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Universidad de León
Departamento de Biología Molecular
“Actividad antimicrobiana y expresión génica diferencial
en fagocitos humanos infectados con micobacterias
y Legionella pneumophila”
David Reyes Ruvalcaba
León, 2010
Los trabajos de investigación realizados en esta Memoria de Tesis Doctoral son
parte de los proyectos: PI05/1288 financiado por el Fondo de Investigación Sanitaria.
Ministerio de Sanidad y Consumo. Y LE07-04 financiado por la Junta de Castilla y
León
El autor de esta Memoria ha sido beneficiario de una beca de postgrado
(UACDJ-139) correspondiente al Programa de Mejoramiento del Profesorado de la
Universidad Autónoma de Ciudad Juárez - Secretaría de Educación Pública, México.
AGRADECIMIENTOS
Con la ayuda de Dios, los sueños sí se cumplen… a cualquier edad.
Sherry Buchanon
Primero agradezco a Dios N.S. por haberme concedido la gracia de llegar hasta
este momento. A mis padres (María Elena Ruvalcaba Hernández y Máximo Reyes Lara)
por haberme dado la vida y la oportunidad de haberme enviado a la escuela, que es la
mejor herencia que me han otorgado. A mis hermanos, Saúl, Favio y Ulises, y al resto
de familiares (presentes y ausentes). Por su apoyo incondicional, mil gracias.
Mi más profundo y sincero agradecimiento al Dr. Octavio Miguel Rivero
Lezcano por su paciencia y constante ayuda, sin la cual no hubiese logrado culminar
este trabajo. Y a los demás miembros del Grupo de Investigación en la Inmunología de
la Tuberculosis, Cristina y Carolina, gracias por su apoyo y consejos que me fueron
muy rentables para poder concluir este objetivo. También agradezco al Hospital de
León las facilidades proporcionadas para mi estancia en la Unidad de Investigación. Así
mismo hago extensivo mi agradecimiento al personal de extracciones del Hospital de
León por su ayuda desinteresada en la toma de muestras sanguíneas.
Agradezco de todo corazón la ayuda, consejos y apoyo proporcionado por dos
personas muy queridas por mí, Héctor Reyes Leal y Martha de la Torre Grajiola,
quienes a lo largo de este camino han estado ahí, en las buenas y en las malas.
Finalmente, no así menos importantes, a los Directivos de la UACJ, por las
facilidades otorgadas para poder culminar este trabajo. Y a mis amistades les agradezco
de corazón su apoyo moral y amistad.
DEDICATORIA
Dedico este Tesis a mí amada e incansable esposa, Myrna Gabriela, y a
nuestros hijos, Anayanci Carolina, David Eduardo y Jesús Alejandro. Gracias por su
cariño, apoyo, consuelo y sobre todo por su paciencia y por seguirme en esta aventura
que nos ha costado muchos sacrificios, pero también muy buenos momentos. Los quiero
mucho.
Ab imo pectore
Lo bueno de los años es que curan heridas,
lo malo de los besos es que crean adicción.
Joaquín Sabina
ÍNDICE
i
Índice General ---------------------------------------------------------------------------- i
Índice de Figuras ------------------------------------------------------------------------ vii
Índice de Tablas ------------------------------------------------------------------------- viii
Índice de Abreviaturas ---------------------------------------------------------------- ix
Introducción y Objetivos
Epidemiología de la tuberculosis -------------------------------------------- 1
Clasificación de las micobacterias y L. pneumophila ------------------ 3
Complejo Mycobacterium tuberculosis --------------------------------- 3
M. tuberculosis ---------------------------------------------------- 4
Otros miembros del CMT -------------------------------------- 5
Micobacterias no-tuberculosas ----------------------------------------- 5
L. pneumophila ----------------------------------------------------------- 7
Patogénesis y patología de la tuberculosis -------------------------------- 8
Desarrollo de la enfermedad ------------------------------------------- 9
Predisposición genética ------------------------------------------------- 10
Respuesta inmune frente a la tuberculosis -------------------------------- 11
Respuesta inmune innata o específica -------------------------------- 11
Macrófagos ------------------------------------------------------ 12
Interacción M. tuberculosis-macrófago, señalización
intracelular y fagocitosis ------------------------------- 13
Células epiteliales ----------------------------------------------- 15
Neutrófilos ------------------------------------------------------- 16
Células dendríticas ---------------------------------------------- 17
Células NK ------------------------------------------------------- 17
Respuesta Inmune adaptativa o específica ---------------------------- 17
Respuesta inmune celular (linfocitos T-Th/Tc) ------------- 18
Células CD4+ o Th --------------------------------------- 18
Células CD8+ o Tc --------------------------------------- 19
Células T γδ ---------------------------------------------- 19
Células CD1-restricted αβ ------------------------------ 19
Respuesta inmune humoral (linfocitos B) ------------------- 19
Granuloma tuberculoso ---------------------------------------- 20
Índice
ii
Evasión de la respuesta inmune --------------------------------------- 22
Citocinas ------------------------------------------------------------------------- 23
Citocinas pro-inflamatorias -------------------------------------------- 23
Interferón gamma (IFNγ) -------------------------------------- 23
Factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) --------------------- 25
Interleucina-12 (IL-12) ----------------------------------------- 25
Otras citocinas pro-inflamatorias ----------------------------- 26
Citocinas anti-inflamatorias -------------------------------------------- 26
Interleucina-10 (IL-10) ----------------------------------------- 26
Factor de crecimiento tumoral beta (TGFβ) ----------------- 26
Interleucina-4 (IL-4) -------------------------------------------- 27
Quimiocinas --------------------------------------------------------------- 27
Otras moleculas implicadas en la actividad antimicrobiana ---------- 29
Defensinas ----------------------------------------------------------------- 29
Catepsinas (CTS) --------------------------------------------------------- 30
Bomba de protones dependiente de ATP ----------------------------- 30
NADPH oxidasa ---------------------------------------------------------- 31
Óxido nítrico (NO) ------------------------------------------------------- 32
Slc11a1 --------------------------------------------------------------------- 32
Receptores de citocinas -------------------------------------------------- 33
IFNGR1 e IFNGR2 ---------------------------------------------- 33
TNFRSF1A -------------------------------------------------------- 33
Objetivos --------------------------------------------------------------------------- 35
Material y Métodos
Bacterias ---------------------------------------------------------------------------- 36
Cepas bacterianas ---------------------------------------------------------- 36
Manipulación y cultivo de bacterias ------------------------------------------ 37
Condiciones de cultivo ---------------------------------------------------- 37
Individualización de bacterias -------------------------------------------- 37
Cuantificación de bacterias ------------------------------------------------ 38
Células humanas ------------------------------------------------------------------- 39
Manipulación y cultivo de las células ------------------------------------ 39
Líneas celulares -------------------------------------------------------------- 39
Índice
iii
Células sanguíneas humanas ----------------------------------------------- 39
Reactivos para la purificación de monocitos y
neutrófilos ----------------------------------------------------------- 40
Solución tampón DPBS con BSA ------------------------- 40
ACD --------------------------------------------------------- 40
Solución dextrano ------------------------------------------- 40
Solución de KCL -------------------------------------------- 40
Purificación y cultivo de monocitos ----------------------------- 40
Purificación y cultivo de neutrófilos ----------------------------- 41
Infecciones --------------------------------------------------------------------------- 43
Reactivos específicos ------------------------------------------------------- 43
TPA ------------------------------------------------------------------ 43
Vit-D3 --------------------------------------------------------------- 43
Citocinas ------------------------------------------------------------ 43
Infecciones de líneas celulares -------------------------------------------- 43
Infecciones de monocitos y neutrófilos ---------------------------------- 43
Cuantificación de bacterias intracelulares y extracelulares ----------- 44
Comprobación de la fagocitosis de micobacterias (tinción
Kinyoun-Giemsa) ----------------------------------------------------------- 45
Reactivos específicos de la tinción Kinyoun-Giemsa -------- 45
Solución Etanol-HCl --------------------------------------- 45
Colorante Giemsa ------------------------------------------ 45
Solución A -------------------------------------------------- 45
Etanol ------------------------------------------------------- 45
Tinción Kinyoun-Giemsa ---------------------------------------- 45
Infecciones para cuantificación de citocinas --------------------------- 46
Infecciones para obtención de ADNc ----------------------------------- 46
Análisis estadístico -------------------------------------------------------- 46
Cuantificación de citocinas ----------------------------------------------------- 48
Método ELISA ------------------------------------------------------------- 48
Método CBA --------------------------------------------------------------- 48
Análisis estadístico -------------------------------------------------------- 49
Expresión génica ------------------------------------------------------------------ 50
Índice
iv
Reactivos específicos ------------------------------------------------------ 50
Solución TE -------------------------------------------------------- 50
Solución TAE ------------------------------------------------------ 50
SYRB green-fluoresceína ---------------------------------------- 50
Genes diana ----------------------------------------------------------------- 50
Diseño de cebadores ------------------------------------------------------- 50
Obtención de ARN total y síntesis de ADNc -------------------------- 53
Estimación de las eficiencias de las reacciones de PCR ------------- 53
Estudio de expresión diferencial mediante qPCR en tiempo
real -------------------------------------------------------------------------- 55
Resultados
Infecciones en diferentes tipos celulares ----------------------------------- 56
Infecciones en células promielocíticas humanas (HL60) ----------- 56
Infección de células HL60 con M. avium -------------------- 56
Efecto del suero en el crecimiento intracelular de mico-
bacterias con grado distinto de patogenicidad en células
HL60 infectadas ------------------------------------------------- 56
Infecciones en monocitos primarios ----------------------------------- 58
Infección de monocitos con M. avium y M. gordonae ----- 58
Infecciones en células epiteliales pulmonares (A549) -------------- 59
Capacidad de los fagotitos humanos (monocitos y neutrófilos)
para eliminar a micobacterias no patógenas ------------------------------ 61
Actividad anti-microbiana de fagotitos humanos ------------------- 61
Infección de monocitos y neutrófilos con bacterias de
diferentes grado de patogenicidad --------------------------- 61
Cuantificación de micobacterias extracelulares y
determinación de la fagocitosis ------------------------------ 64
Patrón de secreción de citocinas en los fagotitos infectados ----- 64
Cuantificación de citocinas pro y anti-inflamatorias ------ 64
Neutralización de citocinas en monocitos infectados con
M. tuberculosis y M. gordonae atenuada ------------------- 66
Activación de los fagotitos con citocinas y su efecto en la
actividad anti-microbiana ---------------------------------------------- 68
Índice
v
Efecto del IFNγ y del TNFα en la actividad anti-
microbiana -------------------------------------------------------- 68
Expresión génica de monocitos infectados con diferentes
bacterias ---------------------------------------------------------------------------- 70
Expresión génica mediante qPCR en tiempo real -------------------- 73
Expresión génica de CCL20 en monocitos infectados
con diferentes micobacterias -------------------------------------------- 75
Discusión
Infecciones ------------------------------------------------------------------------ 77
Infecciones en las líneas celulares HL60 y A549 -------------------- 77
Infecciones en monocitos ----------------------------------------------- 78
Efecto del suero en el crecimiento intracelular de
M. avium en monocitos ---------------------------------------- 78
Obtención del modelo de infección ----------------------------------- 78
Actividad antimicrobiana de fagotitos humanos -------------------- 79
Activación de los fagotitos con citocinas y su efecto en la
actividad anti-microbiana ---------------------------------------------- 81
Patrón de secreción de citocinas en fagotitos infectados ---------- 82
Expresión génica mediante qPCR en tiempo real ---------------------- 84
Expresión génica -------------------------------------------------------- 84
Defensinas (DEFB 1, 2, 3, 4) ------------------------------------------ 84
CTS D y G ---------------------------------------------------------------- 85
NRAMP1 ------------------------------------------------------------------ 85
Receptores de citocinas ------------------------------------------------- 86
IFNGR1 e IFNGR2 --------------------------------------------- 86
TNFRSF1A ------------------------------------------------------ 87
Subunidades de la bomba de protones dependiente de ATP
(ATP6V1G1 y ATP6V0C) ---------------------------------------------- 87
Subunidades de la NADPH oxidasa (p47 phox y gp91 phox) ----- 88
iNOS ----------------------------------------------------------------------- 88
Quimiocina CC ligando 20 -------------------------------------------- 89
Conclusiones
Conclusiones -------------------------------------------------------------------- 91
Índice
vi
Bibliografía
Bibliografía ---------------------------------------------------------------------- 92
Anexos
Anexo 1: Publicación: Human phagocytes lack the ability to kill Mycobacterium
gordonae, a non-pathogenic mycobacteria ------------------------- 113
Índice
vii
Índice de Figuras
Figura 1: Incidencia de la tuberculosis a nivel mundial en el año 2007 ------ 2
Figura 2: Incidencia de la tuberculosis respiratoria por Provincias en
Castilla y León. Tasa por cada 100.000 habitantes ------------------- 2
Figura 3: Esquema de la pared celular de M. tuberculosis --------------------- 5
Figura 4: Vías de entrada y transmisión de M. tuberculosis ------------------- 9
Figura 5: Representación esquemática de la formación de las células
sanguíneas ----------------------------------------------------------------- 13
Figura 6: Esquema de la formación del granuloma tuberculoso --------------- 21
Figura 7: Purificación de monocitos: separación de la capa de células
mononucleares (monocitos y linfocitos) del resto de los
componentes sanguíneos ------------------------------------------------- 41
Figura 8: Actividad anti-microbiana de los fagotitos (A, monocitos;
B; neutrófilos) -------------------------------------------------------------- 63
Figura 9: Activación de fagocitos con citocinas. La multiplicación intracelular
de las bacterias en monocitos (A) o neutrófilos (B) ----------------- 69
Figura 10: Geles de agarosa de los genes diana p47 phox, gp91 phox, iNOS,
NRAMP1, CTSG y D, ATP6V1G1, ATP6V0C, TNFRSF1A,
INFGR1, IFNGR2 y CCL20 --------------------------------------------- 71
Figura 11: Geles de agarosa de los genes de las DEFB1, 2, 3 y 4 ---------------- 72
Índice
viii
Índice de Tablas
Tabla 1: Clasificación científica de M. tuberculosis y L. pneumophila ------- 7
Tabla 2: Bacterias utilizadas -------------------------------------------------------- 36
Tabla 3: Descripción de los genes utilizados ------------------------------------- 51
Tabla 4: Cebadores utilizados ------------------------------------------------------ 52
Tabla 5: Comparación de la supervivencia de micobacterias de diferente grado
de patogenicidad, a diferentes concentraciones de suero ------------ 57
Tabla 6: Efecto del suero en el crecimiento de las micobacterias ------------- 58
Tabla 7: Efecto del suero en el crecimiento de micobacterias en
monocitos infectados ----------------------------------------------------- 59
Tabla 8: Supervivencia de micobacterias en línea celular A549 -------------- 60
Tabla 9: Prueba t de student para la igualdad de medias en neutrófilos infectados - 64
Tabla 10: Cantidad de citocinas liberadas de fagocitos infectados ------------- 66
Tabla 11: Actividad anti-microbiana de monocitos frente a M. tuberculosis y M. gordonae atenuada en presencia de anticuerpos de neutralización
anti-citocinas --------------------------------------------------------------- 67
Tabla 12: Expresión génica de diversos genes en ADNc de monocitos ------- 74
Tabla 13: Expresión génica de CCL20 en monocitos infectados con dos
cepas diferentes de M. tuberculosis ------------------------------------- 76
Tabla 14: Expresión de CCL20 en monocitos infectados con micobacterias
de diferente grado de patogenicidad ------------------------------------ 76
Tabla 15: Cebadores de los genes normalizadotes -------------------------------- 76
Índice
ix
Índice de abreviaturas
% Porcentaje
> Mas de
º C Grado centígrado
7H2O Hepta hidratado
A549 Línea celular epitelial pulmonar (adenocarcinoma humano)
ADC Citrato Ácido Dextroxa, siglas en inglés
ADN Ácido Desoxi-Ribonucleico
ADNc Ácido Desoxi-Ribonucleico complementario
AELC Asociación Europea de Libre Comercio
Anti-CD Anti-cluster of differentiation
anti-IL-β1 Anti-Interleucina Beta 1
APC Células Presentadoras de Antígenos, siglas en inglés
ATP6V0C Subunidad V0C de la bomba de protones vacuolar
ATP6V1G1 Subunidad V1G1 de la bomba de protones vacuolar
CBA “Cytometric Bead Array”, siglas en inglés
cc Centímetro cúbico
CCL20 Quimiocina CC ligando 20
CCR6 Receptor de quimiocina 6
CD cluster of differentiation
CMA Complejo Mycobacterium avium
CMT Complejo Mycobacterium tuberculosis
Ct Ciclo umbral
CTS Catepsina
DE Desviación estándar
DEFB- Defensina β-
dH2O Agua destilada
dNTP´s Di-Nucleotidos Tri-Fosfato
EDTA Etilen-Diamino Ácido Tetra-acético, siglas en inglés
EF1α Factor de elongación1 alfa
ELISA “Enzime-linked immunosorbent assays”
g velocidad angular + radio
g/l Gramo por Litro
Índice
x
GM-CSF Granulocito-Macrófago Factor Estimulante de colonias
gp91 phox subunidad gp91 de la NADPH oxidasa
gr Gramo
HCl Ácido clorhídrico
IFN-γ Interferón gamma
IgG1 Inmunoglobulina G 1
IL- Interleucina-
INFGR1 Receptor de la cadena alfa del Interferón gamma
INFGR2 Receptor de la cadena beta del Interferón gamma
iNOS2 Oxido nítrico sintetasa 2A
Kb Kilo base
KCl Cloruro de potasio
KDa Kilo dalton
KH2PO4
MIP3α Proteína Inflamatoria del Macrófago 3 alfa
ml Mililitro
mM Mili molar
mm Milímetro
MOI “Multiplicity of infection”
M-SFM Medio de macrófagos libre de suero
N Normal
Na2PO4 Fosfato de sodio
NaCl Cloruro de Sodio
NK Células Asesinas Naturales, siglas en inglés
nM Nano Molar
nm Nanómetro
NRAMP1 Resistencia natural-asociada a la proteína 1 del macrófago
p47 phox subunidad p47 de la NADPH oxidasa
PAM´s Patrones moleculares asociados a patógenos
pb Pares de bases
PBS Tampón de fosfato salino
PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa
pg Picogramo
pH Potencial ión hidrógeno
Índice
xi
PMA forbol 12-miristato 13-acetato
PRR´s Receptores de reconocimiento de patógenos
qPCRrt PCR cuantitativa en tiempo real
RD Regiones de diferencia
SFB Suero fetal bovino
SFM Medio libre de suero
Slc11a1 Gen acarreador de solutos de la familia 11 miembro 1
SPSS Paquete estadístico de las ciencias sociales, siglas en ingles
TAE Tris-ácido acético-EDTA
Tc Célula T citotóxica
TE Tris-EDTA
TGF-β1 factor de crecimiento tumoral β1
Th Célula T helper
TNFRSF1A Receptor del factor de necrosis tumoral de la súper familia 1A
TNF-α Factor de necrosis tumoral alfa
TPA forbol 12-miristato 13-acetato
UFC Unidad formadora de colonias
V Versión
Vit-D3 1,25 dihidroxicolecalciferol
W Watts
w/v Peso / volumen, siglas en inglés
µg Microgramo
µl Microlitro
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
1
EPIDEMIOLOGÍA DE LA TUBERCULOSIS
Uno de los principales problemas de salud publica a nivel mundial es la
tuberculosis, que durante siglos ha azotado a la humanidad, y actualmente es
considerada como una enfermedad emergente [van Soolingen et al., 1997]. El virus de
la inmunodeficiencia humana (VIH) y el surgimiento de cepas multirresistentes están
contribuyendo al aumento de la mortalidad por tuberculosis, que es considerada como
una enfermedad curable [Olleros et al., 2005].
La Organización Mundial de la Salud, en el año 2009, informa que el número
estimado de nuevos casos de tuberculosis para el año 2007, fue de 9,27 millones (139
por 100.000 habitantes) entre ellos 4,1 millones de nuevos casos bacilíferos, es decir el
44,0 % del total (61 por cada 100.000 habitantes) y aproximadamente 1,37 millones
(14,8 %) son VIH-positivos.
Para ese año se estimó que 13,7 millones fueron casos prevalentes de
tuberculosis (206 por 100.000 habitantes) de los cuales 687.000 (5 %) eran VIH-
positivos. La cifra estimada de defunciones, en ese mismo año, fue de 1,32 millones
VIH-negativos y adicionalmente 456.000 casos fueron VIH-positivos [WHO, 2009].
En España la tuberculosis en al año 2007 presentó una incidencia de todas las
formas de 13.103 casos (tasa de 30 por cada 100.000 habitantes) [WHO, 2009]. Y una
tasa de 15,1 por cada 100.000 habitantes de tuberculosis respiratoria [Enfermedades de
Transmisión Respiratoria, JCyL, 2009]. La prevalencia fue de 10.320 casos (tasa de 23
por cada 100.000 habitantes). Siendo la mortalidad fue de 1.375 casos (tasa de 3 por
cada 100.000 habitantes) [WHO, 2009]. En la Fig.1 se representa esquemáticamente la
incidencia de la tuberculosis a nivel mundial para el año 2007, donde se observa que
España se encuentra en el rango de 25 a 49 por cada 100.000 habitantes.
Introducción y Objetivos
2
Fig. 1: Incidencia de tuberculosis a nivel mundial en el año 2007, [WHO 2009].
De acuerdo con el Boletín Epidemiológico de Castilla y León (Enfermedades de
Transmisión Respiratoria, año 2007) en la comunidad de Castilla y León, se registraron
458 casos de todas las formas clínicas de tuberculosis (tasa de 18,11 casos por 100.000
habitantes). Siendo la incidencia más elevada en el grupo de edad de 20 a 45 años, otro
grupo de edad que presenta una alta incidencia fue el de 75 a 80 años De todas las
provincias de esta Comunidad, la provincia de León presentó la más alta incidencia con
20,91 por cada 100.000 habitantes (Fig. 2), y la de Zamora la más baja (3,04 casos por
100.000 habitantes) [Enfermedades de Transmisión Respiratoria, JCyL, 2009].
Fig. 2: Incidencia de tuberculosis respiratoria por Provincias en Castilla y León. Tasa por cada 100.000 habitantes. [JCyL,2009].
3
CLASIFICACIÓN DE LAS MICOBACTERIAS Y L.
PNEUMOPHILA
Las micobacterias están ampliamente distribuidas en la naturaleza y se incluyen
tanto bacterias saprofitas como patógenas, tienen una amplia gama de huéspedes que va
desde plantas a humanos [Pieters, 2001]. Las cepas patógenas, que incluyen a M. leprae
y los miembros del complejo Mycobacterium tuberculosis (CMT), como M.
tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti, y M. canettii, que son los micro-
organismos cuya recuperación del cuerpo humano esta casi siempre asociada con la
enfermedad. Dentro del grupo de las micobacterias también encontramos a las llamadas
no tuberculosas que comprende a todas las otras especies de micobacterias que pueden
causar trastornos pulmonares que se asemejan a la tuberculosis [Piersomoni y Scarpano,
2008]. Las micobacterias que causan la enfermedad tuberculosa se pueden englobar en
dos grandes grupos: CMT y micobacterias no tuberculosas (MNT).
Complejo Mycobacterium tuberculosis
El CMT comprende varias especies de micobacterias muy parecidas entre si,
estrictamente responsables de la tuberculosis humana y zoonótica. Son bacterias de
crecimiento lento, ácido resistentes, y genéticamente comparten secuencias idénticas de
la fracción 16S del ARN ribosomal y más del 99.0 % de su secuencia nucleotídica es
idéntica. Sin embargo, difieren significativamente en su morfología, bioquímica, y en el
rango de huéspedes que afectan [Boddinghaus et al., 1990; Sreevatsan et al., 1997].
El alto grado en la conservación de secuencias del ADN entre las micobacterias
pertenecientes al CMT, ha limitado el desarrollo de herramientas diagnósticas a nivel
molecular para identificar los miembros individuales. No obstante, estudios
filogenéticos recientemente han puesto en evidencia regiones del genoma que exhiben
múltiples polimorfismos, que han sido colectivamente designados como regiones de
diferencia (RD) [Liebana et al., 1996; Gordon et al., 1999; Brosch et al., 2002;
Mostowy et al., 2002; van Embden et al., 2000]. La comparación del ADN total de la
cepa de referencia de M. tuberculosis H37RV con el genoma de otras micobacterias del
Introducción y Objetivos
4
complejo, han revelado la existencia de 16 RD, de un tamaño entre 2 y 12,7 Kb
presentes en el genoma de M. tuberculosis pero ausentes en otros miembros del CMT
[Gordon et al., 1999; Brosch et al., 2002; Mostowy et al., 2002; Mostowy et al., 2004].
Debido a que los loci RD parecen haberse acumulado secuencialmente y están
diferencialmente distribuidos entre varios grupos de micobacterias del CMT, estos han
sido propuestos como marcadores genéticos para diferenciar entre subespecies de este
complejo [Brosch et al., 2002; Huard et al., 2003; Mostowy et al., 2004].
M. tuberculosis
La bacteria M. tuberculosis fue descubierta por Heinrich Hermann Robert Koch
(1843-1910) a finales del siglo XIX (1882) [Koch, 1982]. Es un patógeno intracelular,
que puede ocasionar patología grave, es de lento crecimiento y aerobio estricto [Pieters,
2001]. Pertenece a la familia Mycobacteriaceae, la clasificación científica se muestra en
la tabla 3, y es considerado como el agente principal causante de la tuberculosis humana
en el mundo [van Soolingen et al., 1997]. Tras varias décadas de disminución de la
incidencia de la tuberculosis, a mediados de los ochenta se produjo un drástico
incremento. Las principales causas para el desarrollo de esta enfermedad son debidas a
las malas condiciones económicas y sociales de la población, así como la extensión de
la epidemia del VIH [Hartmann y Plumm, 1999; Raja, 2004].
Las causas de la virulencia de M. tuberculosis aun no se conocen del todo, ya
que no tienen factores de virulencia clásicos como la producción de toxinas. Se han
realizado estudios de mutación de genes para determinar los factores que la hacen
virulenta tanto en modelos humanos como de animales. Y se ha observado que genes
que codifican para enzimas que intervienen en la síntesis de la pared celular se
relacionan con la patogenicidad de la bacteria. La pared celular (Fig. 3) es una
estructura compleja formada por proteínas, lípidos y carbohidratos, que son diferentes a
las demás bacterias, Un ejemplo es el lipoarabinomanano (LAM), el mayor componente
de la pared celular, que es un complejo glicolípido que contiene repeticiones del
disacárido arabinosa-manosa y que es un importante inmunomodulador [Smith, 2003].
Se ha observado que esta molécula es un potente inhibidor de la actividad del IFNγ en
macrófagos de ratón [Chan et al., 1991].
Introducción y Objetivos
5
Fig. 3: Esquema de la pared celular de M. tuberculosis (1); Lípidos externos (2); Ácidos micólicos (3); Arabinogalactano (4); Péptido glicano (5); LAM (6); Fosfatidilinositol monóxido (7); Membrana plasmática (8).
Otros miembros del CMT
Aunque M. tuberculosis se conoce como el principal agente causal de la
tuberculosis humana, se ha reconocido la importancia epidemiológica de la transmisión
zoonótica de M. bovis al humano, ocasionada por estar en contacto o consumo de
productos de animales infectados [Zumárraga et al., 1999; Michael, 2002; Ayele et al.,
2004; Fritsche et al., 2004]. También se ha documentado la coinfección con M. bovis
variedad BCG, en niños y M. bovis en pacientes infectados con el VIH [Samper et al.,
1997: Hesseling et al., 2004].
M. africamun es una micobacteria que se subdivide en dos tipos, el tipo I, que se
considera como epidémico en el Este de África y el tipo II, en el oeste de África
[Frothingham et al., 1993]. M. canetti, considerada como la más ancestral de las
micobacterias causante de tuberculosis [Mostowy y Behr, 2005], encontrada
anecdóticamente en un niño somalí en 1993 [van Soolingen et al., 1997]. M. microti,
micobacteria que afecta a pequeños roedores del campo [Wells, 1953], también ha sido
aislada en humanos [van Soolingen et al., 1998]. M. caprae, es una rara enfermedad en
el ganado [Aranaz et al., 1999; Aranaz et al., 2003], además de ser una tuberculosis
zoonótica en humanos [Blaas et al., 2003].
Micobacterias no-tuberculosas
Las micobacterias no tuberculosas [American Thoracic Society, 1990], han sido
también descritas como micobacterias atípicas [Pinner, 1935], anónimas [Runyon,
1959], no clasificadas [Corpe et al., 1963] o ambientales [Caminero-Luna, 2001]. Estas
Introducción y Objetivos
6
bacterias incluyen a todas las especies que no forman parte del CMT. Pueden producir
infecciones con muchos de los síntomas de la tuberculosis. A pesar de que estas
micobacterias son comunes, por lo general causan infección solo en las personas con un
sistema inmunitario debilitado (inmunocomprometido, principalmente pacientes con
SIDA). La mayoría de estas bacterias viven libres como saprofitas y están ampliamente
distribuidas por todo el mundo y en una gran variedad de reservorios ambientales,
especialmente en el agua (dulce o salada) y en la tierra. Aunque también se han aislados
del polvo, aerosoles y biofilms de sistemas de distribución de agua para consumo
[Collins et al., 1984; Rodgers et al., 1999; Caminero-Luna, 2001; Falkinham, 2002].
Estas micobacterias son patógenos oportunistas capaces de ocasionar linfadenitis
e infecciones en: pulmones, piel, tejidos blandos, articulaciones y huesos [Benson,
1994; Benson y Ellner, 1993; Wallace et al., 1990; Wolinsky, 1979]. Las infecciones de
piel, tejidos blandos, articulaciones y huesos, ocasionadas por las MNT, están asociadas
a heridas traumáticas o quirúrgicas [Wallace et al., 1990; Fitzgerald et al., 1995;
Sanders et al., 1995].
Las micobacterias no tuberculosas conforman un grupo muy amplio, pero para
nuestro estudio solo vamos a considerar tres: Complejo M. avium (CMA), M. kansasii y
M. gordonae. El CMA incluye tres especies reconocidas (M. avium, M. intracellulare y
M. chimaera) y otros organismos no clasificados (denominados como especies de
Mycobacterium avium-intracellulare grupo X). Son de lento crecimiento, bacilos ácido
resistentes y no pigmentados [Piersimoni, 2008]. Se ha observado que la incidencia de
la enfermedad que producen ha aumentado en los últimos años [McGarvey y Bermudez,
2002]. M. kansasii es, después del CMA, la especie de MNT mas frecuente, responsable
de la enfermedad pulmonar en individuos inmunocomprometidos. Es una micobacteria
de lento crecimiento. En España, en pacientes con SIDA es la especie más
frecuentemente aislada [Caminero-Luna, 2001]. M. gordonae es una micobacteria
saprofita, que es frecuentemente aislada e identificada en los laboratorios, y casi
siempre considerada como no patogénica, pero ocasionalmente produce patología
pulmonar. Es de lento crecimiento y ácido resistente. Se encuentra ampliamente
distribuida en el medio ambiente agua, tierra, y leche no esterilizada [Douglas et al.,
1986; Weinberger y Berg, 1992].
Introducción y Objetivos
7
L. pneumophila
L. pneumophila es la bacteria causante de la legionelosis o enfermedad de los
legionarios, una forma grave de neumonía que en ocasiones produce una infección
sistémica, y que se ve particularmente en individuos inmunocomprometidos que tienen
un mecanismo de respuesta inmune deficiente [Nakachi, et al., 2000]. Esta bacteria es
un bacilo facultativo intracelular, Gram negativo [Müller et al., 1996]. Se clasifica en la
Clase de las Proteobacterias gamma y la Familia Legionellacae (clasificación científica
se muestra en la tabla 1). Es considerada como un microorganismo exigente en cuanto a
sus condiciones de cultivo ya que requiere de un pH óptimo, estrechos rangos de
temperatura y no crecen en condiciones anaeróbicas [Brenner et al., 1979].
Tabla 1: Clasificación científica de M. tuberculosis y L. pneumophila
Reino Bacteria Bacteria
Filum Actinobacteria Proteobacteria
Clase Actinobacteria Proteobacteria gamma
Orden Actinomycetales Legionellale
Familia Mycobacteriaceae Legionellaceae
Género Mycobacterium Legionella
Especie M. tuberculosis L. pneumophila
Nombre binomial Mycobacterium tuberculosis Legionella pneumophila
Esta bacteria invade a los pulmones y tiene la capacidad de reproducirse en las
células que la fagocitan, como los monocitos y macrófagos alveolares [Horwitz y
Silverstein, 1980], leucocitos polimorfonucleares [Horwitz, 1984], También se ha
observado que se reproduce en la línea celular promielocítica HL60 [Marra et al., 1990]
y la línea celular U937 [Pearlman et al., 1988].
8
PATOGÉNESIS Y PATOLOGÍA DE LA TUBERCULOSIS
M. tuberculosis es una bacteria que tiene predilección por el tejido pulmonar rico
en oxígeno. La principal ruta de entrada al organismo es la vía respiratoria (Fig. 4). La
micobacteria se difunde desde el sitio inicial de la infección en el pulmón por el tejido
linfático y la sangre a otras partes del cuerpo, siendo el ápice pulmonar y los nódulos
linfáticos regionales sus sitios preferentes. Los sitios de difusión extrapulmonar son la
pleura, el tejido linfático, hueso, el sistema genito-urinario, las meninges, peritoneo y la
piel; esto sucede en aproximadamente el 15% de los enfermos con tuberculosis [Raja,
2004].
La transmisión de la infección tuberculosa es casi siempre por la vía aérea,
siendo éste un proceso de entrada natural, por el mecanismo de la respiración del sujeto
receptor. Otras vías de entrada, poco comunes, son la digestiva, dérmica o mucosa, que
requieren de situaciones especiales o anómalas en el huésped, como lo son la pérdida
de continuidad en las superficies expuestas (heridas o lesiones).
Para su transmisión es conveniente tomar en consideración dos condiciones que
nos permitan valorar el riesgo transmisor:
La fuente: Que es el reservorio emisor del agente infeccioso (persona enferma).
En algunas ocasiones, poco comunes, la fuente puede ser un animal enfermo. La
emisión de bacterias depende del carácter bacilífero de la fuente. Los principales
bacilíferos son los enfermos activos de tuberculosis laríngea o pulmonar, los
enfermos portadores de tuberculosis con cepas más virulentas y los enfermos
con SIDA.
El vehículo transmisor: Son los aerosoles emitidos por las personas enfermas,
las gotas que se desprenden de un estornudo o un acceso de tos, generalmente,
son gotas que se evaporan rápidamente y los residuos de esta evaporación son
pequeñas gotas que contienen a la micobacteria llamados núcleos goticulares de
Wells que, por su pequeño tamaño (1-10 µm), son capaces de mantenerse
Introducción y Objetivos
9
suspendidos en el aire [Rodríguez-Bayarri y Madrid-San Martín, 2004; Bates y
Nardell, 1995].
Fig. 4: Vías de entrada y transmisión de M. tuberculosis.
Desarrollo de la enfermedad
Los núcleos goticulares de Wells son inhalados y hospedados en las vías
respiratorias dístales (alvéolos). Las micobacterias son fagocitadas por los macrófagos
alveolares, iniciando una cascada de eventos que puede resultar en una eliminación de la
infección o progresión de la infección a enfermedad activa. Aunque el riesgo de
desarrollar la enfermedad activa, varia de acuerdo al tiempo de la infección, edad, la
resistencia del huésped así como la virulencia del Mycobacterium [Pieters, 2001].
La tuberculosis con frecuencia se presenta de forma asintomática o como una
infección latente. La mayoría de los pacientes contiene la enfermedad de 2 a 10 semanas
con el subsiguiente desarrollo de una respuesta de hipersensibilidad de tipo retardada.
En aproximadamente el 5% de las personas infectadas el control de la replicación del
microorganismo es inadecuada, y desarrollan la enfermedad después de un periodo de
latencia de 1 a 2 años posteriores a la infección (tuberculosis primaria). En otro 5% la
contención del organismo falla dando como resultado el desarrollo de la enfermedad en
algún momento de su vida (tuberculosis postprimaria) [Hartmann y Plumm, 1999;
Flynn y Chan, 2001; van Crevel et al., 2002; Flynn et al., 2003]. La tuberculosis
pulmonar se puede manifestar clínicamente como tuberculosis primaria o post-primaria.
La sintomatología de la tuberculosis pulmonar primaria es inespecífica.
Introducción y Objetivos
10
Síntomas generales: Son los más frecuentes y a veces pasan desapercibidos.
Astenia, anorexia, ligera elevación febril, alteración en la curva de peso, modificaciones
del carácter. La fiebre puede ser el síntoma principal.
Síndrome de hipersensibilidad a las proteínas del bacilo, como el eritema nodoso
y la querato-conjuntivitis flictenular. Sugiere una etiología tuberculosa, pero puede ser
debido a otras causas.
Síntomas respiratorios: Tos, dolor torácico, expectoración, hemoptisis. Los
cuales son poco frecuentes [Milburn, 2001].
La tuberculosis postprimaria es poco frecuente en la infancia; ocurre
principalmente en la adolescencia después de haber estado infectado durante varios
años. Puede producirse como consecuencia de una reactivación endógena, por las
micobacterias que han estado en estado latente desde que ocurrió la infección primaria,
o bien proceder del exterior y producir una reactivación exógena. Los síntomas son los
propios de la tuberculosis del adulto: Fiebre, tos, astenia, anorexia, dolor torácico,
esputo hemoptoico [Wallis y Jonson, 2001].
Predisposición genética
En 1926 en la ciudad de Lubeck, Alemania, hubo un trágico accidente durante
un programa de vacunación con el bacilo de Calmette-Guérin, donde 249 niños fueron
vacunados una bacteria viva de M. tuberculosis virulenta, y aunque 76 murieron, 173
sobrevivieron. Esta desafortunada experiencia mostró que hay una amplia variación de
grados de la inmunidad innata contra M. tuberculosis [Bellamy, 2005]. Estudios
posteriores han demostrado que la presencia de polimorfismos o de defectos genéticos
en ciertos genes favorecen la infección contra M. tuberculosis. Un ejemplo es el gen
NRAMP1 (resistencia natural-asociada a la proteína 1 del macrófago) [Liu et al.,
1995], actualmente conocido como Scl11a1 (miembro 1 de la familia 11 de
transportador de solutos) [Wyllie et al., 2002].
Otros ejemplos son el caso de mutaciones en los genes que codifican el receptor
1 del interferón γ, implicados en la diseminación infecciosa de BCG posterior a una
vacunación [Cassanova et al., 1996], y el receptor 2 del interferón γ, que han dado lugar
a infecciones por micobacterias no tuberculosas [Bellamy, 2005]. Lo mismo sucede en
personas con deficiencias genéticas en los sistemas de producción de las interleucinas
12 y 23 [Ottenhoff et al., 2005].
11
RESPUESTA INMUNE FRENTE A LA TUBERCULOSIS
El sistema inmunológico innato es activado después de la invasión de los
microorganismos patógenos, y coordina la defensa de huésped durante las primeras
horas y días posteriores a la infección. Aunque, el sistema inmunológico innato es muy
eficaz con la mayoría de los patógenos, la especificidad es conferida sólo por la
activación secundaria de inmunidad adquirida regulada por los linfocitos T y B [Netea
et al., 2004].
Respuesta inmune innata o inespecífica
La respuesta inmune innata forma parte de los mecanismos inespecíficos que
representa el primer sistema defensivo del organismo, siendo de especial importancia la
protección del organismo frente a las infecciones. Los mecanismos que conforman la
inmunidad de tipo innato están constituidos por las barreras naturales, que son la piel y
las mucosas, que no sólo actúan aislando al individuo del exterior sino que también
exhiben actividades bactericidas y promotoras de la inflamación debido a la presencia
de múltiples moléculas, factores y células con función defensiva. Estas células se
caracterizan por su capacidad para actuar de manera inmediata sin requerir de un
aprendizaje previo siempre que algún patógeno sobrepasa las barreras naturales.
En la respuesta inmune innata de los pulmones (espacio alveolar) intervienen
una serie de células que incluyen a los macrófagos alveolares y las células epiteliales del
pulmón (células alveolares tipo I y tipo II) que son el primer contacto con los
patógenos. Además de neutrófilos, linfocitos B, células dendríticas, células NK [Raja,
2004; Rivas-Santiago et al., 2005]. También intervienen factores solubles como la
mucina, lisosima, lactoferrina [Knowels y Boucher, 2002], surfactantes, fosfolipasa A2
[Freguson y Schlesinger, 2000], defensinas, catelicidinas [Ganz, 2002],
inmunoglobulinas y proteínas del complemento [van Crevel et al., 2002], cuya función
es mantener la homeostasis pulmonar y la eliminación de partículas o bacterias que
entren por el tracto respiratorio.
Introducción y Objetivos
12
La llegada de M. tuberculosis hasta el espacio alveolar significa que ha superado
la barrera muco-ciliar del tracto respiratorio. Los macrófagos alveolares, que
constituyen la primera línea de defensa, establecen el primer contacto con la
micobacteria, junto con las células epiteliales, y va a ser crucial para definir el control
de la infección o el desarrollo de la enfermedad. La fagocitosis de la micobacteria es
principalmente llevada a cabo por los macrófagos alveolares a través de diversos
mecanismos y es favorecida por la proteína surfactante A, producida por las células
epiteliales alveolares tipo II, ya que aumenta la interacción entre la micobacteria y los
macrófagos [Freguson y Schlesinger, 2000].
Macrófagos
Los macrófagos, al igual que otras células sanguíneas tienen su origen en la
médula ósea (Fig. 5), se forman a partir de las células madre, unidad formadora de
colonias granulosito-macrófago, monoblasto, promonocito y finalmente monocito, este
último pasa al torrente circulatorio para dirigirse a un órgano blanco y ahí se introduce
al micro-ambiente local para ser diferenciado como célula específica y heterogénea, que
en el caso de los pulmones, se diferencia a macrófago alveolar, donde residen durante
varios años [Ma et al., 2003].
Los macrófagos juegan un papel doble en la defensa del huésped, pues son un
componente de la respuesta inmune innata, pero también actúan como células accesorias
importantes en la respuesta inmune adaptativa [Ma et al., 2003], dado que son células
presentadoras de antígenos [Rivas-Santiago et al., 2005].
Introducción y Objetivos
13
Fig. 5: Representación esquemática de la formación de las células sanguíneas.
Interacción M. tuberculosis-macrófago, señalización intracelular y
fagocitosis
Raja caracteriza la secuencia de interacción macrófago-M. tuberculosis y el
papel de los macrófagos en la respuesta inmune del huésped en un proceso de cinco
etapas: 1. Unión de la superficie del M. tuberculosis al macrófago; 2. fusión fagosoma-
lisosoma; 3. crecimiento micobacteriano inhibición/muerte; 4. reclutamiento de células
inmunes secundarias a la respuesta inflamatoria local, y 5. presentación de antígenos de
las células T para el desarrollo de la inmunidad adquirida [Raja, 2004].
Durante las primeras etapas de reconocimiento, los macrófagos pueden
interactuar de dos maneras con las micobacterias: pueden hacerlo de forma directa con
los receptores de superficie de los macrófagos; o se puede establecer gracias a diversos
elementos séricos que el macrófago puede reconocer de manera específica, como los
anticuerpos o, de manera inespecífica como los componentes del complemento o
proteínas de la fase aguda, los cuales funcionan como opsoninas. [Hirsch et al., 1994].
Introducción y Objetivos
14
Inicialmente, la fagocitosis no opsónica realizada por los macrófagos es crítica para la
defensa del huésped en el pulmón, debido a que en el fluido bronco-alveolar no
inflamatorio no hay cantidad suficiente de opsoninas [Linehan et al., 2000].
Los macrófagos alveolares son el primer tipo celular involucrado en la
fagocitosis de M. tuberculosis. Luego de este primer encuentro, las células dendríticas y
los macrófagos derivados de monocitos también forman parte del proceso fagocítico
[van Crevel et al., 2002]. La endocitosis de M. tuberculosis involucra diferentes
receptores de las células fagocíticas, que actúan en el reconocimiento del bacilo
tuberculoso. En los macrófagos humanos, los receptores primarios para el
reconocimiento de M. tuberculosis son el receptor de manosa y el receptor de
complemento 3, mientras que para las células dendríticas, el principal receptor es DC-
SIGN [Tailleux (b) et al., 2003]. Esta micobacteria, también es reconocida por los
receptores tipo Toll (TLR), como el TLR2, TLR 9 y TLR4 [Heldwein y Fenton 2002;
Quesniaux et al., 2004], que se unen a ligandos pro-inflamatorios como lipoproteínas,
peptidoglicanos complejos, lípidos y LAMs. Otros receptores participantes en este
proceso son: el receptor de la proteína surfactante A que facilita la entrada de M.
tuberculosis a los macrófagos [Gaynor et al., 1995], pneumocitos tipo II [Bermúdez y
Goodman, 1996] o neutrófilos [Ernst, 1998]; el receptor “scavenger” clase A , que se
unen a los sulfolípidos de la micobacteria [van Crevel et al., 2002], las lecitinas de
unión a manosa [Garred et al., 1997] y la dectina-1 [Yadav y Schorey, 2006].
Una vez que se ha unido la micobacteria con el fagocito, el colesterol de la
membrana del macrófago se acumula en el sitio de entrada de la bacteria, y se produce
una invaginación de la bacteria a través de la pared celular formando el fagosoma
[Gatfield y Pieters, 2000].
Las células tratan de controlar la infección y al mismo tiempo producen varias
citocinas como IL1β, IL-6, IL-10, TNFα e IL-12, para el reclutamiento y activación de
células del sistema inmunológico [Rivas-Santiago et al., 2005]. La activación de los
macrófagos infectados se manifiesta de distintas maneras. El fagosoma madura y se
fusiona con los lisosomas, que aportan potentes enzimas hidrolíticas. Estas enzimas
funcionan a pH ácidos (4,5-5,0), que se produce gracias la bomba de protones
dependiente de ATP, la H+-ATPasa vacuolar, que se encuentra en la membrana
[Mellman et al., 1986]. Los macrófagos activados también producen especies reactivas
de oxígeno (agua oxigenada, anión superóxido, etc.) y nitrógeno (óxido nítrico). Sin
Introducción y Objetivos
15
embargo, la habilidad de las especies reactivas de oxígeno para aniquilar a M.
tuberculosis solo ha sido demostrado en ratones [Flesch y Kaufmann, 1987; Raja,
2004]. El óxido nítrico es sintetizado por la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS2 o
NOS2), que utiliza como sustrato arginina. Aunque su importancia en la defensa del
huésped contra M. tuberculosis ha sido documentada tanto en estudios in vitro como in
vivo, en modelos de ratón, su papel en infecciones humanas es controvertido [Shiloh y
Nathan, 2000].
Se ha argumentado que la 1,25 dihidroxivitamina D3 induce la expresión de
iNOS2 e inhibición en la actividad de M. tuberculosis en la línea celular macrofágica
humana HL-60 [Rockett et al., 1998]. Hay estudios donde se han encontrado niveles de
expresión de ARMm de la NOS2 en macrófagos infectados con M. tuberculosis tratados
con IFNγ, no así en los no tratados, encontrándose una mayor cantidad de ARNm en
macrófagos co-cultivados con linfocitos y tratados con INFγ [Bonecini-Almeida et al.,
1998]. También se han encontrado altos niveles de expresión de NOS2 en macrófagos
obtenidos de lavados broncoalveolares de individuos con tuberculosis pulmonar
[Nicholson et al., 1996].
Células epiteliales
Inicialmente se pensó que el primer contacto lo establecía M. tuberculosis con
los macrófagos alveolares. Sin embargo, actualmente se sabe que las micobacterias
infectan a las células epiteliales alveolares, como una alternativa para evadir las
agresiones del medio y escapar de los macrófagos. Debido a que al inicio de la infección
hay relativamente pocos macrófagos alveolares para fagocitar a las micobacterias, son
las células epiteliales las que pueden ser invadidas. Se han realizado ensayos de
adherencia e invasión en la línea celular epitelial alveolar tipo II humana (A549) con
diferentes micobacterias (M. tuberculosis H37Rv y H37Ra y con M. avium) y se
observó que estás micobacterias pueden invadir y replicarse intracitoplasmáticamente
[Bermúdez y Goodman, 1996]. Las células epiteliales del tracto respiratorio también
poseen receptores de reconocimiento de patógenos, como las lectinas de unión a
manosa, TLR y CD14 [Netea et al., 2004; Hogg, 2004]. Se ha demostrado que estas
células secretan quimiocinas para el reclutamiento de neutrófilos, linfocitos y monocitos
al pulmón [Rivas-Santiago et al., 2005]. Asimismo, también producen péptidos
antimicrobianos como las defensinas (β-defensina-2) y las catelicidinas (LL-37). Este
tipo de péptidos pueden activar a las células dendríticas inmaduras, dando como
Introducción y Objetivos
16
resultado un aumento de moléculas co-estimuladoras [Biragyn et al., 2002; Davidson et
al., 2004].
Neutrófilos
Los neutrófilos son de las primeras células que se activan en la respuesta
inflamatoria [Sibille y Reynolds, 1990]. Aunque la tuberculosis se caracteriza por la
migración predominante de momocitos/macrófagos al sitio de infección, la respuesta
más temprana a la invasión del tejido por la micobacteria es una afluencia de neutrófilos
con menos monocitos/macrófagos [Kobayashi et al., 1985]. Por otro lado, los
neutrófilos tienen un papel importante en la protección contra la infección
micobacteriana [Appelberg et al., 1995] a través de la producción de quimiocinas
[Riedel y Kaufmann, 1997]. Además, han mostrado que producen varias citocinas como
IL-1, IL-6, IL-8, TNFα, receptor antagonista de IL-1 y MIP1α [Kasahara et al., 1998]
En estudios in vivo, se ha demostrado que los neutrófilos pueden aniquilar a la
cepa no virulenta de M. tuberculosis (H37Ra) [Majeed et al., 1998]. Los neutrófilos, en
su papel defensivo frente a las infecciones microbianas, pueden emplear sistemas
microbicida oxidativos o no oxidativos. En los gránulos de los neutrófilos se encuentran
las defensinas, que son las más abundantes entre una serie de proteínas y péptidos
antimicrobianos [Fu, 2003]. Se ha observado que las defensinas producidas por los
neutrófilos son activas contra micobacterias no tuberculosas [Ogata et al., 1992], M.
tuberculosis H37Ra, así como también en aislados clínicos de M. tuberculosis
[Miyakawa et al., 1996].
Existe una discrepancia con respecto a si los neutrófilos utilizan la vía oxidativa
o la no oxidativa frente a M. tuberculosis. Hay estudios que demuestran la activación de
la vía oxidativa en la infección de neutrófilos con este bacilo [May y Spagnuolo, 1987;
González-Cortés et al., 2009]; pero otros autores consideran que el mecanismo
antimicrobiano principal es no oxidativo, asociado a la producción de las defensinas
[Kisich et al., 2002]. Hay un estudio realizado por Jones y Amirault, donde se observa
en presencia de la superóxido dismutasa y la catalasa fallan en la disminución del
aniquilamiento de M. tuberculosis, por lo que estos investigadores consideran que el
mecanismo de acción de los neutrófilos es el no oxidativo [Jones y Amirault, 1990].
Además Martineau et al., han demostrado la importante participación de los neutrófilos
en la inmunidad innata frente a la tuberculosis, actividad que está asociada con la
Introducción y Objetivos
17
producción de sus péptidos antimicrobianos como LL-37 y la lipocalina-2 que limitan el
crecimiento de la bacteria [Martineau et al., 2007].
Células dendríticas
Las células dendríticas son una familia de células presentadoras de antígenos
derivadas tanto del tejido mieloide como linfoide [Robinson et al., 1999], con una
excelente capacidad de interactuar con las células T y modular su respuesta [Reis e
Sousa et al., 1999]. La interacción entre las células dendríticas presentes en las vías
aéreas y la micobacteria, se considera que es crítica para la respuesta inmune y para
determinar el resultado de la infección. Förstch et al., observaron que las células
dendríticas son huéspedes importantes para M. tuberculosis, ya que esta micobacteria se
puede multiplicar dentro de ellas [Förstch et al., 2000]. Sin embargo, estos hallazgos no
fueron corroborados por Tailleux et al., que llegó a la conclusión de que la
supervivencia intracelular de M. tuberculosis se redujo en estas células. [Tailleux (a) et
al., 2003].
Células NK
Las células NK representan aproximadamente el 10% del total de linfocitos en
sangre periférica [Cooper et al., 2001]; son consideradas como células efectoras de la
inmunidad innata, ya que reconocen y lisan células infectadas y son productoras de
citocinas como el IFNγ [Schierloh et al., 2007]. Se ha demostrado que M. bovis BCG
puede interactuar directamente con las células NK en ausencia de
monocitos/macrófagos y puede inducir la producción de IFNγ, y el aumento de su
actividad citotóxica [Esin et al., 2004].
Aunque primero se creía que tenían solamente actividad citotóxica contra células
tumorales y células infectadas por virus, ahora se conoce que son mediadores
importantes en la respuesta inmune innata frente a una variedad de microorganismos
patógenos incluyendo bacterias intracelulares [Lodoen y Lanier, 2006]. Se conoce que
las células NK producen granulisina, que asociada con la perforina pueden matar
micobacterias [Korbel et al., 2008].
Respuesta inmune adaptativa o específica
Las principales células de la respuesta inmune adaptativa son los linfocitos, que
se desarrollan a partir de progenitores linfoides inmaduros (pre-linfocitos) y se dividen
Introducción y Objetivos
18
en dos grandes grupos, linfocitos B y linfocitos T. Los linfocitos B están especializados
en la producción de anticuerpos. Los linfocitos T son responsables de las respuestas
inmune celular y de tipo retardada [LeBien y Tedder, 2008]. La respuesta de inmunidad
adaptativa es específica y su desarrollo depende en gran medida de la eficiencia de la
inmunidad innata, ya que si los macrófagos alveolares no son capaces de controlar la
infección se favorece una respuesta inmunitaria humoral (Th2), que no es protectora en
la tuberculosis y que se caracteriza por la producción de citocinas como IL-4, IL-5, IL-
6, IL-10, IL-13 y TGF-β, las cuales antagonizan la respuesta de inmunidad celular tipo
Th1, eficiente en infecciones causadas por microorganismos intracelulares y
caracterizada por la producción de citocinas como IFN-γ, IL-2, IL-12, IL-18 y TNF-α
[Rivas-Santiago et al., 2005]
La respuesta inmune celular a la tuberculosis involucra macrófagos, células T
CD4+, células CD8+ y células T γδ. Los macrófagos son críticos en el control de la
infección por M. tuberculosis porque ellos albergan la bacteria en un compartimiento
intracelular y presentan los antígenos de la micobacteria, vía MHC clase II, a las células
T CD4+ [Pai et al., 2003].
Respuesta inmune celular (linfocitos T –Th/Tc)
Los linfocitos T reconocen y responden solo a antígenos presentados por las
células presentadoras de antígeno. Dentro de las células T encontramos principalmente a
los linfocitos T “helper” (Th) o CD4+ y a los linfocitos T citotoxicos (Tc) o CD8+.
Células CD4+ o Th
M. tuberculosis reside principalmente en una vacuola de los macrófagos, que
evoluciona de fagosoma a fagolisosoma y donde en última instancia se produce la
degradación del patógeno. Los péptidos que se originan se unen a las moléculas MHC
clase II y son presentados a las células CD4+. Estas células son las más importantes en
la respuesta de protección contra la tuberculosis [Hartmann y Plum, 1999; Flynn y
Chan, 2001].
Las células T CD4+ pueden desarrollar al menos dos fenotipos que están
asociados con distintos perfiles de expresión de citocinas después de la estimulación
antigénica: a) Células Th-1 que son inducidas por la IL-12 y producen INFγ, TNFα e
IL-2; estas citocinas activan intracelularmente la capacidad microbicida de los
macrófagos e inician y mantienen la respuesta inflamatoria granulomatosa protectora. b)
Introducción y Objetivos
19
Células Th-2, son inducidas por la IL-4 y producen grandes cantidades de esta citocina
y de otras, incluyendo IL-5, IL- 10 e IL-13. Un subgrupo de células T CD4+, son las Th-
17 que son inducidas por el TGFβ y la IL-6, sostenida, al menos en parte por la IL-23, y
produce altas concentraciones de IL-17. Las células Th-17 al parecer pueden ser
importantes en la inmunidad protectiva o pueden estar más involucradas en la respuesta
patológica que ocurre durante la progresión de la tuberculosis así como en la respuesta
autoinmune [Hoft, 2008].
Células CD8+ o Tc
Las células CD8+ pueden reconocer y eliminar células diana infectadas con
patógenos intracelulares. Los antígenos peptídicos son presentados a ellas por las
moléculas MHC clase I y pueden reconocer células diana infectadas con M. tuberculosis
y destruirlas. Estas células citolíticas pueden reaccionar con antígenos proteicos y
lipídicos derivados de la micobacteria [Hoft, 2008]. Los linfocitos CD8+ son capaces de
producir IFNγ e IL-4 y así pueden desempeñar un papel en la regulación del equilibrio
de las células Th1 y Th2 en los pulmones de pacientes con tuberculosis [McDonough et
al., 1993].
Células T γγγγδδδδ
Las células T γδ producen citocinas después de una estimulación con antígenos.
Se concentran en la superficie epitelial y pueden ser un mecanismo de defensa temprano
en el inicio de una invasión con patógenos ambientales. En humanos y en macacos, pero
no en ratones, en la infección con M. tuberculosis se generan los subtipos γ9+δ2, que
esta asociada con una protección parcial a la tuberculosis. [Hoft, 2008].
Células CD1-restricted ααααββββ
Estas células pueden presentar moléculas lipídicas micobacterianas a las células
T γδ, estimulando tanto la respuesta específica de citocinas a la micobacteria como a la
actividad citolítica [Hoft, 2008].
Respuesta inmune humoral (linfocitos B)
El papel definitivo de los linfocitos B en la defensa del huésped frente a M.
tuberculosis aún no está muy esclarecido. Algunos autores han considerado poco
importante la participación de los linfocitos B y de los anticuerpos en la tuberculosis
[Turner et al., 2001]. Sin embargo, los linfocitos B están presentes en un gran número
Introducción y Objetivos
20
de granulomas tuberculosos de humanos y ratones [Bosio et al., 2000]. Recientemente,
se han identificado estructuras dominantes parecidas a los folículos en la periferia del
granuloma en pulmones con tuberculosis y se ha sugerido que las células B puede jugar
un papel importante en la inmunidad local [Ulrichs et al., 2004].
Granuloma tuberculoso
La formación del granuloma tuberculoso se inicia con la infección de los
macrófagos alveolares por M. tuberculosis, resultando en la producción de citocinas,
quimiocinas y la aparición una respuesta inflamatoria, con la afluencia de monocitos,
neutrófilos y células dendríticas. En este punto los bacilos son fagocitados por las
células dendríticas y transportados desde el pulmón hasta los nódulos linfáticos donde
se encuentran las células T naïves (Fig. 6). Posteriormente, las células T y B efectoras y
nuevos monocitos migran desde la sangre hacia el pulmón y a través del tejido
pulmonar se dirigen hacia el sitio de la infección. El lento crecimiento de la
micobacteria (tiempo de duplicación, aproximadamente 24 horas in vivo) previene que
se produzca una abrumadora infección micobacteriana antes de la respuesta
granulomatosa. Una vez que las células llegan al sitio donde están los macrófagos
infectados, forman una estructura para contener la infección, el granuloma. En el cual
las células T interactúan con los macrófagos infectados y son activadas para el control
de la infección. Debido a que esta activación no es muy exitosa las bacterias
permanecen dentro del granuloma. Sin embargo, en la mayoría de los casos, la bacteria
es controlada por un largo período [Scott-Algood et al., 2005].
Introducción y Objetivos
21
Fig. 6: Esquema de la formación del granuloma tuberculoso.
El granuloma esta formado por dos tipos de macrófagos, los activados, con
citoplasma más abundante (macrófagos epiteloides) y los no activados. Además,
también participan en este proceso formas multinucleadas de células gigantes de
Langerhans, células T (CD4+ y CD8+), células NK y células γδ y fibroblastos [Co et al.,
2004; Salgame, 2005]. En la formación y mantenimiento del granuloma, es importante
resaltar la importancia del TNFα como citocina clave de este mecanismo de defensa
[Co et al., 2004; Scott-Algood et al., 2005].
Los macrófagos, a través del granuloma, pueden contener a la micobacteria en
un período de latencia por décadas. Sin embargo, M. tuberculosis puede reactivarse
como resultado de un fallo en el sistema inmune, con la consecuente liberación de los
microorganismos del granuloma y la progresión de la enfermedad a clínicamente activa
[Skeiky y Sadoff, 2006].
Introducción y Objetivos
22
Evasión de la respuesta inmune
M. tuberculosis presenta diversas estrategias para evadir la respuesta inmune. La
pared celular de las micobacterias tiene mucha importancia en la resistencia a los
mecanismos de defensa del huésped, ya que su alto contenido lipídico dificulta la
degradación de la bacteria por las enzimas lisosomales; además, existen proteínas como
la superóxido dismutasa, catalasa, peroxidasa y el sistema thioredoxina que degradan
los radicales libres de oxígeno y de otras sustancias que podrían atravesar la pared de la
micobacteria [Andersen et al., 1991]. Otros componentes de la pared micobacteriana
son los glucolípidos fenólicos I y LAM que son potentes secuestradores de los radicales
de oxígeno [Chan et al., 1991]. Otro lípido, la trealosa 6,6´dimicolato, forma parte de la
cápsula de la micobacteria, y actúa sobre las mitocondrias inhibiendo la respiración y la
fosforilación oxidativa e inhibe la migración de los leucocitos [Daffé y Ettienne, 1999].
Los macrófagos infectados por M. tuberculosis disminuyen su capacidad para
presentar antígenos vía MCH clase II y la co-estimulación de las células Th. Estos
defectos al parecer están relacionados con la disminución de la expresión de moléculas
clase II por los macrófagos infectados [Hmama et al., 1998].
También hay estudios que refieren que las micobacterias virulentas son capaces de
inhibir la fusión de los fagosoma con los lisosomas, debido a la liberación de derivados
sulfatados a partir de la glicoproteína trehalosa 2-sulfato, que detiene la maduración del
lisosoma en el estadio de endosoma temprano [Keane et al., 1997]. Así mismo, la
proteína que contiene una capa de triptófano-aspartato (TACO), es la causante de la
incapacidad de los fagosomas, que contienen a las micobacterias, para fusionarse con
los lisosomas [Ferrari et al., 1999].
23
CITOCINAS
El reconocimiento de M. tuberculosis por células fagocíticas de la inmunidad
innata conduce a la activación celular y la producción rápida de citocinas pro y anti-
inflamatorias. Estas citocinas, incluyendo a las quimiocinas, reclutan células
inflamatorias a las áreas de infección, y coordinan las respuestas inflamatoria e inmune
adaptativa en contra de la micobacteria.
Las citocinas son mediadores de comunicación celular, de bajo peso molecular,
las cuales incluyen las interleucinas (IL), interferones (IFNs), factores de crecimiento,
factores estimulantes de colonias, y otros grupos. Estas moléculas son liberadas por una
variedad de células y por lo general actúan localmente en un tejido que afectan a las
células adyacentes de una forma paracrina. Las citocinas también pueden actuar dentro
de una célula (intracrina), afectan a la misma célula después de la liberación (autocrina),
o viajar a través de la circulación para actuar a distancia de forma endocrina. Las
citocinas llevan a cabo funciones importantes en la fisiología normal como en las
respuestas del huésped a la infección o de otras amenazas exógenas de la integridad del
organismo. Un principio importante que emerge es que la respuesta biológica en un
órgano o tejido refleja un equilibrio entre los niveles locales de citocinas pro-
inflamatorias y anti-inflamatorias. Por lo tanto, una enfermedad crónica puede ser
consecuencia de la producción excesiva de citocinas pro-inflamatorias o la producción
inadecuada de citocinas anti-inflamatorias. [Arend y Gabay, 2004]. La respuesta
inflamatoria a M. tuberculosis no solo es crucial para el control inicial de la infección
sino que también pueden contribuir en el control de la infección crónica y la patología
asociada [Flynn y Chan, 2001].
Citocinas pro-inflamatorias
Interferón gamma (IFNγ)
El IFN fue descrito por primera vez como un producto capaz de interferir con la
replicación viral de células infectadas con virus [Isaacs y Lindenmann, 1988]. En
humanos, los IFNs, han sido clasificados en tres tipos, sobre la base de la secuencia de
Introducción y Objetivos
24
sus genes, la localización cromosómica, y la especificidad de los receptores [Pestka et
al., 2004]. El tipo I, que incluye 13 formas del IFNα, y una forma para los IFNs β, ω, ε,
y κ. Estas moléculas señalizan a través de un receptor expresado de forma ubicua,
compuesto por dos cadenas: IFN-αR1 e IFN-αR2. El IFN tipo II sólo incluye el IFNγ,
que señaliza por vía de un receptor expresado de forma ubicua, compuesto por las
subunidades IFN-γR1 e IFN-γR2. Y el IFN tipo III, del cual se han identificado tres
miembros, IFN-λ1 (IL-29), IFN-λ2 (IL-28A) y el IFN-λ3 (IL-28B), actúa a través de un
receptor compuesto de dos cadenas: un IFN-λ específico IFN-λR1 expresado
selectivamente por ciertos tipos celulares y otro expresado ubicuamente, el IL-10Rβ, el
cual forma parte de los receptores de la IL-10, IL-22 e IL-26. En modelos
experimentales de infecciones en ratones in vivo, se ha observado que los IFN-α/β, son
esenciales para la inmunidad de la mayoría de los virus, mientras que el IFN-γ es
importante para la inmunidad a un número menor de virus, además de bacterias,
hongos, y parásitos. El papel preciso de IFN-λ no ha sido bien dilucidado [Zhang et al.,
2008].
El IFNγ es una citocina prototipo de la respuesta celular Th1, y es esencial para
un control efectivo de M. tuberculosis en el huésped. Es producida por las células T
tanto por CD4+ como las CD8+, y por las células NK. Estimula una respuesta
micobactericida en macrófagos de ratón caracterizada por la inducción de la NOS2
[Flynn y Chan, 2001]. El IFNγ puede aumentar la presentación de antígenos y el
reclutamiento de los linfocitos CD4+ y CD8+. Aunque la producción de IFNγ, que por si
sola no es suficiente para el control de la infección por M. tuberculosis, es requerida
para la respuesta protectora a éste patógeno. La producción del INFγ por los diferentes
tipos celulares, en la fase temprana de la respuesta inmune, tiene un papel significativo
en la activación, diferenciación y expansión de las células Th1 específicas de antígeno.
Estas células son la mayor fuente de INFγ durante la respuesta inmune adaptativa y es
necesaria para el control de la fase crónica de la infección. Por eso cualquier alteración a
nivel de la señalización del INFγ puede causar un desarrollo de la enfermedad. Se ha
observado que en personas con mutaciones en los genes que codifican la proteína INFγ
presentan infecciones graves a micobacterias, incluyendo las poco patógenas como las
no tuberculosas o M. bovis atenuado (BCG) y a la bacteria Salmonellae. Dichos
Introducción y Objetivos
25
defectos genéticos son principalmente a nivel de sus receptores (INF-γR) [Ottenhoff et
al., 2005].
Factor de necrosis tumoral alfa (TNFαααα)
El TNFα es la citocina típica proinflamatorias y es producida por monocitos,
macrófagos, células dendríticas y células T cuando se exponen a M. tuberculosis y a
productos micobacterianos. Desempeña un papel importante en la formación del
granuloma en tuberculosis y tiene propiedades inmuno-reguladoras. En estudios tanto in
vivo como in vitro en el modelo de ratón se ha observado que el TNFα sinergiza con
IFNγ e induce en los macrófagos activados a la producción de NO y RNI vía NOS2
usando como substrato L-arginina [Flynn y Chan, 2001].
El TNFα es importante en la contención de la infección por M. tuberculosis, en
la prevención de la diseminación, y afecta la migración celular. También tiene
influencia en la expresión de moléculas de adherencia, quimiocinas y receptores de
quimiocinas [Raja, 2004]. En pacientes con artritis reumatoide o con la enfermedad de
Crohn, que reciben tratamiento con anticuerpos monoclonales (anti-TNFα) se ha
advertido una asociación con la reactivación de la tuberculosis [Dinarello, 2003].
Interleucina-12 (IL-12)
La IL-12 es una citocina heterodimérica perteneciente a una familia de varias
citocinas que incluye la IL-23, IL-27 [Trinchieri, 2003], y la IL-35 [Collison y Vignali,
2008]. El heterodímero IL-12p70, de la IL-12, esta formado por dos subunidades, la p35
y p40, las cuales para que presenten actividad biológica requieren de la interacción con
el complejo IL-12R, compuesto por IL-12Rβ1 e IL-12Rβ2. En estudios con ratones con
ausencia de la subunidad IL-12p40 se ha detectado una disminución de la respuesta
inmune a las micobacterias, dando como resultado una disminución en la producción de
IFNγ, y aumento del crecimiento bacteriano y de la mortalidad [Khader et al., 2005]. Es
producida después de la fagocitosis de la micobacteria por los macrófagos y las células
dendríticas, e induce la diferenciación de las células T en células Th1 y la producción de
IFNγ [Flynn y Chan, 2001; van Crevel et al., 2002; Berrington y Hawn, 2007]. Algunos
receptores tipo toll (TLR2, TLR4) cuando se activan inducen la producción de IL-12 y
de TNFα [Verreck et al., 2004].
Introducción y Objetivos
26
Otras citocinas pro-inflamatorias
IL-1β. Esta citocina es producida principalmente en los monocitos, macrófagos
y células dendríticas. En pacientes con tuberculosis se ha encontrado en exceso la IL-1β
en los sitios de la infección. En estudios con ratones que presentan una deficiencia de la
IL-1β se ha visto una insuficiente formación del granuloma [van Crevel et al., 2002].
IL-18. Comparte muchas características con la IL-1, fue inicialmente descubierta
como un factor inductor de IFNγ y es sinérgica con la IL-12, por lo que tiene un papel
de protección en la infección de M. tuberculosis [van Crevel et al., 2002].
IL-6. Esta citocina se considera que tiene las propiedades pro y anti-
inflamatorias y es producida en las primeras fases de la infección micobacteriana. Tiene
múltiples funciones en la respuesta inmune, incluyendo la inducción de una respuesta
inflamatoria, favorece la hematopoyesis y la diferenciación de las células T. La IL-6
puede ser perjudicial en la infección, ya que inhibe la producción de TNFα e IL-1β [van
Crevel et al., 2002; Raja, 2004].
Citocinas anti-inflamatorias
La respuesta pro-inflamatoria, iniciada por M. tuberculosis es antagonizada por
mecanismos anti-inflamatorios. Receptores solubles de citocinas (como el receptor
soluble de TNFα I y II) evitan la unión de las citocinas a los receptores celulares,
bloqueando además la señalización. Además, 3 citocinas anti-inflamatorias, IL-10,
TGFβ e IL-4, pueden inhibir la producción o los efectos de las citocinas pro-
inflamatorias en la tuberculosis [van Crevel et al., 2002].
Interleucina-10 (IL-10). Es producida por macrófagos activados, las células
dendríticas, los linfocitos B y los subtipos de los linfocitos T. Posee propiedades de
desactivación de macrófagos, incluyendo la disminución de la producción de IL-12, que
a su vez disminuye la producción de IFNγ por los linfocitos T e inhibe directamente la
respuesta de los linfocitos T CD4+ [Flynn y Chan, 2001]. En pacientes enfermos de
tuberculosis, esta citocina se expresa en exceso en el sitio de la infección [van Crevel et
al., 2002].
Factor de crecimiento tumoral beta (TGFββββ). Los productos micobacterianos
inducen la producción de TGFβ en monocitos y en las células dendríticas. El TGFβ
suprime la inmunidad celular mediada por células T inhibiendo su proliferación y la
Introducción y Objetivos
27
producción de IFNγ. En los macrófagos antagoniza la presentación de antígenos y la
producción de citocinas pro-inflamatorias. El TGFβ de manera selectiva induce la
producción de IL-10, y ambas citocinas muestran sinergismo en la represión de la
producción de IFNγ [van Crevel et al., 2002].
Interleucina-4 (IL-4). Citocina característica de la respuesta Th2, producida por
una gran variedad de tipos celulares, como lo son las células T, eosinófilos, basofilos,
mastocitos, células NK y algunas células presentadoras de antígeno [Rook et al., 2004].
En estudios de pacientes con tuberculosis, la IL-4 induce una disminución de la
respuesta Th1 pero un aumento de la Th2 en sangre periférica [Flynn y Chan, 2001].
Quimiocinas
Las quimiocinas son una gran familia de pequeñas citocinas quimiotácticas
caracterizadas por la conservación de los residuos de cisteína [Schutyser et al., 2000].
Desempeñan un papel importante en las reacciones inmune e inflamatoria y en las
infecciones virales [Mantovani, 1999]. Más recientemente, su papel ha sido reconocido
en muchos procesos biológicos, tales como angiogénesis, angiostasis, hematopoyesis,
organogénesis, proliferación celular, polarización linfocítica, apoptosis, metástasis
tumoral [Esche et al., 2005] y sobre todo en la regulación del tráfico celular [Yang et
al., 2003]. En humanos, más de 40 quimiocinas han sido identificadas. Dependiendo de
la presencia o posicionamiento (adyacente o no) de los dos primeros residuos de
cisteína, se han clasificado en cuatro subfamilias: CXC (familia-α), CC (familia-β), C
(familia-γ), y CX3C (familia-δ) [Zlotnik y Yoshie, 2000].
M. tuberculosis es un gran inductor de la expresión de quimiocinas. Los estudios
que se han realizado se han centrado principalmente en el patrón de expresión de
quimiocinas inducibles tras la infección de macrófagos por M. tuberculosis in vitro. Se
ha observado que ésta micobacteria, induce la expresión de quimiocinas en las 2
primeras horas post-infección [Rhoades et al., 1995]. Los macrófagos humanos
producen las quimiocinas CCL2, CCL3, CCL4 y CCL5 en respuesta a cepas virulentas
de M. tuberculosis [Sadek et al., 1998]. Esta respuesta se ve disminuida cuando se usan
cepas no virulentas (H37Ra) para CCL3 pero no para CCL4 o CCL5 [Saukkonenn et
al., 2002]. Tejidos de nódulos linfáticos y monocitos CD14+ aislados de sangre de
pacientes con tuberculosis, expresan más CCL2, que los de los sujetos control [Lin et
al., 1998]. Los macrófagos alveolares producen significativamente más CCL2, CCL3 y
Introducción y Objetivos
28
CCL5 que los monocitos en sangre después de una infección con M. tuberculosis
[Sadek et al., 1998].
29
OTRAS MOLÉCULAS IMPLICADAS EN LA ACTIVIDAD
ANTIMICROBIANA
El sistema inmunológico es capaz de generar numerosos tipos de células y
moléculas capaces de reconocer y eliminar específicamente una variedad aparentemente
ilimitada de invasores extraños [Conus y Simon, 2008]. M. tuberculosis es una bacteria
que no solo activa la producción de citocinas y quimiocinas en macrófagos, sino que
también activa o inhibe genes que intervienen en la respuesta inmune del huésped.
Algunos de estos genes son los siguientes:
Defensinas
Son péptidos catiónicos, ricos en cisteína, con un peso molecular entre 3 y 5
KDa con actividad antimicrobiana. Constituyen un importante componente de la
inmunidad innata. Las defensinas se clasifican en las familia α y β, en función de la
homología de su secuencia y de la conservación de sus seis residuos de cisteína [Wu et
al., 2003]. Las defensinas α se encuentran en los gránulos de los neutrófilos [Fu, 2003],
y las defencinas β se encuentran en el epitelio de las superficies internas y externas del
cuerpo humano (piel, tracto respiratorio e intestinal) [Rivas-santiago et al., 2006- Salud
pública de Mx]. Las defensinas α son efectivas contra bacterias Gram positivas y Gram
negativas y las β principalmente contra las cepas Gram negativas [Harder, et al., 2001].
También se ha demostrado su actividad antimicrobiana frente a M. tuberculosis en
neutrófilos [Miyakawa et al., 1996,] y células epiteliales [Rivas-santiago, 2005]. Las
defencinas β además de tener actividad antimicrobiana también tienen un papel
quimiotactico sobre células dendríticas inmaduras (DEF1, 2, 3), células T de memoria
(DEF2), macrófagos (DEF3) y monocitos (DEF4) [King et al., 2003]. Aunque estas
proteínas son características de neutrófilos, algunos autores han observado la expresión
de las defensinas β 1 y 2 en monocitos humanos activados con IFNγ y LPS de E. coli
[Duits et al., 2002].
Introducción y Objetivos
30
Catepsinas (CTS)
Las catepsinas son enzimas proteolíticas lisosomales, e incluye a las serín-
proteasas (CTS A y G), aspártico-proteasas (CTS D y E) y cisteín-proteasas (CTS B, C,
F, H, K, L, O, S, V, X, W). Se sintetizan como proenzimas inactivas, glucosiladas post-
translationalmente y dirigidas hacia los lisosomas por medio de receptores de manosa-6-
fosfato [Chwieralski et al., 2006]. La mayoría de las CTS son endopeptidasas, con la
excepción de las CTS C y X [Vasiljeva y Turk, 2008]. En leucocitos polimorfonucleares
se han encontrado proteasas lisosomales con actividad antimicrobiana como lo son las
CTS D y B (activas a pH ácido) y la CTS G (activas al pH neutro y alcalino) [Thorne et
al., 1976]. Hay estudios en conejos infectados con BCG, donde se ha visto una mayor
cantidad de la CTSD en los macrófagos alveolares que se acumularon alrededor de las
lesiones ocasionadas [Rojas-Espinosa et al., 1974]. Mediante análisis de PCR de
transcriptasa reversa, se ha demostrado que en infecciones de células humanas
monocíticas TPH-1 infectadas con M. tuberculosis, o expuestos a LPS inducen la
expresión de los genes CATB y CATD, pero no así de la CATG [Rivera-Marrero et al.,
2004].
Bomba de protones dependiente de ATP
La bomba de protones dependiente de ATP (H+-ATPasas vacuolares) es un
complejo de subunidades que se encuentran en todas las células eucarióticas y consiste
de un dominio V1, el cual contiene la actividad de ATPasa, y un dominio V0, que
contiene un canal de protones transmembrana. Es expresada ubicuamente en varios
compartimientos intracelulares (retículo endoplasmático, aparato de Golgi, lisosomas y
endosomas) y es responsable de su acidificación [Lee (a) et al., 2004].
En ciertos tipos celulares también interviene en el transporte de protones a través
de la membrana plasmática. La V-ATPasa intracelular tiene funciones tanto en la
membrana endocítica como en las membranas intracelulares de tráfico, en la
transformación y degradación de macromoléculas, y se acopla al transporte de pequeñas
moléculas como el ATP y neurotransmisores. También interviene en la entrada de
agentes patógenos como virus y toxinas bacterianas. Las V-ATPasas están presentes en
la membrana plasmática de los macrófagos y son importantes la homeostasis del pH. Se
compone de un dominio periférico (V1) que lleva a cabo la hidrólisis del ATP y un
dominio integral (V0) responsable del transporte de protones. El dominio V1 contiene 8
Introducción y Objetivos
31
subunidades (A-H), mientras que el V0 contiene 6 subunidades (a,c,c´,c´´,d y e)
[Cipriano et al., 2008].
En el macrófago, la función fagolisosomal en la infección por M. tuberculosis se
puede encontrar afectada. Dentro del lisosoma existen potentes enzimas hidrolíticas
capaces de degradar una amplia gama de macromoléculas, incluyendo
microorganismos. Estas enzimas actúan óptimamente en un pH ácido (4,5-5,0)
mantenido por la H+-ATPasas vacuolares. El bacilo tuberculoso, tiene la capacidad de
producir cantidades importantes de amoníaco, lo que puede limitar la toxicidad del
ambiente intravacuolar de los lisosomas [Araujo et al., 2008].
NADPH oxidasa
La nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) oxidasa, son un grupo
de complejos enzimáticos que se encuentran en una variedad de células. La más
estudiada de ellas es la NADPH oxidasa de leucocitos, que se encuentra en fagocitos y
linfocitos B. La NADPH oxidasa cataliza la producción de superóxido (O2-) por la
reducción de un electrón de oxígeno, utilizando NADPH como donante de electrones.
El O2- generado por esta enzima sirve como materia prima para la producción de un
amplio surtido de moléculas oxidantes [Babior, 1999].
El complejo principal consta de cinco componentes PHOX {por PHagocyte
(fagocito) OXidase (oxidasa)}: p40phox, p47phox, p67phox, p22phox y gp91phox [Babior,
1999], y de dos proteínas G pequeñas: Rac1 y Rac2 [Vignais, 2002]. En las células en
reposo, tres de los cinco componentes (p40phox, p47phox y p67phox) se encuentran
acomplejados en el citosol. Los otros dos componentes (p22phox y gp91phox) se
encuentran en las membranas de las vesículas secretoras y en gránulos específicos,
donde constituyen la flavo-hemoproteína heterodimérica conocido como citocromo b558.
La separación de estos dos grupos de componentes entre los distintos compartimentos
subcelulares garantiza que la oxidasa es inactiva en las células en reposo. Cuando la
célula se activa, el componente citosólico p47phox se fosforila [Babior, 1999], los
factores de intercambio de nucleótidos de guanina convierten Rac-GDP en Rac-GTP
[Kawahara y Lambeth, 2007] y todo el complejo citosólico emigra a la membrana,
donde se asocia con el citocromo b558 para ensamblar la oxidasa activa. Los fagocitos
generan especies reactivas de oxígeno (ROS) como el superóxido y H2O2 en los
fagosomas que ayudan a contener a los microorganismos invasores. Se ha comprobado
Introducción y Objetivos
32
que la producción de ROS mediada por M. tuberculosis depende en gran medida por
NOX2 (gp91 phox) y TLR2 [Yang et al., 2009].
Óxido nítrico (NO)
La producción de NO y otros metabolitos reactivos del nitrógeno desempeñan un
papel importante en la inmunidad innata [Chan et al., 1992]. El NO es un radical libre
difusible, capaz de reaccionar con el oxígeno y los intermediarios reactivos del oxígeno
en solución y formar una amplia variedad de productos como el dióxido de nitrógeno
(NO2), nitrito (NO2-), nitrato (NO3-), trióxido de nitrógeno (N2O3), y con el superóxido
produce el anión peroxinitrito (ONOO-) [MacMicking et al., 1997; Miller et al., 2004].
La iNOS es la principal enzima generadora de RNI en las células del sistema inmune
[Lowenstein y Padalko, 2004]. La elevada producción de NO por los macrófagos
activados es un mecanismo antimicrobiano potente. Estos fagocitos, bajo la activación
por agentes apropiados tales como el IFNγ y TNFα, generan NO e intermediarios
reactivos de nitrógeno vía NOS2 usando L-arginina como sustrato. La actividad de estos
óxidos de nitrógeno tóxicos en la defensa del huésped ha sido bien documentada, tanto
in vitro como in vivo, particularmente en modelos de ratón. En el ratón, los RNI juegan
un papel protector en la infección tuberculosa aguda y crónica persistente. En
individuos con TB pulmonar activa se ha detectado un elevado nivel de expresión de
NOS2 en macrófagos obtenidos por lavado pulmonar alveolar. Además, se ha
observado que el nivel de NO exhalado aumenta en los pacientes con tuberculosis. El
papel del oxígeno tóxico en el control de la infección micobacteriana permanece en
controversia ya que no se ha confirmado su habilidad para matar a M. tuberculosis.
Además, las micobacterias son capaces de evadir su efecto tóxico de diferentes maneras.
Por ejemplo los componentes micobacterianos LAM y el fenolicoglicolípido-I (PGL-I)
son potentes destructores de los radicales de oxígeno. Asimismo, los sulfátidos
micobacterianos interfieren con el mecanismo antimicrobiano dependiente de radicales
de oxígeno del macrófago [Araujo et al., 2008].
Slc11a1
Slc11a1, también conocido como NRAMP1 es uno de los pocos genes de
resistencia en ratón que se ha identificado a nivel molecular. Es una proteína de
membrana que es expresada en el compartimiento lisosomal de los macrófagos. Es parte
de un gran familia de genes conservados de transportadores de cationes bivalentes tanto
Introducción y Objetivos
33
en humanos como en bacterias [Gruenheid y Gros, 2000]. En estudios en ratones se ha
demostrado que la proteína esta localizada en el endosoma tardío y en los componentes
lisosomales [Atkinson et al., 1997; Gruenheid et al., 1997; Searle et al., 1998], pero no
en el endosoma temprano [Gruenheid et al., 1997]. Empleando ratones y líneas
macrofágicas transfectadas se ha observado que este gen desempeña un papel
importante en la ruta de activación de los macrófagos. Tiene muchos efectos
pleiotrópicos sobre la función del macrófago incluyendo la regulación de quimiocinas
CXC, IL-1β, iNOS, moléculas del MHC clase II, TNFα, así como sobre la actividad
antimicrobiana [Blackwell et al., 2000].
La función principal de la proteína Slc11a1 es la de transportar hierro a través de
la membrana [Liu et al., 1995]. Sin embargo, hay controversia sobre su función
biológica. Una escuela propone que su función es aumentar el Fe2+ intrafagosomal a fin
de proporcionar el catalizador para la reacción Haber-Weiss/Fenton que generan
radicales hidroxilo, altamente tóxicos. La segunda escuela propone que su función es
privar a la bacteria intrafagosomal de la disponibilidad de Fe2+ y otros cationes
bivalentes (Zn2+, Mn2
+, de la superóxido dismutasa) que son críticos para la bacteria
[Wyllie et al., 2002].
Receptores de citocinas
INFGR1 e IFNGR2
En años recientes, se han observado pacientes con trastornos de la producción de
IFNγ (errores innatos que afectan a la producción o la respuesta del IFNγ), causados por
mutaciones específicas en ciertos genes [Zhang et al., 2008]. Este trastorno es conocido
como susceptibilidad mendeliana a enfermedades micobacterianas, el cual es un raro
síndrome congénito que se define como una enfermedad clínica grave que confiere una
predisposición a infecciones causadas por especies de micobacterias poco virulentas,
como las de la vacuna BCG y MNT. En este síndrome se han identificado algunas
mutaciones del IFNGR1 y del IFNGR2 [Filipe-Santos et al., 2006 TNFRF1A
El TNFα ejerce sus efectos pro-inflamatorios a través de 2 receptores,
TNFRSF1A (TNFRI p55) y TNFRSF1B (TNFRII p75). El TNFRSF1A se encuentra
ampliamente distribuido y parece ser el principal receptor de inducción de la
Introducción y Objetivos
34
señalización del TNFα soluble [Siebert et al., 2005]. Se ha visto en ratones que
presentan una alteración en el gen que codifica el TNFRSF1A, y que fueron infectados
con M. tuberculosis fueron incapaces de controlar la infección y fallecieron rápidamente
en comparación con una cepa control [Flynn et al., 1995].
Introducción y Objetivos
35
OBJETIVOS:
1. Estandarizar un protocolo de infección de monocitos humanos con
micobacterias.
2. Cuantificar citocinas proinflamatorias e inhibitorias, en sobrenadantes de
monocitos y neutrófilos infectados.
3. Determinar el efecto de la actividad antimicobacteriana de los monocitos
y neutrófilos activados con IFNγ y TNFα.
4. Estudiar las diferencias de la expresión génica en monocitos humanos
infectados con M. tuberculosis y L. pneumophila.
MATERIAL Y MÉTODOS
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BACTERIAS
Cepas bacterianas
Las cepas utilizadas para la realización de este trabajo se encuentran
puntualizadas en la tabla 2.
Las micobacterias son aislados clínicos procedentes del Hospital de León y del
Hospital del Bierzo. Mycobacterium gordonae atenuada (HL184Gat) es una cepa
obtenida en la Unidad de Investigación del Hospital de León. La atenuación se observó
tras las resiembras realizadas durante más de un año para su conservación. La cepa
atenuada de M. gordonae proviene de la cepa original rugosa (HL184G) y tiene la
característica de ser lisa, menos pigmentada y más fácil de dispersar en medio líquido.
Tabla 2: Bacterias utilizadas
Cepa bacteriana Identificación
Mycobacterium tuberculosis HL186T1
Mycobacterium tuberculosis 453442
Mycobacterium kansasii HL228K1
Mycobacterium avium HL70A1
Mycobacterium gordonae HL184G1
Mycobacterium gordonae atenuada HL184Gat3
Legionella pneumophila SG1 tipo Philadelphia4 1 Aislado clínico Hospital de León, cedidas por Julio Blanco y Manuela Caño 2 Aislado clínico del Hospital del Bierzo, proporcionada por Ramiro López 3 Unidad de Investigación, Hospital de León, 4 ATCC no 13151, cedida por Carmen Peláz
Material y Métodos
37
Manipulación y cultivo de bacterias
Condiciones de cultivo
Las manipulaciones con las bacterias se realizaron en cuarto con sistema de
extracción de aire y filtros de seguridad en las salidas del extractor; y en campana de
seguridad biológica de flujo laminar vertical BHA 48 FASTER (Cultek, S.L.U.).
Las micobacterias se cultivaron en los siguientes medios:
• Medio líquido 7H9 con 0,2% glicerol y enriquecido con 10% (v/v) de
suplemento Middlebrook ADC (albúmina dextrosa catalasa, Becton
Dickinson Microbiology Systems).
• Medio sólido 7H11 con 0,2% glicerol y con 10% (v/v) de suplemento
Middlebrook OADC (ácido oleico albúmina dextrosa catalasa, Becton
Dickinson Microbiology Systems).
L. pneumophila se cultivó en agar base con carbón activado y extracto de
levadura (BCYE, “Buffered Charcoal Yeast Extract”, CONDA), suplementado con: 1%
N-2-Acetamido-2-Aminoetano Ácido Sulfónico, 0,025% pirofosfato férrico, 0,04%
clorhidrato de L-cisteína, 0,1% alfa-cetoglutarato e hidróxido potásico, pH 6,9. Este
suplemento fue preparado fresco y esterilizado por filtración con membranas de 0,22
µm (Millipore).
Todas las bacterias se incubaron a 37º C en un incubador de CO2 con 95% de
aire/5% de CO2.
Individualización de bacterias
Las micobacterias son muy hidrofóbicas, y muestran una fuerte tendencia a
crecer en grandes agrupaciones. Fue preciso por tanto individualizar las bacterias (u
obtener pequeños grumos de no más de tres bacterias), para aumentar la
reproducibilidad de los ensayos y facilitar su cuantificación y manipulación.
Cada muestra del cultivo fresco en agar 7H11, de las micobacterias se
resuspendió en medio X-VIVO-15 sin antibióticos (Cambrex Bio Science). Se sonicó
con un disruptor celular ultrasónico digital S-450 (Branson, Danbury), con pulsaciones
de 3 segundos a una amplitud del 10% (2W), y se centrifugó a 100 × g durante 1 minuto
a temperatura ambiente. Después de recuperar los sobrenadantes, se repitió la
Material y Métodos
38
sonicación y centrifugación tantas veces como fue necesario para obtener bacterias
individualizadas, generalmente de tres a cuatro rondas. La viabilidad de las bacterias se
determinó por microscopía después de teñirlas con el kit LIVE/DEAD Baclight
bacterial (Molecular Probes, Invitrogen).
En el caso de L. pneumophila, no fue necesario el procedimiento de la
sonicación, solamente se tomó una muestra del cultivo fresco de la placa de agar y se
resuspendió en DPBS (2.0 g/l KCl, 2.0 g/l KH2PO4, NaCl, 21.6 g/l Na2PO4 · 7H2O, pH
de 7,4) sin calcio ni magnesio.
Para la conservación y almacenamiento de las bacterias individualizadas, se
guardaron en congelación a –80º C con glicerol al 25% en medio de cultivo RPMI sin
suero.
Cuantificación de bacterias
Para estimar la concentración de las micobacterias se realizaron una serie de
diluciones decimales y se sembraron en placas de 96 pocillos en medio líquido 7H9
suplementado. Las siembras se hicieron por triplicado y se incubaron a 37º C durante
6-10 días. Las micobacterias crecen en líquido como microcolonias debido a su
hidrofobicidad [Fazal et al., 1992]. Las UFC fueron determinadas mediante
visualización en un microscopio de inversión.
En el caso de L. pneumophila, las bacterias se resuspendieron en DPBS sin
calcio ni magnesio y las diluciones se sembraron en placas Petri de 60 mm de diámetro
con BCYE suplementado. Las siembras se realizaron por triplicado y fueron incubadas
a 37º C. A los 4 días se determinaron las UFC por recuento directo.
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CÉLULAS HUMANAS
Manipulación y cultivo de las células
Las manipulaciones de los cultivos celulares se efectuaron guardando
condiciones de esterilidad y trabajando en campana de seguridad biológica de flujo
laminar vertical. Los cultivos celulares se realizaron en placas de 6, 24 o 96 pocillos de
fondo plano (según las necesidades del ensayo), con tapa de baja evaporación (Falcon/
Becton Dickinson). Se incubaron a 37º C en un incubador de CO2 con 95% de aire y 5%
de CO2.
Líneas celulares
Se han mantenido en cultivo dos líneas celulares:
• A549: línea de células pulmonares alveolares tipo II humanas,
proporcionadas por Antonio Fernández Medarde. Se ha demostrado que
las micobacterias son capaces de infectar estas células, por lo que
constituyen un buen modelo de estudio [Bermudez y Goodman, 1996].
• HL60: línea promielocítica humana, cedida por José Ignacio Rodríguez
Barbosa. Estas células se pueden diferenciar a macrófagos y
consecuentemente infectar con micobacterias.
Ambas líneas se cultivaron en placas de 6 pocillos con medio RPMI 1640 con
tampón HEPES 25 mM suplementado con 10% (v/v) de suero fetal bovino, 2mM
glutamina, 250 µg/ml de anfotericina B y 100 U/ml de penicilina G potásica.
Células sanguíneas humanas
Las células sanguíneas se obtuvieron a partir de sangre de voluntarios jóvenes y
sanos. Todos los donantes firmaron voluntariamente un documento de consentimiento
informado, accediendo a donar sangre con fines de investigación, cuya redacción fue
aprobada por la Comisión Ética de Investigación Clínica del Hospital de León. Las
Material y Métodos
40
muestras fueron tomadas en el servicio de extracciones del Hospital de León, por
personal capacitado en tubo con anticuagulante (EDTA).
Reactivos para la purificación de monocitos y neutrófilos
• Solución tampón DPBS con BSA: Reactivo utilizado en la purificación
de los monocitos (recomendación del proveedor del kit de purificación).
Constituido por 0,5% albúmina sérica bovina y 2,0 mM EDTA en DPBS
sin calcio ni magnesio.
• ACD: Usado en la purificación de neutrófilos como anticoagulante.
Preparado con ácido cítrico 65 mM, citrato sódico 85 mM y dextrosa al
2%, disueltos en agua destilada y esterilizado por filtración (Steritop,
Millipore)
• Solución dextrano: Usado para sedimentar neutrófilos. El dextran-500
se preparó al 6%, disuelto en solución salina 0,9%. Se esterilizó por
filtración (Steritop, Millipore).
• Solución de KCl: Este reactivo fue usado para restablecer la fuerza
iónica de las células y evitar la lisis. Se preparó KCl 0,6 M, y se
esterilizó en autoclave a 121º C de presión durante 20 minutos.
Purificación y cultivo de monocitos
La sangre fue mezclada con DPBS sin calcio ni magnesio en volúmenes iguales
y se añadió sobre un lecho de Ficoll-Paque Plus (General Electric Healthcare Life
Sciences) con una densidad de 1,077 g/ml. Se centrifugó a 300 × g durante 30 minutos
a 20º C para separar las células mononucleares del resto de los componentes de la
sangre (Fig. 7). Se recuperó la capa de células mononucleares, en la interfase, por
encima del Ficoll [Böyum, 1968, modificado], y se purificaron las células CD14+
(monocitos) por separación magnética celular en columna (Myltenyi Biotec). Se
realizaron tres lavados con solución tampón DPBS con BSA, para eliminar las células
CD14- y se eluyeron las células CD14+ en un medio de cultivo adecuado en función del
uso requerido para los monocitos, ya sea el medio X-VIVO-15 o en medio de
macrófagos libre de suero (M-SFM).
Para la purificación de los monocitos también se usó el protocolo del kit
EasySep (StemCell Technologies), con el cual se obtuvo un mayor rendimiento de
Material y Métodos
41
células. En éste kit se utilizaron las células mononucleares obtenidas en gradiente de
Ficoll, y se incubaron en un tubo de plástico de 11 × 70 mm con bolitas magnéticas
recubiertas de anti-CD14. En presencia de un imán se retuvieron las células CD14+ y se
eliminaron las restantes por decantación, se lavó con la solución tampón DPBS con
BSA. La células purificadas se resuspendieron en el medio de cultivo apropiado. Los
monocitos se mantuvieron en incubación a 37º C.
El recuento celular se realizó en una cámara de Neubauer, en un microscopio de
contraste de fases. La pureza de los monocitos fue determinada por citometría de flujo,
usando anticuerpos anti-CD45 (panleucocitario) y anti-CD14 (que reconocen
monocitos). Con el kit de Miltenyi se obtuvo una pureza > 94% y con el kit EasySep, >
95%.
Fig. 7: Purificación de monocitos: separación de la capa de células mononucleares (monocitos y linfocitos) del resto de los componentes sanguíneos.
Purificación y cultivo de neutrófilos
Para la purificación de neutrófilos se siguió la técnica de Böyum con
modificaciones [Böyum, 1968]. Por cada 4,5 ml de sangre anticoagulada se agregó 1 ml
de ACD y 2.5 ml de dextrano, se mezcló por inversión 20 veces para posteriormente
dejar en reposo a temperatura ambiente de 45 a 60 minutos, con la finalidad de separar
los eritrocitos, que van al fondo del tubo, del resto de las células sanguíneas. Tras
recuperar el sobrenadante, se realizó una lisis hipotónica del resto de eritrocitos, que no
habían sido decantados, con 3 ml de agua destilada fría, dejándolo en reposo no más de
20 segundoss. Se agregó 1 ml de KCl 0,6 M, para el restablecimiento la fuerza iónica.
Material y Métodos
42
Se centrifugó a 300 × g durante 5 minutos a 20º C, y se desechó el sobrenadante. Se
repitió este paso tantas veces como fue necesario para eliminar los eritrocitos,
generalmente 2-3 veces. Se recuperaron los neutrófilos y las células mononuclerares y
fueron resuspendidas en 3 ml de DPBS. Se depositaron en un tubo con Ficoll-Paque
Plus, para separar los neutrófilos mediante gradiente de sedimentación, centrifugándolos
a 400 × g durante 30 minutos a una temperatura de 20º C. Después se retiró el
sobrenadante, y los neutrófilos fueron recuperados del fondo del tubo y resuspendidos
en medio X-VIVO-15 o en medio M-SFM, según las necesidades del ensayo.
Los neutrófilos se mantuvieron en incubación a 37º C. El recuento también se
realizó en una cámara de Neubauer, en un microscopio de contraste de fases. La pureza
fue determinada por citometría de flujo, usando anticuerpos anti-CD66b, que reconocen
neutrófilos. > 95% de células fueron CD66b+.
43
INFECCIONES
Reactivos específicos
• TPA: Utilizado para diferenciar células HL60 a células de tipo
macrofágico.
• Vit-D3: Utilizada para diferenciar células HL60 a células de tipo
macrofágico.
• Citocinas: Usadas para activar los monocitos. Interferón gamma (IFNγ,
>2 ×107 unidades/mg), 25 y 100 ng/ml; factor de necrosis tumoral alfa
(TNFα, >2 × 107 unidades/mg), 25 ng/ml, ambas de Peprotech.
Preparados en el medio de cultivo X-VIVO-15 o en medio M-SFM,
según las necesidades del ensayo.
Infección de líneas celulares
Las infecciones de las células HL60 y A549 se realizaron en placas de cultivo
celular de 96 pocillos, infectando 105 células HL60 y 2 × 104 células A549 (de mayor
tamaño) con 103 de bacterias, lo cual representa un MOI de 0,01 y 0,05
respectivamente. Se cultivan en medio RPMI 1640 con suero, en un volumen final del
cultivo de 100 µl, y se incubaron a 37º C por cuatro días. Cuando fue necesario se
agregó TPA a una concentración de 50 nM [modificado de Gallagher et al., 1979] o Vit-
D3 a una concentración de 0,1 µM [modificado de McCarthy et al., 1983]. La lisis
celular y el recuento de las bacterias se realizaron de la misma manera que en el caso de
las infecciones de los monocitos.
Infección de monocitos y neutrófilos
En placas de cultivo celular de 96 pocillos se infectaron 105 de las células
sanguíneas con 103 bacterias, siendo los MOI de 0,1. Se cultivaron en medio X-VIVO-
15 sin antibióticos o medio M-SFM en un volumen final de 100 µl. Para L.
pneumophila se requirió una opsonización, con 10% de suero autólogo.
Material y Métodos
44
Para los experimentos de inhibición aplicamos 2 µg de los anticuerpos de ratón
IgG1, anti-TNFα y anti-IL-β1 o de rata IgG1, anti-IL-6 (eBioscience), en el medio de
cultivo X VIVO 15, con los correspondientes controles isotípicos.
Las infecciones de monocitos se incubaron durante cuatro días y las de
neutrófilos durante 1 día a 37º C.
Después del periodo de incubación, se lisaron las células por medio de
sonicación con micropunta (Branson) con una amplitud del 10% (2 W) durante 3
segundos para liberar las bacterias. En estas condiciones de ruptura celular, sólo se
lisaron las células pero no se vio afectada la viabilidad de las bacterias. Para el recuento
del crecimiento intracelular de las micobacterias, se realizaron diluciones decimales, en
medio 7H9 y se inocularon 100 µl en placas de 96 pocillos por triplicado [Fazal et al.,
1992]. En el caso de L. pneumophila, se resuspendieron en DPBS sin calcio ni magnesio
y se sembraron 100 µl en placas de agar BCYE. Las micobacterias se incubaron durante
6-10 días y L. pneumophila 4 días, ambos casos a 37º C.
Cuantificación de bacterias intracelulares y extracelulares
Para determinar la cantidad de bacterias intracelulares y extracelulares se hizo
una infección con MOI = 0,1. Se infectaron 105 células (monocitos o neutrófilos) con
103M. tuberculosis, y se incubaron durante 3 y 24 horas a 37º C. Después de cada
tiempo de incubación, se recolectó el sobrenadante del cultivo celular y se lavó el
cultivo (sin desprender las células) con 50 µl de DPBS y se volvió a recolectar junto con
el sobrenadante. Se agregaron 100 µl de medio X-VIVO-15 al cultivo y se lisó (como
en protocolos anteriores). Tanto al sobrenadante como a las células lisadas se les
realizaron diluciones decimales y se sembraron en medio sólido (7H11) por duplicado.
Las bacterias fueron incubadas a 37º C durante10 días. El recuento de las micobacterias
se realizo por recuento directo.
Material y Métodos
45
Comprobación de la fagocitosis de micobacterias (tinción
Kinyoun-Giemsa)
Reactivos específicos de la tinción de Kinyoun-Giemsa
• Solución Etanol-HCl: Solución utilizada para decolorar la tinción de
Kinyoun. Preparada en etanol al 70% en agua destilada con 0,5 ml de
HCl en un volumen final de 50 ml.
• Colorante Giemsa: Utilizado como 2º colorante. Se preparó la solución
Giemsa al 10% en agua destilada.
• Solución A: Solución decolorante utilizada para lavar las muestras
teñidas con la tinción de Giemsa. Se prepararon 50 ml de etanol absoluto
+ 2 gotas de ácido acético glacial.
• Etanol: Utilizado como decolorante de la tinción de Giemsa. Se utilizó
etanol absoluto y al 96% en agua destilada.
Tinción Kinyoun-Giemsa
En algunos casos fue necesario teñir las células infectadas, para comprobar si
las micobacterias eran debidamente fagocitadas. Aprovechando que las paredes
celulares lípidicas de las micobacterias poseen la característica de tener afinidad y
fijación del colorante carbofuccina (tinción de Kinyoun), la micobacterias se tiñen de
color rosa. Como coloración diferencial se empleó la tinción Giemsa. Esta técnica esta
formada por varios colorantes, los tintes neutros utilizados combinan el azul de metileno
como tinte básico y la eosina como tinte ácido, que da una amplia gama de colores. El
citoplasma se tiñe de rosa y los núcleos de azul.
Para la realización de la tinción se infectaron monocitos o neutrófilos (8,1 × 105)
con la misma cantidad de bacterias (M. gordonae y M. gordonae atenuada), MOI = 1,0,
en 100 µl de medio de cultivo el cual fue depositado sobre un cubreobjetos circular de
12 mm de diámetro, en placa de cultivo celular de 24 pocillos. Después de 3 horas de
incubación se agregaron hasta 400 µl del medio de cultivo y se incubaron a 37º C, en el
caso de los monocitos, durante 4 días, y para los neutrófilos por 1 día. Después de la
incubación, se retiró el medio de cultivo y se fijaron con metanol durante 30 min. a
Material y Métodos
46
temperatura ambiente. Posteriormente se agregó el colorante Kinyoun, colocando las
muestras a 60º C durante 1 hora, se lavo con agua del grifo hasta que no saliera color y
se procedió a decolorar con solución de etanol-HCl procedimiento realizado en 2
ocasiones. Después se lavó con agua del grifo y se añadió el colorante Giemsa
dejándolas en reposo durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente se les
realizó una seria de lavados con la solución A, etanol al 96 %, etanol 100 % y Xilol (en
4-2-2-2 ocasiones respectivamente). Finalmente se aplicó una gota de líquido de montar
(Pertex) a un portaobjetos y se puso encima el cubreobjetos ya teñido. Las
micobacterias intracelulares fueron visualizadas por microscopía a 1.000 aumentos.
Infecciones para cuantificación de citocinas
Las infecciones para cuantificar las citocinas pro-inflamatorias (IL-1β, IL-6, IL-
8, IL-12 y TNFα) y citocinas inhibitorias de la respuesta inmune (IL-4, IL-10 y TGF-
β1), en sobrenadantes de cultivo se realizaron utilizando el mismo esquema de
tratamiento ya mencionado para monocitos y neutrófilos. Las infecciones fueron por
triplicado, en medio X-VIVO-15, en un volumen final de 100 µl. Se recuperó el
sobrenadante de los tres cultivos, en el caso de los monocitos a los cuatro días pos-
infección y al día siguiente de la infección en el caso de los neutrófilos.
En ambos casos, para eliminar las bacterias del sobrenadante se centrífugo la
muestra a 8000 × g durante 3 minutos a temperatura ambiente en filtros ultrafree-MC
(Millipore), con un tamaño de poro de 0,45 µm. Los sobrenadantes se mantuvieron a
–80º C hasta el momento de realizar su cuantificación.
Infecciones para obtención de ADNc
Para la obtención de ADNc, a partir de ARN total de monocitos, se incubaron
durante 4 horas a 37º C, después se infectaron 5 × 105 células con 5 × 105 bacterias
(MOI = 1), y se cultivaron en placas de cultivo celular de 24 pocillos, en un volumen
final de 400 µl de medio X-VIVO-15 o medio M-SFM e incubados a 37º C durante una
noche.
Análisis estadístico
En el análisis estadístico de la actividad antimicrobiana de los monocitos y
neutrófilos, frente a diversas bacterias, se determinó que la transformación logarítmica
Material y Métodos
47
de la variable UFC seguía una distribución normal. Cuando se compararon dos
muestras, el logaritmo de UFC se analizó usando la prueba t de Student. Cuando más
de dos grupos fueron comparados, se determino un análisis de la varianza de una vía y
realizaron las comparaciones múltiples con la prueba de Tukey´s. Cuando las varianzas
fueron desiguales, se aplicó la prueba Tamhane. En todos los casos, Se consideró
significativamente estadístico un nivel de probabilidad de p <0,05. Los análisis
estadísticos se realizaron con el paquete estadístico SPSS v. 14.0.
48
CUANTIFICACIÓN DE CITOCINAS
Método ELISA
El método ELISA empleado consta de un anticuerpo de captura inmovilizado en
una placa de 96 pocillos en el que se aplica la muestra a estudiar. La citocina presente
en la muestra se une al anticuerpo, y queda disponible para unirse a un segundo
anticuerpo (de detección), que está biotinilado. Para determinar la cantidad de citocina
presente se une al anticuerpo estreptavidina que lleva acoplada covalentemente la
enzima peroxidasa de rábano. La cantidad de citocina es proporcional a la cantidad de
color detectado espectrofotométricamente cuando se adiciona el sustrato TMB (3,3´,5,5´
tetrametilbencidina), que vira de transparente a azul. Se obtiene mayor sensibilidad si se
adiciona HCl 250 mM que da lugar a la formación de un color amarillo que es medido a
450 nm.
La lectura de la reacción coloreada se midió en un lector de ELISA OPSYSMR,
DYNEX a 450 nm
• La cuantificación de la citocina IL-4 se realizo con el kit de IL-4 BD
OptEIA ELISA (Becton Dickinson). Los estándares fueron diluciones
1:2 desde 500 hasta 7,8 pg.
• La cuantificación de la citocina TGF-β1 se determinó con el kit de TGF-
β1 Emax immunoassay system (PROMEGA). Los estándares fueron
diluciones 1:2 desde 1000 hasta 15,6 pg/ml.
En todos los casos el control negativo fue medio de cultivo y las muestras
fueron analizadas por duplicado.
Método CBA
El kit Cytometric Bead Array Human Inflamation Kit (BD Biosciences) permite
la cuantificación de citocinas por citometría, mediante el empleo de unas bolitas de un
tamaño distinto para cada citocina, que tiene acoplado el anticuerpo correspondiente. El
Material y Métodos
49
kit se empleó siguiendo las instrucciones del fabricante, midiendo simultáneamente en
cada muestra IL-12 p70, TNFα, IL-10, IL-6, IL-1β e IL-8 en 30 µl de sobrenadante.
Análisis estadístico
En la cuantificación de citocinas los datos no siguen una distribución normal, y
se analizaron usando el método no paramétrico Krustal-Wallis. Se uso la prueba Dunn´s
para comparaciones pairwise. En todos los casos, Se consideró significativamente
estadístico un nivel de probabilidad de p <0,05. Los análisis estadísticos se realizaron
con el paquete estadístico G-Stat v. 2,0 (prueba de Dunn´s).
50
EXPRESIÓN GÉNICA
Reactivos específicos
• Solución TE: Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM.
• Solución TAE: Tris-Base 4,84 g, ácido acético glacial 1,142 ml, 20 ml
de EDTA 0,5 M (pH 8,0), por litro de solución.
• SYBR green-fluoresceína: El fluorescente intercalante empleado en la
PCR en tiempo real fue SYBR green (1:10.000), que tiene la
característica de emitir una baja fluorescencia cuando esta libre en la
solución que aumenta al unirse a ADN de doble cadena. Dicha
fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN presente en la
reacción. El sistema de detección iCycler de Bio-Rad requiere que para
uniformizar cualquier variación del sistema óptico o de pipeteo, se añada
a la mezcla de reacción fluoresceína (10 nM), que emite fluorescencia a
una longitud de onda similar a la del SYBR green.
Genes diana
Los genes diana se detallan en la tabla 3, estos genes fueron seleccionados por
codificar proteínas que de alguna manera intervienen en la inmunidad innata del
huésped.
Diseño de cebadores
Se usaron una serie de cebadores (tabla 4), un par (“forward/reverse”) para cada
gen en estudio. Se emplearon secuencias ya descritas por otros autores, o fueron
diseñados por nosotros con el programa Primer3 V 4,0, de libre acceso en Internet
(http://frodo.wi.mit.edu/primer3).
Material y Métodos
51
Tabla 3: Descripción de los genes utilizados
Gen
[código HUGO]*
Nombre Código
secuencia&
p47 phox
[NCF1] Factor citosólico 1 de neutrófilos BC002816
gp91 phox
[CYBB] Citocromo b-245, polipéptido beta BC032720
DEFB1
[DEFB1] Defensina beta 1 BC047677
DEFB2
[DEFB4] Defensina beta 4 Z71389
DEFB3
[DEFB103A] Defensina beta 103 A AF301470
DEFB4
[DEFB104A] Defensina beta 104 A AJ314834
iNOS
[NOS2] Oxido nítrico sintetasa 2 A X73029
NRAMP1
[Slc11a1]
Resistencia natural del macrófago asociada a la proteína 1
BC041787
CTSD
[CTSD] Catepsina D BC016320
CTSG
[CTSG] Catepsina G BC014460
ATP6V1G1
[ATP6V1G1] H+-ATPasa lisosomal V1 subunidad G1 BC008452
ATP6V0C
[ATP6V0C] H+-ATPasa lisosomal V0 subunidad c BC007389
TNFRSF1A
[TNFRSF1A]
Receptor del factor de necrosis tumoral de la superfamilia 1 A
BC010140
IFNGR1
[IFNGR1] Interferon gamma receptor 1 BC005333
IFNGR2
[IFNGR2] Interferon gamma receptor 2 U05875
CCL20
[CCL20] Quimiocina CC ligando 20 BC020698
* Nombre del gen y símbolo de acuerdo al Comité de nomenclatura del gen HUGO & Secuencia obtenida del EMBL BANK.
Material y Métodos
52
Tabla 4: Cebadores utilizados
Primer Secuencia ( 5´-3´ ) Amplicón
(pb) Referencia
p47 phox-F p47 phox-R
CCCTGCTGGGCTTTGAGAA
CCGACAGGTCCTGCCATTT 81 Watanabe et al. 2003
gp91 phox-F gp91 phox-R
TCTGCGATTCACACCATTGC
TTGCCTGTCTCCAAGTTCAGAG 111 Éste trabajo
DEFB1-F DEFB1-R
TTGTCTGAGATGGCCTCAGGTGGTAAC
ATACTTCAAAAGCAATTTTCCTTTAT 253 Lehmann et al. 2002
DEFB2-F DEFB2-R
TCCAGGTGTTTTTGGTGGTATAGG
TCTGAATCCGCATCAGCCA 117 Éste trabajo
DEFB3-F DEFB3-R
TGAGGATCCATTATCTTCTGTTTGC
TGTGTTTATGATTCCTCCATGACC 80 Joly et al. 2005
DEFB4-F DEFB4-R
TTGTGCTGCTATTAGCCGTTTCTC
GCAGTCCCATAACCACATATTCTGTC 94 Éste trabajo
iNOS2-F iNOS2-R
ACGAGTGGTTTCGGGAACTG
ACGTCACAGAAGTCCCGGAC 151 Éste trabajo
NRAMP1-F NRAMP1-R
GCTGGAAGCTTTTTTTGGACTCC
GCCGAGTGCAGGTAGATGTTGT 204 Éste trabajo
CTSD-F CTSD-R
GACACAGGCACTTCCCTCAT
CCTCCCAGCTTCAGTGTGAT 151 Verhoeckx et al. 2004
CTSG-F CTSG-R
GGTTCCTGGTGCGAGAAGACTT
GGATGGTCCGCTGATTATATTGAG 165 Éste trabajo
ATP6V1G1-F ATP6V1G1-R
CCGCAAAAGAAAGAACCGGA
CCTTGGCCTTGAATTCTTTCTCC 101 Éste trabajo
ATP6V0C-F ATP6V0C-R
AGTCCATCATCCCAGTGGTC
CAGCTGGAGGAAGCTCT 119 Lee et al. 2004
TNFRSF1A-F TNFRSF1A-R
TGCCTACCCCAGATTGAGAA
ATTTCCCACAAACAATGGAGTAG 169 Éste trabajo
INFGR1-F INFGR1-R
CCAGGGTTGGACAAAAAGAATCT
TGATATCCAGTTTAGGTGGTCCAAT 93 Martinez et al. 2002
INFGR2-F INFGR2-R
TGAGCAATAGCACGAGGCCT
GTGTACAATTCACCCCTATGGACA 102 Éste trabajo
CCL20-F CCL20-R
GGCTGCTTTGATGTCAGTGC
GATGTCACAGCCTTCATTGGC 151 Éste trabajo
Material y Métodos
53
Obtención de ARN total y síntesis de ADNc
Se retiró el sobrenadante del cultivo celular infectado de una noche, y se
procedió a obtener ARN total siguiendo el protocolo de UltraClean Tissue RNA
Isolation Kit (MOBIO). Una vez obtenido el ARN total fue necesario aplicar un
tratamiento con ADNasa (General Electric Healthcare, Life Sciences,), para eliminar los
restos de ADN genómico. Seguidamente se continúo con el protocolo de qScript
cDNA SuperMix (Quanta Biosciences) para obtener ADNc. En un volumen final de 20
µl se mezcló el ARN (15,5µl) con el tampón (qScript cDNA SuperMix (5X)) que
contiene concentraciones optimizadas de MgCl2, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP),
un inhibidor de ARNasa, qScript transcriptasa reversa, primers de secuencia aleatoria,
oligo (dT) primer y estabilizantes, y se incubo en un termociclador con la programación
siguiente:
Paso 1 25º C por 5 min.
Paso 2 42º C por 30 min.
Paso 3 85º C por 5 min.
Paso 4 4º C por tiempo indefinido
Las muestras se guardaron en alícuotas diluidas 1:2,25 en TE a -20º C.
Estimación de las eficiencias de las reacciones de PCR
Mediante la técnica de PCR se amplificaron los genes diana. Se uso la enzima
Taq polimerasa (Taq Hot Star DNA polymerase, Hotmaster) en el tampón suministrado
por el fabricante (5 prime). Los componentes de la reacción de PCR fueron: ADNc (0,3
µl de la reacción de retrotranscripción diluida), solución tampón con magnesio (2,5
mM), cebadores (0,2 mM), dNTP´s (0,2 mM), Taq ADN polimerasa (0,5 U) en un
volumen final de 20 µl. Como agente fluorescente se utilizó SYBR Green-FAM
(Molecular Probes) diluido (1/10.000). Programación del termociclador (ciclos):
Ciclo 1 1 repetición 95º C por 1 min.
Ciclo 2 30 repeticiones
Paso 1 95º C por 30 seg.
Paso 2 55º C por 30 seg.
Paso 3 65º C por 30 seg.
Material y Métodos
54
Paso 4 85º C por 10 seg.
Ciclo 3 1 repetición 25º C por tiempo indefinido
En éste último paso a 85º C se tomó la lectura de la fluorescencia emitida por
el SYBR green, porque a esa temperatura los productos específicos (amplicones)
formados no están desnaturalizados pero los productos inespecíficos (primer-dimers)
sí lo están y no se unen al colorante. Con esto nos aseguramos de que solo se tomó la
lectura de los amplicones.
Los productos de la PCR se analizaron por electroforesis en geles de agarosa, de
acuerdo a la metodolología descrita en el “Current Protocols in Molecular Biology”
(modificada). Se usaron concentraciones de agarosa de 0,8% y 3% en función al tamaño
de los amplicones de la muestras de ADN a separar. Como tampón de electroforesis se
empleó TAE. Como fluoróforo intercalante del ADN en la electroforesis se usó
bromuro de etidio (0,4 µg/ml). El marcador de tamaño molecular incluido en los geles
fue MassRuler DNA Ladder Mix (103 ng/µl; Fermentas Life Sciences), y como
indicador de seguimiento de la electrofóresis se uso 1 µl de 6 × MassRuler DNA
Loading Buffer (Fermentas Life Sciences). Los geles se fotografiaron sobre un
transiluminador de luz ultravioleta Chemidoc con cámara integrada (BIORAD).
El estudio de eficiencias se realizó a partir de amplicones purificados de agarosa
de acuerdo al protocolo del kit de purificación “GFX PCR DNA and Gel band”
(Amersham/Biosciences), basado en el uso de agentes caotrópicos que desnaturalizan
las proteínas, disuelven la agarosa y promueve la unión de los enlaces dobles del ADN a
una matriz de fibra de cristal. Una vez capturado el ADN, las proteínas y sales
contaminantes son lavadas y desechadas, el ADN es conservado en un tampón de
elución (TE pH 8.0, Tris-HCl 10 mM pH 8,0 o agua libre de DNAsas).
Con ayuda del software del instrumento iCycler IQ (Bio-Rad), se determinó la
eficiencia de la amplificación de cada gen a estudiar mediante la construcción de una
recta a partir de diluciones 1/8 del amplicón purificado de geles de agarosa, y aplicando
la ecuación E = 10-1/valor de la pendiente.
Material y Métodos
55
Estudio de expresión diferencial mediante qPCR en tiempo
real
Una vez obtenida la E de los genes diana, se utilizó el ADNc para determinar
la expresión génica de las células infectadas (muestras) en relación con las células no
infectadas (muestra control), su cálculo fue en base a la siguiente relación: {(Eref)Ct
muestra/(Emuestra)Ct test]/ [(Eref)
Ct control/(Emuestra)Ct control} [Pffafl, 2001]. Donde los valores
del Ct para cada uno de los genes diana se normalizaron con el Ct del gen factor de
elongación 1 alfa (EF-1α). Este gen normalizador se expresa por igual en las células
sanguíneas utilizadas en los diversos ensayos y tratadas como se ha explicado
anteriormente.
Se realizó la qPCR como se ha indicado el cálculo de la eficiencia, las muestras
fueron por triplicado, pero en este caso, en lugar de la muestra de ADN obtenida de la
purificación de la banda de agarosa, se utilizó ADNc, sintetizado a partir de ARNt
obtenido de células tratadas como se indicó en cada experimento. Se realizaron
comparaciones entre células infectadas y no infectadas. La programación del
termociclador fue la misma que para el cálculo de la eficiencia, pero en lugar de 30
ciclos se realizaron 40 ciclos.
RESULTADOS
56
INFECCIONES EN DIFERENTES TIPOS CELULARES
Con el propósito de buscar y adecuar un modelo de infección que se asemeje a la
infección causada por M. tuberculosis en el pulmón y su interacción con los macrófagos
alveolares; se realizaron varios ensayos para determinar la multiplicación intracelular de
varias cepas de bacterias con diferente grado de patogenicidad en células
promielocíticas humanas (HL60), monocitos primarios y células epiteliales pulmonares
(A549), probando diferentes medios de cultivo y aplicando distintos tratamientos.
Infecciones en células promielocíticas humanas (HL60)
Infección de células HL60 con M. avium
Siendo M. avium una micobacteria de más rápido crecimiento que M.
tuberculosis, se decide usarla para infectar células HL-60 y valorar su crecimiento
intracelular en diferentes medios de cultivo (suplementados con suero y libres de suero),
diferenciando las células a macrófagos con distintos tratamientos.
Cuando se realizaron infecciones con 1 micobacteria por cada 100 células (105
células con 103 micobacterias) en presencia de tres medios de cultivo: el RPMI,
suplementado con 10% de suero de ternera o suero fetal bovino, y el medio X-VIVO-
15, que no precisa la adición de suero, no se observó diferencia alguna en la tasa de
crecimiento intracelular de M. avium.
Con la finalidad de determinar en qué condiciones se reproducen mejor las
micobacterias, se infectaron células HL60 diferenciadas a macrófagos con la aplicación
de TPA o con Vit-D3 y, de nuevo, no se pudieron apreciar diferencias en el número de
micobacterias recuperadas tras la infección.
Efecto del suero en el crecimiento intracelular de micobacterias con grado
distinto de patogenicidad en células HL60 infectadas
Para determinar si el suero presente en el medio de cultivo influye en la
multiplicación intracelular de la micobacteria, se decide realizar un ensayo usando un
medio de cultivo que no requiere de suero (X-VIVO-15) y adicionar suero humano a
Resultados
57
una concentración de 5% para evaluar si éste tiene efecto sobre el crecimiento
intracelular de la bacteria.
Para este experimento se opta por usar otras cepas de micobacterias con
diferente grado de patogenicidad y valorar si el comportamiento es similar o diferente
entre las micobacterias. Se infectan las células HL60 con M. tuberculosis, M. avium y
M. gordonae. Las células fueron diferenciadas a macrófagos con TPA a una
concentración de 50 nM, pues con este agente las células HL60 adquieren
características similares a macrófagos, las células blanco de M. tuberculosis. Células
infectadas en ausencia de suero representaron el control negativo. Los resultados nos
muestran que las infecciones realizadas con M. avium en ausencia de suero presentan un
ligero crecimiento intracelular con respecto de las infecciones realizadas en presencia
suero, aunque no significativas estadísticamente. No así en el caso de M. tuberculosis
que los resultados son prácticamente iguales; sin diferencias significativas, por lo que
deducimos que el suero no influye en el crecimiento intracelular de estas micobacterias
(tabla 5). Aunque el suero se suele considerar como fuente de opsoninas, los resultados
obtenidos apuntan a que no es necesario para que las micobacterias sean eficientemente
fagocitadas.
Aunque en experimentos realizados por nuestro grupo en el pasado demostraban
que M. gordonae se multiplicaba en monocitos humanos, en estos experimentos
observamos que tanto en ausencia de suero como en presencia del mismo, hay una
drástica disminución en el número de bacterias viables con respecto al inóculo inicial (p
< 0,01).
Tabla 5: Comparación de la supervivencia de micobacterias de diferente grado de patogenicidad, a diferentes concentraciones de suero
Micobacteria Inóculo Sin suero Suero 5%
M. avium 3,17±0,05 3,82±0,56 3,64±0,30
M. tuberculosis 3,05±0,02 3,35±0,18 3,44±0,15
M. gordonae 3,05±0,21 1,67±0,30* 1,87±0,36* Los datos son el resultado de 3 experimentos independientes y consecutivos y representan el promedio de los Log de las UFC±DE. * p < 0,05, estadísticamente significativa
Otro aspecto que puede influir en la viabilidad de las bacterias es la actividad
antimicrobiana intrínseca del suero. Para averiguar su importancia frente a
Resultados
58
micoboacterias se cultivaron en el medio X-VIVO-15 con y sin suero. En el ensayo se
agregaron 103 micobacterias tanto patógenas (M. tuberculosis, M. avium) como no
patógenas (M. gordonae), en medio libre de suero y con suero al 5%, y se observó que
las micobacterias patógenas daban lugar a microcolonias visualizables al microscopio
en el medio sin suero, pero no en el medio con suero (tabla 6). M. gordonae no presenta
crecimiento en ninguno de los casos. De estos resultados concluimos que el suero ejerce
un efecto inhibitorio sobre la multiplicación de las micobacterias.
Tabla 6: Efecto del suero en el crecimiento de las micobacterias
Micobacteria Sin suero Suero al 5%
M. tuberculosis + - M. avium + - M. gordonae - -
+ Visualización de UFC - No visualización de UFC
Experimentos realizados posteriormente revelaron que M. tuberculosis y M.
avium en medio X-VIVO-15 tanto en presencia como en ausencia de suero era capaces
de mantenerse vivos, puesto que se recuperaba un número de colonias semejante al
inóculo inicial. No así en M. gordonae donde se observó una ligera disminución. Por lo
tanto el suero presenta una actividad bacteriostática frente a M. tuberculosis y M. avium,
y una ligera actividad bactericida frente a M. gordonae. Podemos deducir de estos datos
que el empleo del suero es dispensable en infecciones in vitro con micobacterias.
Infecciones en monocitos primarios
Infección de monocitos con M. avium y M. gordonae
En base a los resultados obtenidos en las infecciones de las células HL60 con la
cepa de M. gordonae, donde se observó una contundente disminución del crecimiento
intracelular, y para valorar si el suero también tiene algún efecto sobre el crecimiento
intracelular en M. avium y M. gordonae, se infectaron las células con las micobacterias
(MOI = 0,1). Se emplearon dos cepas distintas de M. gordonae: siendo una de ellas en
la que se observo disminución de la multiplicación intracelular (cepa de varios años de
resiembras), que denominamos M. gordonae atenuada (cepa HL184Gat), y otra cepa
obtenida de viales congelados originalmente, que nunca habían sido resembradas (cepa
Resultados
59
original, HL184G). Las infecciones se realizaron en medio X-VIVO-15 y adicionando
suero humano a una concentración de 5%.
En las infecciones de monocitos con M. avium en ausencia de suero se produjo
una gran proliferación, estadísticamente significativa . No así en presencia del suero,
donde el crecimiento es poco mayor que en el control (tabla 7). Este resultado refleja el
crecimiento extracelular de M. avium, pues si se permite la incubación de la infección
durante seis o siete días aparecen microcolonias de la micobacteria entre los monocitos
del tapiz celular.
Tabla 7: Efecto del suero en el crecimiento de micobacterias en monocitos infectados
Micobacteria Inoculo Sin suero Suero 5%
M. avium 3,15±0,14 4,73±0,53 3,49±0,63
M. gordonae
(original) 3,15±0,14 3,75±0,33* 2,80±0,33*
M. gordonae
atenuada 3,16±0,20 1,72±0,46* 1,80±0,54*
Los datos son el resultado de 3 experimentos independientes y consecutivos y representan el promedio de los Log de la UFC±DE. * p < 0,05 (estadísticamente significativa).
En la cepa original de M. gordonae se aprecia un mayor crecimiento en las
infecciones en ausencia de suero, pero no así en presencia de suero, de forma que hay
diferencias significativas cuando se comparan los dos grupos entre ellos (p < 0,05), pero
no cuando se comparan con el inóculo. Este resultado es paralelo al obtenido para M.
avium, pero de menor magnitud
En el caso de M. gordonae atenuada, se ve claramente una disminución de la
multiplicación de la micobacteria, tanto en ausencia como en presencia de suero, con
diferencias significativas entre cada grupo y el inóculo (p < 0,05). Al observar la
morfología de las colonias sobre medio sólido de esta micobacteria, apreciamos que son
diferentes, siendo la cepa atenuada menos pigmentada y lisa (González-Cortés et al.,
2009).
Infecciones en células epiteliales pulmonares (A549)
En la literatura se describe la multiplicación de micobacterias en la línea celular
epitelial pulmonar A549, por lo que decidimos comprobar si este modelo permite tasas
Resultados
60
de crecimiento comparables a HL60. Al ser las células A549 más grandes que las HL60,
se decide hacer un ensayo para calcular el número de células a usar en las infecciones y
se observó que a una concentración de 2 x 104 células hay una confluencia de
aproximadamente el 85%, lo que es considerado como la mejor opción. Se infectaron
con M. tuberculosis y M. gordonae y se observó que se recuperaron 9 y 3 veces más
bacterias, respectivamente, que las inicialmente inoculadas (p < 0,01) (tabla 8). Estos
resultados confirman los obtenidos por otros autores, y establecen que A549 representan
un modelo adecuado para estudiar la multiplicación intracelular de micobacterias.
Tabla 8: Supervivencia de micobacterias en línea celular A549
Micobacterias T=0 T=4d
M. tuberculosis 2,85±0,00 3,79±0,01
M. gordonae 3,00±0,00 3,48±0,04
Los datos reportados son la media geométrica del Log de la UFC ± DE de dos infecciones consecutivas e independientes T=0 Inóculo inicial T=4d crecimiento intracelular de las bacterias después de 4 días de incubación
61
CAPACIDAD DE LOS FAGOCITOS HUMANOS
(MONOCITOS Y NEUTRÓFILOS) PARA ELIMINAR A
MICOBACTERIAS NO PATÓGENAS
Una vez obtenido un modelo de infección, se decidió hacer una serie de
experimentos con voluntarios, para evaluar la actividad microbicida, cuantificar la
secreción de citocinas pro y anti-inflamatorias, y valorar efecto del INFγ y del TNFα en
la actividad anti-microbiana, tanto en monocitos como de neutrófilos
Actividad anti-microbiana de fagocitos humanos
Infección de monocitos y neutrófilos con bacterias de diferente grado de
patogenicidad
Dado que las micobacterias de baja patogenicidad como M. gordonae muy
raramente dan lugar a procesos clínicos, a pesar de ser ubicuas y encontrarse de forma
abundante en el medio ambiente, la hipótesis de trabajo inicial fue que sería
eficientemente eliminada por fagocitos humanos. Sin embargo, en los experimentos
iniciales obtuvimos evidencias sobre la incapacidad que tienen de matar a ninguna
micobacteria. Para corroborar estos resultados en monocitos, y testar la actividad de
neutrófilos, hicimos nuevas infecciones con un protocolo estandarizado. Cada una de las
infecciones fue realizada con monocitos y neutrófilos purificados simultáneamente del
mismo voluntario. Una de las razones por las que se escogió M. gordonae para testar la
actividad de los fagocitos frente a micobacterias no patógenas fue que tiene un tiempo
de reproducción similar al de M. tuberculosis, lo que permitió emplear el mismo
protocolo de infección. En experimentos preliminares observamos que las micobacterias
de crecimiento rápido crecían en medio de cultivos celulares a gran velocidad, lo que
impedía realizar infecciones de cuatro o cinco días como las realizadas con M.
tuberculosis. Como control de la actividad antimicrobiana empleamos dos modelos
distintos: L. pneumophila y la cepa atenuada de M. gordonae obtenida en nuestro
laboratorio. Se realizaron cuatro experimentos independientes y consecutivos, donde se
Resultados
62
infectaron tanto monocitos como neutrófilos, con M. gordonae y M. gordonae atenuada.
Se infectaron 105 células (monocitos o neutrófilos) con 103 bacterias. Para mejorar la
fagocitosis de L. pneumophila, se empleó para opsonizar suero autólogo sin inactivar.
Dicho tratamiento no fue requerido para las infecciones realizadas con las
micobacterias.
En la infección de monocitos se observa un pequeño pero consistente
crecimiento intracelular de M. tuberculosis (Fig. 8 panel A) con un valor de p= 0,070.
En contraste, L. pneumophila presentó un crecimiento intracelular mayor en el orden de
106 después de cuatro días de incubación, lo que podríamos considerar como una
evidencia de que los fagotitos son viables y representan un huésped apropiado para la
multiplicación intracelular.
Cuando la infección fue con M. gordonae se observan niveles significativos de
la multiplicación intracelular, lo que demuestra que aunque esta micobacteria esta
reconocida como no patógena [Weinberger y Berg, 1992], los monocitos no tienen la
capacidad de eliminarla. No así cuando se infectan con la cepa de M. gordonae
atenuada, donde se detectan niveles muy significativos de la eliminación de ésta
micobacteria.
En el caso de los neutrófilos (Fig.8 panel B), que fueron obtenidos de la misma
muestra de sangre, se probó la actividad anti-microbiana en paralelo. La principal
diferencia que se observa cuando se comparan los neutrófilos con monocitos, es que L.
pneumophila es eficazmente eliminada por los neutrófilos (p=0,005); (tabla 9). Como se
esperaba, también M. gordonae atenuada es parcialmente eliminada. Este resultado
demuestra que en estas condiciones de infección los neutrófilos ejercen una actividad
anti-microbiana sobre estas bacterias. Sin embargo, el comportamiento de los
neutrófilos fue similar al de los monocitos cuando se infectaron con las otras
micobacterias. Nuevamente observa crecimiento de M. tuberculosis y M. gordonae
después de un día de infección, pero no significativo.
Resultados
63
Fig. 8: Actividad anti-microbiana de los fagocitos (A, monocitos; B, neutrófilos). Los datos representan la media de la DE de cuatro experimentos independientes. * Se consideran como valores significativos de la prueba t de student p <0,05 + 105 células t = 0 cantidad de bacterias al momento de la infección. t = 4d cantidad de bacterias intracelulares después de cuatro días de incubación. t = 1d cantidad de bacterias intracelulares después de un día de incubación.
Resultados
64
Tabla 9: Prueba t de student para la igualdad de medias en neutrófilos infectados
95% Intervalo de
confianza para la
diferencia t *Sig.
(bilateral)
Diferencia
de medias
Error
típico de la
diferencia Inferior Superior
M. tuberculosis -0,353 0,736 -0,09246 0,26216 -0,73395 0,54902
M. gordonae
atenuada 4,092 0,006 0,83005 0,20284 0,33371 1,32638
M. gordonae -0,711 0,504 -0,10743 0,15111 -0,47719 0,26232
L. pneumophila 5,834 0,005 0,72147 0,12366 0,37331 1,06963
* Valores significativos de la prueba t de student con p <0,05 t valor de la prueba t de student
Cuantificación de micobacterias extracelulares y determinación de la
fagocitosis
A la hora de cuantificar la actividad antimicrobiana celular se debe siempre tener
en cuenta el nivel de fagocitosis, pues las bacterias que permanecen extracelularmente
no se ven expuestas a los mecanismos de defensa intracelulares. Para calcular el número
de bacterias extracelulares (no fagocitadas) se recuperó el sobrenadante al cabo de 24
horas de los fagocitos infectados con M. tuberculosis, tanto de monocitos como
neutrófilos. La cuantificación de las micobacterias se realizó tanto en el sobrenadante
como en lisados celulares (bacterias intracelulares), y se observó que permanecieron
extracelulares el 29% de las bacterias cuando se infectaron monocitos, y el 10% cuando
se infectaron neutrófilos.
De igual forma se consideró la posibilidad de que la diferencia de crecimiento
intracelular entre M. gordonae y M. gordonae atenuada, estuviera relacionada con
diferentes niveles de fagocitosis atribuibles a los cambios morfológicos sufridos por la
micobacteria atenuada. Para dar respuesta a estas conjeturas, se infectaron células con
ambas micobacterias y se tiñeron con la técnica de Kinyoun y no se apreciaron
diferencias en el número de bacterias fagocitadas en ambas cepas.
Patrón de secreción de citocinas en los fagocitos infectados
Cuantificación de citocinas pro y anti-inflamatorias
Para estimar la relación entre la actividad microbicida y el patrón de producción
de citocinas por las células infectadas, se analizaron dos tipos principales de citocinas:
Resultados
65
pro-inflamatorias (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12 y TNFα) e inhibitorias (IL-4, IL-10 y TGF-
β1). Los datos que se muestran en la tabla 10 son valores expresados en pg/ml. La razón
por la que algunas medianas son cero y los rangos de los intercuartiles distintos de cero
es que la citocina sólo se detectó en uno de los cuatro sobrenadantes analizados. Los
sobrenadantes de los controles negativos (células no infectadas) tuvieron unas medianas
<20 pg/ml, con la excepción de las citocinas IL-6 donde se encontró en los
sobrenadantes de los monocitos (161,9 pg/ml); y de la IL-8, de los sobrenadantes tanto
de monocitos (21.594,0 pg/ml) como de neutrófilos (2.494,2 pg/ml). En el caso de la
citocina TGF-β1 se encontró presente en el suero utilizado para la opsonización de las
infecciones con Legionella (3.184,5 pg/ml). La mediana de cada una de citocinas en los
controles negativos se restó de la cantidad calculada a partir de las muestras. Las
cantidades después de la sustracción ≤ 0 se les dio un valor de 0,0 pg/ml.
No se observó producción de IL-4 o IL-12, incluso en los controles negativos.
Para las citocinas producidas por L. pneumophila varias comparaciones múltiples
mediante la prueba de Dunn´s fueron significativas, pero no para las producidas por las
tres micobacterias. La IL-1β se produjo en mayor cantidad en monocitos infectados por
las bacterias patógenas M. tuberculosis y L. pneumophila, pero no en los neutrófilos
infectados. Un patrón similar se encontró con el TNFα e IL-6 en los monocitos. Pero en
los neutrófilos se encontró que la IL-6 sólo se producía en las células infectadas con L.
pneumophila. La IL-8 se secretó en grandes cantidades tanto en monocitos como en
neutrófilos, aun cuando no estuvieran infectados, pero cantidades superiores a las
obtenidas en los controles negativos sólo se detectaron en los neutrófilos. Sin embargo,
no hubo diferencias significativas entre las cuatro bacterias con las que se infectaron.
En cuanto a las citocinas inhibitorias, la IL-10, se secretó en los monocitos
infectados con M. tuberculosis y L. pneumophila, pero sólo se encontró diferencias
significativas en las células infectadas con L. pneumophila. En el caso de TGF-1β sólo se detecto en grandes cantidades en L. pneumophila, con diferencias significativas en
los neutrófilos cuando se comparó con los tres micobacterias. Aunque no se encontró
diferencia estadística cuando se realizaron comparaciones por pares con la prueba de
Dunn´s para esta citocina en los monocitos (p ≤ 0,06), la prueba Kruskall-Wallis para
este grupo fue significativa (p = 0,017).
Resultados
66
Tabla 10 Cantidad de citocinas liberadas de fagocitos infectados
IL-1ββββ IL-6 IL-8 IL-12 TNFαααα IL-4 IL-10 TGF-1ββββ
Monocitos
M.
tuberculosis
4,5 (507,0)
43,5 (6363,6)
0,0 (0,0)
0,0 (0,0)
20,05 (339,8)
0,0 (0,0)
0,0 (8,6)
0,0 (0,0)
M. Gordonae 0,0 (2,2)
0,0* (0,0)
0,0 (0,0)
0,0 (0,0)
0,0* (0,0)
0,0 (0,0)
0,0* (0,0)
0,0 (0,0)
M. gordonae atenuada
0,0* (0,0)
4,4 (8,7)
0,0 (0,0)
0,0 (0,0)
0,0 (1,3)
0,0 (0,0)
0,0* (0,0)
0,0 (0,0)
L.
pneumophila
90,5 (760,3)
6964,4 (4104,8)
0,0 (0,0)
0,0 (0,0)
62,95 (105,5)
0,0 (0,0)
34,7 (131,0)
2725,0 (1682,8)
Neutrófilos
M.
tuberculosis 0,0 (0,0)
0,0 (9,0)
257,3 (3585,2)
0,0 (0,0)
0,0 (0,7)
0,0 (0,0)
0,0 (0,0)
0,0* (0,0)
M. Gordonae 0,0 (0,0)
0,0* (0,0)
0,0 (2196,2)
0,0 (0,0)
0,0 (0,0)
0,0 (0,0)
0,0 (0,0)
0,0* (0,0)
M. gordonae atenuada
0,0 (0,0)
0,0* (0,0)
0,0 (1908,3)
0,0 (0,0)
0,0 (0,0)
0,0 (0,0)
0,0 (0,0)
0,0* (0,0)
L.
pneumophila 0,0
(24,3) 117,1 (799,9)
4700,4 (13426,8)
0,0 (0,0)
2,3 (36,7)
0,0 (0,0)
0,0 (0,0)
2526,3 (1857,8)
Las cantidades (pg/ml) se obtienen restando la cantidad de citocinas liberadas por las células infectadas a las células no infectadas. Los datos son la mediana (rango intercuartil) de cuatro experimentos independientes. la prueba Dunn´s se utilizó para las comparaciones por pares vs L. pneumophila. * p < 0.05 se considera como estadísticamente significativa.
Neutralización de citocinas en monocitos infectados con M. tuberculosis y M.
gordonae atenuada
Ninguna de las citocinas testadas fue asociada a la actividad anti-microbiana.
Aunque la diferencia en el número de micobacterias recuperadas entre M. gordonae y
M. gordonae atenuada después de la lisis de las células fue más de cien veces para los
monocitos y diez para los neutrófilos, tanto el tipo y la cantidad de citocinas producidas
fueron muy similares. Se encontró una posible relación entre el patrón de producción de
citocinas y la patogenicidad, pero este patrón no tiene asociación con la actividad anti-
microbiana mostrado por monocitos o neutrófilos. Cabe la posibilidad de que los
mecanismos de defensa frente a la actividad bactericida tanto de M. tuberculosis como
de M. gordonae son diferentes. Por este motivo se contrastó la neutralización de
citocinas en monocitos infectados con ambas micobacterias para valorar si presentaban
Resultados
67
alguna influencia en la actividad anti-microbiana. La diferencia más pronunciada en el
patrón de citocinas inducidas por estas bacterias se encontró en monocitos infectados en
presencia de las citocinas IL-1β, IL-6 y TNFα. Debido a que en los patrones a partir de
las cepas de M. gordonae original y atenuada eran similares, se optó por usar la
micobacteria atenuada contra la cual los monocitos son eficaces.
La adición de los anticuerpos neutralizantes no tuvo ningún efecto sobre la
actividad anti-microbiana de los monocitos (tabla 11) contra M. tuberculosis o M.
gordonae atenuada, ya que no hubo diferencias entre las células no tratadas y las
tratadas con cualquier combinación de anticuerpos. La adición de anticuerpos de control
del mismo isótopo demostró que los anticuerpos no específicos no influyen en los
resultados finales. En esta serie de experimentos se encontraron diferencias
significativas en el número de M. tuberculosis entre el inoculo inicial (t = 0) y las
micobacterias recuperadas tras cuatro días de infección, al contrario de lo observado en
la figura 8, en que las diferencias no fueron significativas, si bien la p fue bastante baja
(p = 0.07). Estos resultados confirman que no existe ninguna relación entre la
producción de estas tres citocinas y la actividad anti-microbiana de los monocitos
infectados.
Tabla 11: Actividad anti-microbiana de monocitos frente a M. tuberculosis y M. gordonae atenuada en presencia de anticuerpos de neutralización anti-citocinas.
M. tuberculosis M. gordonae atenuada
Bacterias inoculadas (t=0) 3,24 SD 0,06 (2,66-3,82)* 2,82 SD 0,26 (0,51-5,13)*
Tratamiento
Sin tratamiento 3,88 SD 0,08 (3,68-4,09) 2,27 SD 0,02 (2,21-2,33)
Anti-TNFα 3,92 SD 0,02 (3,86-3,98) 2,38 SD 0,14 (2,02-2,73)
Anti-IL-1β 3,94 SD 0,09 (3,73-4,15) 2,29 SD 0,08 (2,08-2,50)
Anti-IL-6 3,97 SD 0,10 (3,72-4,22) 2,31 SD 0,12 (2,00-2,62)
Anti-TNFα-IL-1β-IL-6 3,97 SD 0,07 (3,79-4,14) 2,41 SD 0,12 (2,11-2,70)
Control (IgG1 rata) 3,91 SD 0,19 (2,23-5,59) 2,30 SD 0,09 (2,08-2,52)
Control (IgG1 ratón) 3,90 SD 0,12 (3,60-4,20) 2,35 SD 0,04 (2,24-2,46) Los datos son el promedio del log del número de colonias con la desviación estándar, SD (95% de intervalo de confianza) de tres experimentos independientes. Sólo las comparaciones por pares frente a t = 0 fueron significativas, * p < 0,05.
Resultados
68
Activación de los fagocitos con citocinas y su efecto en la
actividad anti-microbiana
Efecto del INFγγγγ y del TNFαααα en la actividad anti-microbiana
En el siguiente experimento se probó si la adición de citocinas de activación,
como el IFNγ o TNFα, a las células infectadas podría ayudar en el control del
crecimiento bacteriano. Se advirtió una moderada producción de TNFα en monocitos
infectados con M. tuberculosis y L. pneumophila (20,05 y 62,95 pg/ml respectivamente;
(tabla 10) y no se correlacionó con una aparente actividad anti-microbiana. Se
adicionaron grandes concentraciones de las citocinas (25 ng/ml) por separado, o ambas
en conjunto, para valorar si esto ayudaría a las células a matar a las bacterias.
Cuando se añadieron estas citocinas a los monocitos en el momento de la
infección, no se encontraron diferencias significativas en el número de micobacterias
recuperadas después de la lisis celular entre las células activadas y las no tratadas (Fig.
9, panel A). Aunque M. gordonae atenuada fue eliminada eficazmente por los
monocitos, como se demuestra en la Fig. 8, panel A, la adición de las citocinas no
mejora esta actividad. En cambio, cuando se activan los monocitos con IFNγ, más del
80% del control de L. pneumophila es eliminado. Este resultado demuestra el buen
estado de las células y su capacidad de activación por el IFNγ. Sin embargo, el TNFα
no tiene ningún efecto sobre la actividad de los monocitos frente a L. pneumophila.
Estos resultados también se corroboraron con la adición de estas citocinas en las
infecciones de los neutrófilos (fig. 9, panel B), se observa que el IFNγ también estimuló
a las células para eliminar a L. pneumophila, aunque los valores no alcanzaron niveles
de significación. Tanto en los monocitos como en los neutrófilos, las citocinas no
mejoraron su actividad contra las micobacteria M. gordonae atenuada, y no tienen
ningún efecto notable sobre M. tuberculosis o M. gordonae.
Resultados
69
Fig 9: Activación de fagocitos con citocinas. La multiplicación intracelular de las bacterias en monocitos (A) o neutrófilos (B), en presencia de 25 ng /ml de las citocinas indicadas. Los datos son el logaritmo de la UFC y representa la media + la desviación estándar de cuatro experimentos independientes. + 105 células. * Prueba Tukey´s post-hoc con p <0,05 se consideró significativa.
70
EXPRESIÓN GÉNICA DE MONOCITOS INFECTADOS CON
DIFERENTES BACTERIAS
Los resultados obtenidos hasta este momento nos indican que en nuestro modelo
de infección, tanto de monocitos como de neutrófilos, el INFγ y el TNFα no tienen
efecto microbicida sobre las micobacterias M. tuberculosis, M gordonae e inclusive
sobre la cepa atenuada de M. gordonae. Pero sí se observó este efecto en el INFγ tanto
en los monocitos como en los neutrófilos infectados con L. pneumophila.
Desconocemos qué diferencias en los perfiles de expresión génica hay en
monocitos infectados con ambos patógeno, M. tuberculosis y L. pneumophila.
Determinar qué mecanismos empleados frente a L. pneumophila, que se traducen en una
eficiente eliminación de la bacteria, y que no son funcionales en monocitos infectados
con M. tuberculosis, puede suponer una información muy valiosa para entender la forma
en que las micobacterias sobreviven a las defensas microbicidas de los monocitos. Por
tal motivo se decidió examinar mediante PCR en tiempo real la expresión diferencial de
algunos genes que de una manera u otra intervienen en los mecanismos de defensa del
huésped, infectando monocitos con M. tuberculosis y L. pneumophila (MOI 1,0).
A partir de ADNc obtenido de monocitos infectados, se realizaron una serie de
PCR y electroforesis en geles de agarosa, para detectar la banda del amplicón de los
genes diana. Como control positivo de expresión génica se utilizó el gen EF1α. Debido
a que el tamaño del amplicon era muy variado se decidió usar 2 concentraciones de
agarosa en los geles, al 3% para los amplicones menores de 100 pb y al 1% en los
mayores de 100 pb.
De los genes escogidos solo se obtuvieron amplicones de gp47 phox, NRAMP1,
CTSD, ATP6V1G1, ATP6V0C, TNFRSF1A, INFGR1 y 2, y CCL20 (Fig. 10). No se
lograron obtener amplicones de los genes: gp91, CTSG, iNOS2 (Fig. 10) y en las DEFB
1, 2, 3 y 4 (Fig. 11).
Resultados
71
Fig. 10: Geles de agarosa de los genes diana: p47 phox, gp91 phox, iNOS, NRAMP1, CTSG y D, ATP6V1G1, ATP6V0C, TNFRSF1A,INFGR1, IFNGR2 y CCL20. – Monocitos sin infectar L Monocitos infectados con L. pneumophila T Monocitos infectados con M. tuberculosis
Resultados
72
A monocitos sin activar
B monocitos activados con INFγγγγ y LPS de E. coli
Fig. 11: Geles de agarosa de los genes de las DEFB1, 2, 3 y 4 – Monocitos sin infectar L Monocitos infectados con L. pneumophila T Monocitos infectados con M. tuberculosis
Resultados
73
En el caso de las defensinas, se sabe que se encuentran en los gránulos de los
neutrófilos, pero se decidió trabajar con ellas porque en la literatura se encontró una
referencia en la que se informa sobre la expresión de DEFB1 y 2 en monocitos [Duits et
al., 2002]. Sin embargo, nosotros no conseguimos observar esta expresión, a pesar de
activar los monocitos con INFγ y LPS de E. coli como documentaron los autores del
mencionado artículo.
Expresión génica mediante qPCR en tiempo real
El gen seleccionado como normalizador, el EF1α, fue elegido por presentar
menos variabilidad que otros genes usados generalmente como normalizadores como es
en el caso del gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) o la proteína de
activación tirosina 3 monooxigenasa/triptofano 5 polipéptido zeta (YWHAZ) [Carrol et
al., 2007], usados frecuentemente como genes de referencia. En la tabla 12 se muesran
las caracteristicas de los cebadores utilizados de los genes normalizadotes.
Tabla 12 Cebadores de los genes normalizadores
Cebador Secuencia ( 5´-3´ ) Amplicón (pb) Referencia
EF1α-F EF1α-F
TGTTCCTGTTGGCCGAGTG
ATTGAAGCCCACATTGTCCC 151 Éste trabajo
GAPDH-F GAPDH-R
GGAGTCAACGGATTTGGTCG
GGAATTTGCCATGGGTGG 151 Éste trabajo
YWHAZ-F YWHAZ-R
AAACTGGCCGAGCAGGCT
CCCTCCAAGATGACCTACGG 151 Éste trabajo
En la tabla 13 se muestran resultados representativos de las expresiones génicas
de los ADNc de monocitos infectados con M. tuberculosis y L. pneumophila,
comparándolos con los monocitos sin infectar (control de la expresión). Consideramos
expresiones diferenciales cuando el aumento o disminución es mayor de dos veces.
En las subunidades de las NADPH oxidasa solo encontramos expresión génica
de la subunidad p47 phox, en la que se observa una disminución de la expresión de
aproximadamente 3 veces tanto en los monocitos infectados con M. tuberculosis (0,35)
como por L. pneumophila (0,35). No detectamos actividad transcripcional de la
subunidad gp91 phox.
Resultados
74
En el gen NRAMP1 se aprecia una expresión génica de los monocitos infectados
con M. tuberculosis >3 con respecto al control sin infectar y >2 con respecto a los
infectados con L. pneumophila.
Tabla 13: Expresión génica de diversos genes en ADNc de monocitos
Genes
diana Muestra de ADNc Expresión génica
Sin infectar* 1,00
Infectado con M. tuberculosis 0,35 p47 phox
Infectado con L. pneumophila 0,35
Sin infectar* 1,0
Infectado con M. tuberculosis 3,71 NRAMP1
Infectado con L. pneumophila 1,54
Sin infectar* 1,00
Infectado con M. tuberculosis 0,78 CTSD
Infectado con L. pneumophila 1,37
Sin infectar* 1,00
Infectado con M. tuberculosis 1,48 ATP6V1G1
Infectado con L. pneumophila 3,65
Sin infectar* 1,00
Infectado con M. tuberculosis 0,32 ATP6V0C
Infectado con L. pneumophila 0,35
Sin infectar* 1,00
Infectado con M. tuberculosis 4,26 TNFRSF1A
Infectado con L. pneumophila 1,24
Sin infectar* 1,00
Infectado con M. tuberculosis 1,45 IFNGR2
Infectado con L. pneumophila 1,92
Sin infectar* 1,00
Infectado con M. tuberculosis 16,70 CCL20
Infectado con L. pneumophila 41,45 Los resultados fueron analizados con el macro excel de BioRad * Muestra control de la expresión
Resultados
75
Con respecto a las enzimas proteolíticas lisosomales solo logramos detectar
expresión génica de la CTSD, pero no así de la CTSG. La expresión encontrada en la
CTSD, en el caso de los monocitos infectados con M. tuberculosis fue menor al control
(0,78) y en el caso de L. pneumophila ligeramente superior (1,37), pero en ambos casos
no los consideramos significativas.
En los componentes de la bomba de protones dependientes de ATP,
encontramos expresión génica en la subunidad del dominio V1 (ATP6V1G1) mayores al
control, en el caso de los monocitos infectados con M. tuberculosis fue de sólo 1,48,
pero de y de 3,65 para los infectados con L. pneumophila. En la subunidad del dominio
V0 (ATP6V0C), los monocitos infectados con ambas bacterias presentaron una
disminución de aproximadamente 3 veces con respecto al control.
En los receptores de las citocinas del TNFα (TNFRSF1A) y del INFγ (INFGR1 e
INFGR2), se observó que sólo el TNFARSF1A tiene una expresión diferencial
considerable (4,26 veces) en células infectadas con M. tuberculosis con respecto al
control sin infectar. No vimos diferencias reseñables en la expresión del IFNGR2, y
expresiones muy bajas de IFNGR1, que no siempre fue detectable, y que impedía una
cuantificación precisa de los niveles de transcripción.
Finalmente con la quimiocina CCL20 encontramos la expresión génica
diferencial más evidente. Se aprecia una notable diferencia en la expresión en células
infectadas con respecto a las no infectadas, > 40 veces en el caso de los monocitos
infectados con L. pneumophila y >16 veces en el caso de los infectados con M.
tuberculosis. La diferencia de expresión en monocitos infectados con una u otra bacteria
fue de ~ 2,5 veces.
Expresión génica de CCL20 en monocitos infectados con diferentes
micobacterias
Debido a que CCL20 fue el que nos dio una expresión diferencial mayor se
decidió analizar su expresión génica en monocitos infectados con diferentes
micobacterias.
Para determinar si las diferencias de expresión son específicas de cepas, y no
sólo de especie, infectamos monocitos primarios con dos cepas distintas de M.
tuberculosis, la empleada hasta ahora (HL186T), y la cepa 45344 (tabla 14). De nuevo
observamos que hay mayor expresión en células infectadas que en el control, pero sin
Resultados
76
grandes variaciones entre cepas. El resultado con la cepa HL186T es menor que en el
experimento anterior porque los monocitos se obtuvieron de un voluntario distinto.
Tabla 14: Expresión génica de CCL20 en monocitos infectados con dos cepas diferentes de M. tuberculosis.
Muestra de ADNc Expresión génica
Sin infectar* 1,00
Infectado con la cepa HL186T 6,58
Infectados con la cepa del hospital del Bierzo 5,55 Los resultados fueron analizados con el macro excel de BioRad * Muestra control de la expresión
Al no encontrar diferencias de expresión entre las dos cepas de M. tuberculosis,
se decidió valorar si había diferencias de expresión de CCL20 entre micobacterias de
distinto grado de patogenicidad. Para lo cual se infectaron monocitos con M.
tuberculosis, M. avium y M. kansasii. Los resultados muestran una marcada diferencia
entre los monocitos infectados con M. tuberculosis con respecto a los no infectados y
los infectados con M. avium, presentando una diferencia >30 veces, y con M. kansasii
la diferencia es > 5 veces (tabla 15). De nuevo observamos que la diferencia de
expresión en monocitos infectados con M. tuberculosis HL186T es grande, y distinta a
los valores obtenidos anteriormente, dado que los monocitos pertenecen a un voluntario
distinto.
Tabla 15: Expresión de CCL20 en monocitos infectados con micobacterias de diferente grado de patogenicidad.
Muestra de ADNc Expresión génica
Sin infectar* 1,00
Infectados con M tuberculosis 39,43
Infectados con M. avium 1,48
Infectados con M. kansasii 7,57 Los resultados fueron analizados con el macro excel de BioRad * Muestra control de la expresión
DISCUSIÓN
77
INFECCIONES
Una de las finalidades de la presente investigación fue obtener un modelo de
infección que se asemejara lo más posible al lo que en realidad pasa en la tuberculosis
pulmonar, es decir, reproducir al máximo la interacción macrófago/micobacteria.
Infecciones en las líneas celulares HL60 y A549
Considerando que en el alveolo pulmonar las células inicialmente infectadas son
sobre todo los macrófagos alveolares, pero también las células epiteliales, inicialmente
se decidió usar las células HL-60 y las A549 por ser líneas celulares de origen humano
(macrofágica y epitelial, respectivamente).
Las células HL-60 se pueden diferenciar a otros tipos celulares (granulocitos,
monocitos, macrófagos o eosinófilos) mediante la adición de diversos agentes [Collins,
1987], lo cual es conveniente para trabajar con varios modelos celulares con semejanzas
a las células sanguíneas primarias. Rockett et al., encontraron que M. tuberculosis es
fagocitada y se replica en las células HL-60 y que si estas células son diferenciadas a
macrófagos con 1,25-dihidroxi-vitamina-D3 pueden inhibir la multiplicación
intracelular de la micobacteria por medio de un mecanismo dependiente de NO [Rockett
et al., 1998]. Sin embargo en nuestro trabajo no observamos diferencias de crecimiento
intracelular entre las células diferenciadas con Vit-D3 o con TPA y las no tratadas
(resultados no mostrados). En otros estudios, como el de Nordenfelt et al., donde
diferenciaron las células HL60 a neutrófilos con ácido transretinoico (ATRA), y las
infectaron con Streptococcus pyogenes, en sus resultados sugieren que las células
diferenciadas tienen un comportamiento antibacteriano parecido a los neutrófilos, con
fusión de los fagosomas con gránulos azurofililicos [Nordenfelt et al., 2009].
En las células A549 se han realizado varios estudios de infecciones de las células
con micobacterias, uno de los pioneros fue el trabajo de Bermúdez y Goodman, en
donde demuestran que algunas micobacterias patógenas como M. tuberculosis y M.
avium son capaces de unirse, invadir y multiplicarse dentro de estas células [Bermudez
y Goodman, 1996]. En nuestros resultados también observamos un crecimiento
Discusión
78
intracelular de diversas micobacterias, tanto patógenas (M. tuberculosis) como las
consideradas no patógenas (M. gordonae), en esta línea celular.
Con los resultados de los anteriores estudios, podríamos concluir que estas dos
líneas celulares son útiles como modelos comparativos para el análisis de los eventos
intracelulares a que se ve expuesto M. tuberculosis en células primarias.
Infecciones en monocitos
Efecto del suero en el crecimiento intracelular de M. avium en monocitos
En nuestros resultados de las infecciones de monocitos con M. avium, se vio que
la presencia del suero inhibe el crecimiento intracelular de la micobacteria, aunque de
forma no significativa estadísticamente. Estos resultados coinciden con los de Douvas et
al., quienes observaron que la presencia de suero influye en el crecimiento de M. avium.
Observaron que al adicionar suero en el momento de la infección se produce una
considerable disminución del crecimiento de M. avium, en los primeros 4 días de
cultivo. Posteriormente la micobacteria presentaba un rápido aumento, muy parecido al
del crecimiento bacteriano en ausencia de suero [Douvas et al., 1992]. En nuestro caso
los cultivos se dejaron cuatro días. Esta coincidencia de resultados es a pesar de las
diferencias en los métodos de cultivo y de infección, ya que ellos los cultivos los
realizaron en medio RPMI y usaron de 1 a 2 bacterias por célula, además de que
realizaron lavados después de 1 hora postinfección para retirar las bacterias
extracelulares restantes. En cambio, nosotros utilizamos un medio libre de suero (X-
VIVO-15) y usamos i bacteria por cada 100 células, además de que no se realizó ningún
lavado post-infección.
Obtención del modelo de infección
Son numerosos los estudios en los que se realizan infecciones de monocitos con
M. tuberculosis in vitro, en los que se utilizan antibióticos en los medios de cultivo para
eliminar micobacterias extracelulares, o se realizan una serie de lavados posteriores a la
infección para eliminar los posibles restos de micobacterias no fagocitadas,
introduciendo una importante fuente de variabilidad, pues es sumamente complicado
conseguir lavar distintos pocillos de una forma perfectamente homogénea.
Tomando como referencia algunas características de los métodos de cultivo e
infecciones de la literatura, se ha diseñado un protocolo de infección que minimiza las
Discusión
79
manipulaciones técnicas, presentando, a nuestro criterio, varias ventajas: en primer
lugar, la purificación de los monocitos por separación magnética de las células evita los
lavados utilizados en las técnicas que se basan en la adhesión de monocitos, en las que
se seleccionan monocitos que se adhieren fuertemente. En segundo lugar, el
mantenimiento de las células en medios libres de suero reduce la variabilidad, porque la
composición del suero presente en los medios varía entre lotes, además de tener una
composición muy compleja y mal caracterizada. En tercer lugar, emplear una MOI baja
(0,01 bacterias/célula) en vez de las habituales de 1 -20 bacterias/célula, se asemeja más
a la forma natural de la infección, y elimina la necesidad de lavados para eliminar las
bacterias extracelulares.
En nuestros ensayos hemos observado que ni M. gordonae ni L. pneumophila, se
multiplican en el medio X-VIVO-15, no así M. tuberculosis, que sí forma colonias en
este medio. También se determinó que un día después de la infección el 90% de las
bacterias son intracelulares en neutrófilos y el 71% en monocitos. Probablemente la
mayoría, si no la totalidad de las bacterias, habrán sido fagocitadas por los monocitos
después de cuatro días de cultivo. Como un beneficio final al modelo de infección, la
lisis de las células para la liberación de las bacterias intracelulares por medios físicos
(ultrasonido) dispersan a los grupos de bacterias que puedan haberse formado, al tiempo
que se evita la adición de reactivos (por lo general detergentes) que aumentan el
volumen final, y que también pueden inhibir el crecimiento de algunas micobacterias,
como es el caso de M. gordonae (datos no mostrados). En nuestras condiciones hemos
observado una menor tasa de multiplicación de las micobacterias, en comparación con
el uso de medios de cultivo con suero, pero esta situación puede reflejar mejor la
infección natural en los pulmones.
Actividad antimicrobiana de fagocitos humanos
El uso de distintos protocolos y modelos de infecciones bacterianos en la
literatura científica no permiten hacer una fácil comparación de los resultados
obtenidos. Por esta razón, se ha examinado la actividad tanto de monocitos como de
neutrófilos de un mismo voluntario, al mismo tiempo y en las mismas condiciones,
contra una especie de micobacteria no patógena, M. gordonae. Como modelo
comparativo se ha empleado una micobacteria patógena (M. tuberculosis) y como
control de activación de los fagocitos se uso a L. pneumophila, ya que se ha descrito que
Discusión
80
en esta bacteria se ve disminuida su multiplicación intracelular en monocitos activados
con IFNγ [Bhardwaj et al., 1986].
Hemos observado una significativa disminución en el número de bacterias M.
gordonae atenuada tanto en los neutrófilos como en los monocitos infectados, pero no
así en la cepa original, que a pesar de ser considerada como no patógena [Douglas et
al., 1986] no se observa inhibición de su crecimiento intracelular. Desconocemos
exactamente la naturaleza del proceso de atenuación de M. gordonae, pero las colonias
de la cepa atenuada tienen una morfología lisa, claramente diferenciable de la rugosa de
la cepa original. Se ha comprobado que en otras micobacterias no tuberculosas, como
M. abscessus, el aspecto morfológico de la variante lisa, que es menos virulenta, se ve
influida por la expresión de un lípido glicopéptido [Howard et al., 2006]. Este hecho
pudiera tener relación con la atenuación observada.
En estudios previos realizados por otros autores se ha observado que los
monocitos no son capaces de eliminar micobacterias no patógenas, Barker et al.
observaron que monocitos adherentes no inhiben el crecimiento de M. smegmatis,
aunque células a las que se ha impedido adherirse si eliminan a esta micobacteria
[Barker et al., 1996]. Sin embargo, también se ha descrito que otra micobacteria de baja
patogenicidad, M. fortuitum, puede ser eliminada por los monocitos [Nziramasanga et
al., 1993].
El incremento en la multiplicación de M. tuberculosis en los monocitos
infectados, la consideramos biológicamente relevante ya que en términos de UFC es >3
veces que el inoculo inicial. Estos resultados son comparables con los de otros trabajos
realizados donde se ha demostrado el crecimiento intracelular de M. tuberculosis
virulenta y no virulenta tanto en monocitos humanos diferenciados a macrófagos como
en macrófagos de ratón [Paul et al., 1996].
En nuestro trabajo hemos observado la multiplicación en neutrófilos de tanto las
micobacterias como de L. pneumophila, lo que demuestra que estas células proveen un
ambiente de multiplicación adecuado a las bacterias. La importancia clínica de estas
células está siendo reconocida. Eum et al han identificado neutrófilos infectados en
muestras de esputo, fluidos de lavados bronco-alveolares y granulomas tuberculosos de
pacientes [Eum et al., 2010].
Discusión
81
En el caso de L. pneumophila percibimos un incremento muy significativo (p<
0,001) en los monocitos infectados. Caso contrario sucedió con las infecciones de los
neutrófilos, donde apreciamos una disminución significativa (p= 0,005), lo que nos
sugiere que los neutrófilos ejerce una importante actividad bactericida sobre este
patógeno.
Horwitz y Silverstein han comprobado que los monocitos no pueden frenar la
multiplicación de L. pneumophila [Horwitz y Silverstein, 1980]. Sin embargo, estos
mismos investigadores también infectaron neutrófilos con L. pneumophila y observaron
una ligera disminución en el número de bacterias recuperadas tras la infección [Horwitz
y Silverstein, 1981]. En contraste con nuestros estudios, la infección con bacterias en
presencia de suero humano no permitía la actividad antimicrobiana de los neutrófilos. El
efecto que observaron sólo fue posible con suero inmune (con anticuerpos anti-
Legionella). Nosotros no analizamos la presencia de anticuerpos específicos en los
sueros que empleamos para opsonizar, pero nos parece improbable que todos los
voluntarios que estudiamos hayan estado en contacto con la bacteria. Las diferencias
observadas pueden estar justificadas con los distintos métodos de infección.
Activación de los fagocitos con citocinas y su efecto en la
actividad antimicrobiana
En nuestras condiciones de cultivo, los monocitos y los neutrófilos activados o
no con las citocinas IFNγ y/o TNFα, no eliminan ni a M. tuberculosis ni a M. gordonae.
La validez del método queda atestiguada por la eliminación casi total de M. gordonae
atenuada por los monocitos y en una gran proporción por los neutrófilos. En el caso de
los monocitos estos resultados son parecidos a los de Robertson y Andrew, quienes
observaron que los monocitos activados o no con INFγ son incapaces de eliminar ni a
M. tuberculosis ni a M. phlei [Robertson y Andrew, 1991]. Denis ha observado que
monocitos diferenciados a macrófagos activados con TNFα son capaces de eliminar una
cepa no virulenta de M. avium pero no una virulenta [Denis, 1991]. Estos resultados
difieren de los nuestros con la cepa atenuada de M. gordonae, pues no hemos
encontrado un aumento en la actividad microbicida gracias a TNFα. Desconocemos la
razón de esta disparidad, pero el empleo de dos especies distintas puede justificarlo.
En nuestros experimentos, los neutrófilos no eliminaron a M. tuberculosis,
aunque se ha visto que en infecciones de neutrófilos activados con TNFα inhiben el
Discusión
82
crecimiento de la micobacteria, no así los activados con INFγ [Kisich et al., 2002].
Ignoramos la razón de esta discrepancia, aunque podría ser por las grandes diferencias
con respecto al método de infección, principalmente la infección con un MOI de 10, y el
posterior lavado de las bacterias extracelulares.
Nuestros resultados con las infecciones con M. gordonae, muestran que los
fagocitos humanos no tienen una capacidad intrínseca para eliminar las micobacterias
no patógenas, a pesar de su escasa asociación con la enfermedad [Katoch, 2004].
Patrón de secreción de citocinas en fagocitos infectados
Los fagocitos infectados con M. tuberculosis inducen la secreción de muchas
citocinas, algunas activadoras, y otras inhibidoras [Flynn y Chan, 2001]. Hemos
observado que existe una asociación entre la patogenicidad de las micobacterias y el
patrón de citocinas secretadas, pues las bacterias patógenas (M. tuberculosis y L.
pneumophila), en los monocitos indujo la producción de IL-1β, IL-6 y TNFα, al
contrario que M. gordonae. Estos resultados difieren notablemente de los obtenidos por
Beltan et al., que encontraron que los macrófagos infectados con micobacterias no
patógenas (M. smegmatis y M. phlei) secretaban cantidades más altas de estas citocinas
que los infectados con M. tuberculosis [Beltran et al., 2000].
En el caso de los neutrófilos, las micobacterias no inducen, o lo hacen a un nivel
muy bajo, la producción de cualquier citocina, con la excepción de IL-8, que fue
inducida de manera similar por las tres micobacterias. Por el contrario, Fäldl et al.,
encontraron que los neutrófilos infectados con micobacterias no patógenas (M.
smegmatis) producen más TNFα, IL-6 e IL-8 que los infectados con M. tuberculosis
[Fäldt et al., 2002]. Atribuimos los resultados contradictorios al modelo y método de
infección. Nosotros no utilizamos el habitual medio de cultivo RPMI con suero, sino
que utilizamos uno libre de suero (X-VIVO-15), y nuestro MOI era más bajo (0,01
bacterias/célula). Por ejemplo, en estas condiciones no detectamos la producción de IL-
12, aunque se ha descrito su producción en macrófagos humanos infectados con
micobacterias [Matsumoto et al., 1997]. De hecho, en diferentes cepas de una especie
en particular se pueden inducir cantidades variables de distintas citocinas. Chacón-
Salinas et al., han encontrado que las cepas de M. canetti y M tuberculosis H37Rv y la
cepa de Beijing inducen en monocitos la secreción de diferentes cantidades tanto de IL-
1β, como de TNFα [Chacón-Salinas et al., 2005]. En otros estudios donde se ha
Discusión
83
valorado la expresión de citocinas y quimiocinas en plasma de pacientes con
tuberculosis y se ha encontrado un significativo incremento de la cantidad de IL-6, IL-8,
CCL5, CXCL9 y CXCL10, y una disminución en INFγ, TNFα y TGFβ en contraste con
los voluntarios sanos [Pokkali y Das, 2009]. La disparidad observada en todos estos
resultados sugiere que el patrón de secreción de citocinas puede depender de las
condiciones de cultivo, la estrategia de la infección y el modelo bacteriano, y que podría
no haber una correspondencia directa con los acontecimientos que ocurren in vivo.
No tenemos conocimiento de ningún estudio en el que se analice la relación
entre el patrón de la producción de citocinas y la actividad antimicrobiana de los
fagocitos humanos. Sin embargo, los fagocitos infectados con ambas cepas de M.
gordonae (original y atenuada) prácticamente no producen citocinas, con la excepción
de la IL-8, en la cual se encontraron cantidades similares en ambos casos. Concluimos
que las citocinas probadas no tienen ninguna influencia en la actividad microbicida de
los fagocitos, debido a que la cepa atenuada fue significativamente más susceptible que
la original.
Nuestros resultados sugieren que existen factores desconocidos que impiden que
el sistema inmunitario controlae la multiplicación de las micobacterias no patógenas en
el huésped humano, que no hemos sido capaces de determinarlos en nuestras
infeccionesr in vitro. En este sentido, la susceptibilidad de M. gordonae atenuada por
los fagocitos humanos puede resultar una herramienta útil para diseccionar a nivel
molecular los mecanismos de defensa que fallan en la eliminación de las micobacterias.
84
EXPRESIÓN GÉNICA MEDIANTE qPCR EN TIEMPO REAL
M. tuberculosis y L. pneumophila son dos bacterias que afectan a las vías
respiratorias, ambas son facultativas e intracelulares y sobreviven dentro de los
macrófagos, ya que logran resistir la acidificación de los fagosomas e inhiben la fusión
fagosoma-lisosoma. A pesar de que utilizan mecanismos diferentes para evadir su
eliminación, ambas logran crear un entorno propicio en el fagosoma para lograr
sobrevivir y multiplicarse [Clemens y Horwitz, 2000]. Una diferencia fundamental entre
ambas es que L. pneumophila es eliminada cuando se activan los monocitos infectados
con IFNγ, mientras que esta citocina no consigue activarlos frente a las micobacterias.
Determinar a nivel transcripcional las diferencias en la expresión génica de monocitos
activados con IFNγ infectados con una u otra bacteria puede dar información relevante
acerca de los mecanismos de defensa que fracasan frente a las micobacterias, pero son
exitosos frente a L. pneumophila.
Expresión génica
De los genes que estudiamos, no de todos hay evidencia de su expresión en
monocitos infectados, ni de su participación en infecciones por M. tuberculosis. En
nuestras condiciones de infección de monocitos y con nuestras condiciones de PCR, no
encontramos expresión en los genes de las DEFB 1-2-3-4, CTSG, GP91, iNOS. La
expresión de INFGR1 fue muy baja e irregular, pues no fue siempre detectada.
Defensinas (DEFB 1, 2, 3, 4)
Para este estudio solo se consideraron las defensinas β, porque en humanos las
las defensinas se encuentran en los neutrófilos [Ogata et al., 1992], específicamente las
α que se encuentran en los gránulos azurófilos [Fu, 2003], pero no estan presentes en
monocitos, linfocitos o eosinófilos de sangre periférica, aunque se desconoce si los
macrófagos contienen defensinas [Ogata et al., 1992]. Duits et al., demostraron
mediante hibridación in situ en células individuales, la presencia de las DEFB1 y 2, en
macrófagos alveolares. También observaron que en monocitos y MDM activados y sin
activar con LPS de E. coli e INFγ había expresión del ARNm de estas las defensinas
Discusión
85
[Duits et al., 2002]. Por otro lado, Rivas-Santiago et al., han encontrado expresión
génica de la DEFB2 en células epiteliales A549 y macrófagos alveolares infectados con
M. tuberculosis (H37Rv), pero no en monocitos infectados. Cuando los monocitos
fueron estimulados con LPS, solo en 2 de 5 casos se encontró expresión de la DEFB2
[Rivas-Santiago et al., 2005]. Nosotros no hemos identificado expresión de las
defensinas β (1, 2, 3 y 4) aún cuando los monocitos fueron activados con IFNγ y LPS de
E coli.
Catepsinas D y G
Con respecto a las catepsinas, se consideraron para este estudio una aspártico
proteasa (CTSD), y otra serín proteasa (CTSG). En algunos leucocitos se han encontrado
proteasas lisosomales con actividad antimicrobiana que son activas a distinto pH, como
la CTSD que es activa a pH ácido, y la CTSG, que se activa a pH neutro [Thorne et al.,
1976]. Se ha observado que en monocitos THP-1 infectados con M. tuberculosis se
presenta un aumento de la expresión génica de la CTSD, y una disminución de
expresión en las CTSB y G. Este efecto también se observó cuando las células THP-1
fueron diferenciadas a macrófagos y fueron expuestos a LPS [Rivera-Manero et al.,
2004]. Este mismo resultado se ha encontrado en pulmones de ratón infectados con la
cepa de M. tuberculosis H37Rv y la cepa hipervirulenta ∆acr [Stewart et al., 2006]. En
nuestras condiciones no hemos encontrado expresión del CTSG, y la expresión de
CTSD no varió significativamente entre monocitos infectados con cualquiera de las dos
bacterias y células no infectadas. Estos resultados no aportan evidencias acerca de un
papel en la actividad antimicrobiana frente a L. pneumophila, dado que es
semejantemente expresado en monocitos infectados por M. tuberculosis, que no es
eliminado.
NRAMP1
La proteína traducida de este gen se ha visto implicada en el transporte de
cationes bivalentes tanto de humanos como de bacterias [Gruenheid y Gros, 2000],
principalmente el Fe2+, [Liu et al., 1995]. Con respecto a la función bioquímica de este
gen hay mucha controversia. Algunos autores consideran que su papel principal es
aumentar la cantidad de Fe2+ dentro del fagosoma, para generar especies reactivas de
oxígeno en las que está presente este metal y así combatir a la bacteria. Sin embargo
otros autores consideran que su función se basa en disminuir la cantidad de iones
Discusión
86
divalentes (Fe2+, Zn2+, Mn2+) accesibles a la bacteria intrafagosomal, principalmente
Fe2+, que es fundamental para el crecimiento del patógeno. La asociación de este gen
con la tuberculosis ha sido muy estudiada, principalmente en ratones, donde se ha
encontrado una clara asociación entre la expresión de este gen y la susceptibilidad a la
tuberculosis [Wyllie et al., 2002]. Sin embargo, es controvertido el papel de distintos
polimorfismos de este gen en el padecimiento de esta enfermedad en humanos
[Takahashi et al., 2007].
En nuestros resultados se observo una mayor expresión de NRAMP1 en los
monocitos infectados con M. tuberculosis (3,71 veces) que en los infectados con L.
pneumophila (1,54 veces) con respecto a los no infectados. Siendo la diferencia entre
ambas de 2,41 veces. Este resultado es una evidencia adicional sobre la importancia de
este gen en la respuesta a la tuberculosis, como ya se había detectado en el modelo de
ratón. Sin embargo una mayor expresión del gen no se traduce en una actividad
antimicrobiana efectiva frente a M. tuberculosis.
Receptores de citocinas
IFNGR1 e IFNGR2
Personas que padecen síndromes mendelianos, defectos congénitos que dan
lugar a una enfermedad clínica grave, presentan una predisposición a infecciones
causadas por especies de micobacterias poco virulentas, como las de la vacuna BCG y
MNT. Evidentemente también se ven afectados a especies más virulentas de
micobacterias como M. tuberculosis. Esta enfermedad esta causada por mutaciones en 5
genes autonómicos entre los cuales encontramos al IFNGR1 y el IFNGR2 [Filipe-Santos
et al., 2006]. Se ha observado que en células CD14+ infectadas con M. tuberculosis
presentan una disminución en la expresión del IFNGR1 en comparación con las células
no infectadas [Singhal et al., 2007]. Pero no se ha encontrado asociación entre la
tuberculosis y el gen IFNGR2 [Cooke et al., 2006]. Sin embargo, determinados
polimorfismos que afectan tanto a la producción como a la capacidad de respuesta del
IFNγ pueden influir en el riesgo de desarrollar tuberculosis [Yew et al., 2007].
En nuestro estudio analizamos la expresión génica de las dos subunidades del
IFNGR. La expresión del receptor 1 fue siempre muy baja, y de baja reproducibilidad.
Aunque la del receptor 2 fue más alta, no se observó expresión diferencial significativa
entre células infectadas o no infectadas. Estos receptores están constitutivamente
Discusión
87
expresados en monocitos humanos, y no parece que la infección de estas bacterias
induzca ningún cambio.
TNFRSF1A
Los efectos pro-inflamatorios del TNFα se deben a 2 receptores, TNFRSF1A
(TNFRI p55) y TNFRSF1B (TNFRII p75). El TNFRSF1A se encuentra ampliamente
expresado y se considera el principal receptor de inducción de la señalización del TNFα
soluble [Siebert et al., 2005]. Estudios en ratones han demostrado la importancia de este
receptor en la tuberculosis, se observo que ratones carentes del TNFRSF1A e infectados
con M. tuberculosis, no pueden controlar la infección y mueren en poco tiempo en
comparación con los que si tienen funcional el gen TNFRSF1A [Flynn et al., 1995].
En nuestros resultados observamos una expresión del TNFRSF1A en los
monocitos infectados con M. tuberculosis >4 en comparación con los no infectados y >3
con respecto a los infectados con L. pneumophila. Este resultado puede ser reflejo de la
importancia del TNFα en la tuberculosis, pues es una citocina fundamental en la
defensa frente a la enfermedad, como demuestran los pacientes que son sometidos a
terapias anti-TNFα, que ven aumentado dramáticamente el riesgo de reactivación de la
tuberculosis [Dinarello, 2003].
Subunidades de la bomba de protones dependiente de ATP (ATP6V1G1 y
ATP6V0C)
Para nuestro estudio seleccionamos una subunidad representativa de cada
dominio del complejo, una del dominio periférico V1 (encargado de la hidrólisis del
ATP), y otro del dominio integral V0 (responsable del transporte de protones). Los
patrones de expresión de ambas subunidades en células infectadas fue muy distinto,
pues el componente de la subunidad V1 está más expresado en células infectadas, e
incluso con sensibles diferencias entre ambos patógenos, pues se expresa más del doble
en monocitos infectados con L. pneumophila que con M. tuberculosis. Por el contrario
el componente de la subunidad V0 se expresa menos de 1/3 en células infectadas que no
infectadas. Estos resultados son difíciles de interpretar, pero en última instancia la
subunidad menos expresada es la que produce el intercambio de protones, lo cual se
puede correlacionar con el menor grado de acidificación que se detecta en fagosomas
que contienen a M. tuberculosis o M. avium [Crowle et al., 1991].
Discusión
88
Subunidades de la NADPH oxidasa, genes NCF1 (p47 phox) y CYBB (gp91
phox)
No se encontró expresión del gen de la subunidad de la NADPH oxidasa gp91
phox. En estudios realizados independientemente, hemos observado un aumento de la
producción de ROS en monocitos infectados con M. tuberculosis (datos no mostrados).
De este hecho deducimos que si bien no hemos observado nueva transcripción el gen
gp91 la proteína está presente en la célula antes de la infección, pues es funcional. Sin
embargo, sí hemos detectado inhibición (de 3 veces) de la expresión de p47phox cuando
los monocitos se infectan por cualquiera de las dos bacterias. Esta inhibición pudiera
afectar a la producción de ROS no en el momento de la infección en que se produce la
denominada explosión oxidativa gracias a las proteínas ya presentes en la célula, sino a
la producción continua de ROS más adelante. Este ROS puede tener funciones distintas
de la actividad microbicida, por cuyo motivo estas bacterias intracelulares pueden tener
interés en que no se produzca.
Algunos autores han observado una gran explosión oxidativa en los neutrófilos,
como una respuesta a la infección, como es el caso de neutrófilos infectados con M.
tuberculosis, por ejemplo May y Spagnuolo infectaron neutrófilos opsonizados con
bacterias de M. tuberculosis muertos por calor, siendo el resultodo en un incremento
de O2- a los 30 minutos de exposición [May y Spagnuolo, 1987]; Perskvist et al., al
infectar neutrófilos con esta micobacteria y observaron que se producia apoptosis de los
neutrófilos atraves de una vía dependiente de oxígeno [Perskvist et al., 2002]. También
se ha visto este efecto con otras micobacterias como M. avium, M. kansasii, M.
smegmatis y M. phlei [N’Diaye et al., 1998].
iNOS
La iNOS es la principal enzima generadora de RNI en las células del sistema
inmune [Lowenstein y Padalko, 2004]. Se ha demostrado que la iNOS es importante en
control inmunológico contra M. tuberculosis, como lo demuestran estudios de
infecciones en ratones que carecen del gen de la iNOS, donde se observo que la
ausencia de iNOS conduce a un rápido crecimiento de las micobacterias, neumonitis
granulomatosa necrótica, y muerte.; se cree que la iNOS desempeña una función similar
en los macrófagos humanos, aunque esta hipótesis no ha sido esclarecida [MacMicking
et al., 1996]. La expresión de iNOS2 en monocitos o macrófagos humanos es muy
Discusión
89
controvertida [Nicholson et al., 1996; Davis et al., 2007]. En nuestras condiciones de
trabajo no hemos observado expresión de este gen.
Quimiocina CC ligando 20
Esta quimiocina junto con su receptor (CCR6), están considerados como
responsables de la migración y reclutamiento de células presentadoras de antígenos y de
células inmunocompetentes durante las respuestas inflamatoria e inmunológica. CCL20
y las β defensinas-2 no solo comparten el mismo receptor, sino que también tienen otra
característica estructural común: su carga positiva, que se considera importante para la
actividad antimicrobiana de las defensinas [Pérez-Cañadillas et al., 2001]. Se ha
observado que E. coli y S. aureus son susceptibles a la proteína de CCL20 [Yang et al.,
2003]. Se ha visto que MDM de pacientes con tuberculosis, estimulados con el antígeno
30kDa de M. tuberculosis, promueven la expresión de CCL20, en comparación con los
de controles sanos [Lee et al., 2007]. Se ha demostrado la regulación la transcripción
del gen CCL20 por distintas bacterias, por ejemplo, en pacientes con gastritis
ocasionada por Helicobacter pylori a diferencia de los controles que muestran niveles
muy bajos o nulos [Tomimori et al., 2007]. Shigella flexneri en células epiteliales
humanas derivadas de carcinoma de colón que disminuyen la regulación del gen CCL20
[Sperandio et al., 2008]. No solo las bacterias patógenas inducen CCL20, también se ha
encontrado que algunas bacterias probióticas inducen su expresión en monocitos
diferenciados a células dendríticas [Latvala et al., 2008].
En nuestro trabajo los resultados muestran una gran nivel de expresión génica de
CCL20 >40 veces en el caso de los monocitos infectados con L. pneumophila y >16
veces en el caso de los infectados con M. tuberculosis con respecto a los no infectados.
Esta diferencia en los niveles de expresión es la más elevada de todos los genes que
hemos analizado.Además se ve una clara diferencia de expresión entre los infectados
con L. pneumophila y M. tuberculosis, 2,48 veces.
Desconocemos si la expresión de CCL20 es un mecanismo de defensa de la
respuesta inmune frente a M. tuberculosis. Creemos que esta micobacteria es capaz de
aprovechar las propiedades biológicas de CCL20 de atraer a las células dendríticas,
como una respuesta quimotactica al receptor CCR6 presente en estas células [Pérez-
Cañadillas et al., 2001] para propagarse dentro del organismo. Hay autores como
Förstch et al., que han demostrado que M. tuberculosis es capaz de reproducirse dentro
Discusión
90
de las células dendríticas [Förstch et al., 2000], y las células dendríticas son consideras
como una de las principales células presentadoras de antígenos, y al fagocitar a los
antígenos de bacteria o la micobacteria la conducen a través de sistema linfático a los
órganos linfoides [Benchereau et al., 2000].
CONCLUSIONES
91
Primera:
En estudios in vitro el suero humano no es necesario para la fagocitosis de las
micobacterias.
Segunda:
El pase de la cepa de M. gordonae (HL184G) durante más de un año originó una
cepa atenuada.
Tercera:
En ensayos in vitro, ni monocitos, ni neutrófilos exhiben actividad
antimicobacteriana
Cuarta:
Las citocinas activadoras IFNγ y TNFα no influyen en la actividad
antimicobacteriana de los monocitos y neutrófilos.
Quinta:
No hay relación entre el perfil de producción de citocinas y la actividad
antimicobacteriana de los monocitos y neutrófilos.
Sexta:
Se ha encontrado expresión diferencial en monocitos infectados con M.
tuberculosis y L. pneumophila de los genes: NRAMP1, CTSD, ATPG1V1, TNFRSF1A y
CCL20.
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ANEXOS
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Anexo 1: Publicación: Human phagocytes lack the ability to kill Mycobacterium gordonae, a
non-pathogenic mycobacteria. (PDF).