 49, 181-187. SANTANA, A., MARANHAO, C., SANTOS, J., CUNHA, F., CONCEIÇAO, G., BIEBER, L. & NASCIMENTO, M. 2010. Antitermitic activity of extractives from three Brazilian hardwoods against Nasutitermes corniger. International Biodeterioration & Biodegradation, 64, 7-12. SCHOWALTER, T. 2006. Insect Ecology. In: ELSEVIER (ed.) An Ecosystem Aproach. Second Edition ed. London: Elsevier. SHIMANOUCHI, N. 1992. Distillation of the essential oil of Hinoki (Chamaecyparis obtusa Endl.). Gakujutsu Kiyo- Kochi Kogyo Koto Senmon Gakko, 36, 121-126. VARGAS N., A. 2004. Termitidae (Insecta: Isoptera) de Colombia: Claves genéricas y distribución geográfica., Pontificia Universidad Javeriana. VARGAS N., A., SÁNCHEZ M., O. & SERNA C., F. 2005. Lista de los géneros de Termitidae (Insecta: Isóptera) de Colombia. Biota Colombiana, 6, 181-190. VARGAS R., A. & BOTTIA S., E. 2008. Estudio de la composición química de los aceites esenciales de seis especies vegetales cultivadas en los municipios de Bolivar y el Peñon - Santander, Colombia. Universidad Industrial de Santander.

20

WAGNER, H. & BLADT, S. 1984. Plant drug analysis. A thin layer Chromatography atlas, Berlin, Springer. WOOD, T. 1978. The agricultural importance of termites in the tropics. Agricultural Zoology Reviews, 7, 117-155. YATAGAI, M., MIYASAKI, Y. & MORITA, S. 1991. Extractives from Yakusugi bogwood and their termicidal activity and growth regulation effects on plants seeds. Mokuzai Gakkaishi, 37, 345-351. ZHU, B. C. R., HENDERSON, G., CHEN, F., MAISTRELLO, L. & LAINE, R. A. 2001. Evaluation of vetiver oil and seven insect-active essential oils against the formosan subterranean termite. Journal of Chemical Ecology, 27, 1627-1625. Índice Anexo Titulo……………………………………………………………………………………..….1 Abstract……………………………………………………………………………………...1 Palabras clave………………………………………………………………………………1 1. Introducción……………………………………………………………………………...1 2. Materiales y métodos……………………………………………………………………3 2.1 Selección de material vegetal……………………………………………………...3 2.2 Recolección de material vegetal y extracción de los aceites……………………4 2.3 Cromatografía de capa fina…………………………………………………………4 2.4 Experimento de actividad antitermitica……………………………………………..5 2.5 Análisis estadístico……………………………………………………………………6 3. Resultados y discusión...................…………………………………………………….6 3.1 Especies seleccionadas y no seleccionadas……………………………………….6 3.1.1 Lippia alba…………………………………………………………………………6 3.1.2 Minthostachys mollis……………………………………………………………..7 3.1.3 Cymbopogon citratus…………………………………………………………….7 3.1.4 Psidium caudatum………………………………………………………………..8 3.1.5 Especies no seleccionadas………………………………………………………8

21

3.2 Rendimiento y composición de los aceites de los aceites…………………….9 3.3 Actividad Antitermitica de los aceites……………………………………………..12 4. Conclusiones……………………………………………………………………………..16 5. Agradecimientos………………………………………………………………………….16 6. Bibliografía…………………………………………………………………………………17